UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL FACULDADE DE VETERINÁRIA
ESPECIALIZAÇÃO EM ANÁLISES CLÍNICAS VETERINÁRIAS
PARVOVIROSE CANINA – REVISÃO DE LITERATURA
Autor: Tatiana Rohde Pavan
Orientador: MV, MSc, PhD Luiz Carlos Kreuz
Porto Alegre 2009
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL FACULDADE DE VETERINÁRIA
ESPECIALIZAÇÃO EM ANÁLISES CLÍNICAS VETERINÁRIAS
PARVOVIROSE CANINA – REVISÃO DE LITERATURA
Autor: Tatiana Rohde Pavan
Monografia apresentada à Faculdade de
Veterinária como requisito parcial para obtenção do grau de Especialista em Análises Clínicas Veterinárias
Orientador: MV, MSc, PhD Luiz Carlos Kreutz
Porto Alegre 2009
"O valor de todo o conhecimento está no seu vínculo com as nossas necessidades, aspirações e ações; de outra forma, o conhecimento torna-se um simples lastro de memória, capaz apenas - como um navio que navega com demasiado peso - de diminuir a oscilação da vida quotidiana." (V. O. Kliutchevski)
RESUMO
A parvovirose canina é uma infecção aguda com alta taxa de mortalidade. A doença é altamente contagiosa e representa uma das causas mais comuns de diarréia hemorrágica aguda em cães de companhia. Por isso um diagnóstico rápido e confiável é importante. O diagnóstico clínico da parvovirose canina não é decisivo, uma vez que outros patógenos podem causar diarréia em cães. Como alternativa, o diagnóstico deve ser baseado na combinação de histórico, sinais clínicos, parâmetros laboratoriais e presença confirmada do vírus nas fezes. A alta sensibilidade do real-time PCR permite a detecção do ácido nucléico viral por um longo período, embora os títulos caiam para cerca de 104 DNA cópias/mg de fezes no período final. A presença simultânea da cepa de campo e da vacinal ocorre com frequência quando filhotes são infectados em um período pré ou pós-vacinal muito curto e um sistema capaz de quantificar a quantidade relativa de DNA pode ser aplicado com sucesso para esclarecer as controvérsias existentes entre veterinários, indústria farmacêutica, criadores e proprietários de cães.
ABSTRACT
Canine parvoviral (CPV) enteritis is an acute life-threatening infection. It is highly contagious and represents one of the most common causes of acute hemorrhagic diarrhea in pet dogs. Therefore, quick and reliable diagnosis is important. The clinical diagnosis of CPV infection is indecisive, since several other pathogens may cause diarrhea in dogs. Instead, diagnosis should be based on a combination of history, clinical signs, laboratory parameters and positive fecal test results. The higher sensitivity of real-time PCR allowed the detection of viral nucleic acid for a much longer period, although titers dropped to about 104 DNA copies/mg of feces toward the end. Simultaneous presence of wild-type and vaccinal strains is likely to occur when pups are infected shortly before or after vaccine administration and a system able to show and quantify the relative amounts of DNA may be apllied successfully to resolve controversies between veterinary practitionaries, the pharmaceutical industry, dogs breeders and pet owners.
ABREVIATURAS E SIGLAS
Cap: 7-metil-guanina ligada na extremidade 5´ do RNA. CDV: canine distemper virus
CPV: parvovírus canino.
CRFK: célula de linhagem de rim felino DNA: acido desoxirribonucléico
ELISA: ensaio imunoenzimático FLPV: vírus da panleucopenia felina GEH: gastrenterite hemorrágica HA: teste de hemaglutinação HI: inibicao da hemaglutinacao kDa: quilodalton
MDCK: célula de linhagem de rim canino mRNA: RNA mensageiro
MRV: mammalian reoviruses ORFs: open reading frame SN: soroneutralizacao
SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO... 08 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA... 10 2.1 Parvovirose Canina... 10 2.1.1 Etiologia... 11 2.1.2 Epidemiologia... 13
2.1.3 Patogenia e sinais clínicos... 14
2.1.4 Diagnóstico... 17
2.1.5 Controle e profilaxia... 22
CONSIDERAÇÕES FINAIS... 24
INTRODUÇÃO
O parvovírus canino (CPV) é a principal causa de infecções intestinais em cães domésticos com menos de seis meses de idade. Durante os últimos 20 anos, o CPV-2 sofreu alterações genéticas no cão, desenvolvendo novas cepas virais. Essas alterações permitiram adaptações genéticas, que capacitaram o vírus a se replicar e se disseminar de modo mais eficiente.
