As enzimas de restrição
A Engenharia Genética é possível graças a um grupo especial de enzimas que cortam o DNA. Estas enzimas são chamadas de enzimas de restrição ou endonucleases de restrição. As enzimas de restrição são proteínas produzidas por bactérias para prevenir ou restringir a introdução de DNA exógeno. Elas atuam como “ tesouras” de DNA cortando-o e inativando-o.
As enzimas de restrição reconhecem e cortam sítios específicos ao longo da molécula de DNA, chamados sítios de restrição. Cada enzima de restrição (e existem centenas, produzidas por muitas bactérias diferentes) tem o seu próprio sítio de ação. Em geral, um sítio de restrição é uma seqüência palindrômica de 4 ou 6 pares de base. Um DNA palindrômico é uma seqüência na qual a fita lida no sentido 5’ a 3’ é a mesma da fita lida no sentido 5’ a 3’ . Por exemplo:
5’ GAATTC 3’ 3’ CTTAAG 5’
é uma seqüência de DNA palindrômica. Para verificar isto, leia as seqüências das fitas superior e inferior do final 5’ para o final 3’ . Esta seqüência é também um sítio de restrição para a enzima chamada EcoRI. O nome EcoRI vem de uma bactéria na qual ela foi descoberta, Escherichia coli RY 13 (EcoR), e I porque esta foi a primeira enzima de restrição encontrada neste organismo.
A EcoRI corta entre a G e a A em cada fita de DNA (veja abaixo). Assim que os cortes são feitos, o DNA é mantido unido pelas pontes de hidrogênio entre as quatro bases do meio. As pontes de hidrogênio são frágeis, e então o DNA se separa.
Sítios de restrição: 5’ GAATTC 3’ 3’ CTTAAG 5’
DNA cortado: 5’ G AATTC 3’ 3’ CTTAA G 5’
A EcoRI não corta diretamente a molécula de DNA. Quando a EcoRI corta uma molécula de DNA, há a formação de fitas simples como “ caudas” nos finais novos. Este tipo de final é chamado de “ finais coesivos” (sticky end) porque podem se unir facilmente a outras fitas com finais complementares. Nem todas as enzimas de restrição formam finais coesivos; algumas cortam as duas fitas de DNA diretamente, produzindo um “ final abrupto” (blunt end).
Quando os cientistas estudam uma molécula de DNA, uma das primeiras coisas a fazer é solucionar onde estão os sítios de restrição. Então, eles criam um mapa de restrição, mostrando a localização dos sítios de clivagem para muitas enzimas diferentes. Estes mapas são utilizados como mapas rodoviários para a molécula de DNA. A figura 1 mostra um mapa de restrição de um plasmídio.
Figura 1. Mapa de restrição do plasmídio YIP5 (5541 pares de base). O número após cada nome de enzima de restrição indica em qual par de base o DNA é cortado pela enzima.
Abaixo estão demonstrados alguns sítios de restrição de diferentes enzimas de restrição.
EcoRI: 5’ GAATTC 3’ HindIII: 5’ AAGCTT 3’
3’ CTTAAG 5’ 3’ TTCGAA 5’
BamHI: 5’ GGATCC 3’ AluI: 5’ AGCT 3’
3’ CCTAGG 5’ 3’ TCGA 5’ SmaI: 5’ CCCGGG 3’ HbaI: 5’ GCGC 3’ 3’ GGGCCC 5’ 3’ CGCG 5’ ApaI (2035) EagI (942) SmaI (2540) PvuII (3247) PvuI (4916) EcoRI (1/5541) HindIII (32)
Quais destas enzimas formariam finais abruptos? Quais delas formariam finais coesivos?
Exercício 1
Corte a faixa de papel com a seqüência de DNA ao longo de suas bordas. Esta faixa representa uma molécula de DNA de fita dupla. Cada seqüência de letras representa a cadeia fosfodiéster, e as linhas verticais entre os pares de base representam as pontes de hidrogênio entre as bases.
1. Você vai simular a atividade da EcoRI. Verifique ao longo da seqüência do DNA 1 até você encontrar o sítio da EcoRI (utilize a lista de enzimas dada como referência). Faça cortes através da cadeia fosfo-diéster justamente entre a G e a A do sítio de restrição em ambas as fitas. Não corte através de toda a faixa. Lembre-se que a EcoRI corta a cadeia de cada fita de DNA separadamente.
2. Agora separe as pontes de hidrogênio entre os sítios de corte, cortando através das linhas verticais. Separe os dois pedaços de DNA. Analise os finais produzidos pela EcoRI. Eles são abruptos ou coesivos? Escreva EcoRI nos finais cortados. Mantenha os fragmentos cortados em sua mesa.
3. Repita o procedimento com a faixa 2, desta vez simulando a atividade da SmaI. Encontre o sítio da SmaI e corte através do esqueleto fosfodiéster nos sítios indicados acima. Há alguma ponte de hidrogênio entre os sítios de restrição? Os finais novos são coesivos ou abruptos? Marque os novos finais com SmaI e mantenha os fragmentos de DNA em sua mesa.
4. Simule a atividade da HindIII com a faixa 3. Estes finais são coesivos ou abruptos? Marque os novos finais com HindIII e mantenha os fragmentos.
5. Repita o procedimento com a faixa 4, simulando a EcoRI novamente.
6. Pegue o “ fragmento de DNA inicial” da faixa 4 (um fragmento) EcoRI e o “ fragmento final” da HindIII da faixa 3. Ambos os fragmentos têm “ caudas” em
identifique-as EcoRI e HindIII. Marque os finais 5’ e 3’ . As seqüências de bases dos finais produzidos pela EcoRI e HindIII são complementares?
7. Tire o fragmento da HindIII e pegue o fragmento final da faixa 1 (cortado com EcoRI). Compare os finais de fita simples do fragmento produzido pela EcoRI na faixa 1 com o fragmento produzido pela EcoRI na faixa 4. Escreva as seqüências de bases das “ caudas” de fita simples e marque os finais 5’ e 3’ . Eles são complementares?
8. Imagine que você cortou um fragmento de DNA completamente desconhecido com EcoRI. Você acha que os finais de fita simples destes fragmentos serão complementares àqueles produzidos nas faixas 1 e 4?
9. Uma enzima chamada DNA ligase refaz as pontes fosfodiéster entre nucleotídeos. Para a DNA ligase trabalhar, dois nucleotídeos devem se aproximar com a orientação apropriada para a ponte (o final 5’ de um deve estar próximo ao final 3’ do outro). Você acha que seria mais fácil para a DNA ligase reconectar dois fragmentos cortados pela EcoRI ou um fragmento cortado pela EcoRI com outro cortado pela HindIII? Qual é a sua explicação?
Exercício 2
A figura 1 é um mapa de restrição do plasmídio circular YIP5. Este plasmídio contém 5541 pares de bases. Há um sítio de restrição da EcoRI no par de base 1. As posições dos outros sítios de restrição estão demonstradas no mapa. Os números após o nome das enzimas mostram em qual par de base a enzima cliva o DNA. Se você digerir o YIP5 com EcoRI, você vai obter um pedaço de DNA com 5541 pares de bases.
10. Quais seriam os produtos de digestão com as enzimas EcoRI e EagI?
11. Quais seriam of produtos de digestão com as enzimas HindIII e ApaI?
12. Quais seriam of produtos de digestão com as enzimas HindIII, ApaI e PvuI?
13. Se você pegar os produtos de digestão da questão 10 e digeri-los com PvuI, quais seriam os produtos?
1 1
5’ - TAGACTGAATTCAAGTCA - 3’
3’ - ATCTGACTTAAGTTCAGT - 5’
2 2
5’ - ATACGCCCGGGTTCTAAA - 3’
3’ - TATGCGGGCCCAAGATTT - 5’
3 3
5’ - CAGGATCGAAGCTTATGC - 3’
3’ - GTCCTAGCTTCGAATACG - 5’
4 4
5’ - AATAGAATTCCGATCCGA - 3’
3’ - TTATCTTAAGGCTAGGCT - 5’
DNA e Eletroforese
Você já aprendeu sobre as enzimas de restrição e como elas clivam o DNA em fragmentos. Você também deve ter notado que, em alguns mapas de restrição, uma enzima pode produzir muitos fragmentos de DNA. Para realizar a digestão com enzimas de restrição, basta acrescentar ao DNA a enzima desejada e deixa-la agir num tempo e temperatura apropriados. Antes de a reação começar, a mistura no tubo parece um fluido claro. Ao término da reação, a mistura continua clara! Olhando apenas para o tubo, como você pode dizer que aconteceu alguma coisa?
