UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ CENTRO DE CIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
NIÉDJA FITTIPALDI VASCONCELOS
DESENVOLVIMENTO DE CURATIVO DE CELULOSE BACTERIANA OXIDADA INCORPORANDO PAPAÍNA PARA O TRATAMENTO DE LESÕES CUTÂNEAS
FORTALEZA 2019
NIÉDJA FITTIPALDI VASCONCELOS
DESENVOLVIMENTO DE CURATIVO DE CELULOSE BACTERIANA OXIDADA INCORPORANDO PAPAÍNA PARA O TRATAMENTO DE LESÕES CUTÂNEAS
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Química da Universidade Federal do Ceará (UFC), como requisito parcial à obtenção do título de doutora em Química. Área de concentração: Química.
Orientadora: Dra. Morsyleide de Freitas Rosa. Coorientadora: Profa. Dra. Fábia Karine Andrade.
FORTALEZA 2019
NIÉDJA FITTIPALDI VASCONCELOS
DESENVOLVIMENTO DE CURATIVO DE CELULOSE BACTERIANA OXIDDA INCORPORANDO PAPAÍNA PARA O TRATAMENTO DE LESÕES CUTÂNEAS
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Química da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial à obtenção do título de doutora em Química. Área de concentração: Química.
Aprovada em: ___/___/______.
BANCA EXAMINADORA
________________________________________ Dra. Morsyleide de Freitas Rosa (Orientadora)
Embrapa Agroindústria Tropical
_________________________________________ Profa. Dra. Fábia Karine Andrade (Coorientadora)
Universidade Federal do Ceará (UFC) _________________________________________
Prof. Dr. Rodrigo Silveira Vieira Universidade Federal do Ceará (UFC) _________________________________________
Dra. Juliana Miguel Vaz Kefiplant Inc.
_________________________________________ Profa. Dra. Ângela Maria Moraes
Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) _________________________________________
Profa. Dra. Judith Pessoa Andrade Feitosa Universidade Federal do Ceará (UFC) _________________________________________
Profa. Dra. Maria Elenir Nobre Pinho Ribeiro Universidade Federal do Ceará (UFC)
A Deus.
AGRADECIMENTOS
A DEUS, por sempre guiar, abençoar e proteger meu caminho. Obrigada por permitir mais essa conquista na minha vida! A ELE minha eterna GRATIDÃO!
Aos meus pais, Níobe Fitipaldi e José Carlos Vasconcelos, por todo amor incondicional e apoio que sempre me deram em todos os momentos da minha vida.
Ao meu irmão, Gustavo Fittipaldi, por todo amor, carinho e zelo de irmão mais velho. Sei que essa conquista é nossa, pois não teria conseguido chegar até aqui sem seus “empurrões”, conversas, conselhos e, principalmente, seus fortes abraços.
A toda minha família pela torcida e constante incentivo, em especial meu tio Ivon Fittipaldi, minha tia Denia Fitipaldi e meus primos Pedro Fittipaldi e Camilla Fittipaldi. Obrigada por TUDO!
A minha orientadora e amiga, Dra. Morsyleide de Freitas Rosa, por todo seu carinho, doçura, apoio e dedicação durante a concretização deste e de todos os trabalhos desde a graduação até aqui. Você certamente é um exemplo a ser seguido de profissionalismo, dedicação e ética na pesquisa. MUITO OBRIGADA por sempre confiar e acreditar em mim!
A minha coorientadora e amiga, Profa. Dra. Fábia Karine Andrade, que é autora deste projeto e sempre esteve ao meu lado durante todo o desenvolvimento dele. Diante de todos os contratempos e conquistas conseguimos finalizar esta etapa. MUITO OBRIGADA por ter contado com você para a minha formação.
Ao professor e amigo Dr. Rodrigo Silveira Vieira, que sempre abraçou com muita motivação as ideias e necessidades que surgiram ao longo desde trabalho. AGRADEÇO por toda sua ajuda e dedicação!
Ao Prof. Dr. Diego Mantovani, pela parceira e oportunidade de realizar este trabalho em conjunto com sua equipe de profissionais do Laboratoire de Biomatériaux et de Bioingénierie (LBB), especialmente os assistentes de pesquisa e pós-doutorando Pascale Chevallier, Lucie Levesque e Daniele Pezzoli.
