Dinâmica evolutiva do DNAr em cromossomos de peixes da família Eleotridae e revisão citogenética da ordem gobiiformes (Osteichthyes, Teleostei)

(1)

DINÂMICA EVOLUTIVA DO DNAr EM CROMOSSOMOS DE PEIXES

DA FAMÍLIA ELEOTRIDAE E REVISÃO CITOGENÉTICA DA

ORDEM GOBIIFORMES(OSTEICHTHYES, TELEOSTEI)

SIMIÃO ALEFE SOARES DA SILVA

________________________________________________

Dissertação de Mestrado

Natal/RN, Fevereiro de 2019

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM SISTEMÁTICA E EVOLUÇÃO

DINÂMICA EVOLUTIVA DO DNAr EM CROMOSSOMOS DE PEIXES DA FAMÍLIA ELEOTRIDAE E REVISÃO CITOGENÉTICA DA ORDEM GOBIIFORMES

(OSTEICHTHYES,TELEOSTEI)

Simião Alefe Soares da Silva

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Sistemática e Evolução da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Sistemática e Evolução.

Orientador: Dr. Wagner Franco Molina

Co-Orientador: Dr. Paulo Augusto de Lima Filho

Natal/RN 2019

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CDU 575:597.2/.5 RN/UF/BCZM

1. Evolução cromossômica - Dissertação. 2. Diversificação cariotípica - Dissertação. 3. Rearranjos cromossômicos - Dissertação. 4. DNAr - Dissertação. 5. Microssatélites -

Dissertação. I. Lima Filho, Paulo Augusto de. II. Molina, Wagner Franco. III. Título.

Silva, Simião Alefe Soares da.

Dinâmica evolutiva do DNAr em cromossomos de peixes da família Eleotridae e revisão citogenética da ordem gobiiformes (Osteichthyes, Teleostei) / Simião Alefe Soares da Silva. - 2019.

69 f.: il.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro de Biociências, Programa de Pós-Graduação em

Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI

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SIMIÃO ALEFE SOARES DA SILVA

DINÂMICA EVOLUTIVA DO DNAr EM CROMOSSOMOS DE PEIXES DA FAMÍLIA ELEOTRIDAE E REVISÃO CITOGENÉTICA DA ORDEM GOBIIFORMES

(OSTEICHTHYES,TELEOSTEI)

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Sistemática e Evolução da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisitos para obtenção do título de Mestre em Sistemática e Evolução com ênfase em Padrões e Processos Evolutivos.

Aprovado em 27 de Fevereiro de 2019.

Comissão examinadora:

Dr. Gideão Wagner Werneck Félix Costa – UFRN Dr. Clóvis Coutinho da Mota Neto – CPRM

Dr. Paulo Augusto de Lima Filho - IFRN Dr. Wagner Franco Molina - UFRN

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“Dedico a Deus por tudo que faz por mim, aos meus pais, a minha querida Tia Hagar (in memorian) e a todos que contribuíram na minha formação”

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“Por isso, me alegro, por amor de cristo, com as fraquezas, com as ofensas, com as adversidades, com as perseguições, com as angústias. Porque quando sou fraco, então é que sou forte”

(Apóstolo Paulo)

“Não são nossas habilidades que mostram quem realmente somos, são nossas escolhas”

(J. K. Rowling)

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AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a Deus, por tudo que tem feito na minha vida, pelas portas que ele abriu durante toda minha vida e no percurso desta pesquisa e por tudo que é para mim.

Agradeço do fundo do meu coração aos meus pais Valdenir Dalvino da Silva e Antônia Eveline Soares da Silva, por todo apoio, paciência, carinho e auxilio que me proporcionou em toda minha vida.

Agradeço a minha Vó Maria de Lourdes Mendonça Soares, pelas inúmeras orações e carinho, que foram de muita importância para eu chegar até aqui.

Ao meu irmão por ter me ajudado várias vezes quando precisei e pelo apoio que tem me fornecido.

Ao meu tio Saquel Pascoal de Mendonça Soares, por toda ajuda que me proporcionou e por sempre estar ao meu lado.

Agradeço ao meu orientador Prof. Dr. Wagner Franco Molina, por ter acreditado nesse projeto e confiado na minha pessoa para realizar essa pesquisa, e por todo aprendizado que tive o prazer de ter recebido.

Agradecimento especial ao meu co-orientador Prof. Dr. Paulo Augusto de Lima Filho, por ser uma pessoa excepcional, por ter acreditado e confiado em mim, por ter me proporcionado a oportunidade de desenvolver essa pesquisa, assim como, ter grade participação na minha formação.

Agradeço ao meu tio ‘China’ e ao meu amigo ‘Pretinho’, por ter me ajudado em algumas coletas.

Agradeço também a minha noiva Monike Paulino da Silva de Mendonça, por todo carinho prestado, apoio nos momentos de dificuldade, pelas coletas que fomos juntos que com a presença dela se tornaram especiais.

Agradeço a Enildo e a Francisco pelas incontáveis ajudas que deram ao longo desses dois anos vindo de Guamaré para Natal.

Agradeço ao meu amigo e parceiro de pesquisa Anderson, pelo apoio e dedicação no desenvolvimento do trabalho, como também, na coleta do material biológico.

Agradeço ao meu amigo dos fungos Renan Oliveira, um amigo que ganhei nesse percurso sempre me ajudando nas disciplinas e na construção da dissertação.

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Agradeço também a todos os componentes do Laboratório de Genética de Recursos Marinho, Gideão, Karlla, Inaílson, Divana, Aparecida, Glaicon, Vanessa, Josy, Juliany, Erika, Alisson e os demais, por toda ajuda que me proporcionaram que foram essenciais para desenvolvimento deste trabalho, sem essa ajuda, nada disso seria possível.

Agradeço ao pessoal que trabalha no CTA de Extremoz, pela grande ajuda que me proporcionaram.

Agradeço também, a todos os professores desde o maternal até aqui, pois todos contribuíram para minha formação tanto pessoal como acadêmica.

A professora Lidiane Guilhermino, pela grande ajuda que me deu, me substituindo em algumas aulas quando precisada ir para Natal.

Agradeço aos componentes da “Melhor Turma” do IFRN campus Macau, pelo companheirismo, amizade e ajuda que ultrapassou os limites da graduação e tornou-se para vida.