Para verificar o produto de uma reação de digestão com enzimas de restrição, você deve ser capaz de visualizar os diferentes fragmentos produzidos. Existem corantes químicos que coram o DNA, mas obviamente não é bom adicionar estes corantes à mistura no tubo. No laboratório, os cientistas utilizam um processo chamado eletroforese em gel para separar os fragmentos de DNA de modo que eles podem visualizar o resultado de uma digestão (além de outros procedimentos).
A eletroforese em gel utiliza a natureza química do DNA para separar os fragmentos. Sob circunstâncias normais, os grupos fosfato na cadeia do DNA são carregados negativamente. Então, as moléculas de DNA são muito mais atraídas pelo que é carregado positivamente. No gel de eletroforese, as moléculas de DNA são colocadas em um campo elétrico (o qual tem um pólo positivo e um pólo negativo) e vão migrar para o pólo positivo.
O campo elétrico faz com que as moléculas de DNA se movam, mas para que elas se separem e sejam distinguidas umas das outras, todo o processo ocorre em um gel (daí vem o nome eletroforese em gel). Para separar o DNA, são utilizados diferentes tipos de gel. O gel mais freqüentemente utilizado na eletroforese de DNA é chamado de agarose e se comporta como uma gelatina comestível, porém sem açúcar e sem cor. Para fazer um gel para DNA (ou para moldar um gel), você deve dissolver a agarose em pó em um tampão fervente, colocar em um recipiente apropriado e deixar resfriar. Enquanto isto esfria, solidifica.
Para aplicar o DNA no gel de agarose, utiliza-se um pente apropriado na agarose ainda líquida e já disposta no recipiente. Quando a agarose se solidifica e o pente é retirado, permanece uma fila de pequenos orifícios no gel. As amostras de DNA são colocadas nos poços antes do início da eletroforese.
Para a eletroforese, todo o gel é colocado em uma cuba de eletroforese com um tampão (água + sal). É aplicada uma corrente elétrica, a qual vai fluir através do tampão e do gel. Quando a corrente é aplicada, as moléculas de DNA começam a migrar para o pólo positivo do campo elétrico (Figura 2).
+
Figura 2. Na eletroforese, o gel é colocado em uma cuba com solução salina e é aplicada uma corrente elétrica. O DNA carregado negativamente migra para o pólo positivo.
Todo o DNA migra para o pólo positivo, mas o material do gel torna a migração mais difícil para as moléculas de DNA maiores do que para as menores. Então, em um mesmo período de tempo, um fragmento pequeno de DNA pode migrar muito mais longe do que um fragmento grande. Você pode pensar no gel de eletroforese como uma pista de corrida onde os “ corredores” (as moléculas a serem separadas) se separam como
Cuba de eletroforese com solução salina
DNA
Fonte de energia
atletas em uma corrida real (Figura 3). As moléculas menores correm mais rápidas. Duas moléculas do mesmo tamanho vão correr exatamente juntas.
+
+
+
Figura 3. Na eletroforese, os “DNAs pequenos” sempre ganham.
Após algum tempo, a corrente elétrica é cortada e o gel é colocado em uma solução corante. Após a coloração, o DNA pode ser visualizado. O método mais utilizado pelos pesquisadores é a coloração com brometo de etídio. Quando o brometo de etídio se liga ao DNA, este fluoresce sob luz ultravioleta (UV). (Obs: O brometo de etídio é mutagênico e requer extrema cautela durante a sua utilização e recipientes adequados para descarte). O padrão observado é uma série de riscos (bandas) no gel; cada banda é composta por moléculas de DNA de um tamanho. Na verdade, existem milhões de moléculas de DNA em uma mesma banda, mas elas são do mesmo tamanho (ou de tamanhos muito próximos). Após a digestão com enzimas de restrição, o gel deve apresentar uma banda para cada fragmento de tamanho diferente produzido na digestão. O fragmento menor
será aquele que migrou mais longe do poço onde foi colocado a amostra e o fragmento maior será aquele que migrou menos (Figura 4).
A
B
Amostras 9.000 (Não há amostras 8.000 no restante do gel) 4.000 3.000 2.000Figura 4. Uma das finalidades da eletroforese em gel é separar produtos de digestão com enzimas de restrição. (A) Mapa de restrição com o tamanho dos fragmentos em pares de base. (B) Esquema de um gel após a eletroforese.
8.000 2.000 3.000 4.000 9.000
1. Digestão com enzima de restrição 2. Eletroforese
Atividade
Nas próximas páginas, você tem três representações de uma molécula de DNA (Apêndice 1) e o esquema de um gel de eletroforese (Apêndice 2). No Apêndice 1 estão representados os sítios de três enzimas de restrição diferentes na mesma molécula de DNA. Você vai simular a digestão deste DNA com cada uma das três enzimas e então vai simular a eletroforese dos fragmentos de restrição em um gel de agarose.
1. Corte as três figuras da molécula de DNA.
2. Simule a atividade da enzima de restrição EcoRI na molécula de DNA que mostra os sítios da EcoRI, cortando a faixa nas linhas verticais que representam os sítios da EcoRI. Após ter “ digerido a molécula com a EcoRI” mantenha os seus fragmentos de restrição.
3. Agora você vai digerir a segunda molécula de DNA com a BamHI. Preserve os fragmentos de restrição obtidos.
4. Faça o mesmo com a última molécula de DNA, utilizando a enzima HindIII.
5. Em seu gel de eletroforese imaginário, você vai separar os fragmentos da EcoRI, BamHI e HindIII como se você tivesse aplicado estas amostras em poços diferentes e adjacentes no gel. Arrume os seus fragmentos como se eles estivessem sido separados através de eletroforese em gel de agarose. (Os fragmentos maiores devem ficar mais próximos dos poços onde as amostras foram aplicadas).
6. Agora, separe os fragmentos BamHI e coloque-os adjacente aos fragmentos EcoRI. Certifique-se de ter ordenado cada fragmento EcoRI corretamente pelo tamanho com relação aos fragmentos BamHI que você já havia disposto.
7. Repita o mesmo procedimento para os fragmentos HindIII. Agora você deve ter três grupos de fragmentos dispostos na sua frente.
8. Agora olhe para o esquema de um gel de eletroforese dado no Apêndice 2. Note que ele tem uma escala de tamanho dado em pares de bases disposta à esquerda dos
poços do gel. Utilizando esta escala como um guia, desenhe o padrão obtido com a digestão que você realizou. Utilize um poço para a digestão com EcoRI, outro para a digestão com BamHI e um terceiro para a digestão com HindIII.
9. Utilize as informações obtidas nas fitas de papel que você recortou para desenhar as bandas representando os fragmentos de restrição em pares de bases.
Todos os fragmentos menores no gel estão na frente dos fragmentos maiores? Você notou que o tamanho da escala parece não ter intervalos regulares? Isto ocorre porque os fragmentos de tamanhos diferentes se comportam de forma diferente no gel de agarose.
Apêndice 1
Você tem a representação de três moléculas de DNA com 15.000 pares de bases. Cada representação mostra a localização de diferentes sítios de restrição (linhas verticais). Os números entre os sítios de restrição mostram os tamanhos (em pares de bases) dos fragmentos que serão gerados após a digestão do DNA com as respectivas enzimas.
Sítios de restrição da EcoRI
Sítios de restrição da BamHI
Sítios de restrição da HindIII
4.000 3.500 2.500 5.000
6.000 4.000 3.000 2.000
Apêndice 2
Esquema de um gel de agarose.