O CPV-2 é extremamente estável e resistente às influências ambientais adversas. Esse vírus é capaz de subsistir em objetos inanimados, como roupas e pisos. A maioria dos detergentes e desinfetantes falham ao tentar inativar as cepas desse vírus, com exceção do hipoclorito de sódio.
O início súbito de diarréia sanguinolenta de odor pútrido em um cão jovem frequentemente é considerado indicativo de infecção por CPV. Os testes de pesquisa de antígeno fecal por meio de ensaio imunoenzimático (ELISA) estão disponíveis comercialmente. O teste da reação em cadeia da polimerase (PCR) é empregado com o um meio específico e sensível para detecção do vírus, assim como para diferenciar as cepas de campo das vacinais.
A parvovirose canina, por ser uma enterite infecciosa altamente contagiosa, representa uma das causas mais comuns de diarréia em filhotes, portanto um diagnóstico rápido e confiável é importante.
Técnicas moleculares utilizadas para o diagnóstico isoladamente não são suficientes, o diagnóstico deve ser baseado na combinação de histórico, achados clínicos e laboratoriais, além da detecção da presença do vírus nas fezes por PCR, por exemplo.
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Parvovirose Canina
A parvovirose canina é considerada uma das principais causas de diarréia de origem infecciosa em cães com idade inferior a seis meses. A doença é causada pelo parvovírus canino (canine parvovirus, CPV) que surgiu no final dos anos 1970 e disseminou-se rapidamente por todos os continentes. A incidência da infecção é elevada em todo o mundo. A parvovirose canina caracteriza-se por enterite grave, com anorexia, vômitos, diarréia hemorrágica e choque. O CPV deve ser diferenciado do outro parvovirus que infecta cães, o canine minute vírus (CnMV), que foi descrito em 1970, possui ocorrência pouco freqüente e é considerado pouco patogênico. (FLORES, 2007).
Após o surgimento a partir do FLPV (vírus da panleucopenia felina), o CPV continuou sofrendo alterações genéticas, dando origem a novas cepas, designadas como subtipos CPV-2a e CPV-2b. Felizmente as diferenças antigênicas entre essas cepas são mínimas e as vacinas protegem contra ambas. Um terceiro subtipo tem sido proposto, o CPV-2c. O CPV-2b é amplamente difundido nos Estados Unidos, enquanto na Europa encontram-se tanto o CPV-2b como o CPV-2a. No Brasil, existem relatos da circulação de ambos os subtipos. (FLORES, 2007). ,
2.1.1 Etiologia
Os membros da família Parvoviridae são vírus pequenos, esféricos, com capsídeo icosaédrico, que possuem uma molécula de DNA linear de fita simples como genoma. O nome da família deriva do tamanho dos vírions (parvus = pequeno). (FLORES, 2007).
Uma característica marcante dos parvovírus é a dependência de células na fase S do ciclo celular ou em divisão, para sua replicação. Essa dependência se deve ao requerimento da maquinaria celular para a síntese de DNA e replicação do genoma viral, devido ao número restrito de genes e funções codificadas pelo genoma do vírus (FLORES, 2007).
A dependência na fase S do ciclo celular exerce grande influência sobre a patogenia das infecções pelo parvovírus, afetando preferencialmente órgãos que apresentam células em multiplicação, como células precursoras do epitélio intestinal. Os parvovírus apresentam grande estabilidade no ambiente, podendo manter sua infectividade durante meses (FLORES, 2007).
O parvovírus canino foi identificado primeiramente em 1978, por Burtonboy et al. (1979), identificando duas ORFs no genoma viral, que codificam duas proteínas estruturais (NS1 e NS2) e três proteínas estruturais (VP1 e VP2/VP3). As proteínas não-estruturais são produzidas pela tradução de mRNA que sofrem splicing alternativo. A NS1 é essencial para a replicação do genoma viral, e a NS2 está associada com a formação dos capsídeos, controle da expressão gênica e também participa da replicação do genoma. As proteínas produzidas a partir de outra ORF (VP1 e VP2) fazem parte da estrutura do capsídeo. As proteínas VP1 e VP2 são traduzidas a partir de um mesmo mRNA, após splicing, e compartilham maior parte de sua sequência de aminoácidos. A diferença entre a VP1 e VP2 resulta da utilização de diferentes códons de iniciação pelos ribossomos. A VP3 é composta por uma sequência de aminoácidos da região amino-terminal da VP2. Os mRNAs, produzidos pela transcrição do genoma, possuem 5´ cap e são poliadenilados na extremidade 3´ (FLORES, 2007).