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Resumo

A ordem Gobiiformes, com mais de 2.200 espécies é um dos grupos mais diversificados dentre os teleósteos. Essa alta diversidade é acompanhada por significativa diversificação cariotípica, cujas causas biológicas não são completamente estabelecidas. Dentre seus grupos encontra-se a família Eleotridae, com 23 gêneros e 171 espécies, das quais seis habitam rios próximos à costa e regiões estuarinas em vastas áreas do litoral brasileiro. Com vistas a ampliar os dados citogenéticos para Eleotridae e revisar os padrões de diversificação cariotípica em Gobiiformes, aqui foram analisadas as espécies Dormitator maculatus, Eleotris pisonis, Erotelis smaragdus e Guavina guavina com ocorrência no Atlântico Sul e realizada uma ampla revisão citogenética e associação com os aspectos biológicos e ecológicos da Ordem Gobiiformes. As análises citogenéticas empregaram metodologias convencionais (coloração com Giemsa, impregnação por nitrato de prata, bandamento-C), coloração com fluorocromos base-específicos (MM/DAPI) e mapeamento por hibridação in situ fluorescente com sondas DNAr 18S, 5S e de sequências microssatélites (CA)15. As espécies E. smaragdus e E.

pisonis apresentaram 2n=46 cromossomos (NF=46), D. maculatus exibiu um cariótipo estruturalmente diversificado, com 36sm+4st+6a (NF=86), enquanto G. guavina um cariótipo numericamente divergente com 2n=52 (NF=52). As regiões organizadoras nucleolares nas quatro espécies, estão localizadas em diferentes posições de um único par cromossômico, revelando-se em um efetivo marcador citotaxonômico entre as espécies. O mapeamento in situ do DNAr indicou uma significativa variação de arranjos estruturais dos genes 18S e 5S, confirmando a elevada dinâmica evolutiva dos cariótipos dessas espécies. O conjunto de dados citogenéticos confirma 2n=46 cromossomos acrocêntricos, como uma condição simplesiomórfica para Gobiiformes. O variado conjunto de sequências repetitivas nos cromossomos das espécies de Eleotridae, e em Gobiiformes em geral, pode atuar como fator promotor de diversificação cariotípica, associado a características biológicas, como hábitos bentônicos e ovos adesivos bentônicos. Os resultados encontrados contribuem para um melhor conhecimento da evolução cariotípica da família Eleotridae, indicando a participação de variados rearranjos (inversões, fusões e fissões) e amplia as informações citogenéticas para Gobiiformes. Os padrões estruturais heterogêneos dos cromossomos desta Ordem de peixes, aliado aos seus aspectos biológicos que favorecem estruturações populacionais elevando a dinâmica evolutiva dos cromossomos, tornando este grupo um dos modelos mais ilustrativos de megaevolução cariotípica em ambientes marinhos.

Palavras-chave: Evolução cromossômica, diversificação cariotípica, rearranjos cromossômicos, DNAr, microssatélites.

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Abstract

The Order Gobiiformes, with more than 2200 species is one of the most diversified groups among teleosts. This high diversity of species is accompanied by significant karyotypic diversification, whose the biological causes are not completely established. Among its groups there is the family Eleotridae, with 23 genera and 171 species, of which six inhabits rivers near the coast and estuarine regions in vast areas of the Brazilian coast. In order to extend the cytogenetic data for Eletridae and to review the patterns of karyotype diversification in Gobiiformes, the species Dormitator maculatus, Eleotris pisonis, Erotelis smaragdus and Guavina guavina with occurrence in the South Atlantic were analyzed and a broad review of cytogenetic, biological and ecological aspects of the Order Gobiiformes were performed. The cytogenetic analyses employed conventional techniques (Giemsa staining, silver nitrate impregnation, C-banding), base-specific fluorochromes (MM/DAPI) staining, and fluorescence in situ hybridization with probes of 18S rDNA, 5S rDNA and repeats (CA)15. The species E. smaragdus and E. pisonis presented 2n=46 chromosomes

(NF=46). D. maculatus exhibited a structurally diverse karyotype with 36sm+4st+6a (NF=86), while G. guavina had a numerically divergent karyotype with 2n=52, NF=52). The nucleoli organizing regions in the four species are located in different positions of a chromosome, showing its potential to be an efficient cytotaxonomic marker among the species. In situ rDNA mapping indicated a greater variation in the structural arrangements of the 18S and 5S genes, confirming the high evolutionary dynamics of the karyotypes of these species. The cytogenetic data set for the Order Gobiiformes confirms 2n=46 acrocentric chromosomes, as a symplesiomorphic condition for the Order. The varied set of repetitive sequences in the Eleotrid chromosomes, and in Gobiiformes in general, associated to biological biology, such as benthic habits, benthic adhesive eggs can act as trigger for karyotype diversification. The results contributed to a better knowledge on the karyotype evolution in Eleotridae, indicating a variety of rearrangements (inversions, fusions and fissions) and extending the cytogenetic data for Gobiiformes. The heterogeneous structural patterns of the chromosomes of this Order, together with their biological aspects that favor population structure promoting an elevate evolutionary dynamics in their chromosomes, making this group one of the most illustrative models of karyotype megaevolution in marine environments.

Keywords: Chromosome evolution, karyotype diversification, chromosomal rearrangements, rDNA, microsatellites

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LISTA DE FIGURAS E TABELAS INTRODUÇÃO

Figura 1. Mapa dos pontos de coleta das espécies de Eleotridae no Estado do Rio Grande do Norte, nordeste do Brasil.

Figura 2. Espécies da família Eleotridae utilizados nas análises citogenéticas. a. Dormitator maculatus; b. Eleotris pisonis; c. Erotelis smaragdus; d. Guavina guavina. Fotos: SASS. Imagem de Erotelis smaragdus

obtida em:

https://biogeodb.stri.si.edu/caribbean/en/gallery/specie/4099. Barra = 1cm.

CAPÍTULO 1

Figura 1. Cariótipos de Erotelis smaragdus, Eleotris pisonis, Dormitator maculatus e Guavina guavina, sob coloração com Giemsa e bandamento C. Em destaque nas caixas os pares organizadores nucleolares exibindo os sítios Ag-RONs e regiões MM+_/DAPI-_{. Barra}

= 5µm.

Figura 2. Hibridização in situ com sondas DNAr 18S (vermelho) e DNAr 5S (verde) nas espécies E. smaragdus, E. pisonis, D. maculatus e G. guavina. Os padrões dos arranjos DNAr 18S e DNAr 5S são apresentados para D. maculatus. Barra = 5µm.

Figura 3. Hibridização in situ de sequências dinucleotídicas (CA)15 em Eleotris pisonis, Dormitator maculatus e Guavina guavina. Em destaque no box os pares heterogaméticos da espécie Dormitator maculatus. Barra = 5µm.

Tabela 1. Informações citogenéticas disponíveis para espécies da família Eleotridae.

CAPÍTULO 2

Figura 1. Padrões filogenéticos na Ordem Gobiiformes com informações citogenéticas (2n e NF) por espécie ou gênero. Linhas vermelhas destacam grupos com 2n=46 cromossomos.

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Tabela 1. Frequência de valores diploides (2n) e de números de braços cromossômicos (NF) conhecidos para os gêneros e subfamílias da ordem Gobiiformes.

Tabela 2. Frequência de números diploides e Número Fundamental quanto aos hábitos bentônico (B), pelágico (P) e bento-pelágico (B/P), para a Ordem Gobiiformes e suas famílias.