EcoRI BamHI HindIII
Escala de tamanho em pares de bases 8.000 6.000 4.000 3.000 2.000 Amostras
Plasmídios Recombinantes
Algumas das técnicas mais importantes em Biotecnologia utilizadas hoje envolvem a construção de moléculas de DNA recombinantes. O material recombinante é a reunião de fragmentos com origens diferentes. Você pode construir uma bicicleta recombinante através da união de duas bicicletas diferentes: por exemplo, você pode colocar os pneus de uma bicicleta na estrutura de outra. O seu genoma é recombinante porque uma parte veio de sua mãe e outra de seu pai. As moléculas de DNA recombinantes são pedaços de DNA de fontes diferentes que foram reunidos. Em Biotecnologia, geralmente, uma das fontes de DNA é um plasmídio.
Os plasmídios são pequenas moléculas de DNA circulares. Os plasmídios são copiados pelas enzimas de duplicação de DNA da célula porque eles contêm uma seqüência especial de bases chamada de “ origem de duplicação” . As enzimas de duplicação reconhecem esta seqüência especial e começam a sintetizar uma nova molécula de DNA. Como você deve imaginar, o cromossomo da bactéria e outros cromossomos também apresentam “ origem de duplicação” . As origens de duplicação são essenciais para a hereditariedade; se a molécula de DNA não tivesse uma origem de duplicação, ela não poderia ser copiada pela célula e não seria transmitida às gerações futuras.
Os plasmídios freqüentemente contêm genes para resistência a antibióticos. Os antibióticos são substâncias naturais produzidas pela maioria dos microrganismos para matar outros microrganismos quando em competição. A resistência a antibióticos também é um fenômeno natural; os microorganismos que produzem antibióticos devem ser resistentes pelo menos ao antibiótico que produzem! Nós vamos trabalhar com os genes para resistência aos antibióticos ampicilina e canamicina.
Nesta atividade, você vai reunir plasmídios que carregam genes para resistência à ampicilina e à canamicina e então recombinar os dois plasmídios. Nós chamamos o plasmídio com resistência a ampicilina de pAMP, o plasmídio com resitência à canamicina de pKAN e o plasmídio recombinante de pAMP/KAN. Nós vamos utilizar um modelo de plasmídios de papel para mimetizar o processo realizado quando da construção de um DNA recombinante. A tesoura vai substituir as enzimas de restrição. A enzima DNA
ligase, a qual forma as pontes de fosfodiéster entre os pedaços de DNA, será representada pela fita adesiva (ou cola). Nosso resultado será uma molécula de DNA recombinante. Os cientistas colocam os plasmídios recombinantes reais em bactérias, onde eles vão se multiplicar. As bactérias também se multiplicam, fazendo milhões de cópias de moléculas de DNA recombinante e das proteínas que elas codificam.
A construção dos plasmídios pAMP e pKAN
Localize as fitas de DNA nos Apêndices “ Modelo de papel do plasmídio pAMP” e “ Modelo de papel do plasmídio pKAN” . Em cada faixa, as seqüências de letras indicam as bases e as linhas horizontais indicam a cadeia de açúcar e fosfato da molécula de DNA. As pontes de hidrogênio entre os pares de base estão localizadas no espaço em branco entre as linhas formadas pelas seqüências de letras.
1. Corte ao longo das linhas sólidas. Retire cada faixa, deixando as linhas sólidas intactas. Faça um corte vertical para unir o final aberto de cada faixa formada pelas linhas sólidas. Este corte vai remover as marcações 5’ e 3’ de cada fita.
2. Após ter recortado as três faixas, cole com fita adesiva o final “ 1” com a área “ cole 1” , cobrindo as linhas verticais. Cole o final “ 2” ao “ cole 2” e o “ 3” ao “ cole 3” até que você complete o modelo circular do plasmídio pAMP.
3. Utilizando o Apêndice “ Modelo de papel do plasmídio pKAN” faça o mesmo procedimento descrito acima, montando agora o modelo circular do plasmídio que contém o gene de resistência para a canamicina.
Construindo o plamídio recombinante pAMP/KAN
Agora você tem os plasmídios pAMP e pKAN preparados. Você vai usa-los agora como materiais iniciais para construir um plasmídio recombinante. Corte o pAMP e o pKAN com as enzimas BamHI e HindIII. Você vai unir os fragmentos de cada plasmídio, criando um plamídio pAMP/KAN.
1. Primeiro, simule a atividade da enzima de restrição BamHI. Lendo da posição 5’ para a 3’ (esquerda para a direita) ao longo da fita superior do seu plasmídio pAMP, encontre a seqüência de bases GGATCC (sítio de restrição da BamHI). Note que esta é uma seqüência palindrômica. Corte através da cadeia de açúcar e fosfato entre as duas G; pare no centro da área em branco que contém as pontes de hidrogênio (não corte através de todo o papel). Faça o mesmo com a fita oposta. Agora corte através das pontes de hidrogênio entre os dois cortes anteriores e abra o plasmídio em uma tira. Cada final da tira deve ter uma pequena seqüência de fita simples 3’ CTAG 5’ . Marque no final de cada faixa ‘ BamHI’ .
2. Agora, simule a atividade da enzima de restrição HindIII. Lendo da posição 5’ para a 3’ (esquerda para a direita) ao longo da fita superior do seu plasmídio pAMP, encontre a seqüência de bases AAGCTT (sítio de restrição da HindIII). Note que esta é também uma seqüência palindrômica. Corte através da cadeia de açúcar e fosfato entre as duas A; pare no centro da área em branco que contém as pontes de hidrogênio (não corte através de todo o papel). Faça o mesmo cortando entre as duas A do sítio de restrição da fita oposta. Agora corte através das pontes de hidrogênio entre os dois cortes anteriores e abra o plasmídio em uma tira. Cada final da tira deve ter uma pequena seqüência de fita simples; uma é o final BamHI e a outra é a seqüência 3’ TCGA 5’ . Agora você tem dois pedaços de DNA do pAMP. Reserve-os.
3. Utilizando o modelo de plasmídio pKAN, repita os passos 1 e 2. O plasmídio pKAN deve resultar em duas partes com os finais marcados.
4. Pegue o pedaço de plasmídio que contém o gene de resistência à ampicilina e reúna ao pedaço contendo o gene de resistência à canamicina utilizando a ‘ DNA ligase’ (fita adesiva). Certifique-se da complementaridade de bases quando você fizer a ligação. Note que o final BamHI não vai parear com o final HindIII, mas vai parear com o outro final BamHI. Da mesma forma, o final HindIII deve parear com o outro final HindIII.
Lembre-se de que o DNA é tridimensional. Em nosso modelo, as letras representando as bases podem parecer uma em cima da outra, mas no DNA real isto não acontece. Então, nesta simulação no papel, as letras representando as bases não precisam necessariamente estar logo acima umas das outras. Certifique-se da direção 5’ 3’ da fita e que os pares de base estejam corretos.
Agora você criou um plamídio recombinante pAMP/KAN.
Transformação
É possível introduzir os plasmídios em bactérias utilizando o processo de transformação. As bactérias que podem ser transformadas (podem receber DNA exógeno) são chamadas de células competentes. Algumas bactérias são competentes naturalmente. Outras podem se tornar competentes por meio de um tratamento químico ou físico. Quando a bactéria incorpora o plasmídio, ela passa a expressar a resistência ao antibiótico que estiver "instruído" no DNA recém adquirido. As bactérias que expressam proteínas novas desta forma são chamadas de transformadas. As enzimas de duplicação de DNA da célula sintetizam cópias novas do plasmídio, que será, então, transmitido às células-filhas quando a bactéria se multiplicar. Neste processo são geradas muitas cópias idênticas de genes novos, então, dizemos que estes são genes clonados.
Após a transformação por plasmídios contendo genes de resistência a antibióticos, as bactérias transformadas podem ser detectadas quando são cultivadas em placas contendo o(s) antibiótico(s). No meio de cultura contendo antibiótico, apenas as bactérias que expressarem o novo gene de resistência ao antibiótico vão formar colônias (as bactérias transformadas). Este método de selecionar transformantes (porque eles não são os únicos que podem crescem em meio de cultura) é vantajoso porque, normalmente, a transformação é um processo bastante ineficiente. Em um experimento típico, apenas 1 célula em cada 1.000 será transformada.
