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Kit de Tipagem HLA MIA FORA™ NGS
Para utilização em diagnósticos In Vitro
ÍNDICE
Definições dos Símbolos……….…. 1 Recolha e Preparação da Amostra………
4
Reagentes por número de catálogo…………..………
2
Procedimento………
5
Utilização Prevista……….…… 3 A.
Materiais Fornecidos………
5
Sumário e Explicação……… 3 B. Materiais Necessários, mas não Fornecidos...
5
Princípios do Procedimento……….… 3 Instruções de Utilização………..
5
Reagentes………... 3 Controlo de Qualidade……….
12
A.
Identificação……….………...
3
Limitações do Procedimento………..
12
B. Advertências e Precauções...
3
Características de Desempenho Específicas………..
13
C.
Instruções de
Armazenamento………..
4
Resolução de Problemas………
14
D. Purificação ou Tratamento para a Utilização…...
4
Licenças Limitadas……….………….…………
15
E.
Indicações de Instabilidade………..
4
Informação do Fabricante………..…
15
Requisitos dos Instrumentos………..
4
Marcas Registadas Utilizadas………
15
Definições dos Símbolos
Código do Lote Número de Catálogo Limites de temperatura
Utilizar até
Número de Série
NS
Suficiente para N testesPrecaução Consulte as instruções
antes de utilizar Fabricante
Representante Autorizado na Comunidade Europeia
Dispositivo Médico para
Diagnóstico In Vitro Contém
CONT
Conformidade Europeia08
Fall
REAGENTES POR NÚMERO DE CATÁLOGO
Peça do Kit Principal HLA MIA FORA NGS Número SR-800-10377 consistindo num Kit de Reagente de Tipagem HLA MIA
FORA NGS (SR-800-10365) e num Kit de Esferas Magnéticas HLA MIA FORA NGS (SR-800-10379).
Kit de Reagente de Tipagem HLA (SR-800-10365) MIA FORA NGS:
a)
Reagentes da PCR (Reação em Cadeia da Polimerase): Consistem em nove (9) frascos-ampola individuais
Reagente Número de Produto Volume de Enchimento Armazenamento 24 1 Mistura PCR HLA-A SR‐800‐00326 450µl -20 a -80°C 2 Mistura PCR HLA-B SR‐800‐00327 3 Mistura PCR HLA-C SR‐800‐00328 4 Mistura PCR HLA-DPA1 SR‐800‐00329 5 Mistura PCR HLA-DPB1 SR‐800‐00330 6 Mistura PCR HLA-DQA1 SR‐800‐00331 7 Mistura PCR HLA-DQB1 SR‐800‐00332 8 Mistura PCR HLA-DRB1-S SR-800-00333 9 Mistura PCR HLA-DRB1-L SR-800-00334
b)
Reagentes de Preparação da Biblioteca: Consistem em doze (12) frascos-ampola individuais
Reagente Número de Produto Volume de Enchimento Armazenamento 24 10 Enzima de Fragmentação SR-800-00335 67 µl -20 a -80°C 11 Tampão de Fragmentação SR-800-00336 168 µl 12 Tampão STOP SR-800-00337 225 µl 13 Mistura de Enzima de Reparação Final SR-800-00338 34 µl 14 Tampão de Reparação Final SR-800-00339 168 µl
15 Enzima de cauda poli-A SR-800-00340 17µl 16 Tampão de cauda poli-A SR-800-00341 118 µl 17 Enzima de Ligase SR-800-00342 34 µl 18 Tampão de Ligase 2X SR-800-00343 917 µl 19 Enzima /Mistura Tampão da PCR SR-800-00344 84 µl 20 Iniciadores (primers) de Amplificação SR-800-00345 12 µl
21 Água sem nucleases SR-800-00362 85 µl
c)
Placa Adaptadora (SR-800-00349):
Descrição Número da Peça Volume de
Enchimento
Armazenamento Placa Adaptadora Indexadora
Três colunas preenchidas de uma placa de 96 poços
SR-800-00349 5 µl/poço -20 a -80°C
Kit de Esferas Magnéticas (SR-800-10379):
a)
Esferas Magnéticas: Consistem em um (1) frasco-ampola
Descrição Número da Peça Volume de
Enchimento Armazenamento Frasco-ampola Preenchido, Esfera XP Agencourt® AMPure® SR-800-00378 5ml 2 a 8°C
UTILIZAÇÃO PREVISTA
O kit de tipagem HLA MIA FORA
TMNGS serve para a amplificação e sequenciação de genes HLA, HLA -A, -B, -C,
-DRB-1/3/4/5, -DQA1, -DQB1, -DPA1 e -DPB1 na plataforma de sequenciação Illumina NGS. O software MIA FORA destina-se a ser
usado na determinação da tipagem HLA a partir dos dados gerados com o kit de biblioteca HLA MIA FORA NGS. Este teste
destina-se a ser usado num laboratório competente nos procedimentos de amplificação e sequenciação de ADN.
SUMÁRIO E EXPLICAÇÃO
A tipagem baseada em sequência de exões de genes HLA amplificados pela PCR é um procedimento laboratorial comum. A
amplificação pela PCR é usada para enriquecer as sequências-alvo e a tipagem HLA subsequente é determinada para as
regiões selecionadas. Outros métodos, como por exemplo sondas de oligonucleótidos específicas de sequências (SSOP),
ensaios de extensão de iniciadores específicos de sequências (SSP) também foram utilizados para determinar a tipagem HLA.
O sistema de tipagem HLA MIA FORA NGS é uma nova metodologia de tipagem HLA que tira partido da capacidade de cobrir
todas as regiões relevantes do lócus HLA através da PCR de longo alcance. Nove misturas principais da PCR que contêm
todos os componentes necessários para amplificar cada gene, inclusive as enzimas, os tampões, os dNTPs (Deoxinucleotide
Trifosfați) e os iniciadores para a amplificação pela PCR de longo alcance são fornecidos no kit. O ADN amplificado pode
depois ser processado através do kit de biblioteca HLA MIA FORA NGS para gerar uma biblioteca de ADN para a
sequenciação na plataforma de sequenciação Illumina. O kit permite a sequenciação de 24 amostras de forma múltipla através
da plataforma de sequenciação Illumina.
PRINCÍPIOS DO PROCEDIMENTO
O kit de tipagem HLA MIA FORA NGS foi concebido para determinar a tipagem de lócus HLA de Classe I e Classe II através da
sequenciação do gene inteiro ou dos exões e intrões com mais informação. O kit de tipagem HLA MIA FORA NGS faz uso da
PCR de longo alcance para capturar e enriquecer os principais genes HLA, HLA -A, -B, -C,-DQA1,-DQB1, -DPA1 –DPB1, e –
DRB1/3/4/5. O kit de reagentes de Preparação de Biblioteca MIA FORA NGS gera uma biblioteca para o ADN amplificado para
sequenciação na plataforma de sequenciação Illumina. O software de tipagem HLA MIA FORA NGS oferece a sequenciação
dos genes HLA relevantes e informação da fase para conseguir uma tipagem HLA de alta resolução.
REAGENTES
A. Identificação
Consulte as tabelas na secção de Reagentes por Número de Catálogo para uma lista completa de produtos e números de catálogo.
B. Advertências e Precauções
1. Apenas para a Utilização em Diagnósticos In Vitro dentro da União Europeia.
2. O resultados obtidos a partir destes kits não deverão ser usados como o único critério para a tomada de uma decisão clínica que afete o doente.
3. Deverão ser designados laboratórios ou espaços laboratoriais fechados diferentes para manipulações Pré-PCR assim como para manipulações Pós-PCR.
4. Deverão ser designadas pipetas diferentes para manipulações Pré-PCR assim como para manipulações Pós-PCR. 5. Perigo biológico: Todas as amostras de material biológico ou de sangue deverão ser tratadas como potencialmente
infeciosas. Utilize as Precauções Universais quando as manusear.