A Dra. Fátima Borges e sua equipe do Laboratório de Microbiologia de Alimentos (LMA/Embrapa), que sempre estiveram dispostos para produzir as membranas de celulose. OBRIGADA pela grande contribuição oferecida a este trabalho.
A minha querida amiga, Lídia de Araújo Pinto, que foi meu braço direito durante o doutorado. Sem sua ajuda, carinho e dedicação nada teria sido tão leve e produtivo. Tenho o enorme prazer de dividir esta conquista com você, OBRIGADA POR TUDO!
Aos profissionais e amigos do Laboratório de Tecnologia da Biomassa (LTB/Embrapa) e todos aqueles com quem tive o prazer de conviver na Embrapa, em especial: Adriano Mattos, Lílian Chayn, Natália Moura, Maria do Livramento (Menta), Gabriela (Gabi), Gleyciara (Gleyci), Nágila (Naaa), Vanessa Pereira (Vanessão), Edna (Pitú), Edla, Lídia, Yana, Celso Pires (o maior piadista da história), Maíra, Elígenes (Eli), Matheus, André Pereira, Rayanne (Ray), Diego Nascimento, Vitória, Lyndervan, Hálisson, Jéssica, Juliana (Barbie), Évilyn, Fabrízia, Lorena, Neto, Nádia, Viviane (Vivi), Erika, Genilton, Juliana Rabelo, Luísa, Evellheyn, Tayane, Vivânia, Dionis, Nayra, Fábio, Aldo, Vanessa de Abreu (Vanessinha). Todos vocês participaram de forma direta ou indiretamente durante esses quatros anos de trabalho árduo. Com certeza posso afirmar que nasceram muitas amizades, parcerias e ótimas histórias para contar. A todos vocês MUITO OBRIGADA por tornar essa minha caminhada mais leve e alegre.
Ao meu amigo Prof. Dr. Men de Sá, pela amizade, dedicação, carinho e por toda ajuda. Obrigada por torcer tanto pelo meu sucesso e o de todos do LTB.
Ao grupo de brasileiros do LBB na Université Laval em Quebec: Dimi, Ju, Clayton, Cris, Fer, Carol e Letícia por toda a ajuda, suporte e momentos maravilhosos que foram vividos com vocês. OBRIGADA!
Aos amigos do LIBS/UFC, Leo e Renally, por todo suporte, atenção e carinho quando estava usufruindo a infraestrutura do laboratório. OBRIGADA!
A equipe de profissionais da Central Analítica, especialmente Marlos Chave e Rosemeyre Freire, pela parceria e ajuda na realização das caracterizações microscópicas realizadas neste trabalho.
As Profa. Dra. Oscarina Viana e Profa. Dra. Nágila Ricardo pelo uso das dependências de seus laboratórios (Laboratório de Microbiologia Ambiental e do Pescado e Laboratório de Polímeros e Inovação de Materiais), e aos seus alunos de pós-doutorado, Cristiane Teles e Arcelina Pacheco, que, além da convivência tão agradável, me auxiliaram na realização dos ensaios bacteriano e de liberação in vitro.
As pessoas maravilhosas que tive o prazer de conhecer em Quebec e que foram minha família durante minha estadia: Dimitria, Beto, Danúzia, Leonel, Wesley (Eduardo), Letícia Domene (Elfo), Elizabeth, Christian, Karina, Jéssica, Franciele (Fran), Andressa, Fernando, Murilo, Sérgio, Linda Bonilla e Francesco Copes.
Aos grandes e verdadeiros amigos que DEUS colocou no meu caminho: Menta Linhares, Gabriela Ibiapina, Moema Verçosa, Vanessa Pereira, Felipe Verçosa, Fernando Barros,
Bruno Vasconcelos, Juliana Oliveira, Fernanda Bombaldi, Letícia Domene e Dimitria Camassão. OBRIGADA pela amizade!
Aos professores participantes da banca examinadora Rodrigo Silveira Vieira, Fábia Karine Andrade, Juliana Miguel Vaz, Ângela Maria Moraes, Judith Pessoa Andrade Feitosa e Maria Elenir Nobre Pinho Ribeiro pelo tempo dedicado, pelas valiosas colaborações e sugestões ao trabalho.
À Universidade Federal do Ceará (UFC), ao Programa de Pós-graduação em Química e a todos os funcionários e professores que, de maneira direta ou indireta, colaboraram para minha formação e realização deste trabalho.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo apoio financeiro com a manutenção da bolsa de auxílio à pesquisa no Brasil e no Canadá.