Questões
1. Um sítio de corte feito pela BamHI vai se ligar apenas a um corte que tenha sido feito por BamHI. O mesmo é verdade para cortes feitos pela HindIII e pela maioria dos sítios de corte das enzimas de restrição. Se você usa dois fragmentos de uma vez, quais combinações diferentes poderiam ser formadas a partir dos quatro fragmentos que você obteve no exercício 3? Quais destes poderiam ser detectados em colônias de transformantes em meio de cultura contendo antibiótico?
2. Supondo que você fez a atividade com DNA real e pretende transformar bactérias com o seu plasmídio pAMP/KAN. Descreva um experimento para crescer as bactérias transformadas em placas e selecionar aquelas que tenham sido transformadas por pAMP/KAN. Inclua os controles que poderão lhe dizer quais bactérias formarão colônias e se o antibiótico está ativo.
3. Com relação à questão 2, descreva um procedimento para distinguir as bactérias que foram transformadas por outras moléculas de DNA que se formaram durante o processo de ligação (você descreveu estas moléculas na questão 1).
4. Freqüentemente, os cientistas combinam um gene de resistência a um antibiótico com seja qual for o gene que eles estão tentando clonar. Este gene é então associado a um gene de resistência a um antibiótico. Qualquer bactéria que contenha o gene de interesse será, portanto, resistente ao antibiótico. Na maioria dos casos, os cientistas não têm interesse na proteína que destrói o antibiótico. Porque então os cientistas combinam os genes desta forma?
Modelo de papel do plasmídio pAMP
1
Gene de resistência à ampicilina
5' AATTCGATGAATTCXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXGAATTCTGAAGGTTCGAAGCGCTAT
3' TTAAGCTACTTAAGXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXCTTAAGACTTCCAAGCTTCGCGATA
2
5' GTCGGATCCAGATCCGAAGTCTCTCTAGGACCTTGCGAAGCCACGTAGTTCAGATTAATGCCTGAT
3' CAGCCTAGGTCTAGGCTTCAGAGAGATCCTGGAACGCTTCGGTGCATCAAGTCTAATTACGGACTA
3
Origem de duplicação
5' CGCTACAAGCTTATAGCGGCCXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXAATATTGCGCAGTCTTAGCACTCC
3' GCGATGTTCGAATATCGCCGGXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXTTATAACGCGTCAGAATCGTGAGG
Modelo de papel do plasmídio pKAN
1
Origem de duplicação
5' TACTCGATGAAATCXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXAGCTATGTTCTGAAGGATCCATATAGCGC
3' ATGAGCTACTTTAGXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXTCGATACAAGACTTCCTAGGTATATCGCG
2
Gene de resistência à kanamicina
5' ATGACCGTCAGATCCGATGCTTCXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXTCGAACGTACGGTCCGA
3' TACTGGCAGTCTAGGCTACGAAGXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXAGCTTGCATGCCAGGCT
3
5' GATCACATGCTTATAAATATTGCGAAGCTTCAGTCAGCGCGTAGCACTCCTTAACGCGATGCATTAA
3' CTAGTGTACGAATATTTATAACGCTTCGAAGTCAGTCGCGCATCGTGAGGAATTGCGCTACGTAATT
Análise de Restrição
A combinação da digestão com enzimas de restrição e a eletroforese em gel freqüentemente é chamada de análise de restrição, pois a informação obtida destes procedimentos pode ser utilizada para analisar a estrutura da molécula de DNA. A análise de restrição é importante especialmente para verificar a estrutura de moléculas de DNA recombinante e na análise de DNA desconhecido. Os exemplos a seguir mostram alguns problemas típicos de análise de restrição encontrados pelos pesquisadores.
Desafio de análise de restrição I
Você deseja inserir um fragmento de restrição EcoRI de 1.500 pares de bases em um plasmídio (Figura 1). Você digere o plasmídio com EcoRI, pára a digestão, adiciona o fragmento de 1.500 pares de bases e liga. Você sabe que este procedimento vai gerar uma mistura de plasmídios originais e plasmídios recombinantes. Delineie um procedimento de análise de restrição que você poderia utilizar para distinguir entre o vetor regenerado e o vetor recombinante. Estabeleça o tamanho dos fragmentos esperados. Utilize o esquema de gel fornecido para mostrar os produtos esperados na sua análise (um produto por poço). Marque cada poço com o tipo de molécula de DNA (plasmídio ou plasmídio recombinante) e os tamanhos dos fragmentos esperados.
Desafio de análise de restrição II
Você deseja remover o fragmento de restrição EcoRI do plasmídio e substituí-lo por um fragmento EcoRI diferente mas também de 1.500pb. Você digere o plasmídio com EcoRI, pára a digestão, adiciona o fragmento de 1.500 pares de bases e liga (Figura 2).
Vetor incial Esquema do Gel
A distância entre os sítios de restrição é dada em pares de bases.
Fragmento a ser inserido no vetor EcoRI EcoRI
Figura 1. Informação e esquema do gel de eletroforese para o desafio de análise de restrição I.
Vetor incial Fragmento EcoRI a ser inserido
A distância entre os sítios de restrição é dada em pares de bases.
EcoRI BamHI EcoRI
1.500 pb 2.000 pb EcoRI BamHI 3.000 pb 1.000 pb 500 pb 2.000 pb EcoRI BamHI 3.000 pb EcoRI 1.500 pb Origem
Atividade
A. Desenhe os produtos que você poderia gerar que apresente uma origem de duplicação e menos de 7.000pb. (Sugestão: o que são todos os fragmentos presentes na reação de ligação?). Marque os produtos A, B, etc. e indique as distancias entre os sítios de restrição.
B. Descreva um procedimento de análise de restrição que levará você a identificar o maior número de produtos possível após uma única digestão. Você pode usar mais de uma enzima de restrição na digestão. Estabeleça o tamanho dos fragmentos esperados para cada um dos seus produtos de IIA.
C. Use o esquema de gel de eletroforese da figura 3 para desenhar o padrão de gel esperado de sua proposta de análise para cada um dos produtos mostrados em IIA. Marque os poços do gel com o produto (A, B, etc). Marque as bandas com o tamanho dos fragmentos (com base na escala fornecida).
Tamanho do Fragmento (pb) 7.000 4.000 2.000 1.000
Desafio de análise de restrição III
Quando os pesquisadores estudam um fragmento de DNA desconhecido, freqüentemente, a primeira coisa a se fazer é colocar junto a um mapa de restrição. O mapa é então utilizado como um guia quando eles vão estudar os genes codificados por este segmento. Como o fragmento é colocado junto ao mapa de restrição? Deve-se digerir o DNA com enzimas únicas e com combinações de enzimas. Observando-se os tamanhos dos fragmentos produzidos, os pesquisadores determinam as localizações dos sítios de restrição que poderiam resultar no padrão de bandas obtido.
Agora você vai montar um mapa de restrição (como um quebra-cabeça). Um fragmento de DNA linear é digerido com a enzima de restrição EcoRI e resulta em três segmentos: um com 3.000, outro com 3.600 e outro com 3.400 pb. Quando digerida com a BamHI, a molécula de DNA gera fragmentos de 4.500, 3.000 e 2.500pb. Um digestão dupla com EcoRI e BamHI resulta em fragmentos de 2.500, 500, 3.600, 3.000 e 400 pb.
Desenhe um mapa de restrição do fragmento de DNA desconhecido, mostrando as localizações dos sítios de restrição EcoRI e BamHI. Indique as distâncias entre os sítios de restrição em pares de bases. Indique também a distância e a posição de cada um destes sítios com o respectivo nome da enzima.
Detecção de Seqüências Específicas de DNA
Parte 1. Procurando um gene
Imagine que você é um cientista e acabou de extrair um DNA. Você precisa saber se este DNA contém o gene para fibrose cística. Você sabe pouco sobre o gene da fibrose cística, então, como você pode dizer se o tem em sua amostra?
Quando um cientista procura por um determinado segmento de DNA, ele pode utilizar um DNA especial denominado sonda (probe). Normalmente uma sonda é um fragmento de DNA de fita simples. Se um pedaço de DNA de fita simples encontra outro segmento de DNA também de fita simples e com exatamente a mesma seqüência de bases, eles vão se parear formando um DNA de dupla hélice. Os cientistas utilizam um termo especial para o pareamento de duas fitas simples de DNA para constituir uma fita dupla: hibridação (Figura 1).