6. Nunca deve pipetar com a boca. Evitar o contacto dos reagentes e das amostras com a pele ou com membranas mucosas. 7. Eliminar os materiais usados de acordo com os regulamentos locais e/ou institucionais para a eliminação de materiais
potencialmente perigosos biologicamente.
8. A tecnologia PCR é suscetível de contaminação, principalmente do próprio produto. Os aerossóis dos amplicões da PCR que são gerados durante os passos pós-PCR são uma fonte frequente de contaminação. Por isso, deverão ser tomadas precauções para evitar salpicos ou geração de aerossóis excessivos. Os procedimentos laboratoriais padrão para a PCR que incluem a limpeza das superfícies de trabalho, antes do processamento ou a preparação de amostras PCR, com lixívia a 10% recentemente preparada, a utilização de luz ultravioleta (UV) em hottes ou em câmaras de fluxo laminar entre utilizações, a separação em tempo e espaço das atividades pré e pós-PCR, a utilização de reagentes PCR divididos em partes iguais, a utilização de controlos positivos e negativos, etc. também deverão ser seguidos durante a utilização do kit. A utilização de uma técnica consistente e cuidadosa em conjunto com uma incorporação e monitorização liberal dos controlos irá assegurar uma abordagem atenta e pró-ativa a fim de controlar e monitorizar a contaminação da PCR. 9. Os laboratórios deverão validar os seus próprios procedimentos de limpeza.
10. A contaminação de reagentes ou espécimes poderá causar resultados errados; por isso, deverão ser tomados cuidados para evitar a contaminação deste produto durante a sua utilização. Não utilize reagentes contaminados.
11. Utilize os líquidos do kit conforme foram fornecidos. Qualquer diluição ou alteração poderá gerar resultados errados. Não misture reagentes entre lotes diferentes.
12. Não utilize frascos-ampola com fugas ou sem rótulo.
13. Amostras ou reagentes previamente congelados deverão ser misturados totalmente e centrifugados após descongelação e antes da realização do teste. Evite a formação de espuma e de bolhas nas amostras.
14. Durante a utilização, mantenha todas as enzimas e misturas principais em gelo ou num recipiente criogénico (2 - 8°C), enquanto estão a descongelar.
16. Devido a diferenças inerentes nos mecanismos de desempenho do termociclador, poderão ocorrer variações nos resultados quando os perfis térmicos definidos são transferidos entre instrumentos termocicladores de diferentes marcas ou modelos. Em alguns casos, a especificidade e a sensibilidade da reação poderá ser comprometida, levando à falsa interpretação e leitura dos dados. Termocicladores e perfis alternativos terão de ser validados pelo utilizador.
17. Os tempos de incubação ou temperaturas diferentes daqueles especificados poderão dar resultados errados.
18. Qualquer incumprimento das instruções de utilização recomendadas poderá resultar num desempenho do produto inferior ao ideal. Dependendo da natureza e da gravidade do incumprimento, poderão ocorrer falhas no ensaio (em amostras individuais assim como falhas na execução) e/ou resultados errados. Por exemplo, determinámos que uma limpeza insuficiente/inativa das esferas durante o ensaio poderá resultar numa alta incidência de falhas de chamadas no adaptador indexador.
19. Recomenda-se que se realize uma eletroforese em gel para a análise dos produtos de amplificação do gene HLA por tamanho. Os produtos de PCR deverão serão visualizados com brometo de etídio ou GelRed; outros corantes poderão apresentar bandas mais ténues.
20. As esferas magnéticas são utilizadas em vários passos do protocolo. É importante remover o etanol antes de continuar o passo de eluição sem permitir que as esferas fiquem demasiado secas. A superfície das esferas magnéticas deverá ter um aspeto vítreo sem fundos líquidos visíveis. O tempo apropriado de secagem poderá ser determinado empiricamente para cada ambiente laboratorial (5-10 minutos).
21. Utilize etanol a 80% diluído recentemente para a limpeza de cada esfera.
22. Depois de cada limpeza da esfera existe um ponto de paragem de segurança durante o qual as amostras ou a biblioteca poderão ser armazenadas a -20ºC até 4 dias.
23. Proteja as placas PicoGreen® da luz para evitar a descoloração.
24. É fundamental que a reação de fragmentação não exceda os 20 minutos e que a limpeza da esfera seja executada imediatamente, de forma a assegurar uma gama de tamanho de fragmentação correta.
25. A placa de cauda poli-A deverá seguir diretamente para o passo de ligação ao adaptador.
26. Ao preparar a placa de ligação ao adaptador indexador, use luvas novas enquanto estiver a manusear a placa do adaptador. Remova cuidadosamente a selagem da placa. Verifique se todas as cavidades nas colunas 1, 2 e 3 contêm cerca de 5 µl de solução.
27. A biblioteca amplificada deverá ser purificada no prazo de uma hora após a amplificação.
28. Os passos de pós-amplificação da biblioteca deverão ser realizados numa sala de sequenciação ou numa caixa PCR AirClean para evitar a contaminação entre o ADN ligado com o adaptador-indexador e os produtos finais que contêm os clusters de sequências Illumina.
29. A configuração para a quantificação da biblioteca por qPCR ou Qubit deverá ser efetuada numa hotte de PCR e com um tampão de diluição recentemente preparado para qPCr, no sentido de evitar uma contaminação.
30. Leve a cabo uma desnaturação da amostra com hidróxido de sódio 0,2N preparado recentemente.
31. Leve a cabo todas as lavagens pós-corrida e manutenção do sequenciador, assim como as limpezas regulares.
C. Instruções de Armazenamento
1. Armazene o kit de tipagem HLA MIA FORA NGS abaixo de -20ºC num congelador manual sem gelo. 2. Não use componentes após a sua data de validade.
3. Armazene as esferas magnéticas entre 2 e 8ºC.
D. Purificação ou Tratamento Necessário para a Utilização
Ver "Recolha e Preparação da Amostra."E. Indicações de Instabilidade
1. Caso os sais tenham precipitado fora da solução durante a expedição ou armazenamento, ressolubilize-a completamente antes da utilização misturando em vórtex à temperatura ambiente (18 a 30ºC).
REQUISITOS DOS INSTRUMENTOS
1. Termociclador equipado com uma tampa de aquecimento, tempos de rampa ajustáveis e uma gama térmica mínima entre 2ºC e 100ºC, com uma precisão de pelo menos +/- 0,5°C. As condições para os termocicladores poderão precisar de ser alteradas de forma a otimizar os seus perfis. Foi validado o termociclador Veriti da Applied Biosystems, quando operado no modo pré-definido com uma taxa de rampa de (3,9ºC/seg).
2. Foi validado um leitor de placa fluorescente apropriado com um filtro de excitação de ~ 485 nm e um filtro de emissão de ~ 535 nm para medir a concentração de ADN, como por exemplo o Victor X2, X3.
3. Método/aparato apropriado para o isolamento e purificação de fragmentos de ADN de cerca de 400-500 pares de bases de tamanho. Foi validado um destes instrumentos de seleção de tamanho Pippin PrepTM.
4. Sistema opcional para manuseamento de líquidos para a construção semi-automática de bibliotecas. Foi validado um desses sistemas, o Biomek 4000.
5. Método/aparelho apropriado para a quantificação da biblioteca, como por exemplo qPCR ou Qubit. 6. Foi validada uma plataforma de sequenciação Illumina.
7. Servidor e Software MIA FORA NGS: Número de Peça Immucor SR-790-00017.
RECOLHA E PREPARAÇÃO DA AMOSTRA
O ADN genómico humano pode ser purificado a partir de sangue total e camadas leucocitárias através de um método validado que satisfaça os seguintes critérios. O ADN extraído do sangue preservado em EDTA foi testado e ficou demonstrado que tem o desempenho esperado para a realização deste ensaio. O ADN extraído do sangue preservado em heparina não pode ser usado neste ensaio.