Tabela 3. Dados citogenéticos de 2n e NF e sua frequência no quesito características reprodutivas, ovos bentônicos (OB) e ovos pelágicos (OP) organizados por ordem.

Tabela 4. Frequência do número diploide e Número Fundamental em relação ao tipo de ambiente. M= Marinho, D= Dulcícola, E= Estuarino. Espécies que habitam em mais de um ambiente são identificadas pela sigla referente ao hábitat correspondente, separado por ‘/’. O número total de espécie analisadas por tipo de habitat, estão organizadas no espaço destinado a Total.

ANEXO

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Sumário

INTRODUÇÃO ... 13

1.1 Aspectos biológicos da Ordem Gobiiformes... 13

1.2 Diversidade cariotípica na Ordem Gobiiformes ... 14

1.3 Aspectos biológicos e citogenéticos da família Eleotridae... 15

OBJETIVOS ... 17 2.1 Objetivo Geral ... 17 2.2 Objetivos Específicos ... 17 MATERIAL E MÉTODOS ... 18 3.1 Material ... 18 3.2 Métodos ... 21 3.2.1 Estimulação mitótica ... 21

3.2.2 Técnica de preparação de cromossomos mitóticos ... 21

3.2.3 Preparação das lâminas ... 22

3.2.4 Análises cromossômicas ... 22

3.2.5 Detecção das regiões organizadoras de nucléolos (RONs) ... 22

3.2.6 Detecção de heterocromatina constitutiva ... 23

3.2.7 Coloração com fluorocromos base-específicos ... 23

3.2.8 Hibridação in situ fluorescente (FISH) ... 23

REFERÊNCIAS ... 26

CAPÍTULOS ... 31

5.1 Capítulo I ... 31

Intensa divergência cariotípica e dinâmica das sequências DNAr 18S e DNAr 5S em quatro espécies da família Eleotridae (Teleostei, Gobiiformes) ... 31

5.2 Capítulo II ... 50

Aspectos carioevolutivos da Ordem Gobiiformes (Teleostei): condição cariotípica basal do grupo ... 50

CONCLUSÕES ... 65

(14)

Introdução 13

INTRODUÇÃO

1.1 Aspectos biológicos da Ordem Gobiiformes

Gobiiformes possui 9 famílias, 268 gêneros e 2.210 espécies, constituindo um dos grupos com a maior diversidade entre os vertebrados (Thacker, 2003; Nelson et al., 2016; Eschmeyer & Fong, 2019).

O pequeno porte e aspectos morfológicos pouco distintivos, contribuem para uma morfologia críptica, que em muitos casos ocasionam imprecisão taxonômica na identificação das espécies da Ordem Gobiiformes (Tornabene et al., 2010), o que enseja identificações taxonômicas também embasadas em análises genéticas e citogenéticas (Lima-Filho et al., 2012).

Algumas características morfológicas são diagnósticas para os representantes da Ordem, como linha lateral ausente ou pouco desenvolvida, membranas branquiais geralmente unidas ao istmo, primeira nadadeira dorsal com 4 a 10 espinhos flexíveis, segunda nadadeira dorsal e anal com variação na quantidade de raios, em geral moles, exceto o primeiro raio da segunda nadadeira dorsal que é geralmente duro, presença de nadadeiras pélvicas com 4 a 5 raios moles ligados, formando um disco utilizado na estabilização e movimentação (Nelson et al., 2016).

Gobiiformes possuem uma ampla distribuição geográfica, incluindo áreas da Oceania, Ásia, Europa, América do Norte e América Latina, onde habitam ambientes marinhos, águas salobras e dulcícolas. Algumas espécies podem habitar águas hipersalinas ou mesmo grandes profundidades oceânicas (Muus & Nielsen, 1999; Suzuki et al., 2015; Oto et al., 2017). Contudo, em geral, ocorrem em estuários, costas marinhas rochosas, ou associadas a recifes de corais, onde são predominantemente bentônicas, ocupando tocas em substratos lamacentos ou rochosos, bem como enterradas no substrato, permanecendo apenas com os olhos acima da superfície (Eskinazi, 1972; Kottelat & Freyhof, 1972; Baensch & Riehl, 1991; Patzner et al., 2012).

Suas características comportamentais e reprodutivas são fatores importantes na distribuição e adaptações a novos nichos (Fanta, 1997). Apresentam mecanismos reprodutivos muito variáveis, muitas espécies produzem ovos adesivos perdendo-os ao substrato, enquanto que outras lançam ovos flutuantes, que sob

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Introdução 14

ação de correntes marinhas, aumentam o potencial de dispersão (Manacop, 1953; Skora et al., 1999; Donaldson & Myers, 2002; Patzner et al., 2012).

Algumas espécies apresentam cuidado parental dos ovos e larvas, podem exibir fecundação interna ou externa ou, sob certas circunstâncias ambientais, os machos podem mudar de sexo (Nakashima et al., 1996; Skora, et al., 1999). Características comportamentais, como movimentação restrita associadas a hábitos bentônicos, tornam as espécies da Ordem Gobiiformes propícias a fragmentações populacionais. Isso pode resultar em modificações cariotípicas, que vão desde diferenças no número cromossômico, a variações intrínsecas nos cromossomos das espécies (Lima-Filho et al., 2012).

Nesse sentido a redução do fluxo gênico, propicia diferenciações morfológicas e genéticas das populações, que podem culminar com processos de especiação alopátrica, ecológica e alguns casos de especiação simpátrica (Dawson et al., 2002; Lima-Filho et al., 2012; Zastavniouk et al., 2017), resultando na surpreendente diversidade de espécies desta Ordem.

1.2 Diversidade cariotípica na Ordem Gobiiformes

Rearranjos cromossômicos podem estar diretamente associados ao processo de especiação (Rieseberg, 2001). Assim, dados citogenéticos recentes permitem compreender o processo evolutivo e a importância do dinamismo evolutivo em alguns grupos de peixes (Molina et al., 2014).

Os aspectos citogenéticos em Gobiiformes são ainda pouco conhecidos. Apenas 139 espécies possuem algumas informações citogenéticas, em geral, derivadas de técnicas citogenéticas clássicas. Esse total corresponde a menos de 10% das espécies, que abrange cinco das nove famílias da Ordem, das quais Gobiidae e Oxudercidae apresentam o maior número de espécies analisadas (Arai, 2011).

Diferentemente de outras Ordens marinhas, como Perciformes e Siluriformes, que são detentoras de um alto grau de conservadorismo cromossômico, a Ordem Gobiiformes apresenta uma elevada divergência de número cromossômico entre suas espécies (Galetti et al., 2000; Amorim et al., 2017). A causa da elevada diversidade carioevolutiva no grupo, tem sido associada ao rico repertório comportamental, diversidade de hábitats e limitada capacidade dispersiva das

(16)

Introdução 15

espécies (Fanta, 1997; Ruber et al., 2003; Lima-Filho et al., 2012; Rocha et al., 2015).