Figura 1. Hibridação de uma sonda com uma seqüência dentro do DNA de fita simples.
Para saber se um gene está presente na amostra de DNA, os cientistas utilizam uma sonda com a mesma seqüência de uma parte do gene. Ela é adicionada à amostra de DNA para saber se vai hibridar em algum local. Como eles sabem quando a sonda hibridou? Se a sonda hibridar com a amostra, irá “ grudar” com o DNA da amostra. Se não, a sonda pode ser “ retirada” facilmente. Após a “ lavagem” da amostra, os cientistas conseguem saber se a sonda hibridou com a amostra ou não. Se ocorrer a hibridação é porque a seqüência de DNA da sonda está presente na amostra. Se a sonda é um pequeno segmento do gene, então, provavelmente o gene está presente na amostra.
Gene de interesse Sonda
Complementaridade de bases
Atividade
No Anexo 1 você tem uma longa seqüência de DNA representando a sua amostra. Você também tem uma seqüência curta que é uma sonda para o gene da fibrose cística. Você vai utilizar a sonda para determinar se o gene da fibrose cística está em sua amostra de DNA.
A amostra de DNA dada é de fita simples. Para saber se a sonda vai hibridar com a amostra, é necessário separar as fitas de DNA de modo que a sonda possa encontrar a seqüência de bases complementar.
1. Recorte as sondas.
2. Verifique a seqüência de DNA para ver se a sonda vai hibridar com a sua amostra.
3. O gene da fibrose cística está presente em sua amostra de DNA? Se você encontrou uma seqüência onde a sonda poderia se hibridar, marque-a na seqüência de DNA.
Questões
1. O que é hibridação?
2. Como você pode utilizar a hibridação para saber se uma certa seqüência de DNA está presente em sua amostra de DNA?
3. Determine uma sonda com 10 pares de bases (pb) que poderia se hibridar com a seqüência de DNA a seguir.
Anexo 1. Sequência de DNA de fita simples e sonda.
Sonda
: 3' GGATGCTACCATAGC 5' 3' GGATGCTACCATAGC 5'
Amostra de DNA (a sequência está escrita no sentido 5' 3'):
1
GGATCAGACTTCTAGCAGGCTCTTGACCAATGATCACAGCTTCCGATCTAG
2
AGCTCGATCTCTTGATCTCGATCTCGTGTCGGAATCTAGCCCGGGTCAGC
3
TATCGCTAAGATAGACCGGAATCGAGAATTCCGGATCGATCGATTGTGCGA
4
CCGCGATTATTCGATCGTTTGCCCGGGATCTAGCTTTCCGATCTAGCTGTG
5
TCAAGCTAGTGGAATCGAATTCGGAACTCGGCCCGATCTTGATCTCCCGGG
6
ACAATTGTCGATCTGATGCTAGCTGAATCGATGTGCCTAAGTGCTAGCCCGG
7
GCGATCTGGGATCGATTCCCGGGATCTAGGCCTACGATGGTATCGTTAGC
8
TAGCTCTCTAGCTTAGCTCTCAAGTGATCTACCCGGGTAGATCTAGTATATTG
9
TATCGATATTTTCGCTTAGCTAGCCCGGGCTAGCTCTCTCTAGCTAATAGATAG
10
TCTAGCTAGCTAGCTAGCTGTGTCTAGTCGATCGTTTGTCGATCTTCGATC
Detecção de Seqüências Específicas de DNA
Parte 2. Combinando a análise de restrição e a hibridação
A análise de hibridação que você aprendeu em ‘Procurando um gene’ pode indicar se uma dada seqüência de DNA está presente em sua amostra. Algumas vezes, este simples "pedaço" de informação é tudo o que é necessário. Contudo, um teste de hibridação positiva não dá nenhuma informação sobre onde a seqüência de interesse está localizada na molécula de DNA de sua amostra.
Para se ter informação sobre a presença e a localização de uma determinada seqüência de DNA, os pesquisadores combinam a análise de restrição com a de hibridação. Basicamente, a amostra de DNA é digerida com uma (ou mais) enzima de restrição e os fragmentos são separados por eletroforese. Após a eletroforese é realizada a hibridação nestes fragmentos. Apenas o fragmento (ou os fragmentos) nos quais a sonda se hibridar será detectado (Figura 1).
Gel corado Resultado da análise de hibridação
Há alguns detalhes técnicos importantes sobre este processo. Primeiro que a eficiência não é boa se você simplesmente colocar a agarose em contado com a solução de sonda. Em 1975, um cientista chamado Southern desenvolveu um procedimento para transferir os fragmentos de DNA de um gel diretamente para uma membrana, de forma que a disposição dos fragmentos no gel fosse preservada. Após os fragmentos terem sido transferidos para a membrana, eles poderiam ser testados na análise de hibridação com a sonda. Este método de transferência é chamado de Southern blotting; e a combinação de análise de restrição, transferência para uma membrana e hibridação com uma sonda é chamado de "Análise de hibridação por Southern".
Atividade
1. Recorte a seqüência de DNA da atividade anterior ao longo das linhas pontilhadas. Cole a fita 1 na fita 2 e esta na fita 3 sucessivamente até a fita 10, formando uma molécula longa e linear. Esta molécula poderia ser um cromossomo como um dos nossos.
2. Agora simule a atividade da enzima de restrição SmaI. Esta enzima corta o DNA nas seqüências 5' CCCGGG 3' entre a C e a G no meio da seqüência. Corte a sua seqüência em todos os sítios de restrição SmaI. (Os seus fragmentos estão em fita simples antecipadamente para facilitar a hibridação. Na realidade, a digestão e a eletroforese são realizadas com o DNA em fita dupla; apenas após a eletroforese e a transferência para a membrana é que os fragmentos serão separados ou desnaturados).
3. Agora, simule a eletroforese dos seus fragmentos. Distribua-os por ordem de tamanho e disponha-os em sua mesa como se eles estivessem em um gel.
4. Utilize o esquema dado no Anexo 1 e desenhe a disposição dos seus fragmentos no gel.
5. Marque com um asterisco a(s) banda(s) onde houve hibridação com a sonda.
6. Lembre-se de que o padrão de fragmentos de DNA no seu gel será transferido exatamente da mesma forma para a membrana. Na membrana, os fragmentos serão testados para a hibridação com a sonda e apenas o(s) fragmento(s) que hibridou com a sonda será detectado (como foi demonstrado na Figura 1). Desenhe o que será detectado após a hibridação no quadro marcado "Resultado da análise de hibridação".
Questão
1. É possível recortar uma banda de um gel de eletroforese, purificar o DNA que estiver nesta banda e clonar este DNA. Suponha que você tem uma sonda para um gene viral que você gostaria de clonar, mas você não sabe onde ele se encontra no cromossomo de 40.000 pb do vírus. Como a análise de hibridação poderia ajudá-lo a clonar este gene?
Anexo 1. Esquemas para a eletroforese em gel e para o resultado da análise de hibridação.
Gel de eletroforese corado Resutado da análise de hibridação
Tamanho dos Tamanho dos
fragmentos Amostra fragmentos
(pb) (pb) 100 100 90 90 80 80 70 70 60 60 50 50 40 40 30 30 20 20
Detecção de Seqüências Específicas de DNA
Parte 3. Hibridação por
Southern
Problema A
Você está analisando o DNA de um vírus recém-descoberto. Você já construiu um mapa de restrição com 26.500 pb, demonstrado no Anexo 1. Já que você está interessado em enzimas DNA polimerases, você conduziu a análise de hibridação do DNA do vírus X utilizando um gene de DNA polimerase de outro vírus como sonda. Você acredita que esta seqüência é relacionada com o vírus X. Para sua alegria, a sonda hibridou com o DNA do vírus X. Você acredita que a seqüência de DNA do vírus X na qual a sonda hibridou seja o gene da DNA polimerase do vírus X.
Agora você gostaria de determinar a localização do gene da DNA polimerase do vírus X e, para isto, realizou a análise de hibridação por Southern. Você digeriu o DNA viral com EcoRI e BamHI separadamente, separou os fragmentos em um gel, transferiu-os para uma membrana e realizou a hibridação utilizando a mesma sonda do gene da DNA polimerase.