Enfim, a todos aqueles que involuntariamente omiti, porém que contribuíram, direta ou indiretamente, de alguma forma e acompanharam todos os passos desse processo de formação pessoal, intelectual e científica, MEUS SINCEROS AGRADECIMENTOS.
“Não é sobre chegar no topo do mundo e saber que venceu. É sobre escalar e sentir que o caminho te fortaleceu.”
RESUMO
Os curativos são um segmento importante do mercado médico e farmacêutico que vêm motivando pesquisas para obter biomateriais capazes de acelerar o processo de cicatrização. Nesse contexto, a celulose bacteriana (CB) é um biopolímero que apresenta propriedades promissoras para atuar como um curativo de proteção e controle sobre a ferida. Além disso, a modificação química de sua estrutura pode permitir a imobilização covalente de enzimas que possam atuar ativamente sobre o ferimento e auxiliar na cicatrização. Neste trabalho, membrana de CB foi utilizada para desenvolver um curativo bioativo avançado contendo papaína, que é comumente empregada como agente desbridante de tecidos desvitalizados, capaz de acelerar a cicatrização de feridas da pele. A membrana de CB foi produzida por cultivo estático (5, 7 e 10 dias de fermentação), purificada por tratamento alcalino (com NaOH ou K2CO3) e oxidada com
NaIO4 (tempo de reação: 6, 16 e 24 horas e temperatura: 40 e 55 ºC). Para otimizar as condições
de imobilização da papaína, foi realizado um planejamento experimental, onde as variáveis independentes pH (3 a 7) e temperatura (5 a 45 ºC) foram avaliadas. A membrana de CB obtida com 5 dias de fermentação e purificada com solução de K2CO3 (denominada CB-5d-K2CO3)
apresentou as condições mais propícias (maior porosidade e área superficial) para o desenvolvimento do curativo passivo. A determinação do tempo e da temperatura na oxidação da membrana de CB-5d-K2CO3 estabeleceu uma condição favorável de 6 horas e 55 ºC
(denominada CBOx-6-55) para que ocorra a modificação química com NaIO4, proporcionando
um grau de oxidação de 50% e preservando as propriedades físico-químicas da membrana de partida. Os efeitos estatísticos da temperatura e do pH no rendimento de imobilização, na atividade recuperada e atividade imobilizada forneceram a condição ótima de imobilização da papaína na CBOx-6-55 a pH 7 e 45 ºC (denominada CBOx-Papaína). Para avaliar a eficiência das membranas suporte, essa condição ótima foi empregada para imobilização da papaína na CB-5d-K2CO3 (denominada CB-Papaína). A CBOx-Papaína (que representa o curativo bioativo
avançado) apresentou maior percentual de liberação da enzima do que a CB-Papaína e exibiu propriedades estruturais adequadas para um curativo de pele. Efeitos não citotóxicos sobre células epidérmicas e não hemolíticos foram observados para a membrana. Além do mais, o curativo apresentou propriedade hemostática e baixa adesão celular que são características promissoras quando comparada aos curativos tradicionais (algodão, bandagem e gazes). Portanto, o curativo contendo papaína, desenvolvido a partir da membrana de CB, resultou em um material bioativo com propriedades ideais in vitro para o tratamento de lesões epidérmicas. Palavras-chave: Celulose bacteriana. Oxidação. Imobilização. Papaína. Feridas.
