UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
MARIANA SANTANA SANTOS PEREIRA DA COSTA
POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DE MACROALGAS
VERDES: CORRELAÇÃO COM PARÂMETROS AMBIENTAIS E
OBTENÇÃO DE GLUCOGALACTANAS SULFATADAS
ANTICOAGULANTES
NATAL/RN
2016
POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DE MACROALGAS
VERDES: CORRELAÇÃO COM PARÂMETROS AMBIENTAIS E
OBTENÇÃO DE GLUCOGALACTANAS SULFATADAS
ANTICOAGULANTES
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial para obtenção do título de Doutor em Bioquímica.
Orientador: Hugo Alexandre de Oliveira Rocha Co-orientador: Leandro Silva Costa
NATAL/RN
2016
Dedico esta obra:
À minha mãe Fátima, exemplo de mulher e de mãe, por sua dedicação, apoio e amor, por
todos os sacrifícios que enfrentou para que eu pudesse chegar até aqui. Ao meu pai, Tadeu
(homenagem póstuma), por seu apoio, proteção, cuidado e amor, sei que hoje você estaria
muito orgulhoso por eu ter conseguido esta conquista. Obrigada por nãо medirem esforços
para qυе еυ chegasse аté esta etapa dе minha vida. Espero um dia ser, para os meus filhos,
exemplos de pais como vocês são para mim. Amo muito vocês!
Ao meu esposo Adaíres pelo companheirismo, compreensão, apoio, incentivo, paciência e
amor. Agradeço a Deus por ter colocado você em minha vida há 13 anos e por você estar hoje
Dedico esta obra:
Ao meu orientador, Prof. Dr. Hugo Rocha, por ser um grande professor e orientador, por
confiar no meu trabalho, pelo incentivo, por não ter desistido de mim, mesmo em meio as
minhas dificuldades e ausências; e por hoje servir de exemplo para minha vida como docente.
E ao meu amigo e padrinho Hugo, pelo apoio, preocupação, amizade, viagens, por estar
sempre presente em todos os momentos de minha vida acadêmica e pessoal.
A você, a minha eterna gratidão!!!
“O professor medíocre conta. O bom
professor explica. O professor superior
demonstra. O grande professor inspira.”
que aparecem em meu caminho. “Ainda que eu ande pelo vale da sombra da morte, não
temerei mal nenhum, porque tu estás comigo” (Salmo 23:4).
Aos meus pais, Tadeu (homenagem póstuma) e Fátima, por todos os obstáculos que tiveram
que superar para que hoje eu pudesse ser o que sou, por ficarem felizes com minhas
vitórias, por sempre estarem ao meu lado, me apoiando e incentivando. Amo muito vocês!
Ao meu esposo, Adaíres, que vem acompanhando de perto todas as fases da minha vida
acadêmica desde a graduação, por estar ao meu lado em todos os momentos, pela força,
paciência, incentivo e amor. Muito obrigada, meu amor!
Aos meus irmãos, Thiago e João Neto, as minhas avós Conceição e Mãezinha (homenagem
póstuma), as minhas cunhadas Flávia e Marilandy, a minha sobrinha Letícia, que veio para
alegrar ainda mais nossas vidas, obrigada pelo amor de vocês. E a todos os meus demais
familiares pelo carinho, cuidado e apoio, em especial, ao meu Tio Eider (homenagem
póstuma) que hoje, com certeza, estaria muito orgulhoso por mais esta minha conquista; e as
primas Rosa e Yasmim pelo carinho e admiração.
Ao meu orientador Prof. Hugo Rocha por há 12 anos ter confiado que eu seria capaz. Por
seus ensinamentos, paciência, convívio e amizade. Obrigada!
À Universidade Federal do Rio Grande do Norte por fornecer as condições necessárias para
realização deste trabalho.
À CAPES e ao CNPq por financiarem este trabalho.
Ao professor Elizeu Antunes da UFRN e aos seus alunos Antônio, Anderson e Jonalson
pela ajuda com o AKTA.
Á professora Suely Chavantes da UFRN e a sua aluna Lais Palhares pelo auxílio nos
ensaios de inibição da trombina.
Ao professor Heitor Bruno do IFRN - Campus Macau pelo auxílio nas análises estatísticas.
Aos professores e funcionários do Departamento de Bioquímica da UFRN pelo convívio e
ensinamentos desde a minha graduação.
Aos professores da banca de qualificação, Diego Sabry, Leandro Costa e Luciana Guimarães,
por disponibilizarem seu tempo para lerem esta tese e por todas as contribuições que deram
para melhoria deste trabalho.
Aos professores da banca de defesa, Cinthia Telles, Giulianna Souza, Leandro Costa,
Luciana Bertini e Kátia Scortecci, a contribuição de cada um de vocês foi muito válida e
enriquecedora.
Trabalhar com uma espécie de alga já é difícil, logo, trabalhar com várias espécies, durante
12 meses não foi fácil. Foram muitas coletas, muitas algas para lavar, secar, fazer
proteólise... Eu não teria conseguido chegar até aqui sem a ajuda de vários amigos que fazem
parte do nosso querido BIOPOL, nesta tese há pedacinho de cada um de vocês. Ao Prof.
Hugo (por ter me dado a oportunidade de fazer parte do BIOPOL), Jailma, Ruth, Cinthia,
Dayanne, Karol, Joana, Daniele (amigas muito queridas, obrigada pelo carinho, apoio,
conversas, desabafos...), Leandro e Ivan (por terem sido os primeiros a me receberem no
laboratório e terem me ensinado muito do que hoje sei), Rafael, Leonardo, Gabriel, Moacir
(por estarem sempre dispostos a ajudar), Raniere, Rony e Éder (muito obrigada por me
aguentar sempre aperreando pelas liofilizações de amostras), Vínicius (obrigada pela ajuda
com o AKTA) e a Talita, Arthur, Mônica, Maíra, Marília, Monique, Almino, Fabiana,
Jefferson, Larisse, Letícia, Pablo, Samanta, Lucas, Cauê, Carol, Socorro e Cintia pelo
convívio e carinho. Nunca vou esquecer vocês!!!
Quero agradecer, em especial, a Ruth e Maxsuel pela ajuda nos experimentos referentes a
sazonalidade; Dayanne e Rayanara pelo auxílio nos experimentos da parte purificação dos
polissacarídeos; Leandro por me ajudar na finalização deste trabalho; e Jailma, Karol e
Dayanne por todo o apoio na finalização deste trabalho, pelo carinho, ajuda nos ensaios, no
carinho, paciência e amizade; não sei o que seria dos meus slides e formatações sem você,
amiga. Sara, minha primeira companheira de bancada, uma amiga que posso contar em todas
horas; obrigada por estar sempre por perto, desde a graduação e agora também na minha vida
profissional, pela amizade, incentivo, apoio, viagens, por ajudar nas minhas atividades do
projeto do IFRN enquanto estou afastada... Meninas, obrigada por se alegrarem comigo nas
minhas vitórias e chorarem comigo nos momentos difícieis. Amo vocês!
Aos vários colegas de Departamento de Bioquímica da UFRN pela convivência, pelos
sorrisos e conversas nos corredores do DBQ .
Aos professores do Grupo de Biologia do IFRN-Campus Macau (Lilian, Tarciana, Heitor,
Sidney, Paulo Augusto, Daniel, Danielly, Maria Aparecida e Francinaide) e ao Diretor
Acadêmico Hudson Carlos por terem apoiado o meu afastamento das atividades acadêmicas
do IFRN para poder finalizar o doutorado. Obrigada pelo apoio!
“A vida é em parte o que nós fazemos dela, e em parte o que é feito pelos amigos que nós
escolhemos" (Tennessee Williams). Aos meus amigos de longos anos, Mileide, Ricardo,
Jobson, Leila, Cybelle, Luciana e Rochele, pelo apoio e carinho. Aos meus amigos de
aventuras e viagens, Sara, Katia, Lourdinha, Maria da Paz, Hugo e Adriana, pela força. Já
podemos marcar uma viagem para comemorar meu doutorado. Vocês são maravilhosos!
E a todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho.
“Talvez não tenha conseguido fazer o
melhor, mas lutei para que o melhor fosse
feito. Não sou o que deveria ser, mas graças
a Deus, não sou o que era antes”.