O tamanho das proteínas contidas no seu capsídeo são: VP1 com 82kDa e VP2 com 65kDa. Todo o capsídeo contém um total de 60 cópias de VPs consistindo de
aproximadamente 10 cópias de VP1 e 50 cópias de VP2. A VP3, uma terceira proteína, é produzida pelo processo proteolítico por clivagem de 18-20 aminoácidos da porção N-terminal de VP2 e está presente somente em vírions intactos (PARADISO et al, 1984).
As proteínas contidas no capsídeo permitem ao vírus se ligar a célula hospedeira através do receptor transferrina. Curiosamente, a susceptibilidade do hospedeiro ao CPV depende das proteínas contidas no capsídeo, assim como a habilidade de se ligar a ao receptor no hospedeiro (COTMORE e TATTERSALL, 2007). A adaptação dessa proteína contida no capsídeo em relação a outros hospedeiros permite a propagação eficiente inter-espécies, como visto na propagação de novas cepas de CPV-2 do cão para o gato (HUEFFER e PARRISH, 2003).
O genoma viral apresenta de 6 à 10 sequências palindrômicas, que possibilitam a formação de estruturas em forma de grampo nas regiões terminais. Essas estruturas são essenciais para a replicação do genoma viral e para a encapsidação do genoma na progênie viral. O tropismo do CPV é determinado por três aminoácidos da VP2 (posições 93, 300 e 323) (FLORES, 2007).
Após o surgimento de CPV-2 duas variantes antigênicas foram identificadas nos anos 1980, o tipo 2a e 2b os quais formam substituindo a cepa original (CARMICHAEL, 1994) e se disseminando pelo mundo (BUONAVOGLIA et al., 2000 e PEREIRA et al., 2000). Esses novos tipos diferem do tipo original, o tipo 2, em função de algumas alterações nas proteínas do capsídeo por sua gama de hospedeiros, onde estão incluídas células caninas e felinas in vitro e em caninos e felinos. Posteriormente, o aparecimento de mutações adicionais nas proteínas do capsídeo têm sido detectadas em muitos países (IKEDA, et al., 2000). Na Itália, a mutação do CPV-2b tem sido identificada, a qual apresenta a substituição Asp426Glu ocorrendo em um epitopo estratégico do capsídeo que diferencia essa mutação do tipo clássico de CPV-2b (BUONAVOGLIA, et al., 2001). Essa nova cepa foi designada como CPV-2c, sendo detectada posteriormente no Vietnã (NAKAMURA, et al., 2004), nos Estados Unidos (HONG, et al., 2007), Portugal, Alemanha e Reino Unido (DECARO, et al. 2007b) e Uruguai (PEREZ et al., 2007).
2.1.2 Epidemiologia
A gravidade da parvovirose canina é atribuída à falta de imunização natural da população canina. Os filhotes com idade entre seis semanas e seis meses, quando não vacinados, são altamente susceptíveis ao desenvolvimento da doença. Os anticorpos maternos são protetores contra a infecção nas primeiras semanas de vida, no entanto, em um determinado momento, os níveis de anticorpos são insuficientes para proteger da doença e, em contrapartida, bloqueiam o desenvolvimento de uma resposta imune efetiva pelas vacinas. Esse período é conhecido como “janela de susceptibilidade” e pode explicar porque alguns animais, mesmo adequadamente vacinados, desenvolvem a infecção e a doença. (FLORES, 2007).
Os filhotes são mais propensos ao desenvolvimento da gastrenterite hemorrágica (GEH) pelo CPV, porém cães de qualquer idade, sexo, ou raça podem ser acometidos. Animais de algumas raças de porte médio e grande, como doberman, rottweiler, labrador, pastor alemão e pitbull, parecem apresentar a doença mais severa quando infectados. A incidência maior em animais sem raça definida provavelmente está ligada à vacinação inadequada, associada com o acesso livre à rua, o que aumenta o risco desses animais adquirirem a infecção. (FLORES, 2007).
