TÍTULO: AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIPARASITÁRIA IN VIVO DO NEROLIDOL EM CAMUNDONGOS EXPERIMENTALMENTE INFECTADOS COM SCHISTOSOMA MANSONI
TÍTULO:
CATEGORIA: CONCLUÍDO
CATEGORIA:
ÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E SAÚDE
ÁREA:
SUBÁREA: BIOMEDICINA
SUBÁREA:
INSTITUIÇÃO: UNIVERSIDADE GUARULHOS
INSTITUIÇÃO:
AUTOR(ES): ANA CAROLINA ARAUJO MENGARDA
AUTOR(ES):
ORIENTADOR(ES): JOSUÉ DE MORAES
ORIENTADOR(ES):
COLABORADOR(ES): ADEMAR A. DA SILVA FILHO, DAMIÃO P. DE SOUSA, DANIEL B. ROQUINI, FERNANDA S. TEIXEIRA, MARCOS P. SILVA, MARIA C. SALVADORI, PEDRO L. S. PINTO,
ROSIMEIRE N. DE OLIVEIRA, SILMARA M. ALLEGRETTI
1. RESUMO
A esquistossomose é um grande problema de saúde pública em todo o mundo, especialmente em comunidades pobres. Uma vez que o praziquantel é atualmente o único medicamento disponível para tratar a esquistossomose, há uma necessidade urgente de identificar novos fármacos esquistossomicida. Nerolidol é um sesquiterpeno presente em óleos essenciais de diversas plantas e seu uso tem sido aprovado pela US Food and Drug Administration (FDA). Neste estudo, avaliamos a atividade antiparasitária in vivo do nerolidol em camundongos infectados experimentalmente com Schistosoma mansoni. Grupos de animais foram tratados oralmente com dose única de nerolidol (100, 200 e 400 mg/kg) 49 dias após infecção (vermes adultos.) e nerolidol 400 mg/kg 21 dias (vermes juvenis). Em animais albergando parasitos adultos, comparativamente a grupos de animais infectados e não tratados, nerolidol 400 mg/kg reduziu a carga parasitária em 70.06% (P < 0.001); o oograma quantitativo e qualitativo também mostrou uma redução de 84.6% (P < 0.001) dos ovos imaturos. Além disso, pelo método Kato–Katz notou-se uma redução de 75.2% (P < 0.001) no número de ovos/grama nas fezes de animais tratados com 400 mg/kg de nerolidol. A microscopia eletrônica de varredura revelou alterações no tegumento dos helmintos após tratamento com nerolidol 400 mg/kg. Uma vez que o nerolidol já está em uso global como um aditivo alimentar e tem um registro de segurança, a avaliação do potencial deste composto natural para o tratamento da esquistossomose pode ser totalmente econômica em um futuro próximo.
Palavras-chave: Schistosoma mansoni; Esquistossomose; Esquistossomicida. Antiparasitário; Nerolidol; Produto natural.
2. INTRODUÇÃO
A esquistossomose é uma importante doença negligenciada causada por helmintos do gênero Schistosoma (COLLEY et al., 2014). Ela afeta mais de 200 milhões de pessoas nas regiões tropicais e subtropicais do mundo, especialmente em comunidades pobres sem acesso a água potável e saneamento adequado (VAN DER WERF et al., 2003; STEINMANN et al., 2006). Os efeitos econômicos e sanitários da esquistossomose são consideráveis, e a doença incapacita mais
indivíduos prevalecendo sobre os índices de mortalidade (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2016). Em crianças, a esquistossomose pode causar anemia, raquitismo e reduzir a capacidade de aprender. A esquistossomose crônica pode afetar a capacidade de trabalho das pessoas e, em alguns casos, pode resultar em morte. A estimativa atual de anos de vida ajustados por incapacidade (Disability Adjusted Life Years - DALYs) para a esquistossomose é de 3,3 milhões (HOTEZ et al., 2010). A infecção humana é causada por três espécies principais, nomeadas, Schistosoma mansoni e S. japonicum, que causam esquistossomose intestinal / hepática, e S. haematobium, que resulta em doença urogenital (COLLEY et al., 2014).