ABSTRACT
Dressings are an important segment of the medical and pharmaceutical market that motivates research into biomaterials capable of accelerating the healing process. In this context, bacterial cellulose (BC) is a biopolymer that has promising properties to act as a protective and control dressing on the wound. In addition, chemical modification of its structure may allow the covalent immobilization of enzymes that can actively act on the wound and aid in healing. In this work, BC membranes were used to develop an advanced bioactive papain-containing dressing, which is commonly employed as necrotic tissue debridement agent, capable of accelerating the healing of skin wounds. BC membrane was produced by static cultivation (5, 7 and 10 days of fermentation), purified by alkaline treatment (with NaOH or K2CO3) and
oxidized with NaIO4 (reaction time: 6, 16 and 24 hours and temperature: 40 and 55 ºC). In order
to optimize conditions for papain immobilization, an experimental design was performed, where the independent variables pH (3 to 7) and temperature (5 to 45 ºC) were evaluated. BC membranes obtained after 5 days of fermentation and purified with K2CO3 solution (called
BC-5d-K2CO3) presented the most favorable conditions (higher porosity and surface area) for the
development of passive dressing. The determination of BC-5d-K2CO3 membrane oxidation
time and temperature established a favorable condition of 6 hours at 55 ºC (called OxBC-6-55) for chemical modification with NaIO4, providing a degree of oxidation of 50% and preserving
the physicochemical properties of the starting membrane. The statistical effects of temperature and pH on immobilization yield, recovered activity and immobilized activity provided the optimal condition of papain immobilization on CBOx-6-55 at pH 7 and 45 ºC (called OxBC-Papain). To evaluate the efficiency of the supporting membranes, this optimal condition was used for papain immobilization on CB-5d-K2CO3 (called BC-Papain). OxBC-Papain (which
represents the advanced bioactive dressing) showed a higher percentage of enzyme release than BC-Papain and exhibited adequate structural properties for a skin dressing. Non-cytotoxic effects (on epidermal cells) and non-hemolytic effects were observed in relation to membrane. Moreover, the dressing had hemostatic property and low cell adhesion, which are promising characteristics when compared to traditional dressings (cotton, bandages and gauze). Therefore, the dressing containing papain, developed from the BC membrane, resulted in a bioactive material with ideal in vitro properties for the treatment of epidermal lesions.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Anatomia da pele. ... 22 Figura 2 – Classificação de feridas da pele. ... 25 Figura 3 – Representação esquemática das quatro fases do processo de cicatrização da
pele: (a) hemostasia, (b) inflamação, (c) proliferação celular e (d) remodelação dos tecidos ... 26 Figura 4 – Classificação dos curativos sólidos. ... 29 Figura 5 – Categorização dos biopolímeros e dos curativos disponíveis no mercado
produzido a partir desses polímeros naturais. ... 32 Figura 6 – Representação das estruturas químicas da glicose, glicopiranose, celobiose
e celulose pela projeção de Haworth. ... 33 Figura 7 – Visão geral das etapas de síntese da celulose bacteriana. ... 34 Figura 8 – Esquema da via bioquímica de polimerização da glicose pela bactéria. ... 35 Figura 9 – Micrografias (a) das nanofibrilas de celulose sendo excretadas pela
bactéria, (b) da rede nanofibrilar da celulose bacteriana. ... 36 Figura 10 – Imagens da (a) membrana de celulose (formada em cultivo estático) e (b)
esferas de celulose (formada em cultivo dinâmico). ... 38 Figura 11 – Representação esquemática das funções exercidas pela membrana porosa
de celulose bacteriana ao ser aplicada na ferida... 40 Figura 12 – Visão geral das características da membrana de celulose bacteriana em
relação aos requisitos gerais para materiais aplicados como curativo em feridas. ... 41 Figura 13 – Mecanismo de reação de oxidação da celobiose (formada por duas unidade
de D-glicopiranose) pelo íon periodato, catalisada em meio ácido... 45 Figura 14 – Representação das espécies químicas formadas na imobilização de
Figura 15 – Imagens (a) do látex das folhas e do fruto verde, (b) do mamoeiro (Carica papaya), de onde são extraído a enzima, e (c) da papaína obtida comercialmente. ... 48 Figura 16 – Imagens de (a) gel, (b) máscara, (c) pomada e (d) creme à base de papaína
como desbridante de tecidos desvitalizados. ... 50 Figura 17 – Esquema ilustrativo das etapas desenvolvidas no presente trabalho de tese.