Polissacarídeos de algas podem ter sua síntese, sua estrutura e propriedades farmacológicas modificadas devido a alterações de fatores ambientais. Contudo, poucas algas já foram analisadas com essa ótica. A alga verde C. cupressoides var.
flabellata Børgesen é uma alga abundante na costa do Rio Grande do Norte e já foi
demostrado que esta alga coletada na mesma época, mas em praias com grau de salinidade diferentes, sintetizava polissacarídeos sulfatados (PS) com propriedades diferentes, inclusive atividade anticoagulante. Dessa forma, o objetivo do presente foi avaliar a influência do período de coleta e de parâmetros ambientais na composição química e atividade anticoagulante de PS obtidos de algas verdes do litoral potiguar, bem como obter e avaliar o potencial anticoagulante de PS purificados da alga C.
cupressoides. Inicialmente, foram obtidos extratos ricos em polissacarídeos
sulfatados (ERPS), por proteólise seguido por precipitação com metanol, da alga C.
cupressoides coletada mensalmente, durante um ano na praia de Búzios, Nísia
Floresta/RN. Observou-se que havia variações no rendimento da extração, composição química e atividade anticoagulante dos ERPS da C. cupressoides de acordo com o mês de coleta, sendo o mês de março aquele em que se obteve ERPS com maior potencial anticoagulante, vale salientar que esta atividade foi maior que a do Clexane®, uma heparina de baixo peso molecular comercial. Ao se analisar a influência de fatores ambientais do local de coleta no rendimento, composição química e atividade anticoagulante observou-se que existe uma correlação positiva significativa (p < 0,05) entre o rendimento da extração dos ERPS e a salinidade da água do mar e a insolação; para a quantidade de sulfato observou-se uma correlação negativa significativa (p < 0,05) com a salinidade da água do mar. Já a quantidade de açúcares totais teve uma correlação negativa significativa (p < 0,05) com: sólidos totais, sódio, cloreto e insolação. Como o mês de março foi o mês com ERPS com maior potencial anticoagulante, resolveu-se purificar, caracterizar e avaliar o potencial anticoagulante de PS extraídos neste mês. Após proteólise e fracionamento com volumes crescentes de acetona obteve-se quatro frações polissacarídicas da C.
cupressoides (CCB-0.3, CCB-0.5, CCB-1.0 e CCB-2.0), como a CCB-0.5 apresentou
maior atividade anticoagulante, esta foi submetida a cromatografia de troca-iônica e eluída em duas novas frações (FI e FII), após eletroforese em gel de agarose, coloração da lâmina com azul de toluidina e descoloração, observou-se o aparecimento de uma única banda em ambas as subfrações, o que indica a presença de uma única população de PS, o que permite inferir que estes PS foram purificados. Análises por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) indicam que os PS FI e FII tratam-se de glucogalactanas. Estas glucogalactnas sulfatadas exibiram atividade anticoagulante pela via intrínseca (teste de aPTT), pela via extrínseca (teste PT) e pela via comum (teste TT) da cascata de coagulação. Um resultado interessante foi que a atividade no teste de aPTT das glucogalactanas sulfatadas foi similiar a atividade do Clexane®. Além disso, estes PS foram capazes de inibir parcialmente a trombina. Isto é indicativo que os PS da C. cupressoides podem estar agindo em diversas proteases da cascata de coagulação. Entretanto, mais estudos são necessários para explicar detalhadamente quais os alvos de ação destes polímeros. Por fim, analisou-se a influência do período de coleta e de fatores ambientais em ERPS de outras algas verdes do litoral do RN (Caulerpa prolifera, Caulerpa racemosa
var. occidentalis, Caulerpa sertularioides e Codium isthmocladum) coletadas também
interessante é que cada alga responde de forma diferente as condições ambientais do local de coleta. Estes dados indicam que dependendo do período do ano que a alga é coletada, os PS extraídos destas espécies de algas podem ter suas estruturas químicas afetadas e, consequentemente, suas atividades biológicas poderão ser distintas. Estes tipos de estudos levam ao esclarecimento de quais seriam as melhores condições para se obter o PS com as características estruturais e biológicas de interesse, o que é fundamental para o uso destes polímeros na indústria.
PALAVRAS-CHAVE: algas marinhas. atividade anticoagulante. Caulerpa cupressoides var. flabellata. Chlorophyta. sazonalidade. período de coleta.
pharmacological properties modified due to changes in environmental factors. But few algae have been analyzed in this light. The green seaweed C. cupressoides var.
flabellata Børgesen is an abundant alga in the coast of Rio Grande do Norte and it was
already shown that this seaweed collected at the same time in beaches with different degree of salinity synthesized sulfated polysaccharides (PS) with different properties, including anticoagulant activity. Therefore the objective of this study was to obtain and characterize PS of green seaweed of the coast of Rio Grande do Norte evaluating the influence of the collection period and environmental parameters in the chemical composition and anticoagulant activity of PS as well as purify, characterize and evaluate the anticoagulant potential of at least one PS of the seaweed C. cupressoides. Initially, extracts rich in sulfated polysaccharides (ERPS) were obtained by proteolysis followed by precipitation with methanol of the seaweed C. cupressoides collected monthly for one year on the beach in Búzios, Nísia Floresta/RN. It was noted that there were variations in performance of extraction, chemical composition and anticoagulant activity of ERPS C. cupressoides according to the month of collection, with the month of March being the one in which they obtained more anticoagulant potential of ERPS. It is worth noting that this activity was greater than that of Clexane®, a low molecular weight commercial heparin. When analyzing the influence of environmental factors in the collection site in regards to performance, chemical composition and anticoagulant activity it has been observed that there is a significant positive correlation (p < 0.05) between the performance of the extraction of ERPS and salinity of sea water and insolation; for the amount of sulfate it was observed a significant negative correlation (p < 0.05) with the salinity of the seawater. The amount of total sugars had a significant negative correlation (p < 0.05) with: total solids, sodium, chloride and insolation. Since the month of March was the month with ERPS with more anticoagulant potential, it was decided to purify, characterize and evaluate the PS anticoagulant potential extracted on that month. After proteolysis and fractionation with increasing volumes of acetone four fractions of polysaccharide C. cupressoides (0.3, 0.5, 1.0 e CCB-2.0) were obtained. Since the CCB-0.5 had higher anticoagulant activity, it was submitted to a chromatography ion-exchange column and eluted in two new fractions (FI and FII) after agarose gel electrophoresis, slide staining with toluidine blue and discoloration it was observed the appearance of a single band on both SP which indicates the presence of a single population of PS, which allows inferring that these PS were purified. Analysis by high-performance liquid chromatography (HPLC) indicate that SP FI and FII are glucogalactanas. These sulfated glucogalactans exhibited by the intrinsic pathway anticoagulant activity (APTT assay) the extrinsic pathway (PT test) and common pathway (TT test) of the coagulation cascade. An interesting result was that activity in the aPTT test of sulfated glucogalactans was similiar activity of Clexane®. In addition, these PS were able to partially inhibit thrombin. This is an indicative that the PS C. cupressoides may be acting on various proteases of the coagulation cascade. But more studies are needed to explain in detail which are the targets of action of these polymers. Finally, we analyzed the influence of the period of collection and environmental factors in ERPS of other green seaweeds RN coast (Caulerpa prolifera, Caulerpa racemosa var. occidentalis, Caulerpa
sertularioides and Codium isthmocladum) also collected monthly for one year on the
beach of Búzios, Nísia Floresta/RN; and it was observed that, like the C. cupressoides, there were variations in the performance, chemical composition and anticoagulant
the time of the year that the algae are collected, the PS extracted from these species of algae may have their chemical structures affected hence its biological activity may be different. These types of studies lead to the clarification of which would be the best conditions to obtain the PS with the structural and biological characteristics of interest, which is essential for the use of these polymers in the industry.
KEYWORDS: green seaweed. anticoagulant activity. Caulerpa cupressoides var.