Nas últimas décadas, a quimioterapia tem sido uma estratégia amplamente utilizada para o controle e tratamento da esquistossomose, é limitada ao isoquinolina-pirazino, praziquantel, que foi lançado na década de 1970. No entanto, o fármaco não impede a reinfecção e, devido ao uso por mais de três décadas, o aparecimento de parasitas do gênero Schistosoma resistentes ao PZQ (praziquantel) é uma ameaça constante. Além disso, existe uma deficiência crítica no seu perfil terapêutico, uma vez que carece de atividade contra parasitas na fase juvenil (CIOLI et al., 2014). Portanto, a busca por uma nova quimioterapia é crucial para o controle efetivo da esquistossomose no futuro.
Os produtos naturais, especialmente de plantas medicinais, apresentam uma diversidade de moléculas e têm sido uma fonte confiável de agentes quimioterápicos, incluindo a descoberta de anti-helmínticos (MAFUD et al., 2016; MORAES, 2015). Nos últimos anos, um número crescente de estudos mostraram que o nerolidol, um álcool sesquiterpeno alifático encontrado em óleos essenciais de várias plantas e exibe uma variedade de propriedades biológicas, tais como propriedades antimicrobianas, antitumorais, antioxidantes, antinociceptivas, anti-úlceras, anti-inflamatórias e inseticidas (CHAN et al., 2016). Além do mais, nerolidol demonstrou atividade contra vários parasitas, incluindo Plasmodium (SAITO et al., 2016), Babesia (ABOULAILA et al., 2010), Trypanosoma (HOET et al., 2006) e Leishmania (ARRUDA et al., 2005). É importante notar que o nerolidol é usado em muitos alimentos e produtos perfumados e foi aprovado pela U.S.Food and Drug Administration (FDA) (LAPCZYNSKI et al., 2008; MCGINTY; LETIZIA; API, 2010). Estudos recentes do nosso grupo relataram o efeito anti-helmíntico do nerolidol
contra vermes adultos de S. mansoni ex vivo (SILVA et al., 2014). Com o objetivo de dar continuidade nos estudos, no presente estudo foi avaliada a atividade in vivo do terpeno nerolidol em camundongos infectados com S. mansoni.
3. OBJETIVOS
Avaliar o efeito anti-helmíntico in vivo do nerolidol em camundongos experimentalmente infectados com S. mansoni na fase adulta e juvenil.
4. METODOLOGIA
Para estudos in vivo, foram utilizados camundongos Balb/c com três semanas de idade que foram infectados com cerca de 70 cercárias de S. mansoni (linhagem BH).
Os procedimentos envolvendo animais foram realizados de acordo com a legislação brasileira (11790/2008). O protocolo de manutenção do ciclo de vida de S. mansoni foi aprovado pelo comitê de ética local sobre experimentação animal, Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA), protocolo nº 05/2015.
O Nerolidol (uma mistura de isômeros cis- e trans-) foi adquirido da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA).
Para avaliar o efeito do nerolidol em infecções com parasitas adultos de S. mansoni (infecção patente), os camundongos foram tratados com uma dose oral única de nerolidol 49 dias após a infecção. O nerolidol foi misturado em óleo mineral e administrado nos roedores com 100 μL via oral. O grupo controle recebeu apenas um volume igual de óleo mineral. Os camundongos foram divididos em 4 grupos experimentais, onde cada grupo consistia em 10 animais tratados com dose oral única como se segue: Grupo I, grupo controle. Grupo II, grupo tratado com nerolidol (400 mg / kg). Grupo III, grupo tratado com nerolidol (200 mg / kg). Grupo IV, grupo tratado com nerolidol (100 mg / kg).
Posteriormente, com base na atividade in vivo contra S. mansoni adulto, o nerolidol foi testado em camundongos contendo S. mansoni na fase juvenil (infecção pré-patente). Neste caso, 21 dias após a infecção (infecção pré-patente), um grupo
de 10 camundongos foi tratado com uma única dose oral de 400 mg / kg de nerolidol. Dez roedores não tratados serviram como controles.