O ADN isolado deverá estar em 10 mM Tris-HCl, pH 8,0-9,0, ou em água livre de nucleases. Se um agente quelante, como por exemplo o EDTA, estiver presente, a concentração final do agente quelante não deverá exceder os 0,5 mM.
A concentração final do ADN deverá situar-se entre os 5 e os 15 ng/µl.
As medidas da absorvância da amostra de ADN nos 260 e nos 280 nm deverão dar uma razão entre 1,65 e 2,0.
O ADN poderá ser usado imediatamente após o isolamento ou armazenado a –20ºC durante até 1 ano. O congelamento/descongelamento repetido deve ser evitado, dado que pode resultar na degradação do ADN.
Pelo menos 50% das amostras de ADN genómico deverão ter fragmentos superiores a 10 kb para uma amplificação PCR de longo alcance bem sucedida.
PROCEDIMENTO
A
.
Materiais Fornecidos
(Consultar a tabela na secção de Reagentes por Número de Catálogo para informações específicas)
Reagentes de PCR
Reagentes para preparar a biblioteca, a placa de adaptador indexador e as esferas magnéticas Ampure®
B
.
Materiais, Reagentes e Equipamentos Necessários, mas Não Fornecidos
Termocicladores: O Termociclador ABI Veriti ® foi validado.
Suportes magnéticos para a eluição de baixo volume em placas de 96 poços: A Alpaqua Magnum FLX foi validada.
O suporte magnético para a separação magnética de tubos de microcentrifugadora: o DynaMag-2 Magnet foi validado
Centrifugadora de placa de mesa e microcentrifugadora de tubos.
Pipetas, pipetas multicanal e pontas (1-20µl, 20-200µl, 1000µl)
Vedantes adesivos para placas PCR. O filme adesivo PCR Accuseal (E & K Scientific cat. no. T796150, 4titude cat. no. 4ti-0500) foi validado
Tubos de centrifugação de 1,5ml e tiras de tubos PCR.
Misturador em vórtice
Placas com semi-saia de 96 poços, rígidas, de altura máxima(E & K Scientific cat. no. EK-75012, 4titude cat. no. 4ti-0770/C)
Placa de 96 poços Preta PP, estilo chaminé, fundo em v (E & K Scientific cat. no. 21209, Greiner Bio-One cat. no. 651209)
Placa de Reação Ótica de 96 poços MicroAmp® (ThermoFisher cat. no. N8010560)
Fita de selagem ótica, adesivo avançado MicroAmp® (E & K Scientific cat. no. T796400, ThermoFisher cat. no. 4311971)
Reservatórios de reagente
Fitas almofada transparentes de vedação
Fitade Selagem de Alumínio
Papel para lentes
Pontas de pipeta descartáveis (resistentes a aerossóis) e com filtro que cobrem a gama entre 0,1μl e 1000μl
Etanol (teor alcoólico 100%) de qualidade para biologia molecular
10mM Tris-HCl pH 8,0
100% Tween 20
Hidróxido de Sódio, 1N
Água sem nucleases
1,5% Agarose, sem corante, padrões internos, Pippin PrepTM, 250bp - 1,5kb, (Sage Science,CDF1510)
PhiX Control, v3 (Illumina cat. no. FC-110-3001)
Reagentes para a determinação da concentração de ADN fluorescente: O Kit de Ensaio Quant-iT™ Picogreen®
dsDNA foi validado
Kit cíclico MiSeq® V2 300 (Illumina cat. no. MS102-2002)
MiniSeq® Mid Output Reagent kit 300 cycle (Kit de Reagente de Rendimento Médio de 300 ciclos) (Illumina cat# FC-420-1004)
Kit/método/aparelho de precisão para a quantificação da biblioteca: ambos o Kit de Quantificação da Biblioteca KAPA e o fluorímetro Qubit foram validados.
INSTRUÇÕES DE UTILIZAÇÃO
O ensaio para a corrida de 24 amostras pode ser realizado com o uso de um protocolo manual descrito abaixo. Os protocolos manuais em detalhe para 8, 16 ou 24 amostras e o protocolo automatizado para 24 amostras com o uso do Biomek 4000 estão disponíveis no seu Especialista de Vendas Técnicas de Immucor.
NOTAS:
•
Seja extremamente cuidadoso no processo de divisão em partes iguais. Utilize pipetas calibradas. Se não o fizer, isso poderá resultar na perda do reagente e no fracasso do ensaio.•
Todas as temperaturas têm de ser mantidas com precisão.•
Leve as esferas magnéticas até à temperatura ambiente antes de as utilizar.•
O produto amplificado pode ser armazenado até 4 dias a -20ºC antes de ser utilizado. O produto amplificado apenas pode ser congelado e descongelado uma vez. O congelamento e o descongelamento repetidos poderão resultar na degradação do produto amplificado e poderão proporcionar resultados de má qualidade se este for usado para gerar uma biblioteca.A. Purificação do ADN Genómico
Purifique o ADN genómico através do seu método preferido. Os requisitos para a amostra de ADN são os seguintes:
As amostras de ADN genómico devem ser extraídas a partir de sangue total ou de um camada leucocitária através de um método de extração de ADN que consiga gerar uma massa molecular de ADN elevada.
A concentração final de ADN deverá estar entre 5-15 ng/µl, mantendo todas as amostras a concentrações semelhantes. Se necessário, ajustar com água livre de nucleases.
Pelo menos 50% dos fragmentos de ADN genómico extraídos deverão ter um tamanho de 10 kb ou mais para uma PCR de longo alcance bem sucedida.
B. Amplificação de ADN (PCR)
Configuração da PCR
1. Preencha um Ficheiro de Amostra de Código de Barras (um ficheiro de Windows separado por vírgulas: CSV) com os nomes das amostras e as atribuições de código de barras, conforme apresentado na Figura 1.
Figura 1. Exemplo de Ficheiro de Amostra de Código de Barras
2. Crie um projeto no software MIA FORA depois de criar uma ficha de amostra de código de barras com os nomes da amostra e os códigos de barras. Este nome de projeto é necessário para o nome de corrida do sequenciador.
3. Coloque etiquetas em três placas PCR de 96 poços com semi-saia de revestimento duro.
4. Prepare uma placa de amostra com 100 µL de ADN genómico por poço para cada amostra com uma concentração de 5-15 ng/µl diluída em água livre de nucleases.
A placa de amostras deverá ser organizada em colunas 1, 2 e 3 de um placa de 96 poços, conforme demonstrado na placa de amostras da Figura 2. O poço A1 deverá ser o controlo negativo (NTC) com 10mM Tris-HCl pH 8,0 e sem qualquer ADN, seguido da amostra 1 em B1, da amostra 2 em C1 e sequencialmente até à amostra 23 em H3 (Figura 2, PLACA DE AMOSTRAS).
5. Descongele as misturas principais de PCR (P1-P9), misture por inversão ou agite brevemente em vórtex e centrifugue. 6. Centrifugue a placa de amostras do passo 4 numa centrifugadora com um suporte de placa durante 2 min, para assegurar que
o ADN genómico fica no fundo do poço.
7. Pipete 15 µl das misturas PCR P1-P9 nas colunas 1-9 de cada uma das três placas PCR de 96 poços com semi-saia de revestimento duro para que cada poço de uma coluna tenha a mesma mistura de PCR (Figura 2).
8. Pipete cuidadosamente para evitar bolhas na mistura principal de PCR.
9. Pipete as amostras a partir da placa de amostra com uma pipeta multicanal da seguinte forma (Figura 2):
Coluna 1 a partir da placa de amostras: 10µl de NTC e as amostras 1-7 na coluna 1 (A1-H1) em cada uma das nove colunas da Placa 1 de PCR.