No Anexo 1 há uma figura dos fragmentos no gel de eletroforese e o padrão obtido após a hibridação com a sonda na membrana.
Questões
1. Marque os fragmentos no gel com os seus respectivos tamanhos em pares de bases.
2. Indique, nos mapas de restrição, a região do DNA do vírus X na qual está localizado o gene da DNA polimerase.
3. A que distância da esquerda o gene poderia estar, em termos de sítios de restrição? E a que distância da direita?
4. Porque o gene da DNA polimerase de um outro vírus poderia hibridar com fragmentos de DNA do vírus X?
Problema B
No Anexo 2 você encontra um mapa de restrição do Bacteriófago lambda. Você digeriu uma amostra de DNA do fago com as enzimas BamHI e HindIII separadamente e submeteu os fragmentos digeridos à eletroforese.
Agora você transferiu os fragmentos para uma membrana e realizou a análise de hibridação utilizando um fragmento de 4.878 pb do lambda digerido com EcoRI (referido no mapa) como uma sonda.
1. Desenhe o resultado do gel de eletroforese no esquema dado no Anexo 2 (os dois fragmentos menores da HindIII vão correr para fora do gel).
2. Indique quais fragmentos vão hibridar com a sonda de 4.878 pb (A hibridação vai ocorrer mesmo que ocorra uma complementaridade apenas parcial da sonda com o fragmento de restrição).
3. No segundo quadro, desenhe o que poderia ser visto após a detecção da sonda na membrana.
Anexo 1. Mapas de restrição e análise de hibridação do vírus X para a detecção de seqüências específicas do DNA – Parte 3.
O mapa de restrição superior mostra os sítios de restrição EcoRI e o inferior mostra os sítios de restrição BamHI. Os tamanhos dos fragmentos são dados em pares de bases. O gel de eletroforese corado mostra os fragmentos EcoRI e BamHI do vírus. A análise de hibridação mostra quais as bandas que hibridaram com a sonda.
Mapa de restrição EcoRI
9.000 5.500 4.000 2.000 6.000
Mapa de restrição BamHI
3.000 7.500 10.500 5.500
Gel corado Resultado da análise de hibridação
EcoRI BamHI EcoRI BamHI
Tamanho, pb
10.000 8.000
Anexo 2. Mapas de restrição e análise de hibridação do bacteriófago lambda para a detecção de seqüências específicas do DNA – Parte 3.
Os sítios de restrição do bacteriófago lambda para as enzimas BamHI, HindIII e EcoRI estão demonstrados abaixo. Os tamanhos dos fragmentos são dados em pares de bases. Os esquemas do gel e da análise de hibridação são fornecidos para o seu uso.
Mapa de restrição BamHI
5.505 16.841 5.626 6.527 7.233 6.770
Mapa de restrição HindIII
23.130 9.416 6.557 4.361
Mapa de restrição EcoRI
21.226 4.878 5.643 7.421 5.804 3.530
Gel corado Resultado da análise de hibridação EcoRI BamHI EcoRI BamHI
Tamanho, pb 10.000 8.000 4.000 2.000 2.027 2.322 564 125
Sequenciamento do DNA: os finalizadores
A determinação da seqüência de bases de um segmento de DNA é um passo crítico em muitas aplicações da Biotecnologia. O método mais utilizado hoje emprega componentes chamados de "finalizadores de cadeia", um termo que descreve o efeito letal destes componentes na síntese do DNA e a natureza das enzimas DNA polimerases. Estas enzimas lêem a seqüência de uma fita simples de DNA e sintetizam uma fita complementar. Os “finalizadores de cadeia” nos permitem verificar a ordem na qual as enzimas DNA polimerases incorporam as bases à nova fita de DNA, e então, deduzir a seqüência da fita molde.
O que são estes "finalizadores de cadeia" e como eles bloqueiam a síntese do DNA? Os "finalizadores de cadeia" são moléculas muito semelhantes aos nucleotídeos normais, mas sem o grupo essencial hidroxila (OH) na posição 3' (Figura 1). Na duplicação do DNA, um nucleotídeo complementar à base molde é incorporado na devida posição. A DNA polimerase incorpora este nucleotídeo à fita de DNA em formação inserindo uma ponte de fosfodiéster entre o grupo fosfato na posição 5' do novo nucleotídeo e o grupo OH na posição 3' do último nucleotídeo da cadeia. A DNA polimerase não pode sintetizar o DNA sem um grupo 3' OH preexistente para ser usado como um ponto inicial (daí a necessidade de um fragmento inicial - primer - para o início da síntese de DNA). Se a DNA polimerase incorpora erroneamente um finalizador de cadeia no lugar de um nucleotídeo normal, nenhum nucleotídeo poderá então ser adicionado posteriormente e a síntese do DNA estará finalizada.
O
OH
H
HO CH
2 base DeoxinucleosídioO
H
H
HO CH
2 base DideoxinucleosídioFigura 1. Um deoxinucleotídeo normal com os "finalizadores de cadeia". Todos são incorporados ao DNA em sua forma trifosfato.
Os finalizadores de cadeia utilizados no sequenciamento do DNA são os dideoxinucleotídeos (Figura 1). Como os dideoxinucleotídeos nos levam a identificar a seqüência de bases de uma molécula de DNA? A reação de sequenciamento contém a amostra de DNA a ser sequenciada, os iniciadores (primers) e os deoxinucleotídeos normais radioativos (deoxiadenosina [dA], dG, dC, dT). Esta solução inicial é dividida em 4 partes e cada parte é então acrescida de um dideoxinucleotídeo diferente: dideoxiadenosina (ddA), ddG, ddC ou ddT. Adiciona-se então a enzima DNA polimerase e serão sintetizadas novas moléculas de DNA. Contudo, ocasionalmente é inserido um dideoxinucleotídeo no lugar de um deoxinucleotídeo normal e a cadeia de DNA pára de ser sintetizada. Na solução de reação contendo ddA (a reação A), alguma porcentagem das novas moléculas vão adicionar um ddA onde houver uma T na fita molde. O resultado é um grupo de novas moléculas as quais terminam em cada T que aparece na fita molde. Similarmente, na reação G, algumas das novas moléculas vão terminar a cada C da fita molde. Na reação C, algumas das novas moléculas vão terminar a cada G da fita molde e na reação T, as moléculas terminam a cada A da fita molde.
Ao seu término, as reações de síntese (reação-A, -G, -C e -T) são desnaturadas pelo calor e submetidas à eletroforese em um gel de poliacrilamida. As moléculas recém-sintetizadas são separadas de acordo com o seu tamanho e visualizadas pela exposição do gel a um filme fotográfico (lembre-se de que os novos nucleotídeos são radioativos). A reação-A vai mostrar bandas que correspondem, em tamanho, às posições das T na fita molde. A reação-G vai mostrar bandas cujos tamanhos correspondem às posições das C
O
N
3H
HO CH
2 base AzidotimidinaO
H OH
HO CH
2 base Aciclovire assim por diante. A seqüência da nova fita de DNA é "lida" na seqüência de bandas que aparecem no gel a partir da porção inferior (final do gel), onde estão os fragmentos menores.
Esta explicação pode parecer confusa. Não se preocupe. Faça agora a simulação de um sequenciamento (Anexo 1) e então volte a ler esta introdução. Só então responda as questões a seguir.
Atividade (esta atividade deve ser realizada em classe)
1. Recorte os iniciadores (primers) dados no Anexo 1 (quatro "moléculas" por estudante). A fita mais longa é a fita molde e a mais curta, pareada com a fita molde, é o iniciador.
2. Separe clipes de papel de 5 cores diferentes: 20 de cada uma de quatro cores e 4 de uma cor que será o "finalizador de cadeia". Os clipes vão representar os novos nucleotídeos radioativos.