O CPV é altamente contagioso, e a infecção geralmente ocorre por exposição oro-nasal e fezes, fômites ou ambientes contaminados (FLORES, 2007). Pollock e Carmichael (1982) demonstraram que cães com títulos de anticorpos contra CPV superiores a 80 UHI são imunes à infecção oronasal. Títulos de anticorpos abaixo de 80 UHI não conferem proteção contra a infecção por CPV, além de interferirem na imunização ativa do animal (PRATELLI et al., 2001).
O vírus pode permanecer por longos períodos (mais de seis meses) no ambiente e nos pêlos dos animais que tiveram contato com fezes contaminadas. As pessoas, equipamentos veterinários, insetos e roedores podem atuar como veículos para a propagação do vírus. (FLORES, 2007).
Estudos sorológicos realizados em vários paises indicam uma grande disseminação do agente, com índices variáveis de soropositividade em cães urbanos, geralmente entre 60 e 95%.(FLORES, 2007).
O CPV é muito resistente ao ambiente e a maioria dos desinfetantes, com exceção do hipoclorito de sódio, que é comercializado como água sanitária, em concentrações que variam de 2 à 3%. Sabe-se que o hipoclorito de sódio a 0,175% é efetivo para inativação do CPV, porém. para assegurar a eficácia da sua utilização, a solução deve permanecer em contato com o agente por tempo prolongado. (FLORES, 2007).
2.1.3 Patogenia e sinais clínicos
Após a exposição oronasal, o vírus replica nos tecidos linfóides próximos ao local de entrada (geralmente na orofaringe) e é disseminado através da corrente sanguínea para uma variedade de órgãos resultando em infecção sistêmica (MEUNIER, et al., 1985). Durante a disseminação virêmica, o vírus se localiza preferencialmente em tecidos com rápida divisão celular, como medula óssea, órgãos linfopoiéticos e criptas do jejuno e íleo (FIG 14.7). O período de incubação varia entre de 2 à 14 dias, mas, na maioria dos casos, é de 4 à 7 dias. A viremia é intensa do primeiro ao quinto dia da infecção e cessa por volta do quinto ou sexto dia, quando os anticorpos neutralizantes já podem estar presentes no soro. Os animais com a imunidade parcial apresentam infecção subclínica ou formas clínicas mais brandas. (FLORES, 2007).
Durante a infecção intestinal, o parvovírus replica nas células epiteliais das criptas da mucosa intestinal. Essas células estão em constante mitose e são responsáveis pela reposição do epitélio absortivo das vilosidades (FLORES, 2007). A taxa de replicação das células do intestino e do sistema linfático parece ser o fator determinante para a severidade da doença. Fatores estressantes, em particular fatores parasitários e não específicos (como desmame), podem predispor os cães à doença pelo aumento da atividade celular (OTTO, et al., 1997). As células das criptas se diferenciam em células de absorção à medida que migram para a superfície das vilosidades. A conseqüência imediata da infecção pelo CPV é o achatamento das vilosidades, o colapso e a necrose epitelial, com exposição da lâmina própria da mucosa (FIGURA 14.7 E.8). A diarréia, resultante de má absorção intestinal, costuma ser hemorrágica, pelo sangramento de capilares subjacentes ao revestimento epitelial da mucosa. (FLORES, 2007).
A perda do epitélio intestinal permite a penetração de bactérias na circulação sanguínea, que é facilitada pela leucopenia. A replicação do vírus nas células linfóides e
na medula óssea resulta em linfopenia e neutropenia. A imunossupressão decorrente permite o estabelecimento de infecções secundárias por outros vírus, bactérias, fungos e parasitas. Essas infecções podem contribuir para o agravamento dos sinais clínicos. (FLORES, 2007).
A excreção do vírus nas fezes inicia no terceiro ou quarto dia após a infecção e se intensifica com o surgimento da doença. O CPV é excretado em grandes quantidades por até 20 dias. O término da excreção viral fecal está provavelmente relacionado com o desenvolvimento de imunidade. (FLORES, 2007).
Duas síndromes clínicas são descritas em cães infectados com o CPV: a miocardite e a gastrenterite hemorrágica (GEH). A miocardite pode ocorrer em neonatos, após a infecção intra-uterina ou nas primeiras seis semanas de vida. Esses animais apresentam morte súbita ou sinais inespecíficos e, posteriormente, desenvolvem sinais de insuficiência cardíaca. Essa forma clínica da doença ocorreu com freqüência quando foram relatos os primeiros surtos de parvovirose no final dos anos 1970. Atualmente, essa manifestação é considerado muito rara, provavelmente pela alta prevalência de anticorpos contra o CPV na população canina. A imunidade passiva protege os filhotes na fase da ocorrência dessa forma clínica. A principal manifestação da parvovirose é a gastrenterite. (FLORES, 2007).
