Ressonância Magnética Nuclear Estrutural:

(1)

Ressonância Magnética Nuclear

Estrutural:

Aplicações em moléculas biológicas

protéicas em solução.

(2)

LABORATÓRIO DE SISTEMAS BIOMOLECULARES – DEPARTAMENTO DE FÍSICA – IBILCE UNESP SJRP

RMN x DRX

(em meados de 2004)

1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004

0

500 1000

1500

2000

2500

3000

3500

RMN

DRX

#

e

s

tr

u

tu

ra

s

d

e

p

o

s

it

a

d

a

s

n

o

P

D

B

ano

Hoje : 23.352 (DRX) + 3.626 (RMN) = 26.978

(3)

Vantagens

• Experimento realizado em solução aquosa

(mais próximo de condições in vivo;

• Não necessita de cristais;

• Uma gama de parâmetros pode ser obtido das

linhas de ressonância;

(4)

NMR APRESENTA UM LARGO ESPECTRO DE APLICA

NMR APRESENTA UM LARGO ESPECTRO DE APLICAÇ

Ç

ÇÕES

ÕES

ÁTOMOS

MOLÉCULAS

CÉLULAS

CORPOS

-Imagens tomograficas

-Microscopia

-Estrutura

--

NOEs

-

Deslocamento

Químico

-

Acoplamento

Escalar

-

Relaxação

-Dinâmica

-Espectroscopia

LABORATÓRIO DE SISTEMAS BIOMOLECULARES – DEPARTAMENTO DE FÍSICA – IBILCE UNESP SJRP

-Catálise enzimática

(5)

Propriedades magnéticas dos isótopos de

maior interesse para RMN de biomoléculas.

6,6 10

-2

9,2 10

-2

8,0 10

-1

2,7 10

-1

9,5 10

-4

1,0 10

-3

1,6 10

-2

-1,2

9,3 10

-3

1 Sensibilidade

Absoluta

6,6 10

-2

100 10,8

1/2

31 _P

9,2 10

-2

100 7,1

3/2

25 _Na

8,0 10

-1

100 25,2

1/2

19 _F

1,1 10

-5

0,004

-3,6

5/2

17 _O

3,8 10

-6

0,4

-2,7

1/2

15 _N

1,0 10

-3

99,6

1,9

1

14 _N

1,8 10

-4

1,1

6,7

1/2

13 _C

-98,9

-0

12 _C

-28,5

1/2

3 _H

1,4 10

-6

0,015

4,1

1

2 _H

1 99,985

26,7

1/2

1 _H

Sensibilidade

Relativa

Abundância

Natural (%)

F.Giromag.

γγγγ

I

Núcleo

(6)

Campo externo

até 20T (1GHz)

Excitação por radiação

Sinal captado

-FID-Conjunto das melhores

soluções possíveis

Amostra em solução

600µl a ~1mM

LABORATÓRIO DE SISTEMAS BIOMOLECULARES – DEPARTAMENTO DE FÍSICA – IBILCE UNESP SJRP

(7)

Spin I

Spin S

E

I

_x

I

_y

I

_z

E

S

_x

S

_y

S

_z

Spin I+S

E,

I

_z

, S

_z

, I

_z

S

_z

,

I

_x

,

I

_y

, S

_x

, S

_y

,

2I

_x

S

_z

, 2I

_y

S

_z

, 2I

_z

S

_x

, 2I

_z

S

_y

,

2I

_x

S

_x

, 2I

_y

S

_y

,

2I

_x

S

_y

, 2I

_y

S

_x

,

(8)

LABORATÓRIO DE SISTEMAS BIOMOLECULARES – DEPARTAMENTO DE FÍSICA – IBILCE UNESP SJRP

ESPECTROS 2D

(9)

COSY

- Acoplamento J

- Alcance de 3 ligações

Ven, F. J. M. v. d. (1995)

(10)

LABORATÓRIO DE SISTEMAS BIOMOLECULARES – DEPARTAMENTO DE FÍSICA – IBILCE UNESP SJRP

TOCSY

- Acoplamento J

- Alcança todo o sistema de spins

NOESY

- Acoplamento dipolar

-Alcança 5 Angstrons

- Intensidade

∝

1/r

6

(11)

NMR

(12)

LABORATÓRIO DE SISTEMAS BIOMOLECULARES – DEPARTAMENTO DE FÍSICA – IBILCE UNESP SJRP

ASSINALAMENTO DE RES

(13)

10

9

8

7

6

5

4

3

2

1 O

H

C

N

H

C

H

C

H

Deslocamentos químicos

HN, H

α

, H

β

, H

γ

1 ₁₂₃

, H

γ

2 _1,2,3

HN

H

α

H

β

H

γ

(14)

10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0

10

9

8

7

6

5

4

3

2

1

0 Acoplamento escalar (J)

HN – HA

O

H

C

H

C

H

N

C

(15)

10

9

8

7

6

5

4

3

2

1 Acoplamento escalar (J)

H

α

– H

β

O

H

C

N

H

C

H

C

H

(16)