... 52 Figura 18 – Representação esquemática da preparação do inóculo e produção da
membrana de celulose bacteriana. ... 54 Figura 19 – Representação esquemática do processo de purificação da membrana de
celulose bacteriana. ... 55 Figura 20 – Ilustração do procedimento de oxidação com periodato de sódio da
membrana de celulose bacteriana. ... 56 Figura 21 – Ilustração do procedimento de imobilização da papaína na membrana de
celulose bacteriana oxidada. ... 58 Figura 22 – Imagens das membranas de CB produzidas em 5, 7 e 10 dias de
fermentação e purificadas com solução diluída de K2CO3 (imagem acima)
e NaOH (imagem abaixo). ... 76 Figura 23 – Gráficos de (a) espessura (n = 10) e (b) massa (n = 5) das membranas de
CB com mesmo diâmetro obtidas com 5, 7 e 10 dias de fermentação e purificadas com K2CO3 e NaOH. ... 77
Figura 24 – Micrografias por MEV da superfície das membranas de (a) CB não tratada, (b) CB-5d-K2CO3 e (c) CB-5d-NaOH (aumento de 15000x) com seus
respectivos histogramas de diâmetro das nanofibrilas. ... 81 Figura 25 – Padrões de difração de raios X das membranas de CB não tratada,
CB-5d-K2CO3 e CB-5d-NaOH. ... 83
Figura 26 – Image das membranas de CB após oxidação com periodato de sódio. ... 86 Figura 27 – Padrão de difração de raios X das membranas de CB-5d-K2CO3 e da CB
Figura 28 – Deconvolução dos espectros de C1s de alta resolução para as membranas de (a) CB-5d-K2CO3 e (b) CBOx-6-55... 90
Figura 29 – Micrografias das seções longitudinal e transversal, obtidas por MEV, das membranas liofilizadas de (a) CB-5d-K2CO3 e (b) CBOx-6-55 (ampliação
de 5000x). ... 92 Figura 30 – Curvas representativas de tensão versus deformação das membranas de
CB-5d-K2CO3 e CBOx-6-55. ... 93
Figura 31 – Curvas de (a) TGA e (b) DTG das membranas de CB não tratada, CB-5d-K2CO3 e CBOx-6-55 em atmosfera de ar sintético. ... 96
Figura 32 – Curvas de DSC das membranas de CB não tratada, CB-5d-K2CO3 e
CBOx-6-55. ... 97 Figura 33 – Espectros de FTIR das membranas de CB não tratada, CB-5d-K2CO3,
CBOx-6-55 e CBOx-Papaína. ... 99 Figura 34 – Relação entre os valores observados e preditos para o rendimento de
imobilização da papaína em membranas úmidas de CBOx-6-55. ... 104 Figura 35 – Relação entre os valores observados e preditos para a atividade recuperada
da papaína em membranas úmidas de CBOx-6-55. ... 106 Figura 36 – Relação entre os valores observados e preditos para a atividade imobilizada
da papaína nas membranas úmidas de CBOx-6-55. ... 108 Figura 37 – Gráficos de (a) superfície resposta e (b) curva de nível do modelo
matemático gerado para o rendimento de imobilização (RI) da papaína nas membranas úmidas de CBOx-6-55. ... 109 Figura 38 – Gráficos de superfície resposta do modelo matemático gerado para (a)
atividade recuperada (AR) e (b) atividade imobilizada (AI) da papaína nas membranas úmidas de CBOx-6-55. ... 111 Figura 39 – Figura 39 – Curva de nível dos gráficos de superfície resposta da (a)
atividade recuperada (AR) e (b) atividade imobilizada (AI) da papaína nas membranas úmidas de CBOx-6-55. ... 112
Figura 40 – Perfil de desejabilidade das variáveis respostas: (a) rendimento de imobilização (RI), (b) atividade recuperada (AR) e (c) atividade imobilizada (AI). ... 113 Figura 41 – Valores preditos obtidos pela regressão matemática das equações
polinomiais do (a) rendimento de imobilização (RI), (b) atividade recuperada (AR) e (c) atividade imobilizada (AI). ... 115 Figura 42 – Curvas de (a) TGA e (b) DTG das membranas de CB-Papaína,
CBOx-Papaína e papaína (em pó) em atmosfera de ar sintético. ... 118 Figura 43 – Curvas de DSC das membranas de CB-Papaína, CB-5d-K2CO3,
CBOx-Papaína, CBOx-6-55 e da CBOx-Papaína, em panelinha hermética e atmosfera de N2. ... 120
Figura 44 – Imagens superior digitais e microscópicas, por fluorescência confocal, das membranas úmidas de (a) CB-5d-K2CO3, (b) CBOx-6-55, (c) papaína, (d)
CB-Papaína e (e) CBOx-Papaína (magnificação de 100x)... 122 Figura 45 – Perfil de difusão da papaína após 12 horas e 72 horas nas membranas
úmidas de (a) CBOx-Papaína e (b) CB-Papaína sob condições fisiológicas simulada à pele inflamada. ... 125 Figura 46 – Imagens superiores digitais do ensaio bacteriano, por difusão em disco, das
membranas úmidas de (A) CB-Papaína e (B) CBOx-Papaína. ... 128 Figura 47 – Perfil de absorção em soluções aquosas da membrana secas de (a)
CB-5d-K2CO3 e (b) CBOx-Papaína. ... 132
Figura 48 – Atividade hemolítica qualitativa, por difusão em placa de ágar-sangue, das membranas úmidas de (a) e (b) CB-5d-K2CO3 e (c) e (d) CBOx-Papaína.