Kapil et al. (2007) observou, em casos com diagnóstico de infecção por CPV-2c muitos cães apresentam diarréia mucóide amarelada ou diarréia sanguinolenta.
A apresentação típica da GEH geralmente ocorre em cães jovens, não-vacinados, e é caracterizada pelo surgimento brusco de prostação, anorexia, vômitos freqüentes, sialorréia, febre, dor abdominal e diarréia hemorrágica. Os sinais de prostação, anorexia e vômitos precedem o quadro de diarréia, geralmente em 12 à 24 horas. Cães com diarréia podem apresentar desidratação, hipovolemia e choque. Os sinais clínicos iniciais de choque incluem taquicardia, pulso normal ou fraco, palidez das mucosas, tempo de preenchimento capilar aumentado, hipotensão, nível de consciência reduzido e temperatura corporal baixa. Os animais que não recebem tratamento suporte (fluidoterapia) nesse estágio evoluem para o estágio terminal do choque, apresentado bradicardia, mucosas pálidas e cianóticas, hipotensão grave, pulso muito fraco ou
ausente, hipotermia, anúria e estupor ou coma. Nessa situação, a parada cardíaca e respiratória é eminente e os animais que atingem esse estagio dificilmente sobrevivem.
O hemograma dos animais infectados demonstra leucopenia, neutropenia e linfopenia (FLORES, 2007). A leucopenia é atribuída á destruição das células progenitoras hematopoéticas de vários tipos primários de leucócitos na medula óssea, e também em outros órgãos linfoproliferativos como timo, linfonodos e baço, resultando em produção inadequada na demanda leucocitária (especialmente neutrófilos) no trato gastrintestinal (PRITTIE, 2004). Na fase de recuperação, pode ocorrer leucocitose. Anemia pode ocorrer pela perda sanguínea intestinal. Hipoproteinemia, pela perda de proteínas plasmáticas pelo intestino, pela elevação dos níveis de uréia e creatinina por azotemia pré-renal e redução dos níveis de potássio também podem estar presentes. (FLORES, 2007).
Na necropsia, observa-se a mucosa intestinal congesta, hemorrágica e frequentemente recoberta por uma pseudomembrana. As placas de Peyer encontram-se atrofidas. A medula óssea pode apresentar-se liquefeita e hiperêmica. A histopatologia intestinal revela necrose epitelial, colapso das vilosidades e aumento do infiltrado inflamatório na lamina própria. (FLORES, 2007). Além de linfonodos com atrofia cortical, com ausência ou diminuição de folículos linfóides; timo com perda considerável de linfócitos corticais e perda da arquitetura, atrofia de baço e medula óssea com contagem celular reduzida são achados frequentes em filhotes infectados por CPV (GODDARD, et al., 2008).
Em cães com até seis semanas de idade, o miocárdio é o sitio preferencial de infecção pelo parvovírus. Em animais mais velhos, as células que se encontram em divisão são principalmente, células linfóides e as células das criptas do intestino. A replicação do parvovírus nessas células pode produzir linfopenia ou enterite, respectivamente (FLORES, 2007).
2.1.4 Diagnóstico
O diagnóstico presuntivo na rotina clínica geralmente é feito pelo histórico, sinais clínicos e hemograma. Porém, o diagnóstico definitivo de parvovirose exige a identificação do vírus por testes específicos. Testes de ELISA, para detecção de antígenos virais nas fezes, estão disponíveis no mercado brasileiro. Outros testes, como a identificação do vírus por teste de hemaglutinação (HA) , sorologia pareada por teste de inibição da hemaglutinação (HI) e soroneutralização (SN), testes de ELISA, para a detecção de IgM, detecção dos virions por microscopia eletrônica (ME) podem ser utilizados para diagnóstico definitivo. Em casos clínicos, a grande concentração de partículas virais nas fezes (pode chegar até 109 partículas/grama) e a estabilidade viral favorecem a utilização da ME. Uma alternativa é a imunomicroscopia (IME) eletrônica, na qual os anticorpos são adicionados às suspensões fecais, para a formação de complexos que favorecem a visualização. (FLORES, 2007).