Figura 1 - Gêneros de algas verdes utilizados como matérias básicas para se extrair polissacarídeos sulfatados ... 23 Figura 2 - Polissacarídeos encontrados na parede celular de algas da ordem
Ulvales ... 24 Figura 3 - Modelo clássico de coagulação sanguínea ... 28 Figura 4 - Modelo de coagulação baseado em superfícies celulares ... 29 Figura 5 - Mecanismos de ação anticoagulante dos polissacarídeos
sulfatados de algas marinhas ... 32 Figura 6 - Localização do ponto de coleta das algas na Praia de Búzios, litoral
Sul do Rio Grande do Norte ... 46 Figura 7 - Algas verdes utilizadas neste trabalho ... 47 Figura 8 - Rendimento da extração dos ERPS da alga C. cupressoides de
acordo com o mês de coleta ... 60 Figura 9 - Comportamento eletroforético dos PS da alga C. cupressoides ... 61 Figura 10 - Quantidade de açúcares totais e sulfato dos ERPS da alga C.
cupressoides de acordo com mês de coleta ... 62 Figura 11 - Atividade anticoagulante pelo ensaio de aPTT dos ERPS da alga
C. cupressoides de acordo com o mês de coleta ... 63 Figura 12 - Comparação da variação anual do rendimento da extração dos
ERPS da C. cupressoides com parâmetros ambientais do local de coleta (insolação e salinidade) ... 65 Figura 13 - Comparação da variação anual da quantidade de sulfato dos ERPS
da C. cupressoides a salinidade da água do mar ... 65 Figura 14 - Comparação da variação anual da quantidade de açúcares totais
dos ERPS da C. cupressoides com parâmetros ambientais do local de coleta (sólidos totais, cloreto, sódio e insolação) ... 66 Figura 15 - Rendimento percentual do fracionamento com acetona ... 69 Figura 16 - Perfil de eluição da fração CCB-0.5 em cromatografia de troca
aniônica em sistema FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) em equipamento AKTA ... 71 Figura 17 - Comportamento eletroforético dos PS da alga C. cupressoides ... 72
Figura 19 - Efeito dos PS FI e FII da C. cupressoides na inativação da trombina na ausência do HCII e da AT ... 77 Figura 20 - Rendimento da extração dos ERPS de acordo com o mês de coleta 78 Figura 21 - Comportamento eletroforético dos PS das algas C. prolifera, C.
racemosa, C. sertularioides e C. isthmocladum ... 80 Figura 22 - Quantidade de açúcares totais (A) e sulfato (B) dos ERPS das algas
verdes de acordo com o período de coleta ... 81 Figura 23 - Atividade anticoagulante dos ERPS das algas verdes de acordo
com o período de coleta ... 83 Figura 24 - Coeficiente de correlação (n=12) para os parâmetros ambientais do
local de coleta que tiveram correlações significativas (p < 0,05) com a quantidade de açúcares totais e atividade anticoagulante dos ERPS da C. prolifera ... 87 Figura 25 - Coeficiente de correlação (n=11) para os parâmetros ambientais do
local de coleta que tiveram correlações significativas (p < 0,05) com o rendimento, composição química e atividade anticoagulante dos ERPS da C. racemosa ... 89 Figura 26 - Coeficiente de correlação (n=12) para os parâmetros ambientais do
local de coleta que tiveram correlações significativas (p < 0,05) com o rendimento e composição química dos ERPS da C. sertularioides 91 Figura 27 - Coeficiente de correlação (n=10) para os parâmetros ambientais do
local de coleta que tiveram correlações significativas (p < 0,05) com o rendimento e composição química dos ERPS da C. isthmocladum 93
Tabela 1 - Atividades farmacológicas atribuídas aos polissacarídeos sulfatados extraídos de algas marinhas verdes ... 26 Tabela 2 - Resumo do atual modelo de coagulação baseado em superfícies
celulares ... 30 Tabela 3 - Polissacarídeos sulfatados de algas verdes com atividade
anticoagulante ... 38 Tabela 4 - Média e variação anual dos fatores ambientais da Praia de
Búzios/RN durante o período de estudo (média ± desvio padrão e variação, n=12) ... 63 Tabela 5 - Coeficiente de correlação (n=12) entre o rendimento, composição
química e atividade anticoagulante dos ERPS da C. cupressoides e os parâmetros ambientais do local de coleta ... 67 Tabela 6 - Atividade anticoagulante das frações polissacarídicas da C.
cupressoides ... 70 Tabela 7 - Composição química do ERPS, da fração CCB-0.5 e dos PS FI e FII
da alga C. cupressoides ... 73 Tabela 8 - Relação molar dos monossacarídeos ERPS, da fração CCB-0.5 e
dos PS FI e FII da alga C. cupressoides ... 73 Tabela 9 - Atividade anticoagulante no teste de aPPT do ERPS, da fração
CCB-0.5 e dos PS purificados FI e FII da C. cupressoides ... 74 Tabela 10 - Atividade anticoagulante no teste de PT do ERPS, da fração
CCB-0.5 e dos PS purificados FI e FII da C. cupressoides ... 75 Tabela 11 - Atividade anticoagulante no teste de TT da fração CCB-0.5 e dos
PS purificados FI e FII da C. cupressoides ... 76 Tabela 12 - Média e variação anual da quantidade de açúcar e sulfato dos ERPS
(média ± desvio padrão, n=12) e ANOVA (Razão-F e probabilidade) 82 Tabela 13 - Média e variação anual da atividade anticoagulante dos ERPS das
algas verdes (média ± desvio padrão, n=12) e ANOVA (Razão-F e probabilidade) ... 83
parâmetros ambientais do local de coleta ... 86 Tabela 15 - Coeficiente de correlação (n=11) entre o rendimento, composição
química e atividade anticoagulante dos ERPS da C. racemosa e os parâmetros ambientais do local de coleta ... 88 Tabela 16 - Coeficiente de correlação (n=12) entre o rendimento, composição
química e atividade anticoagulante dos ERPS da C. sertularioides e os parâmetros ambientais do local de coleta ... 90 Tabela 17 - Coeficiente de correlação (n=10) entre o rendimento, composição
química e atividade anticoagulante dos ERPS da C. isthmocladum e os parâmetros ambientais do local de coleta ... 92
ABS Absorbância
aPTT Tempo de tromboplastina parcial ativada
AT Antitrombina
BIOPOL Laboratório de Biotecnologia de Polímeros Naturais CCB-0.3 Fração precipitada com 0,3 volumes de acetona da
C. cupressoides de Búzios
CCB-0.5 Fração precipitada com 0,5 volumes de acetona da
C. cupressoides de Búzios
CCB-1.0 Fração precipitada com 1,0 volumes de acetona da
C. cupressoides de Búzios
CCB-2.0 Fração precipitada com 2,0 volumes de acetona da
C. cupressoides de Búzios
CLAE Cromatografia líquida de alta eficiência
DEAE Dietilaminoetil
CETAVLON Brometo de cetiltrimetilamônio
EMPARN Empresa de Pesquisa Agropecuária do Rio Grande do Norte
ERPS Extrato rico em polissacarídeo sulfatado
FF Fast flow
FI PS proveniente da CCB-0.5 eluído na faixa de 0,48 - 0,65 M de NaCl
FII PS proveniente da CCB-0.5 eluído na faixa de 0,73 - 0,78 M de NaCl
FIIa Trombina
FIX Fator de Christmas
FPLC Fast Protein Liquid Chromatography
FT Fator tecidual
FUC Fucose
FV Pró-acelerina
FVII Pró-convertina
FXII Fator de Hageman
FXIII Fator estabilizante de Fibrina
GAG’s Glicosaminoglicanos
GAL Galactose
GLC Glicose
HCII Cofator II da heparina
MAN Manose
MIN. Minutos
ND Não determinado
NT Não detectado
PDA 1,3 diamino propano acetato
OS Polissacarídeo sulfatado
PT Tempo de protrombina
RHA Ramnose
RN Rio Grande do Norte
TFPI Inibidor da via do fator tecidual
TT Tempo de Trombina
1 INTRODUÇÃO ... 22
1.1 Polissacarídeos sulfatados de algas marinhas ... 22
1.2 Polissacarídeos sulfatados de algas verdes ... 23
1.3 Atividade anticoagulante de polissacarídeos sulfatados de algas verdes .. 27
1.3.1 Coagulação sanguínea x anticoagulantes ... 27
1.3.2 Polissacarídeos sulfatados anticoagulantes de algas marinhas ... 31
1.4 Carboidratos x período de coleta da alga e parâmetros ambientais ... 40
2 OBJETIVOS ... 45 2.1 Objetivo geral ... 45 2.2 Objetivos específicos... 45 3 MATERIAIS E MÉTODOS ... 46 3.1 Local de coleta ... 46 3.2 Materiais ... 46 3.2.1 Material biológico ... 46 3.2.3 Outros materiais ... 48 3.2.4 Aparelhos ... 48 3.3 Métodos ... 50