Em meio a variação numérica dos cromossomos, tem sido sugerido que 2n=46 cromossomos acrocêntricos constitua o padrão basal para a Ordem, como foi para a família Gobiidae (Vasil’ev & Gregorian, 1994). De fato, dentre as 51 espécies da família Gobiidae analisadas, 41% (21 spp.) exibem 2n=46 cromossomos, das quais 21% (11 spp.) apresentam apenas cromossomos acrocêntricos (Arai, 2011), enquanto as demais, como Gobiopsis macrostoma (10m+4sm+32a) (Khuda-Bukhsh et al., 1995), exibem fórmulas cariotípicas diversificadas.

Algumas famílias, como Oxudercidae e Odontobutidae, apresentam 2n=44, como condição mais frequente (Dong, 1984). No primeiro grupo, essa é a condição modal, presente em 37% das espécies. Em Eleotridae e Butiidae, por outro lado, 2n=46 cromossomos é a condição prevalente, ocorrendo em 66% das espécies, com 30% delas com cariótipos inteiramente formados por cromossomos acrocêntricos (Donsakul & Magtoon, 1997; Molina 2005).

Os mecanismos de diversificação cariotípica das espécies de Gobiiformes, tais como rearranjos cromossômicos, têm se mostrado extremamente variados (Amores et al., 1989; Caputo et al., 1997; Prazdnikov et al., 2013). Diante da dimensão evolutiva deste grupo de peixes, análises citogenéticas resolutivas, sob bases filogenéticas mais extensas, incluindo alguns grupos com poucas informações como Eleotridae, permitirão estabelecer a amplitude da diversificação cromossômica bem como possíveis efeitos de fatores biológicos e geográficos na sua evolução cariotípica.

1.3 Aspectos biológicos e citogenéticos da família Eleotridae

Eleotridae, conhecidos popularmente como “dorminhocos” ou “peixes-macaco” (nome dado devido ao seu modo de vida, escondendo-se em tocas no substrato e pouca mobilidade), abrange 23 gêneros e 171 espécies (Thacker, 2009; Betancur-R et al., 2013; Eschmeyer & Fong, 2019). Em toda costa brasileira ocorrem apenas seis espécies, que são Erotelis smaragdus (Valenciennes, 1837), Dormitator maculatus (Bloch, 1792), Eleotris pisonis (Gmerlin, 1789), Eleotris perniger (Cope, 1871), Eleotris amblyopsis (Cope, 1871) e Guavina guavina (Valenciennes, 1837) (Pezold & Cage, 2002; Silva et al., 2014; Guimarães-Costa et al., 2016). Algumas

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Introdução 16

espécies do oceano Atlântico Ocidental estendem sua distribuição do litoral brasileiro até o litoral do Caribe (Guimarães-Costa et al., 2017; Ottoni, 2017).

Quando é analisado a morfologia dos peixes da família Eleotridae é possível constatar uma condição críptica para a família, dificultando uma identificação precisa em algumas espécies. Pigmentação, escamas laterais e distribuição geográfica, são usadas como critérios taxonômicos mais frequentes (Pezold & Cage, 2001). A maioria das espécies da família possui ovos pelágicos, fase larval pelágica longa e movimentação restrita na fase adulta, contudo poucas espécies possuem hábito pelágico (Riede, 2004; Bussing & Lopez, 2005), fatores que favorecem estruturações populacionais (Ceccarelli et al., 2001).

Dados citogenéticos para Eleotridae são escassos (Arai, 2011). Os poucos dados existentes revelam uma notável variação nas fórmulas cariotípicas (Arai et al., 1974; Uribe-Alcocer et al., 1983, 1989; Maldonado-Monroy et al., 1985; Molina, 2005). Apesar de 2n=46 cromossomos ser a condição mais frequente na família, algumas espécies exibem 2n=52 cromossomos, resultado de fissões cromossômicas (Uribe-Alcocer & Diaz-Jaimes, 1996). Elevados números de braços cromossômicos (NF) sem redução diploide, apontam que inversões pericêntricas tiveram um papel ativo na modelagem dos cromossomos das espécies (Molina, 2005).

As contribuições das informações citogenéticas para o conhecimento da diversidade de espécies de peixes na região Neotropical têm sido notáveis (Nirchio et al., 2014; Borges et al., 2019). O conhecimento citogenético em várias famílias de Gobiiformes, entre elas Eleotridae ainda é incipiente, mas tem revelado nos cariótipos de suas espécies desde divergências dentro de sua área de distribuição (Molina, 2005), polimorfismos cromossômicos (Uribe-Alcocer et al., 1989), como também a ocorrência de cromossomos sexuais (Oliveira & Toledo, 2006; Lima-Filho et al., 2014).

A ampliação das informações citogenéticas nesta Ordem, através de análises citogenéticas resolutivas, baseadas no mapeamento de sequências repetitivas se mostra apropriada para identificação de possível fauna críptica, nesse grupo. Além disso, as análises podem auxiliar a compreensão da diversificação cariotípica na família Eleotridae e no grande grupo filético representado pela Ordem Gobiiformes.

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Objetivos 17

OBJETIVOS 2.1 Objetivo Geral

O presente trabalho visa ampliar os dados citogenéticos para a família Eleotridae por meio de técnicas citogenéticas resolutivas, contribuindo para um melhor entendimento dos padrões de evolução cariotípica na família e na Ordem Gobiiformes. Adicionalmente, se propõe a realizar uma ampla revisão dos aspectos cariotípicos dos Gobiiformes, identificando seus processos de diversificação cromossômica e possíveis associações com aspectos biológicos desse grande grupo de peixes.

2.2 Objetivos Específicos

• Realizar análises citogenéticas nas espécies Erotelis smaragdus, Eleotris pisonis, Dormitator maculatus e Guavina guavina (Eleotridae), através de técnicas citogenéticas convencionais (coloração com Giemsa, Ag-RONs, bandamento C), coloração com fluorocromos base-específicos (MM/DAPI) e hibridização fluorescente in situ (FISH) das sequências repetitivas DNAr 18S, DNAr 5S e sequências microssatélites (CA)15.

• Compilar os dados citogenéticos disponíveis para a Ordem Gobiiformes e analisar mecanismos de diversificação, relacionando-os com fatores biológicos dos grupos e realizando inferências/inferindo sobre o possível cariótipo basal para Ordem.

