Anais do Conic-Semesp. Volume 1, 2013 - Faculdade Anhanguera de Campinas - Unidade 3. ISSN 2357-8904
TÍTULO: PADRÃO DE EXPRESSÃO DE UROCORTINA NO NÚCLEO EDINGER-WESTPHAL DE POMBOS FRENTE AO ESTRESSE ALCOOLICO
TÍTULO:
CATEGORIA: CONCLUÍDO
CATEGORIA:
ÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E SAÚDE
ÁREA:
SUBÁREA: BIOMEDICINA
SUBÁREA:
INSTITUIÇÃO: UNIVERSIDADE CIDADE DE SÃO PAULO
INSTITUIÇÃO:
AUTOR(ES): FERNANDA SOARES QUINTEIRO GOMES DA SILVA
AUTOR(ES):
ORIENTADOR(ES): RENATO FIGUEIREDO DE SANTANA
PADRÃO DE EXPRESSÃO DE UROCORTINA NO NÚCLEO EDINGER-WESTPHAL DE POMBOS FRENTE AO ESTRESSE ALCOOLICO
1. Resumo
O processamento neural de estímulos estressores, assim como o consumo de alimentos e alcool envolve vasta circuitaria neural. Uma das áreas possivelmente envolvidos nesta circuitaria é o núcleo Edinger-Westphal de projeção central (Ewcp), cujos neurônios são peptidérgicos. Além do Ewcp, o núcleo de Edinger-Westphal também possui outra subdivisão, com função oculomotora parassimpática e neurônios colinérgicos, denominado pré-gaglionar (Ewpg). No EWcp há, aparentemente, uma proeminente espressão de urocortina 1 (UCN-1), um neuropeptídeo membro da ampla família do(s) fator(es) liberador(es) de corticotrofina (CRH) envolvida na resposta ao estresse. Estudos revelam que a indução de drogas, como álcool, pode influenciar a expressão de fatores de transcrição como a proteina nuclear c-Fos no EW, sugerindo que este núcleo possa desempenhar um papel importante na resposta ao álcool. No experimento, utilizamos 16 pombos adultos, sendo 4 controles e 12 experimentais. Durante um período de trinta dias, todos os animais eram pesados e, recebiam gavagens de álcool (experimental) ou água (controle) de acordo com seu peso. Ao final do procedimento, os animais foram perfundidos, seus encéfalos retirados, seccionados, processados imunohistologicamente com anticorpos contra UCN-1 e c-Fos e analisados. A contagem de células imunorreativas no EWcp revelou que nos pombos os quais a gavagem continha álcool, a expressão de células marcadas contra UCN-1 e c-Fos era maior que aqueles cujo a gavagem continha água A diferença encontrada na imunomarcação deixa-se supor uma relação entre o estresse alcoólico sofrido pelo animal e o incremento da atividade neural em neurônios UCN-1+ no núcleo de Edinger-Westphal evidenciada pela expressão de c-Fos. Em conclusão, nossos dados corroboram com os dados da literatura indicando o sistema urocortinérgico presente no EWcp desempenha um papel importante na adaptação ao estresse alcoólico.
O núcleo de Edinger-Westphal (EW) é conhecido como o núcleo acessório parassimpático do complexo nuclear do oculomotor (Klooster et al, 1993), fonte de motoneurônios pré-ganglionares parassimpáticos para o gânglio ciliar, através do qual, controla a constrição da pupila e acomodação da lente. Uma nova visão consta que o EW pode ser dividido em duas distintas populações neuronais, de acordo com a conectitividade: uma colinérgica com função oculomotora parassimpática, denominado Ewpg (EW pré-ganglionar) e outra peptidérgica, relacionado com estresse e consumo de álcool e alimentos, o Ewcp ( EW de projeções centrais). O Ewcp também pode ser denomeado npEW (EW não pré-ganglionar) (Saper et al, 1976; Burde et al., 1982; Vasconcelos et al, 2003;. Ryabinin et al, 2005;. Laursen e Rekling, 2006; L. Xu et al, 2009, Kozicz, 2011).
A urocortina 1 (UCN-1) é um neuropeptídeo membro da ampla família do(s) fator(es) liberador(es) de corticotrofina (CRH) expressa em muitas regiões do Sistema Nervoso, mas em grande parte no núcleo não-pré-ganglionar de Edinger-Westphal (npEW) (Kozicz et al, 1998; Skelton et al, 2000; Bittencourt et al, 1999; Fekete & Zorrilla, 2006; Ryabinin et al, 2005; Xu et al, 2009).