10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0

10

9

8

7

6

5

4

3

2

1

0 Acoplamento escalar (J)

H

β

– H

γ

1 ₁₂₃

O

H

C

N

H

C

H

C

H

(17)

10

9

8

7

6

5

4

3

2

1 Acoplamento escalar (J)

H

β

– H

γ

2 ₁₂₃

O

H

C

N

H

C

H

C

H

(18)

10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0

10

9

8

7

6

5

4

3

2

1

0 Sistema de Spins

Valina

O

H

C

N

H

C

H

C

H

Espectro Tocsy

(19)

10

9

8

7

6

5

4

3

2

1 Segmento de peptídeo

Valina – Alanina

O

H

C

N

H

C

H

C

H

C

N

H

C

H

O

Espectro Tocsy

(20)

10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0

10

9

8

7

6

5

4

3

2

1

0 Segmento de peptídeo

Valina – Alanina

O

H

C

N

H

C

H

C

H

C

N

H

C

H

Espectro Noesy

O

LABORATÓRIO DE SISTEMAS BIOMOLECULARES – DEPARTAMENTO DE FÍSICA – IBILCE UNESP SJRP

(21)

10

9

8

7

6

5

4

3

2

1 Segmento de peptídeo

Valina – Alanina

O

H

C

N

H

C

H

C

H

C

N

H

C

H

Espectro Noesy

O

Noe ~1/r

6

(22)

10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0

10

9

8

7

6

5

4

3

2

1

0 Segmento de peptídeo

Valina – Alanina

O

H

C

N

H

C

H

C

H

C

N

H

C

H

Espectro Noesy

O

LABORATÓRIO DE SISTEMAS BIOMOLECULARES – DEPARTAMENTO DE FÍSICA – IBILCE UNESP SJRP

(23)

10

9

8

7

6

5

4

3

2

1 Segmento de peptídeo

Valina – Alanina

O

H

C

N

H

C

H

C

H

C

N

H

C

H

Espectro Noesy

O

Noe ~1/r

6

(24)

10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0

10

9

8

7

6

5

4

3

2

1

0 Noes de longa distância

(folha beta)

O

H

C

N

H

C

H

C

H

O

H

C

N

H

C

H

O

C

N

H

C

O

C

N

H

C

Espectro Noesy

(25)

10

9

8

7

6

5

4

3

2

1 Noes de longa distância

O

H

C

N

H

C

H

C

H

O

H

C

N

H

C

H

Espectro Noesy

O

C

N

H

C

O

C

N

H

C

(26)

10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0

10

9

8

7

6

5

4

3

2

1

0 O

H

C

N

H

C

H

C

H

O

H

C

N

H

C

H

Espectro Noesy

O

C

N

H

C

O

C

N

H

C

(27)

(28)

(29)

(30)

HA/HN

HB2/HA

HB3/HA

HB3/HB2

IDENTIFICANDO

UM

SISTEMA DE SPINS

(31)

HB2/HA

HB2/HAHB3/HB2

IDENTIFICANDO

OUTRO

SISTEMA DE SPINS

(32)

(2)HA/HN

(2)HB2/HA

(2)HB3/HB2

(1)HA/HN

(1)HB2/HA

(1)HB3/HA

(1)HB3/HB2

IDENTIFICANDO

SISTEMAS DE SPINS

(33)

(2)HA/HN

(2)HB2/HA

(2)HB3/HA(2)HB3/HB2

(1)HA/HN

(1)HB2/HA

(1)HB3/HA

(1)HB3/HB2

(1)HB3/HN

(1)HB2/HN

(2)HB3/HN

(2)HB2/HN

IDENTIFICANDO

SISTEMAS DE SPINS

(34)

HN

_i+1

/HA

_i

HN/HN

HN

_i

/Ha

_i-1

ASSINALAMENTO

SEQUENCIAL

HN

HA

CL

(35)

(36)