Controle (e) negativo (NaCl, 0,9% m/v) e (f) positivo (saponina, 10% m/v). ... 136 Figura 49 – Estudo do tempo de coagulação das membranas úmidas de CB-5d-K2CO3
(curativo passivo) e CBOx-Papaína (curativo bioativo) após incubação com sague humano. ... 137
Figura 50 – Citotoxicidade indireta, obtida a partir dos extratos das membranas úmidas de CB-5d-K2CO3, CBOx-6-55 e CBOx-Papaína para (a) fibroblastos de
rato (L929) e (b) queratinócitos humano (HaCat). ... 139 Figura 51 – Micrografias das células (a) fibroblastos de rato (L929) e (b) queratinócitos
humanos (HaCat) após cultivo com os extratos da CB-5d-K2CO3,
CBOx-6-55 e CBOx-Papaína (aumento de 100x). ... 141 Figura 52 – Atividade metabólica de fibroblastos de pele humana aderidos sobre as
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Resumo dos métodos de caracterização de membranas e as propriedades desejáveis para um curativo sólido. ... 30 Tabela 2 – Variáveis independentes e seus níveis utilizados um Delineamento de
Composto Central Rotacional (DCCR). ... 59 Tabela 3 – Matriz experimental do Planejamento Composto Central Rotacional
(DCCR) para as variáveis independentes X1 (pH) e temperatura X2
(temperatura, ºC). ... 59 Tabela 4 – Teor de água das membranas úmidas de CB purificadas. ... 78 Tabela 5 – Efeito do tempo de fermentação e do tratamento alcalino na área superficial
e porosidade das membranas de CB. . ... 79 Tabela 6 – Grau de oxidação (GOx), perda de massa na reação e índice de cristalinidade
(ICr) das membranas de CBOx obtidas em diferentes condições de tempo (6, 16 e 24 horas) e temperatura (40 e 55 ºC) de oxidação. ... 85 Tabela 7 – Propriedades de tração das membranas úmidas de CB-5d-K2CO3 e
CBOx-6-55. ... ... 93 Tabela 8 – Matriz experimental do Planejamento Composto Central Rotacional para as
variáveis independente e os valores observados e previstos das variáveis respostas. ... 102 Tabela 9 – Análise de variância (ANOVA) do modelo polinomial obtido a partir do
rendimento de imobilização (RI) da papaína nas membranas úmidas de CBOx-6-55 (p < 0,01). ... 103 Tabela 10 – Análise de variância (ANOVA) do modelo polinomial obtido a partir da
atividade recuperada (AR) da papaína nas membranas úmidas de CBOx-6-55 (p < 0,01). ... 105 Tabela 11 – Análise de variância (ANOVA) do modelo polinomial obtido a partir da
atividade imobilizada (AI) da papaína nas membranas úmidas de CBOx-6-55 (p < 0,01). ... 107
Tabela 12 – Resultados de rendimento de imobilização (RI), atividade recuperada (AR), eficiência de imobilização (EI) e atividade imobilizada (AI) da papaína nas membranas úmidas de CB-5d-K2CO3 e CBOx-6-55 sob condição ótima a pH
7 e temperatura de 45 ºC. ... 116 Tabela 13 – Intensidades dos canais de emissão de fluorescência observados para a
papaína e para as membranas úmidas de celulose antes e após imobilização da enzima. ... 123 Tabela 14 – Parâmetros de difusão do modelo cinético de Korsmeyer-Peppas calculado
para as membranas úmidas de CB-Papaína e CBOx-Papaína. ... 126 Tabela 15 – Análise da formação de halo em cultivo bacteriano, por difusão em disco,
para as membranas úmidas de CB-5d-K2CO3 (sem papaína), CB-Papaína,
CBOx-6-55 (sem papaína) e CBOx-Papaína. ... 130 Tabela 16 – Propriedades físico-químicas, mecânicas e biológica para a membrana de
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AR Atividade recuperada ADP Adenosina difosfato ANOVA Análise de variância
ASTM American Society for Testing and Materials ATCC American Type Culture Collection