Coluna 1 a partir da placa de amostras: 10µl das amostras 8-15 na coluna 2 (A2-H2) em cada uma das nove colunas da Placa 2 de PCR.
Coluna 1 a partir da placa de amostras: 10µl das amostras 16-23 na coluna 3 (A3-H3) em cada uma das nove colunas da Placa 3 de PCR.
NOTA: as amostras têm de ser misturadas delicadamente para evitar bolhas na mistura principal de PCR, conforme apresentado na Figura 2.
10. Vede as placas PCR com fita adesiva para PCR. Centrifugue brevemente as placas PCR, coloque-as em 3 termocicladores diferentes e execute o programa HLA_PCR MIA FORA usando a definição de tampa aquecida; Ver Tabela 1.
PONTO DE PARAGEM DE SEGURANÇA
Figura 2. Esquema de amostras e configuração de PCR
Tabela 1. Condições do Termociclador para a amplificaçãoCiclos (15) Ciclos (20)
Espera inicial Desnaturação Hibridação Extensão Desnaturação Hibridação Extensão Extensão final Espera
940 C /30seg 940 C /1min15seg 600 C /30seg 660 C /7min30seg 940 C /30seg 600 C /30seg 660 C /7min30seg 660 C /10 min 40C/∞
11. Opcional: A amplificação pode ser confirmada ao correr algumas amostras representativas em gel de agarose a 0,8% com brometo de etídio ou GelRed. A eletroforese deverá ser conduzida a 90 volts durante 40 minutos. Os fragmentos PCR poderão variar entre as amostras devido a diferenças nos intrões. Os tamanhos aproximados para os produtos PCR são apresentados na Tabela 2.
Tabela 2: Tamanhos dos produtos de amplificação
Lócus HLA Tamanho (kb)
HLA-A 3,2 HLA-B 4,1 HLA-C 4,4 HLA-DPA 5,0 HLA-DPB 5,2 HLA-DQA 5,8 HLA-DQB 6,3 HLA-DRB1 0,9 HLA-DRB2 5,6
C. Equalização e Agregação (Pooling) Produtos de PCR
A concentração de cada produto de PCR pode ser determinada utilizando um reagente apropriado de quantificação de ADN fluorescente, como por exemplo o PicoGreen®.
Com base nas medições de fluorescência, os produtos PCR de todas as novas reações de PCR para cada amostra são equilibradas e agregadas de acordo com o resultado do SironaQuantTM, disponível no Sistema HLA MIA FORA NGS. As amostras agregadas são depois purificadas na preparação para a amplificação.
Equalização e Agregação
Figura 3. Configuração do Ensaio PicoGreen®
1. Quantifique os produtos PCR utilizando o reagente PicoGreen®: Deixe o reagente PicoGreen® atingir a temperatura ambiente e dilua-o com um tampão 1X TE (50µL PicoGreen®+ 7450µL 1xTE). Agite em vórtex para misturar e proteja-o da luz até utilizar. Nota: Siga as instruções do folheto informativo dos reagentes, se forem usados outros reagentes para a quantificação PCR.
2. Prepare padrões diluídos em série em tubos de microcentrifugação usando o controlo de 100ng/µl fornecido com o kit PicoGreen®. Distribua 20 µl de cada padrão pelos poços A10 –E12 da Placa 1 PicoGreen® (placas de medição de saia completa preta), conforme demonstrado na Figura 3. Transfira 20 µl de tampão 1xTE nos poços F10, F11, F12 da Placa 1 PicoGreen®, conforme demonstrado na Figura 3.
3. Adicione 20µl de PicoGreen® diluído a cada poço das três placas PicoGreen®, inclusive aos poços padrão na placa 1, conforme demonstrado na Figura 3.
4. Adicione 19 µl de tampão 1xTE a três placas PicoGreen® no mesmo formato das três placas de PCR. Adicione 1 µl de produtos PCR às três placas PicoGreen®, para que a combinação corresponda às placas de PCR originais para produzir uma diluição 1:20 de produtos de PCR. O volume final é de 40µl em todos os poços medidos.
5. Centrifugue a placa e incube-a à temperatura ambiente durante pelo menos 5 min. Proteja as placas da luz durante a incubação.
6. Meça a fluorescência com um filtro de excitação a ~ 485 nm / emissão a ~ 535 nm, 0,1s (Victor X3).
7. Guarde o ficheiro de saída utilizando a seguinte convenção para o nome: (Nota: Windows: utilize Texto Separado por Tab; MacOs: utilize Texto Formatado para Windows).
Projecto_COLUNA1_Data.txt (p.ex. ProjectoX_COLUNA1_123115.txt) Projecto_COLUNA2_Data.txt (p.ex. ProjectoX_COLUNA2_123115.txt) Projecto_COLUNA3_Data.txt (p.ex. ProjectoX_COLUNA3_123115.txt)
Execute o Programa de Equalização SironaQuant no software MIA FORA. O valor pmol recomendado é entre 0,00035 e 0,0009 pmol.
8. Centrifugue as placas PCR e rotule uma nova placa para o próximo passo com "Project_pooled PCR_date"
9. Dilua os produtos PCR de cada lócus com um Tampão 10mMTris HCl de pH 8,0, segundo o resultado do SironaQuant antes de agregação.
10. Consolide os produtos PCR de todas as 9 reações PCR para cada amostra transferindo os volumes especificados no resultado do SironaQuant.
11. Sele as placas e armazene-as a -20ºC se não prosseguir de imediato para o passo de limpeza das esferas.
12. Leve as esferas magnéticas até à temperatura ambiente e misture as esferas magnéticas agitando-as em vórtex para ressuspender homogeneamente as esferas.
13. Adicione 55 µl de esferas por poço de amostras consolidadas. Misture bem o ADN e as esferas pipetando para cima e para baixo pelo menos 10 vezes.
14. Incube a Mistura de Esferas de ADN à temperatura ambiente durante 10 minutos. Transfira a placa para o misturador magnético durante 5 minutos.
16. Mantenha a placa no misturador magnético para os passos de lavagem com etanol. Adicione 200µL de etanol diluído recentemente a 80% a cada poço, incube durante 30 segundos e depois remova cuidadosamente e descarte o etanol. 17. Repita a lavagem com etanol mais duas vezes (dando um total de 3 lavagens). Remova todos os vestígios de etanol
após a terceira lavagem.
18. Retire a placa do misturador magnético e deixe as esferas secarem ao ar. A superfície das esferas magnéticas deverá ter um aspeto vítreo sem quaisquer poços de líquido visíveis. O tempo apropriado para a secagem poderá ser determinado empiricamente em cada ambiente laboratorial (5 – 10 minutos).
19. Adicione 35 µl de 10mM Tris-HCl pH 8,0 à temperatura ambiente a cada poço. Misture bem pipetando e incube durante 5 minutos.
20. Coloque a placa no misturador magnético e incube durante 5 minutos ou até a solução ficar límpida.
21. Com a placa no misturador magnético, transfira 30 µl de eluato para a nova placa PCR de 96 poços rotulada: Projeto_Equalizada_limpa_data.
PONTO DE PARAGEM DE SEGURANÇA
As amostras agregadas e limpas podem ser armazenadas a -20ºC até 4 dias até estarem prontas para o passo de Fragmentação.
D. Construção de uma Biblioteca de Sequenciação
a. Fragmentação
1. Inicie um temporizador laboratorial para 20 minutos antes do passo 8.
2. Faça alíquotas de 20ul do tampão de paragem do tubo 12 em cada poço da coluna 11 da nova placa de 96 poços rotulada como placa de fragmentação.