RESIDUE ASN 5 19 3 18 35 1 OMEGA -1 2 10.0000 2 1 3 4 0 2 PHI 0 0 0.0000 1 3 5 17 0 3 CHI1 1 3 1.3500 3 5 7 11 16 4 CHI2 0 0 0.0000 5 7 11 12 16 5 PSI 0 0 0.0000 3 5 17 19 0 1 C C_BYL 2 8.2024 -0.6824 -1.1357 0.0000 2 3 0 0 0 2 O O_BYL 2 -7.0004 -0.1723 -2.2550 0.0000 1 0 0 0 0 3 N N_AMI 2 -6.4912 0.0000 0.0000 0.0000 1 4 5 0 0 4 HN H_AMI 0 3.2103 -0.4226 0.9063 0.0000 3 0 0 0 0 5 CA C_ALI 3 1.1597 1.4530 0.0000 0.0000 3 6 7 17 0 6 HA H_ALI 0 0.3677 1.7394 -0.5422 0.9011 5 0 0 0 0 7 CB C_ALI 3 -2.1920 2.0038 -0.6938 -1.2474 5 8 9 11 0 8 HB2 H_ALI 0 1.0041 1.6375 -1.7196 -1.2891 7 0 0 0 10 9 HB3 H_ALI 0 1.0041 1.6375 -0.1881 -2.1409 7 0 0 0 10 10 QB PSEUD 0 0.0000 1.6375 -0.9538 -1.7150 0 0 0 0 0 11 CG C_BYL 2 8.3721 3.5338 -0.6925 -1.2451 7 12 13 0 0 12 OD1 O_BYL 2 -6.8307 4.1821 -1.1949 -2.1483 11 0 0 0 0 13 ND2 N_AMI 2 -8.1034 4.0726 -0.1015 -0.1825 11 14 15 0 0 14 HD21 H_AMI 0 3.6487 3.4834 0.2913 0.5236 13 0 0 0 16 15 HD22 H_AMI 0 3.6487 5.0670 -0.0498 -0.0896 13 0 0 0 16 16 QD2 PSEUD 0 0.0000 4.2752 0.1208 0.2170 0 0 0 0 0 17 C C_BYL 2 8.2024 1.9587 1.4440 0.0000 5 18 19 0 0 18 O O_BYL 2 -7.0004 1.1648 2.3835 0.0000 17 0 0 0 0 19 N N_AMI 2 -6.4912 3.2772 1.5756 0.0000 17 0 0 0 0

library

4 3.337 0.000 HA 1 6 2.680 0.000 HB2 1 7 2.567 0.002 HB3 1 9 6.384 0.002 QD 1 10 6.639 0.001 QE 1 27 3.559 0.001 HA 2 31 1.599 0.008 QB 2 35 1.074 0.000 QG 2 53 4.013 0.000 HA 3 57 1.840 0.003 QB 3 59 2.374 0.001 HG2 3 60 2.243 0.000 HG3 3 64 7.449 0.000 HE21 3 65 6.822 0.000 HE22 3 71 4.594 0.002 HA 4 73 3.132 0.004 HB2 4 74 3.078 0.000 HB3 4 80 4.932 0.000 HA 5 82 3.259 0.000 HB2 5 83 3.216 0.004 HB3 5 91 6.958 0.001 HD2 5 92 7.597 0.000 HE1 5 97 4.096 0.004 HA 6 101 1.964 0.000 QB 6 103 1.586 0.000 HG2 6 104 1.500 0.000 HG3 6 109 1.672 0.000 QD 6 113 2.944 0.000 QE 6 123 4.178 0.000 HA 7 125 1.731 0.006 HB2 7

Proton list

# Number of dimensions 2 #INAME 1 ? #INAME 2 ? 15 8.277 4.127 1 U 2.628e+03 0.00e+00 - 0 499 501 0 18 8.042 3.857 1 U 4.028e+03 0.00e+00 - 0 147 150 0 37 7.032 3.144 1 U 3.848e+03 0.00e+00 - 0 593 182 0 40 7.404 1.707 1 U 2.612e+03 0.00e+00 - 0 121 125 0 41 7.404 1.628 1 U 3.557e+03 0.00e+00 - 0 121 126 0 42 7.689 1.641 1 U 5.753e+03 0.00e+00 - 0 266 272 0 43 8.107 1.473 1 U 3.710e+03 0.00e+00 - 0 322 326 0 44 8.379 1.691 1 U 5.954e+03 0.00e+00 - 0 292 296 0 54 4.339 1.294 1 U 3.523e+03 0.00e+00 - 0 324 327 0 61 3.026 2.428 1 U 1.677e+04 0.00e+00 - 0 484 485 0 63 2.951 2.388 1 U 2.140e+04 0.00e+00 - 0 191 192 0 64 3.389 1.920 1 U 4.199e+03 0.00e+00 - 0 356 352 0 65 3.590 1.669 1 U 5.632e+03 0.00e+00 - 0 228 230 0 66 3.590 1.378 1 U 2.859e+03 0.00e+00 - 0 228 231 0 70 3.898 2.109 1 U 2.857e+03 0.00e+00 - 0 254 261 0

Peaks list

(37)

Problemas

• Superpopulação de picos nos espectros

e

• Alargamento das linhas de ressonância

com o aumento do tamanho da molécula,

reduzindo a sensibilidade

limitam a aplicabilidade da técnica a

pequenas moléculas

(38)

• Enriquecimento isotópico de proteínas

recombinantes com

15 _{N e}

13 _{C e espectros}

multidimensionais

Soluções

LABORATÓRIO DE SISTEMAS BIOMOLECULARES – DEPARTAMENTO DE FÍSICA – IBILCE UNESP SJRP

HNCO

1 _J

_C_α_CO

Experiment

Correlations observed

Magnetization transfer

J Couplings

HNCA

HN(CO)CA

H(CA)NH

HNCO

HN(CA)CO

(40)

S

de Fernandez C, Wuthrich K. NMR solution structure determination of membrane proteins reconstituted in detergent micelles.FEBS Lett. 2003 Nov

27;555(1):144-50. Review.

Soluções

• Espectroscopia de relaxação transversa optimizada - TROSY