ATP Adenosina trifosfato
ATR Attenuated Total Reflection BET Brunauer-Emmett-Teller BJH Barrett-Joyner-Halenda
BOD Biochemical Oxygen Demand
bcs bacterial cellulose synthesis
CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute
CN China
CB Celulose Bacteriana
CBOx Celulose Bacteriana Oxidada DAC dialdehyde cellulose
DCCR Delineamento Composto Central Rotacional
DE Alemanha
DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium DRX Difração de Raio X
DSC Differential Scanning Calorimetry DTG Derivada termogravimétrica EDTA Ethylenediamine tetraacetic acid
eV Elétron-volts
FCS Fluído corpóreo simulado
FTIR Fourier Transform Infrared Spectroscopy GOx Grau de oxidação
G1P Glicose-1-fosfato G6P Glicose-6-fosfato HaCat Queratinócitos de gato
HDF Human Dermal Fibroblast
ICr Índice de Cristalinidade
IRL Irlanda
IUPAC International Union of Pure and Applied Chemists
JP Japão
LBB Laboratoire de Biomatériaux et de Bioingénierie LIBS Laboratório Integrado de Biomoléculas
LMA Laboratório de Microbiologia de Alimentos
LMAP Laboratório de Microbiologia Ambiental e do Pescado LTB Laboratório de Tecnologia da Biomassa
MEV Microscopia Eletrônica de Varredura
MPa Megapascal
MSR Metodologia de Superfície Resposta PBS Phosphate buffer saline
PPi pirofosfato
RI Rendimento de imobilização rpm Rotação por minuto
SQ Soma dos quadrados
SFB Soro fetal bovino
STA Simultaneous thermal analyser Td Temperatura de degradação
TCR Taxa de crescimento relativos para as células Tg Temperatura de transição vítrea
TGA Thermogravimetric analysis Tm Temperatura de fusão cristalina
TOnset Temperatura inicial de degradação
TSA Trypticase Soy Agar
TTVU Taxa de transmissão ao vapor de umidade UDP Uridina difosfato
UFC Unidade Formadora de Colónia UTP Uridina trifosfato
LISTA DE SÍMBOLOS A Área D Diâmetro eV Elétron-volts F Força L Largura m massa N Newton P Pressão Po Pressão inicial Q Capacidade de absorção
R2 Coeficiente de determinação para equação matemática
$ Dólar
€ Euro
® Marca Registrada
© Direito autoral (copyright) ΔH Variação de entalpia 3D Tridimensional θ Teta σ Tensão ε Deformação Δ Variação
β Termo independente para equação polinomial βI Coeficiente linear do pH para equação polinomial
βII Coeficiente linear da temperatura para equação polinomial
βIII Coeficiente quadrático do pH para equação polinomial
βIV Coeficiente quadrático da temperatura para equação polinomial
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 14
1.1 Organização e apresentação do trabalho ... 18
2 OBJETIVO ... 21
2.1 Objetivos específicos ... 21
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 22
3.1 Anatomia e fisiologia da pele ... 22
3.2 Visão geral sobre feridas ... 24
3.2.1 Processo de cicatrização de feridas ... 25
3.3 Características desejáveis para um curativo ... 27
3.3.1 Propriedades intrínsecas requeridas para um curativo sólido ... 29
3.4 Biopolímeros para curativos ... 31
3.4.1 Celulose ... 33
3.4.1.1 Celulose Bacteriana (CB) ... 34
3.5 Celulose bacteriana como curativo ideal ... 39
3.6 Celulose bacteriana: plataforma para imobilização de enzimas ... 42
3.7 Papaína como agente desbridante de feridas ... 47
3.8 Análise conclusiva da literatura consultada ... 50
4 MATERIAIS E MÉTODOS ... 52
4.1 Materiais ... 53
4.2 Métodos ... 53
4.2.1 Produção da celulose bacteriana (CB) ... 53
4.2.2 Purificação da membrana de CB ... 54
4.2.3 Oxidação da membrana de celulose ... 55
4.2.4 Otimização da imobilização da papaína na membrana de CB oxidada (CBOx-Papaína) ... 57