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Material e Métodos 18

MATERIAL E MÉTODOS 3.1 Material

Quatro espécies da família Eleotridae foram utilizadas nas análises citogenéticas. As espécies Dormitator maculatus (n=10; 8 ♂ e 2 ♀) e Eleotris pisonis (n=25; 15 ♂ e 10 ♀) foram coletadas no Rio Pium, em Parnamirim (5°56’51.2”S,

35°14’09.2”O), Erotelis smaragdus (n=15; 10 ♂ e 5 ♀), próxima à foz do estuário no Rio Curimataú, município de Canguaretama (6°19'15.50"S, 35°2'29.31"O) e Guavina guavina (n=4; 1 ♂ e 3 ♀) coletada no estuário do Rio Potengi (5°41’07.2”S,

35°14’28.1”O), no Estado do Rio Grande do Norte, Nordeste do Brasil. Todos os procedimentos desenvolvidos em campo ou laboratório contaram com a aprovação do Comitê de Ética no uso de Animais (Proc. 044/2015) da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN).

Figura 1. Mapa indicando os pontos de coleta no estado do Rio Grande do Norte. RPO= Rio Potengi, no município de Natal; RP= Rio Pium, no município de Parnamirim; RC= Rio Curimataú, no município de Canguaretama.

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Após as coletas, os espécimes foram transportados vivos ao Laboratório de Genética de Recursos Marinhos (LGRM) da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, onde foram mantidos em aquários aerados até a realização das preparações cromossômicas.

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Figura 2. Espécies da família Eleotridae utilizados nas análises citogenéticas. a. Dormitator maculatus; b. Eleotris pisonis; c. Erotelis smaragdus; d. Guavina guavina.

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Fotos: SASS. Imagem de Erotelis smaragdus obtida em: Biogeodb.stri.si.edu. Barra = 1cm.

3.2 Métodos

3.2.1 Estimulação mitótica

Os exemplares foram submetidos à estimulação mitótica com o uso de complexos de antígenos bacterianos e fúngicos, de acordo com Molina (2001) e Molina et al. (2010). Um total de 7mg de antígenos foi diluído em 10ml de água destilada e injetado intramuscularmente na proporção 1ml/50g do peso corporal dos exemplares. Após um período de 24-48 horas os indivíduos foram eutanasiados com superdosagem de Eugenol, anestésico a base de óleo de cravo (Syzygium aromaticus), até cessação dos movimentos branquiais, quando foram removidos fragmentos da porção anterior dos rins.

3.2.2 Técnica de preparação de cromossomos mitóticos

A técnica de preparação e obtenção de cromossomos mitóticos, fez uso da preparação in vitro, descrito por Gold et al. (1990). O tecido renal foi removido com o auxílio de uma pinça e adicionado a uma cuba de vidro contendo 10ml de meio de cultura RPMI 1640. Os fragmentos foram dissociados por sucção com seringa de vidro de 10ml desprovida de agulha, até se obter uma mistura de células homogênea. Em seguida foi adicionado 125µl de colchicina a 0,025%, deixando-a agir por 28 minutos em temperatura ambiente.

Terminado a colchicinização, o material foi centrifugado por 10 minutos à 1000 rpm, retirando-se o sobrenadante com ajuda de pipeta Pasteur. Em seguida o material foi ressuspendido em 10ml de solução hipotônica de KCl à 0,075M, onde permaneceu por 30 minutos à temperatura ambiente. Ao término desse período o material foi pré-fixado com o acréscimo de um volume de 0,5ml de fixador de Carnoy (Metanol/Ácido Acético, 3:1), sendo refrigerado, e posteriormente centrifugado por 10 minutos à 1000 rpm. Após três ciclos de fixação, com ressuspensão em 6ml de fixador, e centrifugação à 1000rmp, o material foi estocado em 1,5ml de fixador em tubos Eppendorf e mantido em freezer à -20°C.

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3.2.3 Preparação das lâminas

Para análises da morfologia cromossômica e valor diploide das espécies, 75µl a 100µl da suspensão celular (3 gotas) foi gotejado em uma lâmina recoberta com um filme de água destilada aquecida à 60°C e secas ao ar em temperatura ambiente. Posteriormente, o material foi corado com Giemsa 5%, diluído em solução tampão fosfato pH 6,8, durante 8 minutos, sendo posteriormente lavado com água destilada e seco ao ar.

3.2.4 Análises cromossômicas

As preparações cromossômicas foram analisadas em fotomicroscópio de epifluorescência OlympusTM _{BX50, em um aumento de 1000X, com sistema de}

captura de digital DP73 (Olympus), com o uso do software cellSens. O valor diploide modal e o cariótipo das espécies foram estabelecidos pela análise de cerca de 30 metáfases para cada exemplar. Os cromossomos foram classificados de acordo com a razão entre braços, em metacêntricos (m), submetacêntricos (sm), subtelocêntricos (st) e acrocêntricos (a) ( Levan et al., 1964).

3.2.5 Detecção das regiões organizadoras de nucléolos (RONs)

A detecção das regiões organizadoras de nucléolos foi realizada de acordo com Howell e Black (1980). Previamente foi preparada uma solução gelatinosa contendo 1g de gelatina incolor em 50ml de água destilada e 0,5ml de ácido fórmico. Posteriormente foi depositada sobre uma lâmina com preparações mitóticas 150µl de solução de gelatina (1g de gelatina, dissolvida em 50 ml água e 0,5ml ácido fórmico), 75µl de água destilada e 175µl de solução aquosa de AgNO3 à 50%,

misturando bem e recobrindo com uma lamínula. A lâmina foi incubada em estufa à 60°C, por um período de aproximadamente 3 minutos, até que assumisse uma tonalidade âmbar, sendo em seguida lavada em água deionizada e seca ao ar. A preparações foram analisadas em microscópio sob magnificação de 1000X, e as melhores metáfases fotografadas.

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3.2.6 Detecção de heterocromatina constitutiva

As regiões heterocromáticas foram identificadas de acordo com Summer (1972). Lâminas com preparações cromossômicas foram mantidas em estufa de 37°C por 3 dias. Posteriormente foram imersas em HCl 0,2N à temperatura ambiente durante 15 minutos, lavadas em água destilada e secas ao ar. Em seguida foram mergulhadas em solução saturada de hidróxido de bário Ba(OH)28H2O à 5% à 42°C,

por aproximadamente 1 minuto e 20 segundos, mergulhada rapidamente em solução de HCl 0,2N, lavadas em água destilada e secas ao ar. Foram então incubadas em solução salina 2XSSC à 60°C, durante 45 minutos, lavadas em água destilada e secas ao ar. Por fim, foram coradas em solução de Giemsa diluída em tampão fosfato à 2% (pH=6,8), durante 15 minutos.

3.2.7 Coloração com fluorocromos base-específicos

Adicionalmente foi realizada coloração com os fluorocromo MM (C52H76O24) e

DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol), de acordo com Schweizer (1976). As lâminas foram envelhecidas por três dias em estufa à 37°C, coradas com 30µl de MM (0,5mg/ml) por 30 min, lavadas com água destilada e coradas com DAPI (2µl/ml) por 15 minutos. Feito isso, as lâminas foram montadas em tampão glicerol Mcllvaine pH 7,0 (1:1), seladas com esmalte incolor e mantida em câmara escura por pelo menos três dias até as análises em fotomicroscópio de epifluorescência (OlympusTM_BX50),

sob filtros apropriados.