3.3.1 Obtenção dos ERPS das algas verdes C. cupressoides, C. prolifera, C. racemosa, C. sertularioides e C. isthmocladum ... 50
3.3.2 Obtenção das frações polissacarídicas da C. cupressoides ... 50
3.3.3 Obtenção dos PS purificados da C. cupressoides ... 51
3.3.4 Caracterização físico-química das amostras ... 51
3.3.4.1 Eletroforese em gel de agarose ... 51
3.3.4.3 Análises químicas ... 52
3.3.4.4 Composição monossacarídica ... 53
3.3.5 Atividade anticoagulante das amostras ... 53
3.3.5.1 Ensaio de aPTT, PT e TT ... 54
3.3.5.2 Inibição da trombina mediada pela AT ... 54
3.3.5.3 Inibição da trombina mediada pelo HCII... 55
3.3.6.1 Coleta da água do mar ... 55 3.3.6.2 Obtenção dos dados de precipitação pluviométrica e insolação ... 56 3.3.6.3 Determinação da salinidade e temperatura da água do mar ... 56 3.3.6.4 Determinação de outros parâmetros ambientais ... 56
3.3.7 Análise estatística ... 57 4 RESULTADOS ... 59 4.1 Parte I: Análise das possíveis mudanças na composição química/atividade anticoagulante de ERPS da alga C. cupressoides de acordo com o período de coleta ... 59 4.1.1 Rendimento da extração dos ERPS da alga C. cupressoides ... 59 4.1.2 Perfil eletroforético dos ERPS da alga C. cupressoides ... 60 4.1.3 Composição química dos ERPS da alga C. cupressoides ... 61 4.1.4 Atividade anticoagulante dos ERPS da alga C. cupressoides ... 62 4.1.5 Parâmetros ambientais do local de coleta ... 63 4.1.6 Correlações entre o rendimento, composição química e atividade anticoagulante dos ERPS da C. cupressoides e os parâmetros ambientais do local de coleta ... 64 4.2 Parte II: Purificação, caracterização e atividade anticoagulante de PS purificados da alga C. cupressoides ... 68 4.2.1 Obtenção das frações polissacarídicas da alga C. cupressoides ... 68 4.2.2 Atividade anticoagulante das frações polissacarídicas da alga C. cupressoides69 4.2.3 Purificação da fração CCB-0.5 da alga C. cupressoides ... 70 4.2.4 Eletroforese em gel de agarose dos PS FI e FII da alga C. cupressoides ... 71 4.2.5 Composição química do ERPS, da fração CCB-0.5 e dos PS purificados FI e FII da alga C. cupressoides ... 72 4.2.6 Atividade anticoagulante do ERPS, da fração CCB-0.5 e dos PS purificados FI e FII da alga C. cupressoides ... 74 4.3 Parte III: Análise das possíveis mudanças na composição química/atividade anticoagulante de ERPS de outras algas verdes de acordo com o período de coleta ...78 4.3.1 Rendimento anual e análises químicas dos ERPS das algas verdes ... 78 4.3.2 Perfil eletroforético dos ERPS das algas verdes ... 79 4.3.3 Composição química dos ERPS das algas verdes ... 80
dos ERPS das algas verdes e os parâmetros ambientais do local de coleta ... 84 5 DISCUSSÃO ... 94 5.1 Parte I: Análise das possíveis mudanças na composição química/atividade anticoagulante de ERPS da alga C. cupressoides de acordo com o período de coleta ... 94 5.2 Parte II: Purificação, caracterização e atividade anticoagulante dos PS purificados da alga C. cupressoides ... 98 5.3 Parte III: Análise das possíveis mudanças na composição química/atividade anticoagulante de ERPS de outras algas verdes de acordo com o período de coleta ...103 6 CONCLUSÕES ... 110 REFERÊNCIAS ... 112 APÊNDICE ... 126
Mariana Santana S. P. da Costa Programa de Pós-Graduação em Bioquímica 1 INTRODUÇÃO
Os oceanos cobrem mais de 70% da superfície terrestre e são habitados por uma enorme variedade de seres vivos. Fazem parte desse universo as macroalgas marinhas que são importantes para a manutenção da estabilidade do ecossistema, pois suas comunidades produzem nutrientes necessários para reprodução de outros organismos (PINTO et al., 2002). Além disso, presume-se que por viverem num ambiente tão hostil, com características únicas, como o ambiente marinho, são capazes de sintetizar uma diversidade de compostos bioativos com interesse para a humanidade (RAJAPAKSE; KIM, 2011).
Dentre estes biopolímeros, destacam-se os polissacarídeos, os quais possuem grande importância para as indústrias alimentícia, cosmética e farmacêutica (AHMED et al., 2014), como o ágar, carragenana e alginatos, que são bastantes utilizados comercialmente devido a sua viscosidade e suas propriedades emulsificante e gelificante (CARDOZO, 2007). Destacam-se também outros tipos de polissacarídeos, como fucanas, fucoidans e diferentes tipos de homo e heteropolissacarídeos sulfatados, que ainda não são utilizados comercialmente de forma correspondente ao seu potencial, mas apresentam um grande apelo econômico devido ao elevado número de atividades farmacológicas que possuem (NGO; KIM, 2013; JIAO et al., 2011).
1.1 Polissacarídeos sulfatados de algas marinhas
Por definição os PS são polímeros formados por unidades repetidas de açúcares e carregados negativamente devido a presença do grupo sulfato (CARVALHO; GAMA, 2015), estes podem ocorrer na forma de homopolissacarídeos ou heteropolissacarídeo, dependendo se é formado por um ou por mais de dois monossaccarídeos diferentes, respectivamente (ROCHA, 2006).
Nas algas marinhas, estes PS se localizam na matriz mucilaginosa e sua função biológica, nesses seres, ainda não está bem esclarecida, porém, devido ao seu caráter altamente higroscópico, acredita-se que protejam a alga da desidratação quando esta é submetida a longos períodos de exposição ao sol durante as marés baixas. A natureza mucilaginosa destes compostos, também parece contribuir para tornar a alga flexível o bastante para crescer em ambiente líquido e rígida o suficiente
Mariana Santana S. P. da Costa Programa de Pós-Graduação em Bioquímica para permanecer estendida, e assim, melhor captar a luz e os nutrientes existentes (PERCIVAL; MCDOWELL, 1967).
Os PS de algas apresentam estruturas bastante diversas, variando de espécie para espécie e, às vezes, em diferentes partes da mesma alga (DIETRICH et al., 1995; ALVES, 2000). A seguir, serão descritos os principais dados da literatura relacionados com a composição e atividades farmacológicas atribuídas a PS de algas verdes, uma vez, que as espécies estudadas nesta tese fazem parte deste grupo.
1.2 Polissacarídeos sulfatados de algas verdes
De acordo com Wang e colaboradores (2014) cerca de 40 espécies de algas verdes, pertencentes a oito famílias, foram globalmente usadas para extrair PS. Os grupos com o maior número de espécies das quais PS foram extraídos e estudados incluem os gêneros Ulva (38%), Enteromorpha (14%), Monostroma (14%), Codium (16%) e Caulerpa (11%). Outros gêneros, inclui Capsosiphon, Chaetomorpha,
Bryopsis e Halimeda (7%) (Figura 1).
Figura 1 - Gêneros de algas verdes utilizados como matérias básicas para se extrair polissacarídeos sulfatados.
Fonte: Adaptado de WANG et al., 2014.
Os principais polissacarídeos encontrados na Ordem Ulvales, em especial nas de espécies do gênero Ulva e Enteromorpha, são as ulvanas, as quais possuem como principais constituintes sulfato, ramnose, xilose e ácido glucorônico ou idurônico (LAHAYE; ROBIC, 2007; JIAO et al., 2011; WANG et al., 2014). Estes polímeros sulfatados são um dos principais constituintes da parede celular dessas algas e
Mariana Santana S. P. da Costa Programa de Pós-Graduação em Bioquímica juntamente com a celulose, xiloglucanas e glucuronanas representam em torno de 38 - 54% do peso seco da alga (LAHAYE; ROBIC, 2007). A distribuição e associações destes polissacarídeos na parede celular da Ulva é descrito esquematicamente no modelo apresentado na Figura 2.
Figura 2 - Polissacarídeos encontrados na parede celular de algas da ordem Ulvales.
Fonte: Adaptado de LAHAYE; ROBIC, 2007.