3. Reserve 4 copos plásticos e marque em cada um A, C, G ou T. Determine quais cores de clipes vão representar a A, C, G e a T. A classe deve ser dividida em 4 grupos: grupo A, grupo C, grupo G e grupo T. Cada grupo vai conduzir apenas uma reação de sequenciamento nas 4 fitas-molde. Os estudantes do grupo A devem colocar 20 clipes da cor pré-determinada nos copos G, C e T e no copo plástico A devem colocar 16 clipes da cor A e os 4 clipes "finalizadores de cadeia" e misturá-los com os demais. Neste caso, os 4 clipes diferentes representam as moléculas de dideoxiadenosina (ddA). Os estudantes do grupo G devem separar 20 clipes A, C e T; no copo G devem colocar 16 clipes G e 4 clipes "finalizadores de cadeia". Os grupos C e T devem fazer as suas "reações" seguindo este mesmo raciocínio.
4. Agora todos devem começar a sintetizar a nova fita de DNA a partir do final 3' do primer. Os nucleotídeos devem ser incorporados de acordo com a complementaridade com a fita molde. Os nucleotídeos devem ser pegos ao acaso (de olhos fechados); se você pegar um "finalizador de cadeia" este deve ser incorporado à nova fita, mas nenhum outro nucleotídeo poderá ser adicionado. Cada estudante deve construir uma nova fita de DNA quatro vezes (uma para cada fita molde).
5. Agora você deve desnaturar as suas amostras e realizar a eletroforese. Desnature as amostras cortando o papel entre a fita molde e o primer (você deve ficar com o primer juntamente com a fita nova de DNA [clipes] que você construiu).
6. Em uma folha grande, desenhe o esquema do gel de sequenciamento da seguinte forma (onde P = primer):
A G C T
P + 16 P + 15 P + 14
P + 3 P + 2 P + 1
7. Os estudantes de cada grupo devem montar apenas um "gel" e "aplicar as suas amostras" no poço correspondente ao seu tipo de reação de sequenciamento (A, G, C ou T).
8. Cada estudante deve contar quantos nucleotídeos (clipes) foram incorporados ao primer (P) em cada uma das quatro fitas de DNA produzidas e então colocar cada fita em seu devido lugar no gel de acordo com o guia de referência de tamanho das moléculas (P+1, P+2, etc).
9. Agora deve ser montado um único gel. Quando todos os grupos terminarem, um representante de cada grupo deve desenhar as bandas obtidas pelos demais.
10. Agora a seqüência do gel pode ser totalmente lida. Confira o resultado com a fita molde.
Questões
1. A seqüência inteira da molécula de DNA molde (representada pela fita de DNA de papel) está presente no gel de sequenciamento?
2. Se você acrescentar alguns dideoxinucleotídeos no meio de uma cultura de células, qual (se há algum) processo celular seria o mais afetado?
3. (Texto a seguir) Os dideoxinucletídeos e outras moléculas "finalizadoras de cadeia" são utilizados na Medicina como drogas no combate à AIDS. Porque?
Os "terminadores de cadeia" são utilizados como drogas anti-virais.
As substâncias químicas utilizadas inicialmente em laboratórios de pesquisa, encontram freqüentemente uma utilização na Medicina. Componentes que afetam os processos biológicos são importantes na pesquisa básica e algumas vezes têm utilidade terapêutica. Os finalizadores de cadeia são um bom exemplo de tais componentes. Inicialmente eles foram utilizados no sequenciamento do DNA (1995) e, posteriormente, como uma droga anti-AIDS e como a melhor droga disponível anti-herpes (desta classe de componentes).
Como os finalizadores de cadeia são utilizados na luta contra a AIDS e infecções pelo vírus do herpes As infecções virais são combatidas da mesma forma que é realizado o sequenciamento: finalizando a síntese de DNA. Para que um vírus estabeleça uma infecção, ele necessita multiplicar o seu ácido nucléico. Bloquear esta duplicação é uma forma potencialmente eficaz de combater a infecção pelo vírus, mas o bloqueio da síntese do DNA pode ser prejudicial tanto para o vírus como para o paciente. O combate ao vírus do herpes e ao vírus da AIDS pode ser feito usando-se drogas que inibem a duplicação porque eles codificam as suas próprias enzimas de síntese de DNA, as quais têm propriedades únicas que podem ser exploradas.
O vírus da AIDS (Human Immunodeficiency Virus - HIV) é um vírus de RNA. Ele codifica uma enzima especial, chamada transcriptase reversa, que sintetiza o DNA utilizando o RNA viral como molde. Este passo é essencial para a infecção pelo HIV. Os finalizadores de cadeia vão interferir neste passo. A enzima transcriptase reversa é um bom alvo para as drogas finalizadoras de cadeia porque é uma enzima “descuidada”: ela incorpora mais facilmente nucleotídeos errados ou os finalizadores de cadeia do que uma polimerase humana. Além disso, a transcriptase reversa não tem a propriedade de rever os nucleotídeos incorporados e remover aqueles incorretos.
Há outros aspectos importantes na utilização das drogas finalizadoras de cadeia além da sensibilidade das polimerases virais. A droga deve permanecer no corpo e ser absorvida pelas células-alvo. A forma trifosfato ativa dos finalizadores de cadeia (demonstrada na Figura 2 pelo nucleotídeo que está sendo incorporado na cadeia) não é absorvida pelas células, de forma que as drogas são ministradas na forma desfosforilada (demonstrada na Figura 1). Quando estes componentes entram na célula, as enzimas humanas são capazes de adicionar grupos fosfato (fosforilar as moléculas) para ativá-las. Diferentes
desenvolvimento de uma nova droga depende não apenas de sua toxicidade para o vírus, mas também de como ela é metabolizada no corpo humano.
Os finalizadores de cadeia freqüentemente empregados contra o vírus da AIDS são: azidotimidina (AZT), dideoxicitosina (ddC; o mesmo componente usado no sequenciamento do DNA) e dideoxinosina (ddI) (Figura 1). O AZT, um análogo da timidina, é incorporado à cadeia de DNA que está sendo sintetizada no lugar da citosina. A inosina é um análogo de nucleotídeo que é idêntico à adenosina, exceto pela presença de um grupo amino. As células sintetizam inosina e esta é convertida diretamente em adenosina. Quando a ddI é ministrada como droga, ela entra na célula e é convertida rapidamente em ddA. A ddA é incorporada pela transcriptase reversa no lugar da adenosina normal.
Estas drogas têm efeitos colaterais aos pacientes. Embora a DNA polimerase humana seja menos sensível às drogas do que a transcriptase reversa, a síntese de DNA nas células humanas normais também é afetada. O AZT é tóxico particularmente à medula óssea, enquanto o ddC e o ddI afetam os nervos periféricos. Infelizmente, o HIV adquire resistência a estes componentes.
Os vírus do herpes são vírus de DNA com genomas relativamente grandes. Eles codificam muitas de suas próprias enzimas de duplicação, incluindo a DNA polimerase. Após a infecção inicial, o vírus do herpes permanece no corpo no estado inativo (latente), do qual ele pode ser ativado e causar a doença. Os vírus do herpes simples 1 (HSV-1) e 2 (HSV-2) causam herpes labial e genital, respectivamente. O vírus do herpes (Varicella-zoster virus) causa a catapora.
O vírus do herpes simples 1 pode ser tratado com o terminador de cadeia aciclovir (Figura 1). O aciclovir (conhecido comercialmente como Zovirax) é relativamente atóxico para o corpo humano porque as nossas células não conseguem fosforilar esta droga que permanece na forma inativa. Contudo o vírus do herpes codifica uma enzima que fosforila o aciclovir de forma que este se tornará ativo apenas naquelas células infectadas pelo vírus. O aciclovir é um análogo da guanina (G) e é incorporado onde houver uma citosina na fita molde. Uma vez incorporado o aciclovir finaliza a síntese do DNA viral e inibe a atividade da polimerase do vírus do herpes.
Iniciadores e fita molde para o Sequenciamento do DNA
5’ CGAACATC
3’ GCTTGTAGAAGCTGCATTGACGCT
5’
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 165’ CGAACATC
3’ GCTTGTAGAAGCTGCATTGACGCT
5’
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 165’ CGAACATC
3’ GCTTGTAGAAGCTGCATTGACGCT
5’
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 165’ CGAACATC
3’ GCTTGTAGAAGCTGCATTGACGCT
5’
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16Reação em Cadeia da Polimerase
(Polymerase Chain Reaction - PCR)
Uma das dificuldades dos pesquisadores frente à análise baseada no DNA é a escassez deste. Na medicina forense pode-se ter em mãos apenas uma gota de sangue ou de saliva para testar; um evolucionista pode querer analisar um exemplar de um museu sem destruí-lo. Mesmo que se tenha uma grande quantidade de tecido, seria trabalhoso purificar o DNA em larga escala.