3.2.8 Hibridação in situ fluorescente (FISH)

A hibridação in situ fluorescente (FISH) foi realizada de acordo Pinkel et al. (1986) com algumas modificações. Sondas para as sequências DNAr 18S e DNAr 5S, foram obtidas da amplificação do DNAr da espécie Rachycentron canadum (Rachycentridae sensu Betancur-R et al., 2013), utilizando primers A 5’-TAC GCC CGA TCT CGT CG ATC-3’ e B 5’-CGA GCT GGT ATG GCC GTA AGC-3’ (Pendás et al., 1994). para as sondas DNAr 18S foram utilizadas seguimentos de 1400 pares de base (bp) do gene RNAr 18S (White et al., 1990) e a de DNAr 5S corresponderam a seguimentos de 200bp do gene RNAr 5S (Pendás et al., 1994) obtida via PCR do DNA nuclear (Costa, 2015).

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Ambas as sondas foram marcadas por nick translation (BioNick Labeling System – Invitrogen) com digoxigenina-11-dUTP para sonda 18S e 5S com biotina-14-dATP, respectivamente, de acordo com as instruções do fabricante.

A hibridação in situ fluorescente (FISH) foi realizada de acordo Pinkel et al. (1986). A solução de hibridação consistiu de 240μl de formamida 50%, 96μl de sulfato dextrano 50%, 48μl de 20XSSC, 32μl de água q.s.p., 30 perfazendo um volume total de 480μl, sendo adicionado 1,5 μg de sonda (DNA marcado com biotina). Em seguida, a solução de hibridação foi transferida para um recipiente a 100°C, durante 10 minutos, para desnaturação do DNA e, imediatamente após, para um recipiente com gelo, impedindo a renaturação por choque térmico. As lâminas contendo as preparações cromossômicas foram lavadas com tampão PBS 1X por 5 minutos à temperatura ambiente, sob agitação e, posteriormente, desidratadas em série alcoólica (70%, 85% e 100%). Em seguida, foram submetidas à digestão com RNAse (100μg/ml) por 1 hora e 30 minutos, em câmara úmida à 37°C, e lavadas em soluções salinas.

O material foi desidratado em uma série alcoólica, 5 minutos em cada banho, e tratado com formamida 70%/2XSSC à 70°C, por 5 minutos, para que os mixes da formamida promovessem a diminuição da temperatura de melting do DNA sem comprometer a estrigência, além de prolongar o tempo de hibridação. Uma nova desidratação em série alcoólica foi realizada. Após tal procedimento, foi aplicado, sobre a lâmina, 60μl da solução de hibridação contendo a sonda desnaturada, permanecendo em câmara úmida overnight, à 37o_{C. Transcorrido esse tempo, as}

lâminas foram lavadas em solução de formamida 50%/2XSSC à 42o_{C por 10}

minutos, três vezes em 0,1XSSC à 60°C, 5 minutos em cada lavagem e em solução Tween20 (0,05%/2XSSC), sob agitação, por 5 minutos. Em seguida, foi realizado um tratamento com 90μl de NFDM 5% (non fat dry milk – leite em pó desnatado) em 4XSSC, por 15 minutos à temperatura ambiente. Os sinais de hibridação foram detectados através da deposição de 100μl de Mix NFDM + Strepteavidina – FITC + anti-digoxigenina rodamina conjugada por 1 hora, com três lavagens adicionais de 5 minutos com Tween20. Finalizado, a lâmina foi desidratada em série alcoólica (70%, 85% e 100%) durante 5 minutos em cada banho. Os cromossomos foram contra-corados com vectashild com DAPI (0,2 μg/ml). Sequências de oligonucleótidos (CA)15 foram marcadas diretamente com Alexa Fluor 555 durante a síntese. A sonda

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desnaturada foi aplicada à lâmina, coberta com uma lamínula, permanecendo por 18 horas à 37°C. As lâminas foram então lavadas à temperatura ambiente, duas vezes durante 5 minutos cada, em 2XSSC e uma vez durante 1 minuto em 1XPBS (Kubet et al., 2008).

As sequências (CA)15 foram marcadas diretamente com Cianina durante a

síntese. A sonda desnaturada foi aplicada a lâmina, coberta com uma lamínula, permanecendo por 18 horas à 37°C. As lâminas foram lavadas em temperatura ambiente, duas vezes durante 5 minutos cada, em 2XSSC e uma vez durante 1 minuto em 1XPBS.

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Capítulo I – Divergência de sequências repetitivas do DNA de peixes da família Eleotridae 31

CAPÍTULOS 5.1 Capítulo I

Intensa divergência cariotípica e dinâmica das sequências DNAr 18S e DNAr 5S em quatro espécies da família Eleotridae (Teleostei, Gobiiformes) Resumo

A família Eleotridae é uma das 9 famílias que compõem a Ordem Gobiiformes. Com aproximadamente 23 gêneros e 171 espécies, são popularmente conhecidos como “dorminhocos” ou “peixes-macaco”. Suas espécies apresentam ampla distribuição na costa do Atlântico, onde habitam águas doces e estuarinas rasas. Dados citogenéticos neste grupo são incipientes e baseados em técnicas convencionais. Com vistas a contribuir para definição dos padrões de divergência cariotípica e da dinâmica das sequências DNAr nesta família, foram analisadas as espécies Dormitator maculatus, Eleotris pisonis, Erotelis smaragdus e Guavina guavina. As análises incluíram técnicas cromossômicas convencionais (coloração com Giemsa, Ag-RONs e bandamento C), coloração com fluorocromos base-específicos (MM/DAPI) e hibridação in situ com sondas fluorescentes DNAr 18S, DNAr 5S e de sequências microssatélites dinucleotídicas (CA)15. As espécies D. maculatus (2n=46,

36sm+4st+6a, NF=86), Eleotris pisonis (2n=46a, NF=46), Erotelis smaragdus (2n=46a, NF=46), e Guavina guavina (2n=52a, NF=52), apresentaram em geral uma conspícua variação cariotípica. Os sítios Ag-RONs ocorrem em um único par, mas em diferentes posições, entre as espécies. O mapeamento dos sítios DNAr 18S e DNAr 5S mostraram diferenças relacionadas ao número de sítios DNAr 5S (E. smaragdus), e quanto ao padrão de organização dessas sequências entre as espécies, variando entre arranjos sintênicos (E. pisonis, e cariomorfo de D. maculatus) e não sintênicos. As sequências microssatélites (CA)15 se localizaram em

regiões teloméricas e centroméricas, com grandes variações de posicionamento entre as espécies. Apesar do conservadorismo do número diploide em três das espécies (2n=46), as variações estruturais dos cromossomos (D. maculatus), do número e arranjo das sequências ribossomais (D. maculatus, E. pisonis e E. smaragdus), e sequências (CA)15, apontam uma vigorosa reorganização evolutiva

dos cromossomos das espécies da família.