Já as espécies do gênero Codium sintetizam arabinanas e arabinogalactanas sulfatadas e, principalmente, galactanas sulfatadas, no entanto, estes polímeros são mais heterogêneos e complexos do que as galactanas sulfatadas sintetizadas por algas vermelhas (WANG et al., 2014). Por exemplo, da alga Codium isthmocladum purificou-se uma galactana sulfatada composta preponderantemente de unidades -3)-β-D-galactopiranose-(1-, sendo a maioria delas sulfatada em C4, esta galactana ainda possue menores quantidades de unidades -3)β-D-galactopiranose(4,6-di-O-(SO4 )-(1, ramificações -6)β-D-galactopiranose(4-mono-O-(SO4)-(1- e uma substituição característica dos terminais não redutores, o resíduo 3,4-O-(1’-carboxi)-etilideno, cetal cíclico com cinco membros (FARIAS, 2011). Outra galactana sulfatada, também extraída de C. isthmocladum é formada por β-D-galactopiranoses unidas por ligações β-1,6 (predominante) e β-1,3. Alguns resíduos de galactoses apresentam sulfatação em C4 ou em C6, e algumas galactoses em posição não redutora apresentam piruvatação na forma de 3,4-O-(1’-carboxi)-etilideno, cetal cíclico com cinco membros (SABRY, 2010). Como exemplos de algas desse gênero que sintetizam outros PS que não galactanas tem-se a alga C. dwarkense, de onde foram extraídas
Mariana Santana S. P. da Costa Programa de Pós-Graduação em Bioquímica arabinogalactanas sulfatadas (SIDDHANTA et al., 1999) e a C. latum de onde se obteve arabinanas sulfatadas (UEHARA; TAKESHITA; MAEDA, 1992).
Os PS extraídos de espécies do gênero Caulerpa são mais heterogêneos do que as espécies de algas das famílias Codiaceae e Ulvaceae. Estes heteropolissacarídeos são constituídos por diferentes monossacarídeos, sendo a galactose o açúcar principal e xilose, glicose, arabinose e manose os outros componentes comuns (WANG et al., 2014). Este fato pode ser observado com os PS
da C. racemosa, a qual sintetiza uma xiloarabinogalactana sulfatada
(CHATTOPADHYAY et al., 2007) e para PS de duas espécies de Caulerpa que vem sendo estudadas pelo grupo de pesquisa a qual está inserida esta tese, a C.
cupressoides var. flabellata (COSTA et al., 2012) e C. prolifera (CÂMARA, 2015),
ambas apresentam galactose como principal monossacarídeo, no entanto, as frações polissacarídicas obtidas dessas algas também apresentam outros monossacarídeos como: glicose, xilose, manose e fucose. Mas isso não é uma regra, pois a C.
sertularioides, estudada por Shevchenko e colaboradores (2009), sintetiza uma
homogalactana sulfatada que é composta por unidades de -3)β-D-galactopiranose-(1- e -6)β-D-galactopiranose-(1- sulfatada em C2.
Por fim, do gênero Monostroma obtem-se predominantemente ramnanas sulfatadas. Harada e Maeda (1998) extraíram da Monostroma nitidum uma ramnana sulfada, constituída por resíduos de L-ramnose α-(1→3) ligados, alguns dos quais
foram substituídos com grupos sulfato, principalmente, na posição O-2. Já da M.
latissimum obteve-se uma ramnana sulfatada com resíduos α-(1→3)- e
α-(1→2)-ligados, com sulfatação na posição 3 dos resíduos α-(1→2)-ligados (LEE et al., 1998). Diversas atividades farmacológicas vêm sendo atribuídas aos polissacarídeos sulfatados de algas verdes. A Tabela 1 sumariza algumas destas atividades.
Mariana Santana S. P. da Costa Programa de Pós-Graduação em Bioquímica Tabela 1 - Atividades farmacológicas atribuídas aos polissacarídeos sulfatados extraídos de algas marinhas verdes.
ATIVIDADE ALGA REFERÊNCIA
Antiadesiva Ulva rotundata GADENNE et al., 2013
Antiadipogênica Caulerpa prolifera CAMARA, 2015
Antiangiogênica Codium cylindricum MATSUBARA et al., 2003
Antimicrobiana Caulerpa racemosa PIRES et al., 2013
Antinociceptiva Caulerpa cupressoides Caulerpa racemosa Codium isthmocladum RODRIGUES et al., 2012 RIBEIRO et al., 2014 CORDEIRO, 2013 Antioxidante Caulerpa cupressoides Caulerpa prolifera Caulerpa sertularioides Codium isthmocladum Enteromorpha linza Enteromorpha prolifera Ulva fasciata Ulva pertusa COSTA et al., 2012 CAMARA, 2015 COSTA et al., 2010 COSTA et al., 2010 WANG et al., 2013 LI et al., 2013 SHAO et al., 2013 QI et al., 2005 Antitumoral Caulerpa racemosa Enteromorpha intestinalis Monostroma nitidum Ulva lactuca Ulva fasciata JI et al., 2008 JIAO et al., 2009 KARNJANAPRATUM; YOU, 2011 KAEFFER et al., 1999 SHAO et al., 2013 Imunomodulatória /anti-inflamatória Capsosiphon fulvescens Caulerpa lentillifera Caulerpa racemosa Caulerpa cupressoides Codium fragile Monostroma nitidum Ulva rigida NA et al., 2010 MAEDA et al, 2012 RIBEIRO et al., 2014 RODRIGUES et al., 2012
LEE et al., 2010a
KARNJANAPRATUM; YOU, 2011 LEIRO et al., 2007
Mariana Santana S. P. da Costa Programa de Pós-Graduação em Bioquímica Antiviral Caulerpa racemosa Gayralia oxysperma Monostroma latissimum Monostroma nitidum
GHOSH et al., 2004;PUJOL et al., 2012
CASSOLATO et al., 2008 LEE et al., 1999 LEE et al., 2010b
Fonte: Autoria própria
1.3 Atividade anticoagulante de polissacarídeos sulfatados de algas verdes 1.3.1 Coagulação sanguínea x anticoagulantes
O entendimento sobre a bioquímica do processo de coagulação sanguínea iniciou-se na década de 40, quando Paul Owren (1947) reconheceu que a diatese hemorrágica, tendência a sangramento sem causa aparente, em uma jovem não poderia ser explicado pelo conceito de 4 fatores de coagulação vigente na época, sugerindo que ela teria perdido um quinto fator de coagulação de seu plasma.
Estudos sobre o processo de coagulação foram sendo ampliados ao longo das décadas de 40 e 50 e vários outros fatores de coagulação foram sendo descobertos; e estes fatores foram designados por algarismos romanos de acordo com sua sequência de descoberta (RIDDEL et al., 2007; VINE, 2009).
No entanto, somente na década de 60 foi que se tornou claro como estes múltiplos fatores interagem para converter a protrombina em trombina, resultando na formação de um coágulo de fibrina. Estudos realizados por dois grupos independentes de bioquímicos (o grupo de Macfarlane e o de Davie e Ratnoff) em 1964 investigaram como estes múltiplos fatores interagiam e propuseram um modelo “cascata” e “cachoeira” de coagulação, respectivamente. Em ambos os casos o processo de coagulação se dava numa série de passos em que a ativação de cada um dos fatores de coagulação leva à ativação de um outro, culminando na formação de trombina (RIDDEL et al., 2007).
De acordo com estes modelos o mecanismo de coagulação é dividido inicialmente em duas vias: via intrínseca, assim chamada porque todos os componentes estão presentes no sangue; e via extrínseca, em que a proteína da membrana das células subendoteliais, o fator tecidual (FT), é necessária, além de componentes circulantes (Figura 3).
Mariana Santana S. P. da Costa Programa de Pós-Graduação em Bioquímica A via extrínseca é desencadeada pela formação do complexo Fator Tecidual (FT): Fator VIIa (FVIIa) que resulta na ativação do fator X. Já a via intrínseca é iniciada pela ativação do fator XII (FXII), quando o sangue entra em contato com qualquer superfície contendo cargas negativas (ativação por contato), este processo requer ainda a presença de outros componentes do plasma: pré-calicreína (uma serino-protease) e cininogênio de alto peso molecular (um cofator não enzimático). O fator XII ativo (FXIIa), desencadeia uma série de ativações proteicas, que culmina na ativação do fator X (VINE, 2009).
O ponto de convergência das vias extrínseca e intrínseca é conhecido como via comum da coagulação e é caracterizada pela ativação de fibrinogênio à fibrina pela trombina, formando uma malha de fibrina que vai ser estabilizada pelo fator XIIIa (FERREIRA et al., 2010).
Figura 3 - Modelo clássico de coagulação sanguínea. HMWK – cininogênio de alto peso molecular.
Mariana Santana S. P. da Costa Programa de Pós-Graduação em Bioquímica Embora o modelo de cascata da coagulação descreva as interações bioquímicas dos fatores de coagulação e tenha sido um avanço significativo no entendimento da coagulação, observações experimentais e clínicas demonstraram que a hipótese da cascata não reflete completamente os eventos da hemostasia in
vivo. Por isto, um novo modelo de coagulação foi proposto e denominado de modelo
celular de coagulação ou modelo da coagulação com base na superfície celular (Figura 4).