Duas semanas após o tratamento, os roedores foram eutanizados e os esquistossomas sobreviventes residentes nas veias mesentéricas e no fígado foram contados e sexados como descrito (DE MORAES J et al., 2014). A avaliação da eficácia terapêutica baseou-se também na técnica de oograma quantitativo e qualitativo, utilizando um fragmento do intestino (10 mm) (PELLEGRINO et al., 1962), bem como o método de Kato-Katz para o exame quantitativo de fezes (KATZ; CHAVES; PELLEGRINO, 1972). No padrão oograma, os ovos foram classificados como imaturos, maduros ou mortos (PELLEGRINO et al., 1962).
Para mostrar se o nerolidol pode causar alterações morfológicas no tegumento de esquistossomas adultos recuperados de camundongos, dois roedores adicionais foram tratados oralmente com 400 mg / kg de nerolidol e dissecados 24 e 48 h pós-tratamento (DE MORAES J et al., 2014). Os vermes recuperados foram enxaguados duas vezes em PBS e fixados em 1 mL de glutaraldeído a 2,5% durante 3-24 h à temperatura ambiente. As amostras foram preparadas como descrito previamente (20). Resumidamente, os espécimes foram secos ao ar, montados em stubs e metalizados com ouro usando um SputterCoater. As amostras foram então visualizadas utilizando um Microscópio Eletrônico de Varredura (MEV) de alta resolução JEOL JSM-6460LV (JEOL Ltd., Tóquio, Japão) de alta resolução com uma tensão de aceleração de 20 kV.
Os testes estatísticos foram realizados com o software GRAPHPAD PRISM (versão 5.0). O teste de Dunnet foi utilizado para analisar a significância estatística das diferenças entre os valores médios experimentais e de controle (DE MORAES J et al., 2014). Um valor de P <0,05 foi considerado significativo.
5. DESENVOLVIMENTO
Nerolidol é um terpeno aprovado pela FDA amplamente utilizado na indústria, na fabricação de produtos cosméticos e não cosméticos (por exemplo: xampus, perfumes, detergentes e produtos de limpeza) e como um intensificador de sabor em muitos produtos alimentares (LAPCZYNSKI et al., 2008; MCGINTY; LETIZIA; API,
2010). Está presente nos óleos essenciais de várias plantas e exibe uma variedade de propriedades biológicas e farmacológicas (CHAN et al., 2016). Com base em dados farmacocinéticos e toxicológicos disponíveis, o nerolidol é considerado seguro e tem um grande potencial para ser usado como um novo medicamento químico ou terapêutico (CHAN et al., 2016; LAPCZYNSKI et al., 2008; MCGINTY; LETIZIA; API, 2010). Estudo prévio demonstrou que nerolidol com 31-62 μM ocasionou à morte de vermes adultos de S. mansoni em experimentos ex vivo (DE MORAES J et al., 2014). No presente estudo, o nerolidol foi testado experimentalmente pela primeira vez em um modelo animal utilizando camundongos infectados com S. mansoni.
Foram administradas doses orais de 100-400 mg/kg em camundongos com 49 dias após a infecção (infecção patente). Posteriormente, uma única dose oral de 400 mg / kg de nerolidol foi administrada nos camundongos 21 dias após a infecção (infecção pré-patente). Foram avaliados os seguintes parâmetros: quantidade de vermes, quantidade de ovos nas fezes e frequência de estágios de desenvolvimento dos ovos. O tegumento é a principal interface entre o esquistossoma e seu ambiente externo. Além de fornecer proteção, o tegumento tem sido um alvo importante para drogas esquistossomicida (MORAES, 2012; MORAES et al., 2011). Essa investigação foi realizada por Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV).
6. RESULTADOS
Em primeiro lugar, avaliamos a relação dose-resposta do nerolidol em infecções com S. mansoni adultos. Grupos de 10 camundongos foram então tratados oralmente com doses únicas de nerolidol (100, 200 e 400 mg / kg) aos 49 dias após a infecção. Depois disso, com base na sua atividade in vivo contra S. mansoni adultos (infecção patente), nerolidol foi testado em camundongos que abrigavam S. mansoni juvenil (infecção pré-patente) 21 dias.