Palavras-chave: Evolução cariotípica, FISH, DNAr, sequências repetitivas, peixes-macaco.

INTRODUÇÃO

A família Eleotridae (Gobiiformes) possui 171 espécies válidas que estão divididas nas subfamílias Eleotrinae, Butinae e Milyeringinae (Thacker, 2009; Betancur et al., 2013, Eschemeyer & Fong, 2019).

As espécies desta família frequentemente apresentam padrões morfológicos crípticos, dificultando a identificação taxonômica. Algumas características merecem

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destaque na taxonomia das espécies, como pigmentação, escamas da linha lateral e distribuição geográfica (Pezold & Cage, 2002). Fatores biológicos intrínsecos como período pelágico larval, comportamento reprodutivo, pouca mobilidade entre os representante do grupo, podem influenciar a estruturação genética das populações, entre os exemplos podemos citar ovos pelágicos, período pelágico larval longo e movimentação restrita na fase adulta (Riede, 2004; Bussing & Lopez, 2005).

Dentre suas subfamílias, Eleotrinae, formada pelos gêneros Dormitator, Eleotris, Erotelis, Guavina, e outros gêneros é a mais diversa, com distribuição no Atlântico Ocidental e Pacífico Oriental, Indo-Pacífico e Atlântico Oriental (Guimarães-Costa et al., 2016; Guimarães et al., 2018).

Na costa brasileira ocorrem seis espécies, Dormitator maculatus (Bloch, 1792), Eleotris pisonis (Gmerlin, 1789), Eleotris perniger (Cope, 1871), Eleotris amblyopsis (Cope, 1871), Erotelis smaragdus (Valenciennes, 1837), e Guavina guavina (Valenciennes, 1837) (Marceniuk et al., 2013, Guimarães-Costa et al., 2016), com ampla distribuição nas bacias hidrográficas, onde ocupam rios costeiros e regiões estuarinas (Silva et al., 2014, Nelson et al., 2016). Descrições recentes indicam ainda, duas possíveis novas espécies do gênero Eleotris e uma espécie invasora Butis koilomatodon (Bleeker, 1984), proveniente do Indo-Pacífico, em áreas do extremo norte da costa brasileira (Guimarães-Costa et al., 2016; Guimarães et al., 2018).

Os dados citogenéticos para a família são incipientes, revelando em geral cariótipos com 2n=46 (Arai, 2011), contudo algumas espécies apresentem números diploides mais elevados, como Eleotris picta, com 2n=52 cromossomos (Uribe-Alcocer & Diaz-Jaimes, 1996). Além da variação diploide, os cariótipos podem exibir estruturas variadas, sendo formados apenas por cromossomos acrocêntricos, ou por diferentes tipos cromossômicos, como identificado em espécies dos gêneros Dormitator, Gobiomorus e Morgunda (Arai & Sawada, 1974; Uribe-Alcocer et al., 1983; Maldonado-Monroy et al., 1985; Uribe-Alcocer et al., 1989; Molina, 2005).

A frequência e distribuição de sequências de DNAr 18S e 5S que têm sido informativas sobre a evolução do cariótipo de muitos grupos de peixes (Gornung, 2013) são desconhecidos em Eleotridae. Neste trabalho são apresentados dados citogenéticos de quatro espécies com ocorrência na costa brasileira e investigados

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os aspectos de diversificação cariotípica e da distribuição de três classes de DNA repetitivo (DNAr 18S, DNAr 5S, sequências (CA)15 e (CAA)10).

MATERIAL E MÉTODOS

Análises citogenéticas foram realizadas nas espécies Dormitator maculatus (n=11; 6♂ e 5♀), Eleotris pisonis (n=25; 15♂ e 10♀), Erotelis smaragdus (n=15; 10♂

e 5♀) e Guavina guavina (n=4; 4♀). Os espécimes de D. maculatus e E. pisonis foram coletados no rio Pium (5°56’51.2”S, 35°14’09.2”O), município de Parnamirim, os de E. smaragdus no estuário do rio Cunhaú (6°19'15.50"S, 35°2'29.31"O), no município de Canguaretama e os de Guavina guavina coletados no estuário do rio Potengi (5°41’07.2”S, 35°14’28.1”O), no município de Natal, Estado do Rio Grande do Norte, região Nordeste do Brasil.

Os espécimes foram submetidos à estimulação mitótica in vivo com inoculação intramuscular de complexos de antígenos bacterianos e fúngicos (Molina et al., 2010). Os cromossomos mitóticos foram obtidos a partir de suspensões celulares de fragmentos do rim anterior (Gold et al., 1990). As preparações foram coradas com Giemsa 5%, diluído em tampão fosfato (pH 6,8). Cerca de 30 metáfases foram analisadas para cada exemplar.

As regiões organizadoras de nucléolos (RONs) e as regiões heterocromáticas foram identificadas de acordo com Howell & Black (1980) e Sumner (1972) respectivamente. Adicionalmente, os cromossomos foram corados com fluorocromos base-específicos DAPI e MM (Schweizer, 1976).

As hibridações fluorescentes in situ (FISH) foram realizadas de acordo com Pinkel et al. (1986). As sondas foram amplificadas por PCR a partir do DNA de Rachycentron canadum (Teleostei, Rachycentridae sensu Betancur-R et al., 2013), utilizando primers para DNAr 18S (White et al., 1990) e DNAr 5S (Pendás et al., 1994). A sonda DNAr 18S foi marcada por nick translation com digoxigenina-11-dUTP (Roche, Mannheim, Alemanha), enquanto que a sonda 5S rDNA, com biotina-14-dATP (Invitrogen, San Diego, EUA), de acordo com as especificações do fabricante. O sinal de hibridização da sonda foi detectado usando avidina-FITC (Sigma) para a sonda DNAr 5S e anti-digoxigenina-rhodamina (Roche) para a sonda DNAr 18S. Os cromossomos foram contracorados com Vectashield/DAPI (1,5 μg/ml).

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As sondas da sequência (CA)15 e (CAA)10 foram marcadas diretamente com

durante a síntese. A hibridização das sondas ocorreu em câmara úmida por 18 horas à 37°C. As lâminas foram lavadas em temperatura ambiente, duas vezes durante 5 minutos cada, em 2XSSC e uma vez durante 1 minuto em 1XPBS.

As preparações com FISH e fluorocromos base-específicos foram analisadas em fotomicroscópio de epifluorescência Olympus BX51, equipado com sistema digital de captura de imagens Olympus DP73, utilizando o software cellSens (Olympus Optical Co. Ltda.)

Os cromossomos foram classificados de acordo com razão entre os braços em metacêntricos (m), submetacêntricos (sm), subtelocêntricos (st) e acrocêntricos (a) (Levan et al., 1964).