Em 1985, foi introduzida uma técnica revolucionária. Esta técnica permite gerar uma grande quantidade de cópias de um fragmento de DNA específico. Ela foi inventada por um cientista de indústria farmacêutica chamado Kary Mullis, que teve sua inspiração inicial numa noite em 1983 quando ele estava dirigindo e pensando sobre um problema técnico que ele estava enfrentando em seu trabalho.
A essência da idéia de Mullis é o seguinte: se você pudesse colocar em um tubo uma reação na qual a DNA polimerase duplicasse uma única fita-molde de DNA em 2 moléculas, estas em 4, então em 8, 16, 32, etc, você teria um número virtualmente infinito de cópias da molécula original. Cada ciclo da síntese de DNA dobraria o número de moléculas iniciais: uma reação em cadeia produzindo fragmentos específicos de DNA. A nova técnica de Mullis foi chamada de reação em cadeia da polimerase (Polymerase
Chain Reaction) ou PCR.
Naturalmente, Mullis fez mais do que apenas perceber que a DNA polimerase pode copiar uma hélice de DNA em duas. Você também já sabia disto. O que ele fez foi imaginar como realizar a reação in vitro e como utilizar esta reação para copiar um segmento de DNA de interesse.
O método de Mullis se baseia nas características das enzimas DNA polimerases e no processo de hibridação. Lembre-se de que as DNA polimerases devem ter um iniciador (primer) pareado a uma fita molde para sintetizar uma fita complementar e também que a hibridação é um processo espontâneo no qual as bases formam pares complementares. Você pode separar duas fitas de uma hélice pelo calor, mas se resfriá-las, elas tornarão a se unir.
Primeiro você deve decidir qual segmento do DNA você deseja duplicar (os pesquisadores dizem amplificar ao invés de duplicar porque eles estão fazendo muitas cópias). Então você sintetiza duas moléculas de DNA de fitas simples curtas (20 a 28 nucleotídeos) e complementares às extremidades do segmento que você escolheu. Estas duas moléculas pequenas devem ter características específicas. Observe o início da figura 1 (ciclo 1). Estão esquematizadas uma fita dupla de DNA e duas cópias de duas moléculas pequenas de DNA de fita simples. Cada uma das moléculas de fita simples é complementar a apenas uma fita do DNA parental e cada uma é complementar apenas à porção final do segmento. Além disso, se você imaginar estas moléculas pequenas pareadas às regiões complementares respectivas na fita-dupla, os seus finais 3' vão apontar um para o outro. Estas moléculas pequenas e de fita-simples são chamadas de iniciadores (primers).
Para realizar a PCR uma grande quantidade de iniciadores e de molécula-molde são misturadas em um tubo contendo um tampão e muitos deoxinucleotídeos trifosfatados. Esta mistura é aquecida até quase a ponto de ebulição e então as fitas das moléculas-molde desnaturam (se separam uma da outra).
Depois, esta mistura é resfriada. Eventualmente, as fitas da molécula parental de DNA se reúnem, mas como há uma grande quantidade de iniciadores na mistura, alguns deles encontram seus sítios complementares nas fitas-molde antes que estas se reúnam (Hibridação do primer com a fita-molde na figura 1).
Agora a DNA polimerase é adicionada à reação. Os iniciadores hibridados à molécula-molde são os pré-requisitos para que a DNA polimerase inicie a síntese do DNA. A DNA polimerase começa a adicionar os deoxinucletídeos no final 3' dos iniciadores, formando uma nova fita complementar (Síntese do DNA na figura 1).
Após um curto espaço de tempo, a mistura é novamente aquecida. Agora, as duas fitas-molde novas desnaturam, resultando em quatro fitas-simples (Desnaturação no ciclo 2 da figura 1). A mistura é resfriada e os iniciadores se hibridam às moléculas de fita simples (Hibridação, ciclo 2). A DNA polimerase é adicionada à reação e os deoxinucleotídeos são adicionados ao final 3' dos iniciadores hibridados, formando quatro moléculas de fita-dupla (Síntese de DNA, ciclo 2). Note que duas das fitas recém-sintetizadas começam e terminam nos sítios de hibridação dos iniciadores.
Este processo de desnaturação, hibridação e síntese de DNA se repete de 25 a 45 vezes, resultando em um grande número de moléculas. A grande maioria das moléculas
recém-pode escolher qual segmento será amplificado através da escolha dos iniciadores. Hoje a PCR é utilizada rotineiramente para muitos propósitos diferentes: para amplificar um fragmento específico de DNA para clonagem, para gerar um fingerprint de uma amostra muito pequena de DNA, para o diagnóstico de doenças, etc.
Um aperfeiçoamento técnico do processo tornou a PCR muito mais fácil. Você notou que a DNA polimerase foi adicionada antes de cada síntese de DNA? Isto porque as primeiras PCR utilizavam a DNA polimerase da Escherichia coli, a qual é inativada sob alta temperatura. Então, a enzima deveria ser acrescentada a cada ciclo de síntese. Posteriormente, foram isoladas enzimas de microrganismos que vivem em águas oceânicas profundas. Estas enzimas não são inativadas pelo calor e resistem às temperaturas elevadas necessárias para a síntese do DNA. Hoje a PCR é realizada com DNA polimerases resistentes ao calor, e então é adicionada apenas uma vez no início da reação. A DNA polimerase mais utilizada é a Taq DNA polimerase (proveniente da bactéria Thermus aquaticus).
Quando a PCR foi desenvolvida, utilizava-se três banhos-Maria com as temperaturas necessárias para desnaturação, hibridação e síntese do DNA. Os pesquisadores transferiam os tubos de um banho para outro. Posteriormente foi desenvolvida uma máquina que altera rapidamente as temperaturas necessárias, chamada de termociclador. Hoje a PCR é realizada através da adição de DNA, iniciadores, tampão, deoxinucleotídeos e DNA polimerase em um tubo e este é levado ao termociclador, que pode ser programado com as temperaturas e o número de ciclos necessários, e espera-se até que os ciclos tenham sido completados (cerca de 2 a 4 horas).
Porém, só se aprende a fazer PCR com a prática. E por isso você vai simular uma PCR e um teste diagnóstico baseado em PCR no papel (você pode pintar o DNA-molde, os iniciadores e as moléculas recém-sintetizadas para facilitar a sua compreensão).
Ciclo 1 Ciclo 2
Fita-dupla de DNA parental Desnaturação
Iniciadores de fita simples Desnaturação Hibridação Hibridação Síntese do DNA Síntese do DNA TCGAA 3’ 3’ GGGCC 5’ CCCGG AGCTT 3’ 5’ CCCGG AGCTT 3’ 5’ GGGCC TCGAA 3’ CCCGG 5’ CCCGG 5’ TCGAA 3’ TCGAA 3’ 5’ CCCGG AGCTT 3’ TCGAA 5’ 5’ GGGCC TCGAA 3’ CCCGG 5’ 3’ GGGCC 5’ CCCGG AGCTT 3’ TCGAA 5’ 5’ CCCGG AGCTT 3’ 5’ GGGCC TCGAA 3’ 5’ GGGCC TCGAA 3’ 5’ CCCGG TCGAA 3’ 3’ GGGCC TCGAA 5’ 5’ GGGCC TCGAA 3’ 5’ CCCGG TCGAA 3’ 5’ CCCGG AGCTT 3’ TCGAA 5’ 3’ GGGCC TCGAA 5’ CCCGG 5’ 5’ CCCGG TCGAA 3’ TCGAA 5’ 5’ GGGCC TCGAA 3’ CCCGG 5’ 5’ CCCGG AGCTT 3’ TCGAA 5’ 3’ GGGCC TCGAA 5’ CCCGG 5’ 3’ GGGCC 5’ CCCGG TCGAA 3’ TCGAA 5’ TCGAA 3’ 5’ GGGCC TCGAA 3’ CCCGG 5’