3. Prepare a mistura principal de fragmentação transferindo 134 µl do tubo 11 (Tampão de Fragmentação) para o tubo 10 (Enzima de Fragmentação). Misture bem agitando em vórtex e centrifugando brevemente.
4. Pipete 23 µl da mistura principal de fragmentação preparada no passo 3 em cada poço da coluna 12 da placa de fragmentação, de forma a criar uma coluna "reservatório" da mistura principal.
5. A partir da coluna 12, transfira 6 µL da mistura principal de fragmentação para cada poço das colunas 1, 2 e 3 da placa de fragmentação.
6. Transfira 14 µl de amostra da coluna 1 da placa agregada e limpa com esferas da secção anterior
(Projeto_Equalizada_limpa_data) para a coluna 1 da placa de fragmentação. Misture pipetando para cima e para baixo 5 vezes.
7. Transfira 14 µl de amostra da coluna 2 da placa agregada e limpa com esferas da secção anterior
(Projeto_Equalizada_limpa_data) para a coluna 2 da placa de fragmentação. Misture pipetando para cima e para baixo 5 vezes.
8. Transfira 14 µl de amostra da coluna 3 da placa agregada e limpa com esferas da secção anterior
(Projeto_Equalizada_limpa_data) para a coluna 3 da placa de fragmentação. Misture pipetando para cima e para baixo 5 vezes.
9. INICIE O TEMPORIZADOR e incube à temperatura ambiente durante 20 minutos. É vital que a reação não exceda os
20 minutos.
10. Depois de 20 minutos de incubação, transfira imediatamente 5 µl do tampão de PARAGEM a partir da coluna 11 para as colunas 1, 2 e 3 e misture totalmente pipetando para cima e para baixo 5 vezes após cada adição.
11. Pipete 200 µl de esferas magnéticas à temperatura ambiente para cada poço da coluna 10 da placa de amostra fragmentada ou para uma tira de tubos de PCR limpos.
12. A partir da coluna 10, adicione 40 µl de esferas magnéticas a cada poço do ADN fragmentado e misture lentamente pipetando para cima e para baixo 10 vezes. Incube a Mistura de Esferas de ADN à temperatura ambiente durante 10 minutos.
13. Transfira a placa para o misturador magnético durante 5 minutos para ligar as esferas às paredes dos poços e descarte cuidadosamente o sobrenadante utilizando a pipeta.
14. Mantenha a placa no misturador magnético para os passos de lavagem com etanol. Lave cada poço com 200 µl de etanol a 80%, incube durante 30 segundos e remova cuidadosamente o líquido com uma pipeta multicanal, sem perturbar as esferas.
15. Repita a lavagem com etanol mais uma vez (totalizando 2 lavagens).
16. Remova a placa do misturador magnético e seque ao ar para evaporar o etanol em excesso até que o pellet das esferas magnéticas tenha um aspeto vítreo.
17. Remova a placa do misturador magnético. Adicione 20 µl de tampão 10mM Tris-HCl pH 8,0 à temperatura ambiente às esferas, misture através de pipetagem e incube durante 5 minutos fora do misturador magnético.
18. Coloque a placa no misturador magnético e incube durante 5 minutos.
19. Transfira 15 µl de eluato para as novas placas PCR de 96 poços de revestimento duro rotuladas com
Projeto_Fragmentado_Limpo_Data e sele a placa. As amostras estão agora prontas para o passo de Reparação Final.
PONTO DE PARAGEM DE SEGURANÇA
As amostras fragmentadas e limpas podem ser armazenadas a -20ºC até estarem prontas para o passo de Reparação Final. Poderá armazenar com segurança a placa, com os poços selados, fragmentada e limpa até 4 dias a -20ºC.
b. Reparação Final
1. Volte a rotular a placa previamente fragmentada e limpa como Projeto_Reparaçãofinal_Data.
2. Prepare a mistura principal de Reparação Final adicionando 136 µl do tubo 14 (Tampão de Reparação Final) ao tubo 13 (Enzima de Reparação Final), agite em vórtex e centrifugue brevemente.
3. Pipete 18,5 µl da mistura principal de Reparação Final preparada no passo 1 à coluna 12 da placa de Reparação Final rotulada Projeto_Reparaçãofinal_Data, para criar uma coluna "reservatório".
4. A partir da coluna 12, transfira 5 µl da mistura principal de Reparação Final às colunas 1, 2 e 3 de ADN equalizado, fragmentado e limpo rotulado como Projeto_Fragmentado_Limpeza_Data preparadas na secção anterior e misture pipetando 5 vezes.
5. Sele a placa com fita adesiva para PCR e centrifugue brevemente para assegurar que todo o líquido fica no fundo do poço.
6. Transfira a placa de Reparação Final rotulada como Projeto_Reparaçãofinal_Data para um termociclador e execute o programa de Reparação Final MIA FORA, conforme indicado na tabela 3.
7. Mantenha a placa a -20ºC até estar pronta para a Adenilação.
Tabela 3: Programa do Termociclador para a Reparação Final
Reparação_Final_MIA FORA20°C durante 30 min 70°C durante 10 min
Espera a 4ºC ∞
c. Adenilação
1. Prepare a mistura principal de cauda poli-A ao adicionar 85 µl do tubo 16 (Tampão Cauda Poli-A) ao tubo 15 (Enzima Cauda Poli-A), agite em vórtex e centrifugue brevemente.
2. Pipete 12 µl da mistura principal de cauda poli-A preparada no passo 1 à coluna 11 da placa já com a Reparação Final para criar uma coluna "reservatório".
3. A partir da coluna 11, transfira 3 µl da mistura principal de cauda poli-A para cada poço das colunas 1, 2 e 3 da placa já com reparação final rotulada como Projeto_Reparaçãofinal_Data vinda da secção anterior. Misture pipetando para cima e para baixo 5 vezes. Volte a rotular a placa como Projeto_Cauda poli-A_Data.
4. Coloque a placa no termociclador e execute o programa A-tail MIA FORA conforme apresentado na tabela. 5. PROCEDA DIRETAMENTE PARA O PASSO DE LIGAÇÃO DO ADAPTADOR INDEXADOR antes de terem
passado 30 minutos.
Tabela 4: Programa do Termociclador para Adenilação
MIA FORA_Cauda poli-A37°C durante 30 min 75°C durante 20 min
Espera a 4ºC ∞
d. Ligação ao Adaptador Indexador
1. Utilize luvas novas ao manusear a placa adaptadora. Centrifugue a placa adaptadora brevemente antes de remover o selante da placa. Remova cuidadosamente o selo da placa da placa adaptadora. Verifique que todas as cavidades nas colunas 1, 2 e 3 contêm aproximadamente 5 µl de solução.
2. Prepare a mistura principal de Ligação ao adicionar 850 µl do tubo 18 (Tampão de Ligase) para o tubo 17 (Enzima de Ligase), agite em vórtex e centrifugue brevemente.
3. Pipete 95 µl da mistura principal de Ligação preparada no passo 2 para a coluna 10 da placa de cauda Poli-A rotulada como Projeto_Cauda poli-A_Data da secção anterior, para criar uma coluna "reservatório". Volte a rotular a placa como Projeto_Ligação_Data.
4. A partir da coluna 10, transfira 26 µl da mistura principal de Ligação para cada poço das colunas 1, 2 e 3 da placa de cauda Poli-A e misture pipetando para cima e para baixo pelo menos 5 vezes.
5. Transfira 2,5 µl do adaptador para os poços correspondentes da placa de ligação. 6. Misture bem e sele a placa com uma fita adesiva de PCR. Centrifugue brevemente.
7. Transfira a placa de ligação para um termociclador e execute o programa de ligação MIA FORA, conforme apresentado na tabela 5.