Figura 4 - Modelo de coagulação baseado em superfícies celulares. Representação do modelo da coagulação baseado em superfícies celulares compreendendo as fases de iniciação, amplificação e propagação. FT – Fator tecidual, a – ativado, FvW – Fator de von Willebrand).
Fonte: Adaptado de FERREIRA et al., 2010.
Este modelo enfatiza a interação entre os fatores solúveis, a membrana celular e a célula, todos são considerados elementos essenciais para o processo de coagulação. O novo modelo realça a importância de um complexo TF/FVIIIa na fase de ativação do sistema e propõe a ativação do processo de coagulação sobre
Mariana Santana S. P. da Costa Programa de Pós-Graduação em Bioquímica diferentes superfícies celulares em quatro fases que se sobrepõem: iniciação, amplificação, propagação e finalização (VINE et al., 2009; FERREIRA et al., 2010). Estas fases estão resumidas na Tabela 2.
Tabela 2 - Resumo do atual modelo de coagulação baseado em superfícies celulares.
Fases da coagulação
Iniciação Amplificação Propagação Finalização
Endotélio vascular e células sanguíneas circulantes são perturbados; Interação do FVIIa derivado do plasma com o FT. Trombina ativa plaquetas, cofatores V e VII, e fator XI na superfície das plaquetas. Produção de grande quantidade de trombina, formação de um tampão estável no sítio da lesão e interrupção da perda sanguínea. Processo da coagulação é limitado para evitar a
oclusão trombótica ao redor das áreas íntegras dos vasos.
Fonte: FERREIRA et al., 2010.
A coagulação sanguínea é controlada por anticoagulantes que sob condições normais prevalecem sobre as forças procoagulantes (DAHLBACK; VILLOUTREIX, 2005). As reações bioquímicas da coagulação devem ser reguladas para evitar a ativação excessiva, formação inadequada de fibrina e a oclusão vascular. Os inibidores fisiológicos da coagulação (anticoagulantes naturais) de maior relevância fisiológica são a AT, também chamada de antitrombina III pela literatura mais antiga; TFPI (inibidor da via do fator tecidual); proteína C e proteína S (KUBIER; O’BRIEN, 2012).
Anticoagulantes têm sido amplamente utilizados para o tratamento de sangue durante diálises e cirurgias; como fármacos em várias doenças, como coagulação intravascular disseminada e trombose; e para testes sanguíneos in vitro (WANG et al., 2010).
O principal fármaco anticoagulante, usado há mais de 80 anos, é a heparina, um polissacarídeo sulfatado de origem animal, extraído de intestino de suínos e pulmão de bovinos, constituído por unidades dissacarídicas repetitivas, onde um dos resíduos é uma hexosamina (glucosamina); e o outro, um ácido urônico (L-idurônico e D-glucurônico), a sulfatação pode ocorrer em vários pontos da molécula (NADER et al., 2004). No entanto, o uso deste composto pode provocar algumas reações adversas, como trombocitopenia decorrente do seu uso prolongado (FABRIS et al.,
Mariana Santana S. P. da Costa Programa de Pós-Graduação em Bioquímica 2000) e efeito hemorrágico residual, apresentado por fragmentos da heparina sem atividade anticoagulante (NADER et al., 1979; 2004). Heparinas de baixo peso molecular, obtidas a partir de hidrólise da heparina não fracionada também são utilizadas como anticoagulante. A enoxaparina (que pode ter como nome comercial Clexane®), é uma das heparinas de baixo peso molecular mais utilizada em uma ampla variedade de doenças tromboembólicas e tem várias vantagens sobre a heparina não fracionada (IQBAL; COHEN, 2011). No entanto, quadros de hemarragias ainda são comuns em pacientes que fazem uso deste medicamento (CROWTHER; WARKENTIN, 2008; NEVIASER et al., 2010).
Portanto, se faz necessário a busca por novos compostos anticoagulantes, que apresentem menos reações adversas e que possam vir a substituir a heparina e/ou as heparinas de baixo peso molecular, ou os seus usos em algumas situações específicas.
1.3.2 Polissacarídeos sulfatados anticoagulantes de algas marinhas
Os PS de algas marinhas têm uma grande variedade de atividades biológicas, mas a sua ação anticoagulante é a mais amplamente estudada (WANG et al., 2014).
Apesar do modelo de coagulação sanguínea em “cascata” (Figura 3, página 28) ter sido considerado inadequada do ponto vista fisiológico, a divisão do processo de coagulação em vias, como propõem este modelo, ainda é utilizado para interpretação de testes laboratoriais que avaliam a coagulação sanguínea. Por conseguinte, a atividade anticoagulante dos PS é geralmente avaliada por esses testes, como: tempo de protrombina (PT) e tempo de tromboplastina parcial ativada (aPTT), que avaliam se o polissacarídeo age nas vias extrínseca e intrínseca da coagulação, respectivamente; e pelo tempo de trombina (TT), que é o teste para a via comum da coagulação, que avalia a formação de fibrina mediada por trombina (CIANCIA; QUINTANA; CEREZO, 2010).
A ação anticoagulante dos polissacarídeos sulfatados reside, principalmente, na potencialização dos inibidores naturais das proteases (trombina e fator Xa) do plasma: antitrombina (AT) e cofator II da heparina (HCII). Esses PS podem agir por dois mecanismos distintos: induzindo a mudança alostérica nas serpinas (AT e HCII) ou a cadeia do PS pode atuar como uma ''ponte'', aproximando a protease à serpina (NADER et al., 2004; CIANCIA; QUINTANA; CEREZO, 2010). No entanto, há casos
Mariana Santana S. P. da Costa Programa de Pós-Graduação em Bioquímica de PS que exibem um efeito anticoagulante independente de serpinas, por exemplo, inibindo diretamente a atividade da trombina (MATSUBARA et al., 2001; MAO et al., 2006). O mecanismo de ação dos PS sob as proteases trombina e fator Xa pode ser avaliado por testes in vitro utilizando substratos cromogênicos na presença ou ausência de serpinas (CIANCIA; QUINTANA; CEREZO, 2010).
A Figura 5 sumariza os mecanismos de ação anticoagulante dos PS de algas marinhas.
Figura 5 - Mecanismos de ação anticoagulante dos polissacarídeos sulfatados de algas marinhas. PS – polissacarídeo sulfatado, X – fator X inativo, Xa – fator X ativo, Va – fator V ativo, AT – antitrombina, HCII – cofator II da heparina, TFPI – inibidor da via do fator tecidual, HS – heparan sulfato.
Fonte: Adaptado de Costa (2012).
Em 1936 foi feito o primeiro relato de um PS de alga anticoagulante, uma galactana sulfatada extraída da alga vermelha Iridaea laminarioides (CHARGAFF; BANCROFT; STANLEY-BROWN, 1936). A partir de então, foi crescente o interesse em se estudar polissacarídeos sulfatados anticoagulantes de algas marinhas. Sendo os mais bem estudados, os extraídos das algas marrons (ALBUQUERQUE et al., 2004; SILVA et al., 2005; ATHUKORALA et al., 2007; MEDEIROS et al., 2008; AZEVEDO et al., 2009) e vermelhas (FARIAS et al., 2000; ROCHA et al., 2006; FONSECA et al., 2008; ALVES, 2015).
Apesar de o primeiro relato de polissacarídeos sulfatados anticoagulantes de algas marinhas ter sido feito em 1936 (CHARGAFF; BANCROFT; STANLEY-BROWN,
Mariana Santana S. P. da Costa Programa de Pós-Graduação em Bioquímica 1936), só em 1985 verificou-se a presença de polissacarídeos sulfatados com atividade anticoagulante em algas verdes (DEACON-SMITH; LEE-POTTER; ROGERS, 1985).
Dentre as algas verdes, o gênero Codium é aquele que tem o maior número de espécies com PS extraídos e avaliados quanto ao seu potencial anticoagulante.