RESULTADOS

Erotelis smaragdus, E. pisonis e D. maculatus têm 2n=46 cromossomos, enquanto G. guavina possui 2n=52 cromossomos. Erotelis smaragdus (NF=46), E. pisonis (NF=46) e G. guavina (NF=52) compartilham cariótipos formados apenas por cromossomos acrocêntricos. Por outro lado, D. maculatus apresentou um cariótipo 2n=46, com variados tipos cromossômicos 36sm+4st+6a (NF=86) (Figura 1).

Os sítios Ag-RONs ocorrem em um único par de cromossomos e são as únicas regiões no cariótipo que apresentam coloração MM+/DAPI-_{. Em E.}

smaragdus se localizam em posição terminal no braço longo do par 9, em E. pisonis em posição intersticial do braço longo do par 21, em D. maculatus na porção terminal do braço curto do par 4 e em G. guavina na região intersticial no braço longo do par 19 (Figura 1).

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Figura 1. Cariótipos de Erotelis smaragdus, Eleotris pisonis, Dormitator maculatus e Guavina guavina, com coloração com Giemsa e bandamento C. Em destaque nas caixas os sítios Ag-RONs e regiões MM+_/DAPI-_{. Barra = 5µm.}

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As regiões heterocromáticas ocorrem principalmente nas regiões centroméricas dos cromossomos de E. smaragdus e E. pisonis, enquanto em D. maculatus e G. guavina, além das regiões centroméricas, localizam-se também em posição terminal e intersticial de alguns pares (figura 1).

Em todas as espécies os sítios DNAr 18S são simples e congruentes com as marcações Ag-RONs. Por outro lado, os sítios DNAr 5S demonstraram considerável variação nas espécies, apresentando divergências interespecíficas quanto ao número de sítios, posição e arranjo com os sítios DNAr 18S (figura 2).

Os sítios DNAr 5S em E. smaragdus são múltiplos situados nos pares 7 e 14. Em G. guavina ocorrem na porção pericentromérica do par 4. Em E. pisonis exibiram um arranjo sintênico e co-localizado com sítios DNAr 18S na porção intersticial do par 21. Em D. maculatus apresentam um notável polimorfismo estrutural, com dois citótipos quanto à organização e posicionamento destas regiões (Figura 2). Assim, enquanto alguns indivíduos apresentaram sítios DNAr 18S (par 4) e sítios DNAr 5S (par 5), outros exibiram um segundo tipo de organização, com o par 4 portando sítios DNAr 18S, com um dos homólogos exibindo um arranjo DNAr 18S/DNAr 5S co-localizado e um homólogo do par 5 portando um sítio DNAr 5S (Figura 2).

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Figura 2. Hibridização in situ com sondas DNAr 18S (vermelho) e DNAr 5S (verde) nas espécies E. smaragdus, E. pisonis, D. maculatus e G. guavina. Os padrões dos arranjos DNAr 18S e DNAr 5S são apresentados para D. maculatus. Barra = 5µm.

O mapeamento da sequência microssatélites (CA)15 a partir da hibridação in

situ fluorescente mostrou padrões diferenciados de distribuição entre as espécies E. pisonis, D. maculatus e G. guavina (Figura 3). Em E. pisonis, estas sequências ocorrem principalmente na região terminal dos braços longos, e em ambos os braços dos pares 15 e 21. Em G. guavina as regiões marcadas pela sonda (CA)15, se

mostraram muito variáveis, ocorrendo exclusivamente em posição terminal dos braços curtos ou longos, ou nessa posição em ambos os braços, e ainda em regiões intersticiais de alguns poucos pares de cromossomos. Na espécie D. maculatus, ocorreram variação na distribuição destas sequências nos cromossomos, contudo

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predominou uma distribuição nas posições terminal de ambos os braços. No par 5, pode ocorrer uma condição heterozigota, com presença e ausência do sinal destas sequências entre os braços curtos dos homólogos (Figura 3). Foram observados sinais dispersos em todas as espécies para sequências microssatélites (CAA)10,

entretanto um padrão de localização semelhante foi encontrado nas espécies G. guavina e E. pisonis nas regiões terminais dos braços cromossômicos, em D. maculatus, foram encontrados em regiões terminais dos braços longos e curtos vários cromossomos (Figura 3).

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Figura 3. Hibridização in situ de sequências dinucleotídicas (CA)15 e trinucleotídicas

(CAA)10 em Eleotris pisonis, Dormitator maculatus e Guavina guavina. Em destaque

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DISCUSSÃO

As espécies analisadas dos quatro gêneros da família Eleotridae indicaram notáveis discrepâncias quanto ao número fundamental, morfologia cromossômica e organização ou localização física de sequências nos cromossomos. Enquanto a maioria tem 2n=46, G. guavina apresenta 2n=52, o maior valor diploide descrito para a família. Adicionalmente, as fórmulas cariotípicas demonstram uma diversificação evolutiva, onde E. pisonis, E. smaragdus e G. guavina apresentam exclusivamente cromossomos acrocêntricos, e D. maculatus um padrão cariotípico diversificado com a ocorrência de diversos elementos bibraquiados, formando diferentes tipos cromossômicos.

As espécies E. pisonis, E. smaragdus e D. maculatus ampliam a frequência de cariótipos com 2n=46 para a família Eleotridae, condição considerada basal para Gobiiformes (Vasil’ev & Grigoryam, 1993) (discussão detalhada no Capítulo 2). Entretanto, valores diploides discrepantes (Tabela 1), progressivamente maiores decorrentes de fissões têm sido identificados em algumas espécies, como Gobiomorus dormitor (2n=48; Maldonado-Monroy et al., 1985), G. guavina (2n=52; presente trabalho) e Eleotris picta (2n=52; Uribe-Alcocer & Diaz-Jaimes, 1996).

A diversificação de valores diploides (2n=46-52) e estrutura cariotípica (NF=46-90) em Eleotridae se mostra elevada mesmo entre espécies co-genéricas (Tabela 1), demonstrando uma marcante dinâmica cariotípica decorrente sobretudo da ação de inversões pericêntricas e fissões cromossômicas (Uribe-Alcocer & Diaz-Jaimes, 1996; Molina, 2005).

As espécies mostraram uma marcante heterogeneidade intra e interespecífica dos padrões de heterocromatina, seja quanto ao conteúdo ou localização dos blocos nos cromossomos. Essa diversidade de padrões heterocromáticos é bem conhecida em espécies de Gobiiformes, onde algumas espécies, como G. guavina, apresentam heterocromatinas reduzidas e centroméricas (Molina, 2007; Lima-Filho et al., 2012; 2014), ou padrões intersticiais e terminais nos cromossomos, como em D. maculatus. Estas variações sugerem intensas reorganizações internas derivadas de elevada dinâmica evolutiva neste grupo.