Tabela 5: Programa do Termociclador para a Ligação por Adaptador
MIA FORA_Ligação25°C durante 30 min 65°C durante 10 min
e. Consolidação dos Produtos Ligados ao Adaptador
1. Combine 20 µl a partir de cada poço da placa rotulada Projeto_Ligação_Data da secção anterior para um único tubo Eppendorf de 1,5 ml. Rotule o tubo com "Projeto-Data-Consolidado."
2. Adicione 865 µl de esferas magnéticas ao tubo da microcentrifugadora rotulado como Projecto-Data-Consolidado. Misture completamente no misturador em vórtex. Incube durante 10 minutos.
3. Transfira o tubo para o suporte magnético até a solução ficar límpida. Remova e descarte o sobrenadante.
4. Enquanto ainda estiver no misturador magnético, adicione 1 ml de etanol a 80% e incube durante 30 segundos. Remova o etanol a 80% sem perturbar as esferas ligadas.
5. Repita a lavagem com etanol (passo 4), para um total de 2 lavagens. Retire o máximo possível de etanol do tubo. 6. Remova o tubo do suporte magnético e permita que as esferas sequem ao ar durante 5-10 minutos até que o pellet das
esferas magnéticas tenha um aspeto vítreo.
7. Ressuspenda as esferas em 63 µl de 10mMTris-HCl pH 8,0 à temperatura ambiente. Agite em vórtex e incube durante 5 minutos.
8. Coloque o tubo no misturador magnético até a solução ficar límpida e transfira 60 µl de eluato que contenha amostras ligadas por adaptador limpas para dentro de um tubo de microcentrifugação limpo.
PONTO DE PARAGEM DE SEGURANÇA
As amostras ligadas por adaptador Agregadas e Limpas (Biblioteca) podem ser armazenadas a -20ºC, até estarem prontas para realizar a Seleção de Tamanho, durante até 4 dias.
f. Seleção de Tamanho e Amplificação da Biblioteca de Tamanho Selecionado (Pippin Prep)
NOTA: A biblioteca amplificada deverá ser purificada no prazo de 1 hora após a amplificação.1. Aplique um método apropriado de seleção de tamanho na preparação biblioteca para isolar fragmentos de aproximadamente 400-500 pares de bases. Siga o manual de instruções do produto se não utilizar o Pippin Prep. 2. Misture 30 µl da Biblioteca com 10 µl do marcador apropriado e carregue a mistura em uma das faixas da cassete
Pippin.
3. Crie e execute um programa para selecionar a Biblioteca com um tamanho de fragmento entre 400-500 pares de bases. 4. Descongele os módulos de Amplificação do kit de preparação de Biblioteca, tubos 19, 20 e 21 e faça a montagem da
reação numa tira de tubos de PCR de 0,2 ml da seguinte forma:
Misture 25 µl da mistura de amplificação a partir do tubo 19, 2 µl de iniciadores do tubo 20, 18 µl de água livre de nucleases do tubo 21 e 5 µl da eluição selecionada por tamanho.
5. Misture gentilmente e centrifugue. Transfira para o termociclador e amplifique através do PCR Biblioteca MIA FORA conforme apresentado na tabela 6.
Tabela 6: PCR Biblioteca MIA FORA Ciclo (1) Ciclos (12) Ciclo(1)
Espera inicial Desnaturação Hibridação Extensão Ext. Final Espera
980C /30 seg. 980C /15 seg. 650C /30 seg. 720C /30 seg. 720C/5 min 40C ∞
E. Preparação da Sequenciação
NOTA: Abra e realize todos os passos de Pós-amplificação numa secção designada do laboratório. Preferivelmente, numa câmara de fluxo laminar de PCR para evitar a contaminação das superfícies de trabalho e dos reagentes de sequenciação. 1. Transfira 50 µl da Biblioteca amplificada para um tubo de microcentrifugação. Adicione à Biblioteca 50 µl de esferas
magnéticas à temperatura ambiente. Misture totalmente e incube durante 10 minutos.
2. Após 10 minutos, coloque o tubo no suporte magnético até a solução ficar límpida, cerca de 5-8 min. Remova e descarte o sobrenadante.
3. Enquanto ainda estiver no misturador magnético, adicione 200 µl de etanol a 80% e incube durante 30 segundos. Remova o etanol a 80% sem perturbar as esferas ligadas.
4. Repita a lavagem com etanol (passo 3) totalizando 2 lavagens. Remova o máximo etanol possível de dentro do tubo. 5. Retire o tubo do suporte magnético e deixe as esferas secar ao ar durante 5 – 10 minutos até que o pellet das esferas
magnéticas tenha um aspeto vítreo.
6. Ressuspenda as esferas em 17 µl de 10mM Tris-HCl pH 8,0 à temperatura ambiente. Misture em vórtex e incube durante 5 minutos.
7. Coloque o tubo no misturador magnético até que a solução fique límpida e transfira 15 µl de eluato que contenha uma biblioteca de sequenciação limpa e amplificada para um tubo de microcentrifugação limpo.
PONTO DE PARAGEM DE SEGURANÇA
As amostras eluídas podem ser conservadas a -20ºC durante até 4 dias.
8. Determine a concentração da Biblioteca através de métodos que meçam com precisão a concentração de ADN. A Immucor recomenda os métodos de qPCR ou Qubit para obter uma estimativa da concentração da Biblioteca.
9. Devido à natureza do sequenciador, a concentração da biblioteca de sequenciação deve ser maior do que 10 nM. A distribuição de tamanho da biblioteca pode ser determinada através da eletroforese com gel de agarose ou qualquer sistema de eletroforese capilar para verificar o tamanho das bibliotecas resultantes.
10. Dilua a biblioteca até 4 nM e depois prepare uma biblioteca desnaturada final de 8pM (Qubit) ou 12 pM (qPCR) para o MiSeq®, e uma biblioteca desnaturada final de 1,3pM (Qubit) para o MiniSeq®. A biblioteca pode ser marcada com um controlo PhiX a 5% se for desejável.
11. Carregue a biblioteca desnaturada na cassete e execute no sequenciador.
12. Siga as instruções Ilumina para a sequenciação da biblioteca. Certifique-se de que o nome do ficheiro na ficha de amostra corresponde ao nome de projeto gerado durante a configuração do PCR de longo alcance.
F. Análise de Dados
Os ficheiros fastq gerados pelo instrumento de sequenciação deverão ser analisados com o software MIA FORA para criar a tipagem HLA. A ficha da amostra com os nomes e os códigos de barras da amostra e os ficheiros fastq correspondentes deverão ser carregados no ficheiro de projeto do software MIA FORA. Para utilizar o software MIA FORA, siga o Guia de Utilizador do Software.
RESULTADOS
1.
Amplificação por PCR:A análise de gel de agarose não deverá apresentar produto no controlo negativo (NTC) para que a corrida seja válida. O gel de agarose dos produtos amplificados poderá apresentar variações no tamanho com base nas diferenças nas sequências intrónicas. Consulte a Tabela 2 para informações sobre o tamanho aproximado das bandas.
2.
Preparação da Biblioteca:O Kit Biblioteca deverá gerar uma biblioteca quando o nível de entrada de ADN no SironaQuant tiver uma valor entre 0,0009 e 0,0035 pmol.
A concentração final da biblioteca deverá ser de pelo menos 10 nM e deverá ser quantificado com precisão antes da sequenciação. As bibliotecas deverão ser diluídas até 4 nM antes da desnaturação.
O clustering nos kits MiSeq® e MiniSeq® poderá variar dependendo do grau de precisão da quantificação. Tipicamente, as densidades dos clusters das bibliotecas de 8-12 pM deverão oscilar entre 600-800 K/mm2 no MiSeq® e entre 160-220 K/mm2 no MiniSeq®.
Deverão ser tomadas as devidas precauções para quantificar com precisão a biblioteca. Todos os produtos posteriores à ligação por adaptador deverão ser contidos numa câmara de fluxo de PCR ou numa área designada. Também deverão ser preparados imediatamente antes os reagentes de diluição para evitar contaminação.