Dentre as espécies de Codiaceae, a alga Codium fragile foi a que teve seus polissacarídeos sulfatados anticoagulantes mais estudados, sendo extraídos por metodologias diferentes por 4 grupos de pesquisadores (JURD et al., 1995; HAYAKAWA et al. 2000; CIANCIA et al., 2007; ATHUKORALA et al., 2007), o que proporcionou a obtenção de polímeros diferentes da mesma alga. Apesar de terem sido obtidos através de métodos de extração distintos os PS obtidos apresentaram mecanismo de ação anticoagulante similar, que foi a inibição da trombina, via potencialização da ação HCII e da atividade da AT (JURD et al., 1995; HAYAKAWA et al., 2000). Posteriormente em 2007, Ciancia e colaboradores e Athukorala e colaboradores avaliaram a atividade anticoagulante dos PS da C. fragile pelos ensaios anticoagulantes de aPTT, PT e TT; e verificaram que estes polímeros foram capazes de prolongar o tempo de coagulação apenas nos ensaios de aPTT e TT, indicando que agem na via intrínseca e/ou comum da coagulação (CIANCIA et al., 2007; ATHUKORALA et al., 2007).
Das algas C. divaricatum, C. adhaerence e C. latum foram extraídos PS ricos em arabinose que possuem a capacidade de inibição da trombina, via potencialização da ação HCII e da atividade da AT. Estes autores também verificaram que os PS destas algas eram capazes de interagir com o HCII em sítios distintos de onde interage a heparina e o dermatan sulfato (HAYAKAWA et al., 2000).
Da alga Codium dwarkense foram purificadas por troca iônica, seguida por gel filtração, arabinanas sulfatadas e arabinogalactanas sulfatadas, as quais apresentaram excelente atividade nos diversos ensaios anticoagulante in vitro (aPTT, PT e TT) (SIDDHANTA et al., 1999). Posteriormente, um outro PS, rico em galactose e arabinose, foi obtido desta mesma alga e apresentou atividade anticoagulante pelo teste de PT. Vale salientar que neste trabalho este foi o único teste anticoagulante realizado (SHANMUGAM et al., 2002).
Extratos de PS das algas C. indicum, C. tomentosum e C. geppi também foram avaliados por Shanmugam e colaboradores (2002) e como os da C. dwarkense,
Mariana Santana S. P. da Costa Programa de Pós-Graduação em Bioquímica também apresentaram excelente atividade nos ensaios de PT (SHANMUGAM et al., 2002). Contudo, os estudos com os PS dessas algas como agentes anticoagulantes não foi continuado.
Matsubara e colaboradores (2001) demonstram que um PS rico em galactose e com pequenas quantidades de glicose de C. cylindricum apresentou atividade nos testes aPTT e TT, porém não teve atividade no teste de PT. Quando estes autores analisaram o mecanismo de ação deste polímero, verificaram que o mesmo não teve a capacidade de potencializar as serpinas AT e HCII e por isto os autores sugeriram que o mecanismo de ação deste polímero é diretamente inibindo a polimerização da fibrina ou inibindo a via intrínseca da coagulação sem agir na AT (MATSUBARA et al., 2001). Contudo, os autores não apresentaram resultados que confirmasse ou refutassem nenhumas dessas duas hipóteses.
Outra espécie estudada foi a Codium vermilara, que teve polissacarídeos sulfatados anticoagulantes ativos nos testes de aPTT e TT, porém estes não apresentaram atividade no ensaio de PT (CIANCIA et al., 2007). Neste caso, o mecanismo de ação do PS não foi avaliado.
Já da alga Codium isthmocladum foram obtidas frações ricas em galactose, manose e arabinose e sulfato que apresentaram atividade pelo ensaio de aPTT, porém não apresentaram atividade quando submetidas ao teste de PT, uma destas frações foi purificada por cromatografia de troca iônica, obtendo-se uma galactana sulfatada também com potente ação anticoagulante pelo teste de aPTT (FARIAS, 2006).
O segundo gênero de algas verdes mais estudado em relação a PS anticoagulantes é o gênero Monostroma. Uma atividade relativamente alta em inibir a trombina foi encontrada para extratos de PS de M. nitidum (MAEDA et al., 1991). Um polissacarídeo ativo destes extratos foi purificado por cromatografia de troca iônica e gel filtração, obtendo-se um homopolissacarídeo (ramnana sulfatada), que foi capaz de inibir a trombina de forma seis vezes mais potente que a heparina (HARADA; MAEDA, 1998). Posteriormente, dois polissacarídeos sulfatados ricos em ramnose, com pequenas quantidades de glicose e xilose, foram obtidos desta mesma alga por Mao e colaboradores (2008), os mesmos apresentaram alta atividade anticoagulante pelos testes de aPTT e TT e foram potentes inibidores da trombina mediado pelo HCII.
Mariana Santana S. P. da Costa Programa de Pós-Graduação em Bioquímica Estes PS também aceleraram a inibição da trombina e do factor Xa pela potenciação AT, mas com menor eficácia.
Uma ramnana sulfatada anticoagulante também foi encontrada na alga M.
latissimum, este PS é formado por resíduos de ramnose 1,3- e 1,2-ligados, numa
razão de 3:2, o sulfato encontra-se, principalmente, na posição C3 ou C4 dos resíduos de ramnose 1,2-ligados (LEE et al., 1998).
Zhang e colaboradores (2008) extraíram desta mesma alga outra ramnana, no caso uma heteroramanana sulfatada com massa molecular de 725,4 kDa, e este foi fragmentado por degradação com H2O2 em 5 fragmentos com massa molecular de 216,4; 123,7; 61,9; 26,0 e 10,6 kDa. Estes fragmentos apresentaram composição e estrutura química similares entre si, sendo também ricos em ramnose. Os mesmos tiveram atividade anticoagulante pelos testes de aPTT e TT. Os dados mais relevantes desses autores foi demonstrar que os fragmentos de maior massa molecular possuíam maior atividade anticoagulante em comparação com os de menor massa molecular. Este foi um dos primeiros artigos que mostrou com correlação entre a massa molecular de PS de algas verdes e atividade anticoagulante.
Nos anos seguintes, não houve mais referências a essa ramnana de alta massa molecular, e este mesmo grupo de pesquisa passou a publicar trabalhos com ramnanas de massa molecular menor extraídas de M. latissimum. Para tal, o grupo submeteu extratos aquosos obtidos de M. latissimum a cromatografia de troca iônica e obteve três frações de PS, as quais foram eluídas com 0,5; 2,0 e 3,0 M de NaCl (MAO et al., 2009; LI et al., 2011). No primeiro trabalho do grupo a fração obtida com 0,5 M de NaCl foi submetida a cromatografia de gel filtração e assim obteve-se uma ramnana sulfatada de 55 kDa, composta principalmente por resíduos de L-ramnose 1,2-ligados sulfatados em C3 e/ou C4, este PS apresentou atividade pelos testes de aPTT e TT, além disso, os autores propuseram que o mecanismo de ação deste PS era promovendo a inibição da trombina mediada pelo HCII (MAO et al., 2009). Apesar da estrutura dessa ramnana se assemelhar com aquela descrita por Lee colaboradores (1998), Mao e colaboradores (2009) não fazem referências a estes. Já no trabalho de Li e colaboradores (2011), da fração de PS obtida com 2,0 M de NaCl, após cromatografia de gel filtração, obteve-se outra ramnana sulfatada, com massa molecular de 513 kDa, formada por resíduos de α-L-ramnose (1→3)-ligados, α-L -ramnose (1→2)-ligados e resíduos de α-L-ramnose (1→2,3)-ligados, em uma razão
Mariana Santana S. P. da Costa Programa de Pós-Graduação em Bioquímica molar de 4:1:1, podendo haver sulfatação em C2 dos resíduos de α-L-ramnose
(1→3)-ligados e em C3 de resíduos de α-L-ramnose (1→2)-ligados. Esta ramnana também
apresentou atividade nos testes de aPTT e PT, de acordo com os autores as ramnanas obtidas foram mais potentes do que PS obtidos por Zhang e colaboradores (2008) e Mao e colaboradores (2009) (LI et al., 2011). No entanto, o mecanismo de ação desta nova ramnana não foi proposto por Li e colaboradores (2011).