A substância UCN-1 está potencialmente relacionada com a modulação do eixo hipotálamo-adreno-hipofisiário e particularmente envolvida em respostas de estresse. As corticotrofinas são parte integrante da cascata de eventos fisiológicos de indivíduos submetidos a uma carga de estresse, cujas alterações orgânicas são típicas de um aumento da ativação simpática. Sendo assim neurônios no npEW-UCN-1 respondem fortemente e selectivamente a paradigmas de vários estresse, incluindo ao alcóolico. (Weninger et al, 1999, 2000; Gaszner et al, 2004; Korosi et al, 2005; Kozicz, 2007, Xu et al, 2009)
Os IEGs (genes de ativação imediata ou “immediate early genes”) foram descritos como uma classe de genes que aparentemente expressam-se de forma diversa, em diferentes áreas do SNC, após estimulação específica. São considerados como marcadores de atividade celular, que promovem alterações a longo prazo em certos aspectos da fisiologia neuronal. Um desses genes é a proteína nuclear c-Fos, produzida mediante a ativação neuronal após diversos
estímulos como exemplo a despolarização de neurônios e o estresse. (Ryabinin et al, 1995; PRADO & DEL BEL, 1998).
Trabalhos de diversos grupos têm concordado que a(s) função(ções) do sistema urocortinérgico central parecem convergir para algum papel na resposta fisiológica ao estresse (Fekete e Zorrilla, 2006). Bachtell et al (2002) tem mostrado elevação de expressão de fatores de transcrição durante a exposição a drogas, sugerindo que o EW esteja envolvido neste processo.
Este trabalho visou ampliar e aprofundar o conhecimento dos mecanismos neurais envolvidos em situações de estresse relacionadas a exposição a drogas, no caso etanol. Para isso, estabelecemos uma relação entre a expressão de neurônios UCN-1+ e a imunomarcação da proteína c-Fos no núcleo de Edinger-Westphal (EW) durante o estresse alcóolico utilizando como modelo experimental pombos.
3. Objetivos
Caracterizar morfologicamente e quantificar possíveis diferenças na expressão da proteína c-Fos na região do núcleo de Edinger-Westphal (EW) em resposta ao estresse alcoólico.
4. Metodologia
Para alcançar os objetivos propostos, os animais foram submetidos a gavagens com etanol ou água e após, utilizamos as técnicas de imunohistoquímica, dosagem alcoólica e para análise quantitativa, foi realizada contagem celular.
5. Desenvolvimento
Foram utilizados 16 animais adultos (pombo – Columba livia), sendo, 4 controles e 12 experimentais.
Os animais foram mantidos no biotério do Laboratório de Neurociências da UNICID com ciclo de luz claro-escuro de 12/12 horas, temperatura controlada e com água e alimentação irrestritas. Todos os experimentos foram conduzidos segundo as rígidas normas do Conselho Brasileiro de
Experimentação Animal, dentro dos princípios éticos que norteiam a atividade científica.
Os animais foram mantidos em jejum por 4 horas, pesados e, através de gavagem, administrado o volume determinado de aguardente de acordo com o peso corpóreo, por um período de 60 dias, numa freqüência de cinco vezes por semana.
As dosagens de álcool no sangue foram feitas através de um método de análise enzimática via fotometria, utilizando um leitor de para teste Elisa (Versamax) e comparada (concentração alcoólica) com a tabela de estágios de influência alcoólica, sugerida pelo Departamento de Adolescência da Sociedade Brasileira de Pediatria (2007).
Para os estudos imunohistoquímicos, os animais foram anestesiados e perfundidos por via intracardíaca com salina tamponada (pH 7,4) seguido de solução de paraformaldeído a 4% em 0.1M de tampão fosfato (PFA 4%). Os cérebros foram removidos, pós-fixados (PFA 4%) e crioprotegidos em solução com sacarose a 30% para serem seccionados em micrótomo de congelamento.
Em cada etapa do processo de imunohistoquimica, os tecidos foram lavados em solução tampão 0,1M em temperatura ambiente por aproximadamente 30 minutos.
Os cortes de um compartimento foram incubados, por 24 horas a 4C, com o anticorpo primário contra c-Fos 1: 20 000 (Sigma-Aldrich, S. Louis, MO, USA) Os cortes foram então incubados por uma hora com o anticorpo secundário contra as imunoglobulinas do animal em que foi feito o anticorpo primário (Jackson Immuno Research, USA) marcado com biotina. A seguir, os tecidos foram colocados por uma hora numa nova solução onde se incluia o complexo avidina-biotina-peroxidase (ABC ELITE kit, Vector Labs.)e revelados pelo método da peroxidase, na presença de solução de sulfato de níquel cromo
Os cortes sofreram nova reincubação, passando pelos mesmos processos, apenas substituindo o anticorpo primário por outro anticorpo primário, agora contra UCN-1 1:1000 (gentilmente doados pelo SalK Instiute,
La Jolla, CA - USA) e revelado sem a presença de níquel-cromo.