Em camundongos infectados por S. mansoni adulto, houve redução significativa na carga de vermes após tratamento oral por nerolidol (P <0,001). A maior atividade foi observada com uma dose única de nerolidol 400 mg / kg, com redução total da quantidade de vermes em 70%. Com uma dose de 200 mg / kg, a redução total da quantidade de vermes foi de 50%. Na dose mais baixa investigada
(100 mg / kg), o nerolidol não mostrou nenhum efeito significativo na carga de vermes em comparação com controles não tratados infectados.
Além dos efeitos in vivo descritos acima, o tratamento oral com nerolidol reduziu a produção de ovos. Na parede do intestino, os ovos em todos os estágios de desenvolvimento foram observados no grupo tratado, mas a frequência de ovos imaturos foi significativamente menor em comparação com os controles não tratados (P <0,001). A administração de doses únicas de 200 mg / kg e 400 mg / kg alcançou reduções no número de ovos imaturos de 65% e 85% respectivamente (P <0,001). Com uma dose de 100 mg / kg, a redução dos ovos imaturos era de 30% (P <0,05). O oograma também mostrou aumentos significativos na proporção de ovos mortos a 200 mg / kg e 400 mg / kg (P <0,001), enquanto que nenhuma redução significativa no número de ovos de S. mansoni foi observada com uma dose única de 100 mg / kg em camundongos infectados por S. mansoni.
Nas amostras de fezes coletadas de camundongos, o método de Kato-Katz revelou que o nerolidol reduziu significativamente o número de ovos em comparação com o grupo controle não tratado, com redução de 50% (P <0,01) e 75% (P <0,001) em doses de 200 e 400 mg / kg, respectivamente.
Na análise por MEV no tegumento de vermes adultos de S. mansoni recuperados a partir de camundongos não tratados infectados e camundongos tratados com nerolidol (400 mg / kg) na infecção patente, os efeitos estão apresentados na figura 1. Nerolidol causou alterações morfológicas no tegumento de vermes macho e fêmea.
Figura 1: (A) vermes fêmeas de animais infectados e não tratado (controle). (B) Vermes fêmeas de animais infectados e tratados com nerolidol; Superfície tegumentar mostrando bolhas, inchaço e encurtamento. (C) Vermes machos de animais infectados e não tratados (controle); Superfície dorsal do tegumento mostrando tubérculos e espinhos na superfície. (D) Vermes machos de animais infectados e tratados com nerolidol; Superfície do tegumento dorsal mostrando inchaço, encurtamento e ruptura dos tubérculos ou mesmo perda dos espinhos na superfície.
Nerolidol na dose de 400 mg / kg foi mais eficaz contra vermes adultos de S. mansoni. Com base nisso, analisamos os efeitos deste composto sobre a forma juvenil de S. mansoni. No entanto, em contraste com a atividade in vivo de nerolidol em camundongos que possuíam infecções adultas, o tratamento de camundongos infectados com S. mansoni juvenil com dose oral única de 400 mg / kg mostrou uma fraca redução na carga de vermes e ovos, em comparação com o grupo controle. Na verdade, as reduções de carga de vermes total ficaram moderadas, mas não significativas, 30% foram alcançadas com nerolidol. Além disso, a análise do padrão do oograma mostrou todos os estágios de desenvolvimento com predominância de ovos imaturos e nenhuma redução significativa em ovos imaturos, em comparação com camundongos não tratados. O exame Kato-Katz revelou uma baixa redução de ovos de 25% em comparação com o grupo controle.
7. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Em conclusão, os resultados do presente estudo mostraram o efeito anti-helmintico do nerolidol utilizando um modelo animal, especialmente no período de infecção patente. Além de reduzir a carga parasitária, o tratamento oral com nerolidol resultou em uma redução acentuada na produção total de ovos, com uma diminuição dos ovos imaturos totais e um aumento nos ovos mortos. Como o controle da esquistossomose depende de um único fármaco, há uma necessidade urgente de identificar novos fármacos anti-Schistosoma. Nerolidol é facilmente disponível e de baixo custo, e aprovado pelo U.S. Food and Drug Administration. Reconhecido como seguro, a avaliação do potencial deste composto natural para o tratamento da esquistossomose, poderá resultar em aplicações como antiparasitário.
8. FONTES CONSULTADAS
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