Posteriormente, a ramnana sulfatada obtida por Li e colaboradores (2011), a qual tinha massa molecular aproximadamente de 513 kDa, foi degrada por hidrólise ácida e obteve-se um polissacarídeo de baixa massa molecular (aproximadamente 33,6 kDa), formada por resíduos α-L-ramnose 1,3-ligados, sulfatada parcialmente em C2. Este PS também teve a capacidade de prolongar o tempo de coagulação no ensaio de aPTT e foi potente inibidor da trombina mediada pelo HCII (LI et al., 2012). Espécies de Ulva e Enteromorpha também vem tendo seus PS anticoagulantes extraídos e avaliados. Por exemplo, PS ricos em ramnose extraídos da Ulva
conglobata agem inibindo diretamente a trombina ou potencializando a ação do HCII
(MAO et al., 2006). Já da alga E. clathrata foi extraída uma arabinana sulfatada, formada principalmente por resíduos de α-L-ramnopiranose (1→4)-ligados,
parcialmente sulfatados em C3 (QI et al., 2012) e da alga E. linza foram extraídos polissacarídeos ricos em ramnose e xilose (WANG et al. 2013), os polissacarídeos de ambas as espécies tiveramação anticoagulante quando submetidos aos ensaios de aPTT e TT, porém não apresentaram atividade anticoagulante no ensaio de PT, indicando que os mesmos agem na via intrínseca e/ou comum da coagulação.
O interesse por polissacarídeos anticoagulantes de espécies da família Caulerpaceae também vem crescendo nos últimos anos, no entanto, diferente dos trabalhos citados anteriormente para espécies de Monostroma e Codium, a maioria dos trabalhos com espécies de Caulerpa se detem aos testes clássicos de atividade anticoagulante (aPTT, PT e TT), não sendo o mecanismo de ação destes polímeros explorados.
Caulerpa okamurai e Caulerpa brachypus possuem polissacarídeos sulfatados
anticoagulantes, os quais são ricos em galactose e têm um efeito específico na inibição da trombina dependente do HCII (HAYAKAWA et al., 2000).
Costa e colaboradores 2010 estudaram a atividade anticoagulante de extratos ricos em PS de 11 algas marinhas do litoral do Rio Grande do Norte, destas 3 foram
Mariana Santana S. P. da Costa Programa de Pós-Graduação em Bioquímica Caulerpaceae (Caulerpa cupressoides var. flabellata, Caulerpa prolifera e Caulerpa
sertularioides). Todos os extratos obtidos das algas verdes apresentaram atividade
anticoagulante pelo teste de aPTT, e, interessantemente, das 11 espécies estudadas, o extrato da C. cupressoides foi o único que teve a capacidade de prolongar o tempo de coagulação no teste de PT (COSTA et al., 2010). Posteriormente, o extrato rico em polissacarídeos de C. cupressoides foi fracionado e se obteve quatro frações ricas em galactose denominadas de CCB-0.3, CCB-0.5, CCB-1.0 e CCB-2.0 todas apresentaram atividade pelos testes de aPTT e PT de maneira dose-dependente, além disso CCB-0.3, CCB-0.5 apresentaram atividade semelhante a Clexane®, uma heparina de baixo peso molecular comercial (COSTA et al., 2012).
Um grupo do estado do Ceará também vem trabalhando com polissacarídeos sulfatados anticoagulantes de C. cupressoides, porém da variedade lycopodium. Dessa alga obteve-se um polissacarídeo anticoagulante por cromatografia de troca iônica, seguida por gel filtração, com potente ação anticoagulante pelo teste de aPPT, o qual age inibindo a trombina na presença da AT (RODRIGUES et al. 2011a; RODRIGUES et al. 2011b).
Recentemente, a atividade anticoagulantes de extratos de PS de mais 3 espécies de algas verdes (Penicillus capitatus, Udotea flabellum e Halimeda opuntia) foi avaliada. Todos os extratos são formados por heteropolissacarídeos sulfatados e tiveram atividade anticoagulante pelos testes de aPTT e TT, no entanto, não tiveram a capacidade de prolongar o tempo de coagulação no ensaio de PT. O extrato da P.
capitatus foi purificado e observou-se que a fração denominada de F1 também teve
atividade pelos testes de aPTT e TT e foi capaz de inibir a formação de fibrina (ARATA et al., 2015).
A Tabela 3 sumariza os dados descritos acima a respeito da atividade anticoagulante de PS de algas verdes.
Mariana Santana S. P. da Costa Programa de Pós-Graduação em Bioquímica Tabela 03 - Polissacarídeos sulfatados de algas verdes com atividade anticoagulante.
Família Espécie Composição química aPTT PT TT ATa HCIIb IIac Ref.d
Cod ia c e a e C. adhaerence xiloglucoarabinana nd nd nd + + - 1 C. cylindricum glucogalactana + - + - - + 2 C. divaricatum xiloglucoarabinana nd nd nd + + - 1 C. dwarkense arabinana/ arabinogalactana galactoarabinana + nd + + + nd nd nd nd nd nd nd 3 15 C. fragile nd xiloarabinana glucoarabinogalactomanana nd + nd + + - nd - - + nd + + + + nd nd + + nd nd - - nd nd 4 1 5 16 C. geppi nd nd + nd nd nd nd 15 C. isthmocladum arabinomanogalactanas / galactanas + - nd nd nd nd 6 C. indicum nd nd + nd nd nd nd 15 C. latum arabinana arabinana nd nd nd nd nd nd nd + nd + + - 7 1 C. pugniformes galactoarabinoglucana + - + + - + 17 C. tomentosum galactoarabinana nd + nd nd nd nd 15 C. vermilara glucoarabinogalactomanana + - + nd nd nd 5 Cau le rp a c e a e C. brachypus galactana nd nd nd - + - 1 C. cupressoides var. flabellata xiloglucomanogalactanas / manogalactanas + + nd nd nd nd 20 C. cupressoides var. lycopodium nd nd + nd - nd nd nd nd + nd nd nd nd 22 21 C. prolifera nd + - nd nd nd nd 23 C. sertularioides nd + - nd nd nd nd 23 C. okamurai manoxilogalactana nd nd nd - + - 1 H a limed a c e a e H. opuntia glucomanogalactanas + - + nd nd nd 26
Mariana Santana S. P. da Costa Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
1 - HAYAKAWA et al., 2000. 2 - MATSUBARA et al., 2001. 3 - SIDDHANTA et al., 1999. 4 - JURD et al., 1995. 5 - CIANCIA et al., 2007. 6 - FARIAS, 2006. 7 – UEHARA; TAKESHITA; MAEDA, 1992. 8 - LEE et al., 1998. 9 - ZHANG et al., 2008. 10 - MAO et al., 2009. 11 - MAEDA et al., 1991. 12 - HARADA; MAEDA, 1998. 13 - MAO et al., 2008. 14 – MAO et al., 2006. 15 - SHANMUGAN et al., 2002. 16 - ATHUKORALA et al., 2007. 17 - MATSUBARA et al., 2000. 18 – QI et al., 2012. 19 – WANG et al., 2013. 20 – COSTA et al., 2012. 21 – RODRIGUES et al., 2011a. 22 – RODRIGUES et al., 2011b. 23 – COSTA et al., 2010. 24 – LI et al., 2011. 25 – LI et al., 2012. 26 – ARATA et al., 2015. a Inibição da trombina via AT; b Inibição da trombina via HCII; c Inibição direta
da trombina; d Referências. + apresenta atividade, - não apresenta atividade, nd – não determinado
Fonte: Autoria própria.
A partir dos dados sumarizados na Tabela 3 observa-se que todos os PS que foram avaliados pelo teste de aPTT e TT tiveram atividade anticoagulante. Além disso, quando se observa os dados do teste de PT, dos 26 PS que foram avaliados por este teste apenas 6, em sua maioria do gênero Codiaceae, tiveram atividade. Isso leva a propor que, com poucas exceções, a via de ação PS anticoagulantes de algas verdes se dá na via íntriseca e comum da cascata de coagulação. Ainda, pode-se perceber que esses PS são potentes inibidores da trombina, principalmente, via serpinas HCII e AT, visto que quando avaliados em testes específicos de inibição desta protease
M o n o s tro m a ta c e a e M. latissimum ramnana glucuronoglucoxiloramnana xiloglucoramnana xiloglucoramnana ramnana ramnana nd nd + + + + nd nd - - - nd nd nd + + + nd nd + nd + nd + nd + nd + nd + + - nd - nd - 8 1 9 10 24 25 M. nitidum glucuronoglucoramnana ramnana glucuronoglucoxiloramnana sulfatada xilogalactoglucoramnana manoxiloglucoramnana nd nd nd + + nd nd nd - - nd nd nd + + nd nd + + + nd nd + + + + + - + + 11 12 1 13 13 Ulv a c e a e U. conglobata glucofucoramanas + nd nd + + + 14 E. clathrata arabinana + - + nd nd nd 18 E. linza xiloarabinana + - + nd nd nd 19 Udo te a c e a e P. capitatus glucogalactanas / galactoglucanas + - + nd nd nd 26 U. flabellum glucogalactanas + - + nd nd nd 26