3.
A tipagem HLA é gerada pelo Software MIA FORA NGS e é apresentada num relatório. Consulte o Guia de Utilizador do Software MIA FORA para a análise de dados de tipagem HLA.CONTROLO DE QUALIDADE
É obrigatório o uso de um controlo negativo e um controlo conhecido opcional para cada teste, como por exemplo um de água desionizada e uma amostra tipada previamente, respetivamente. Deverá ser tido o máximo de cuidado ao remover os selos das placas e as placas devem ser centrifugadas antes de serem abertas. Devem ser usados selos de placas novos em cada passo onde as placas precisem de ser seladas. As pontas de pipetas usadas deverão ser colocadas nos recipientes apropriados e descartadas. A configuração PCR deverá ser realizada numa sala Pré-PCR a partir da qual os produtos amplificados são manuseados. Todo o ADN genómico tem de ser diluído em água livre de nucleases. Após a seleção de tamanho e amplificação do ADN, a biblioteca amplificada deve ser manuseada numa área separada, de preferência numa câmara de fluxo de PCR, e usando um conjunto diferente de pipetas. Deverão ser tomadas as precauções devidas para não contaminar as áreas de trabalho com bibliotecas amplificadas. O ensaio deverá ser executado conforme recomendado neste folheto informativo e seguindo qualquer outro procedimento de controlo de qualidade em conformidade com os requisitos locais, distritais, nacionais ou de agências de acreditação.
LIMITAÇÕES DO PROCEDIMENTO
1. A PCR e o ensaio descritos neste folheto informativo requerem condições rigorosamente controladas. Qualquer desvio destes parâmetros validados poderá levar a falhas no produto.
2. Caso pelo menos 50% dos fragmentos de ADN iniciais sejam menos de 10kB, pode não ser gerada uma quantidade suficiente do produto de PCR de longo alcance.
3. Se a concentração da biblioteca final for abaixo de 10 nM, podem não ser gerados resultados de sequenciação precisos. 4. Vão ser observadas ambiguidades no 4º campo devido à falta de cobertura na região intrónica.
5. Aditivos na mistura PCR poderão interferir com alternativas não tóxicas ao brometo de etídio frequentemente utilizadas na eletroforese com gel de agarose e poderão levar a uma intensidade menor das bandas.
6. Os géis de agarose corados a verde SYBR® não funcionam com os produtos PCR. O brometo de etídio ou GelRed™ deverão ser usados para a visualização dos produtos de PCR.
7. O iniciador DPB1 não amplifica nem o exão 1 e o exão 5. Consequentemente, quaisquer polimorfismos nestes exões não serão sequenciados. Estes serão assinalados como ambiguidades no relatório.
8. A falta de sequências de referência genómicas para DPB1 e para os níveis baixos de polimorfismo no intrão 2 (entre o exão 2 e o 3) faz com que seja difícil realizar análises de faseamento para amostras heterozigóticas. Consequentemente, poderá ocorrer uma ambiguidade de genótipos que não pode ser resolvida.
9. O iniciador frente para o DPB1 sobrepõe-se com algumas das primeiras bases no exão2. Consequentemente, os polimorfismos nessas sequências não serão identificados pela sequenciação.
10. Os lócus DRB são amplificados como dois fragmentos – um que amplifica o exão 1 e outros que amplificam os exões 2 a 6. O intrão 1 não é amplificado na sua totalidade. Consequentemente, o faseamento do lócus inteiro não é possível para o DRB1/3/4/5 e os polimorfismos presentes no Intrão 1 vão resultar em ambiguidades no 4º campo.
11. O primer inverso para os exões DRB 2 a 6 sobrepõe-se á ponta 3' do exão 6 e, por essa razão, os polimorfismos dessas sequências não serão determinadas pela sequenciação.
12. Na maior parte dos casos, os produtos de amplificação do exão 1 do DRB1/3/4/5 mapeiam fracamente com o exão 1 das sequências de referência conhecidas do DRB5; assim, o contig. para o exão 1 provavelmente não vao ser gerado para DRB5. Uma vez que não se conhecem polimorfismos do exão 1 para DRB5, isto não causa qualquer ambiguidade na tipagem HLA do DRB5.
13. Devido à natureza complexa da tipagem HLA, os técnicos qualificados deverão rever a interpretação dos dados e tarefas de tipagem.
CARACTERÍSTICAS DE DESEMPENHO ESPECÍFICAS
Estudos clínicos foram realizados em três locais para avaliar o desempenho do kit de tipagem HLA MIA FORA NGS. O desempenho deste ensaio foi comparado com as tipagens anteriores que, sempre que disponíveis, incluíam as Tipagens por Sequência (SBT) e a tipagem de baixa resolução, em casos em que as SBT estavam indisponíveis. As amostras foram selecionadas pelos locais dos ensaios para
representar um conjunto diversificado de tipos HLA que seriam encontrados durante o curso normal das operações. Foram testadas um total de 206 amostras pelos locais, cada um em 3 corridas e utilizando dois lotes de reagentes. A tipagem HLA foi determinada para os lócus HLA-A, -B, -C, -DPA1, -DPB1, -DQA1, -DQB1, e -DRB 1/3/4/5. Foram avaliados um total de 3692 alelos com estas 206 amostras. Os resultados mostraram que os tipos HLA obtidos pelo ensaio MIA FORA, sem um novo teste às falhas e aos lócus discordantes, são de 99,34%. Depois de voltar a testar o lócus falhado e o dissonante, a concordância total foi de 99,74%.
Tabela 8: Sumário da Concordância Total Local Número de
amostras
Número de lócus testados
Número de alelos
para análise de concordância
Concordância após o novo teste
Local1 68 748 1223 1220 (99,75%) Local2 69 759 1064 1063 (99,91%)* Local3 69 759 1241 1236 (99,59%)
* Não foi levada a cabo nenhuma repetição neste local. Um dos lócus DQB1 não tinha dados suficientes. Tabela 9: Sumário do Ensaio Clínico por Lócus
Lócus HLA Concordância Inicial Concordância após o Reteste**
HLA-A 100,00% 100,00% HLA-B 99,76% 99,76% HLA-C 99,51% 100,00% DPA1 99,72% 100,00% DPB1 99,44% 99,72% DQA1 99,26% 100,00% DQB1 98,48% 99,27% DRB1 98,54% 99,03% DRB3/4/5 99,43% 100,00% Total 99,34% 99,74%
** As repetições de testes incluem chamadas que foram assinaladas para revisão e que não puderam ser resolvidas através da inspeção manual dos dados. As chamadas que não foram efetuadas devido a dados insuficientes (11/1854 amplificações) também voltaram a ser testadas.
Nota: Para consultar características de desempenho detalhadas e específicas, por favor ligue para a Immucor Transplant Diagnositcs, Inc. através do 1- 888-329-0255.
RESOLUÇÃO DE PROBLEMAS
PROBLEMA POSSÍVEL CAUSA SOLUÇÃO
Não aparecem bandas no gel depois da amplificação PCR.
Qualidade ou quantidade do ADN
Razão DO 260/280 inferior a 1,65 Repurificar o ADN para remover impurezas. ADN fragmentado
Pelo menos 50% do ADN deverá ser maior do que 10Kb
Volte a extrair o ADN da amostra
ADN diluído em Tris-HCL ou TE. Dilua as amostras em água.
Baixa concentração do modelo de ADN Certifique-se de que a concentração de ADN é de 50 - 15 ng/reação.
As alternativas ao etídio usadas no gel de agarose
Utilize o brometo de etídio se as bandas do gel de agarose estiverem fracas, visto quealguns corantes fluorescentes poderão ficar extintos devido à composição da mistura PCR
Saída da amplificação
Repetir para as saídas de amplificação de PCR utilizando reagentes de sobra, dos quais existe o suficiente para quatro amostras. Os reagentes de sobra armazenados a 2-8ºC ficam estáveis durante uma semana.