Alguns cortes também foram corados pelo método de Giemsa para servir de referência para a citoarquitetura.
Os cortes foram montados em lâminas tratadas com gelatina e banhados em tetróxido de ósmio 0,1% por 15-30 segundos, tratados com a série de álcool em concentrações crescentes, clarificantes (Citrisolv, Fisher) e cobertas com lamínulas tendo com meio de montagem Permount (Fischer).
Uma vez prontos, os tecidos foram observados em microscopia de campo claro para quantificação dos dados obtidos.
6. Resultados
Os experimentos imunohistoquímicos permitiram identificar a presença da expressão de proteína c-Fos em neurônios urocortinérgicos de animais que receberam etanol (figura 1 A) e animais controle (figura 1 B).
A marcação c-Fos+ na região do EWcp ocupou não apenas a região nuclear da células, como foi uma marcação que estava distribuída em todo o citoplasma. A expressão de c-Fos foi visualmente maior em pombos que receberam gavagens com etanol (figura 1).
Figura 1: Fotomicrografias de corte coronal do encéfalo de pombo processadas imunohistoquimicamente com anticorpos contra a proteína c-Fos e contra a proteína UCN-1 adquirida da empresa Salk. Podemos notar na figura A, encontra-se uma maior expressão de células reativas comparadas a figura B.
Na contagem de células imunorreativas no núcleo EW, foi observado que os pombos na qual a gavagem continha álcool, a expressão de células marcadas contra UCN-1 e c-Fos era maior que aqueles cujo a gavagem continha álcool (fig.3).
Figura 2: Gráfico da contagem de imunomarcação de UCN-1 + c-Fos, comparando a quantidade de células imunorreativas em animais que receberam gavagem com agua (controle) e animais cujo a gavagem continha etanol (álcool).
A determinação da concentração de etanol em amostras de sangue de pombos (tabela 1) foi comparada a tabela de estágios de influência alcoólica (fig.3), sugerida pelo Departamento de Adolescência da Sociedade Brasileira de Pediatria (2007), demostrando que os animais que receberam gavagem com álcool estavam em estagio de euforia e agitação.
ESTÁGIOS DA INTOXICAÇÃO ALCOOLICA AGUDA
Figura 3 Estágios de influência alcoólica segundo o Departamento de Adolescência da Sociedade Brasileira de Pediatria (2007).
Dosagem de álcool no sangue Amostra Concentração Estágio
Experimental (com álcool) 0,9 g/l Euforia/excitação Controle (sem álcool) 0 g/l Não alcoolizado
Tabela 1: Concentração de álcool no sangue de pombos que receberam gavagem com água (controle) e animais que receberam gavagem com etanol (experimental).
. 5. Considerações finais
Nossos resultados demonstraram a presença de células UCN+ na região perioculomotora, especificamente no núcleo de Edinger-Westphal, confirmando resultados de estudos anteriores (Chang et al, 1995;. Bachtell et ai, 1999; Ryabinin et al, 2001; Weitemier et al, 2001).
Além disso, o mapeamento da co-localização de c-Fos e UCN-1 em pombos submetidos a administração de álcool, aponta um possível envolvimento de células urocortinegicas presentes EW neste mecanismo estressor. Os dados revelaram uma maior expressão de células imunoreativas
em animais que receberam gavagem de álcool, assim como sugerido por Bachtell et al. (2003) provavelmente por fazer parte de eventos fisiológicos de uma via alternativa de resposta ao estresse.
As células de UCN-1 no EWcp estão envolvidos em processos de adaptação ao estresse, podendo ser a chave para a identificação e caracterização de regiões do cérebro que regulam o consumo de álcool e para a compreensão dos mecanismos de alcoolismo. Mais esforços são necessários para elucidar o papel da UCN no EW para o consumo de álcool.
A utilização de c-fos é vastamente utilizada na literatura para identificar mudanças de atividade em situações agudas. Korosi et al. (2005) mostraram que a expressão de mRNA para Fos acontece em situações agudas quanto em situações crônicas, porém em situações crônicas pode haver um declínio da robustez da expressão.
Em um elegante artigo de revisão, Ryabinin and Wetemier (2006) mostraram evidências do envolvimento do sistema urocortinérgico no consumo alcoólico que levam a três hipóteses: 1) neurônios urocortinérgicos são extremamente sensíveis ao álcool; 2) o circuito urocortinérgico pode contribuir para predisposição genética ao consumo de álcool em ratos e camundongos e 3) manipulação do sistema urocortinérgico altera consumo e sensitividade ao álcool.
Em conclusão, nossos dados identificaram um aumento na expressão de c-fos em neurônios urocortinérgicos do núcleo EWcp em pombos submetidos a ingestão alcoólica, revelando um possível envolvimento deste sistema em situações de estresse alcoólico.
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