4.2.4.2 Ensaio de atividade da papaína ... 59
4.2.4.3 Variáveis resposta ... 60
4.2.4.4 Análise estatística ... 61
4.2.5 Imobilização da papaína na membrana de CB (CB-Papaína) ... 62
4.3 Técnicas de caracterizações química, física e biológica ... 62
4.3.1 Determinação da massa e espessura ... 64
4.3.2 Teor de água ... 64
4.3.3 Medida da área superficial e porosidade ... 64
4.3.4 Difração de Raios X (DRX) ... 65
4.3.5 Espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier (FTIR, Fourier transform infrared spectroscopy) ... 65
4.3.6 Análise termogravimétrica (TGA, Thermogravimetric analysis) ... 65
4.3.7 Calorimetria exploratória diferencial (DSC, Differential scanning calorimetry) ... 66
4.3.8 Espectroscopia Fotoelétrica de Raio X (XPS, X-ray Photoelectron spectroscopy) ... 66
4.3.9 Microscopia eletrônica de varredura (MEV) ... 66
4.3.10 Teste mecânico ... 67
4.3.11 Grau de oxidação (GOx) ... 67
4.3.12 Perda de massa na oxidação ... 68
4.3.13 Microscopia de fluorescência confocal ... 69
4.3.14 Ensaio de difusão em célula de Franz ... 69
4.3.15 Atividade antibacteriana ... 70
4.3.16 Absorção de soluções aquosas ... 71
4.3.17 Transmissão de vapor de umidade (TVU) ... 71
4.3.18 Tempo de coagulação ... 72
4.3.19 Teste de hemólise ... 73
4.3.21 Adesão celular ... 75
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 76
5.1 Membrana de CB e CB oxidada: propriedades e características morfológicas ... 76
5.1.1 Avaliação da CB purificada em diferentes tempos de fermentação ... 76
5.1.1.1 Característica estrutural da membrana ... 76
5.1.1.2 Propriedades físico-químicas ... 79
5.1.1.3 Avaliação morfólogica e cristalinidade ... 81
5.2.1 Avaliação das membranas de CB oxidada (CBOx) ... 84
5.2.1.1 Efeito da temperatura e tempo de oxidação ... 84
5.3.1 Avaliação conjunta das propriedades CB e CBOx ... 89
5.3.1.1 Caracterização da superfície das membranas ... 89
5.3.1.2 Propriedades mecânicas ... 92
5.3.1.3 Análises térmica ... 95
5.4.1 Comprovação da imobilização da papaína na CBOx ... 99
5.2 Otimização da imobilização da papaína em membranas heterofuncional de celulose bacteriana oxidada (CBOx) ... 102
5.2.1 Modelos polinomiais ... 103
5.2.1.1 Rendimento de imobilização ... 103
5.2.1.2 Atividade recuperada ... 104
5.2.1.3 Atividade imobilizada ... 106
5.2.2 Avaliação dos gráficos de superfície resposta ... 108
5.2.3 Otimização e teste de validação ... 113
5.2.4 Avaliação do suporte de imobilização ... 116
5.2.5 Análise das propriedades da CB-Papaína e CBOx-Papaína ... 117
5.2.5.1 Estabilidade térmica ... 118
5.2.5.2 Análise química ... 122
5.2.5.4 Atividade antibacteriana ... 128
5.3 Membrana de celulose bacteriana oxidada contendo papaína como potencial curativo bioativo para feridas: propriedades estruturais e biológicas ... 131
5.3.1 Avaliação das propriedades estruturais ... 131
5.3.1.1 Intumescimento em soluções aquosas ... 131
5.3.1.2 Transmissão ao vapor de umidade ... 133
5.3.2 Avaliação das propriedades biológicas ... 135
5.3.2.1 Hemocompatibilidade ... 135
5.3.2.2 Comportamento hemostático ... 137
5.3.2.3 Citocompatibilidade (in vitro) ... 138
5.3.2.4 Adesão celular ...,,... 141
6 CONCLUSÃO ... 144
6.1 Sumário dos resultados ... 144
6.2 Conclusão geral ... 147
7 SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS ... 149
REFERÊNCIAS ... 150
APÊNDICE A – CURVA PADRÃO DE CONCENTRAÇÃO DA TIROSINA ... 173
APÊNDICE B – CURVA PADRÃO DE CONCENTRAÇÃO DA PAPAÍNA ... 174