Bandas múltiplas ou manchas de bandas após a amplificação de PCR Condições do Termociclador
Inclinação das rampas Assegure-se que a inclinação da rampa é igual à especificada no protocolo. Temperatura Calibre o aparelho de PCR para verificar o desempenho dos
aparelhos de PCR.
Qualidade do ADN Assegure-se de que o ADN é diluído em água e está descontaminado.
Valores fluorescentes baixos para todos os lócus
Reagente PicoGreen®
Fotobranqueamento do reagente PicoGreen®
Siga de perto das instruções dos fabricantes. Os reagentes devem ser protegidos da luz.
Diluição incorreta do reagente Dilua o reagente PicoGreen® segundo as instruções. Padrões diluídos incorretamente Dilua os padrões segundo as instruções.
Seleção incorreta do
tamanho do ADN Instrumento Pippin
Verifique o perfil de eluição para assegurar que a eluição ocorreu sem erros.
Siga o guia de resolução de problemas da Sage Science para determinar se o instrumento tem o desempenho segundo as especificações.
Instrumento não calibrado
Corra 2 µl de um marcador 1 kb ou mais (ThermoFisher) com um protocolo de excisão de 400-600 pares de bases. Corra 15 µl de produto eluído no gel de agarose para visualizar a eluição de um fragmento de 500 pares de base.
Reutilização do cartucho Pippin O cartucho Pippin deverá ser utilizado apenas uma vez. qPCR R2 < 0,95 KAPA PCR Causada por um valor discrepante nítido Repita a análise omitindo o valor discrepante.
Contaminação nos reagentes Repita a KAPA PCR com padrões novos.
Baixa concentração da biblioteca amplificada
Limpeza das esferas magnéticas
O etanol não foi completamente removido
Remova o etanol enquanto as placas estão no suporte
magnético. Remova todos os vestígios de etanol, principalmente após a última lavagem.
Esferas armazenadas incorretamente Armazena as esferas entre 2 e 8ºC – NÃO CONGELAR Etanol não preparado recentemente O etanol a 80% deverá ser preparado recentemente antes de
cada utilização.
Esferas demasiado secas.
O tempo de secagem poderá depender da temperatura ambiente e da humidade. Monitorize de perto as esferas para assegurar que as esferas não secam demasiado e ajuste o protocolo conforme for necessário.
Utilização de uma concentração errada de Tris-HCl Certifique-se de que o tampão Tris-HCl tem 10mM e um pH de 8,0
O Pippin prep não elui o ADN
Verifique a pré e a pós eluição para produtos ligados com adaptador
Amplifique 1 µl de bibliotecas limpas por agrepagação pré-pippin com metade dos reagentes para amplificação da biblioteca. Corra os produtos amplificados (sem purificação necessário) num gel de agarose a 2% para determinar se está presente uma mancha de fragmentos.
Produto amplificado perdido durante a limpeza da esfera
Volte a amplificar 5 µl da eluição. Se a biblioteca for > 25nM, os produtos poderão ser visualizados ao corer 5 µl num gel de agarose.
Erro na Fragmentação através dos passos de Ligação
Problemas de fragmentação Purifique 20 µl de 2-3 amostras ligadas e NTC utilizando o protocolo de limpeza de esferas com 36 µl de esferas. Elua os produtos em 10 µl e procure for fragmentação num gel de agarose a 2%. Se a fragmentação não tiver ocorrido, telefone para o apoio técnico para receber instruções adicionais para resolver o problema.
Clustering MiSeq® inferior ao esperado
Quantificação incorreta da Biblioteca
Kapa qPCR Siga as instruções do fabricante, dando especial atenção às diluições, verificando que a curva padrão é correta e que os valores Ct estão dentro do intervalo linear da curva padrão.
Fluorímetro Qubit
Siga as instruções do fabricante e siga atentamente as diluições, e utilize diluições padrão preparadas recentemente. Se a amostra estiver fora da curva de calibração dos reagentes da Ampla Gama, repita com o ensaio de Alta Sensibilidade. Reagentes Illumina Problemas com células de fluxo,
instrumentos ou reagentes.
Contacte o apoio técnico da Illumina para resolver problemas relativos a reagentes e instrumentos.
LICENÇAS LIMITADAS
IMPORTANTE — LEIA ATENTAMENTE: Este Contrato de Licença de Rótulo ("Contrato") é o contrato legal entre você (doravante denominado "Titular da Licença") e a Immunocor Transplant Diagnostics, Inc. ("Immunocor") (individualmente, como "Parte" ou em conjunto, as "Partes"), para a utilização de reagentes aqui fornecidos ("Reagentes"). Ao utilizar os reagentes, o Titular da Licença concorda com os termos e condições definidos a seguir.
1. Utilização dos Reagentes pelo Titular da Licença. A Immunocor concede ao Titular da Licença um direito não exclusivo, não transferível para utilizar apenas a quantidade transferida dos Reagentes estritamente de acordo com os procedimentos definidos a seguir no rótulo anexado e sujeitos às limitações definidas a seguir. A titularidade dos Reagentes não será transferida para o Titular da Licença. A Immucor retém todos direitos que não são expressamente concedidos e que não existem licenças implícitas concedidas por estas disposições.
2. Utilizações Não Previstas. Nenhuma permissão é garantida nos termos deste contrato para que o Titular da Licença utilize Reagentes além dos designados sob a Secção 1 deste Contrato. Especificamente, nenhuma permissão é garantida neste contrato ao Titular da Licença para utilizar os Reagentes para os propósitos de os transferir, vender, publicar ou fornecer acesso de qualquer outra forma aos Reagentes ou ao produto Mia Fora a terceiros. O Titular da Licença não tem o direito de produzir derivados a partir de qualquer Reagente ou autorizar terceiros a utilizar e vender quaisquer Reagentes ou derivados dos
Reagentes. O Titular da Licença reconhece que certos Reagentes e as suas utilizações estão sujeitas a patentes de terceiros e são licenciadas pela Immucor. O Titular da Licença não deverá usar os Reagentes excepto quando for aqui explicitamente permitido.
3. Utilização incorreta dos Reagentes e Termos de Indemnização. Na medida prevista pela lei, o Titular da Licença irá defender, indemnizar e manter livre de danos Immucor, os afiliados da Immucor, os seus gestores, diretores, encarregados, funcionários, patrocinadores e agentes (coletivamente denominados por "Parte Indemnizada") contra toda e qualquer responsabilidade, perda, dano, reclamações ou despesas, inclusive os honorários com advogados, (coletivamente as "Perdas Indemnizáveis") resultantes de ou em ligação a este Contrato, incluindo, sem limitações as Perdas Indemnizáveis resultantes de qualquer utilização por ou por parte do Titular de Licença. O Titular de Licença irá indemnizar e manter indemne as Partes Indemnizáveis contra todos e quaisquer Perdas Indemnizáveis resultantes de, advindas de ou relacionadas com a quebra do contrato por parte do Titular de Licença; além disso, as reclamações por um terceiro de que o Titular de Licença ou a utilização dos reagentes por parte do Titular de Licença infringe ou se apropria indevidamente de qualquer patente, direitos de cópia, marca registada, segredo comercial ou outros direitos de propriedade intelectual do referido terceiro.
4. Este Acordo aplica-se somente aos Reagentes. Toda a utilização do software Mia Fora é sujeita ao contrato de licença do utilizador final aplicável. Este contrato será interpretado e feito cumprir de acordo com as leis do Estado de New York nos Estados Unidos. Se o comprador não estiver disposto a aceitar os termos deste contrato, a Immucor aceitará de boa vontade a devolução do produto.
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