A sintomatologia semelhante apresentada por cães infectados por qualquer um dos subtipos de CPV-2, complica o diagnóstico da doença, aumentando a necessidade do uso de técnicas sorológicas e/ou moleculares a fim de avaliar corretamente a real incidência de determinadas cepas, como a CPV-2c na população canina (CALDERON, et
al., 2009).
Em função do curto período de incubação do vírus, testes sorológicos não são relevantes para o diagnóstico da parvovirose canina. Além disso, os anticorpos podem persistir por meses e a resposta sorológica a infecção não pode ser diferenciada dos anticorpos induzidos pela vacinação. Então, testes sorológicos não são práticos para o diagnóstico de enterite causada pelo parvovírus canino (SCHMITZ, et al. 2009).
Hemaglutinação (HA) é a capacidade que certos vírus têm de ligarem-se a hemácias e causarem sua aglutinação. Inibição da hemaglutinação (HI) é a capacidade que anticorpos específicos contra esses vírus têm de inibir a atividade hemaglutinante. HA tem sido utilizada como indicador da presença de vírus em material clínico e HI é um teste usado para medir a anticorpos específicos contra vírus hemaglutinantes (JANEWAY
Alguns dos testes comerciais para a detecção do CPV existentes contam com SNAP parvo antigen test, teste rápido de parvovirose AG, FASTest parvo strip e Witness parvo card.
O SNAP parvo antigen test e teste rápido de parvovirose AG são baseados no ELISA. FASTest parvo strip é um teste de imunocromatografia de fluxo lateral (sistema sanduíche com dois anticorpos diferentes, um deles é fixado à membrana e outro é fixado à partículas de ouro). O Witness parvo card é baseado na imunomigração (tecnologia de radioimunomigração), onde complexos antígeno-anticorpo são visualizados através da alteração de coloração da banda pré-sensibilizada sobre uma membrana de nitrocelulose (SCHMITZ et al., 2009).
Os testes comerciais que detectam o antígeno na amostra fecal possuem especificidade relativamente alta e baixa sensibilidade. A falha do SNAP parvo antigen test pode estar relacionada à diminuição da liberação de vírus nas fezes, já que o vírus é detectado nas fezes apenas 10 á 12 dias após a infecção (DESARIO et al., 2005).
O ensaio imunoenzimático (ELISA; enzyme-linked immunosorbent assay) é frequentemente usado no diagnóstico viral. Uma preparação pura de um antígeno ou anticorpo conhecido, ou ambos, é necessária para padronizar o ensaio. Para o ELISA, uma enzima é quimicamente ligada ao anticorpo. O componente não-marcado, que nesse caso é o antígeno, é ligado a um suporte sólido, tal como um poço de uma microplaca, que irá adsorver uma certa quantidade de qualquer proteína. O anticorpo marcado pode-se ligar ao antígeno não-marcado, sob condições em que a adsorção inespecífica é bloqueada; todos os anticorpos não-ligados e outras proteínas são retiradas por lavagens. A ligação do anticorpo é medida por uma reação que torna um substrato incolor em produto colorido (FIGURA). A mudança de cor pode ser lida diretamente na placa onde ocorreu, facilitando a coleta de dados. O ELISA evita o os perigos do uso da radiação, o que torna o método preferido da maioria dos ensaios de ligação direta (JANEWAY et al., 2007).
Em geral, quando um resultado positivo é obtido no teste rápido, o diagnóstico de enterite pelo vírus da parvovirose canina, comumente está correto. Entretanto, um resultado negativo no teste rápido não descarta a possibilidade de parvovirose como diagnóstico diferencial em cães com diarréia hemorrágica. Em tais casos, testes
adicionais deveriam ser considerados, preferencialmente exames das amostras fecais para pesquisa de CPV por IEM e PCR (SCHMITZ et al., 2009).
Outro teste comercial disponível é o Anigen Rapid CPV Ag Test kit que detecta CPV, CPV 2a e CPV 2b, utiliza anticorpos monoclonais contra o subtipo mais comum (CPV2), porém ele pode detectar os outros subtipos do CPV porque o epitopo antigênico, presente no ANIGEN Rapid CPV Ag Test kit, é comum entre eles.
Decaro et al. (2005a) verificou que CPV-2 foi detectado por HA em amostras fecais de filhotes com diarréia durante quatro dias, enquanto que no cultivo celular a média foi de seis dias. Em contraste, na real-time PCR o vírus foi detectado durante 46 dias em média. O maior título de anticorpos detectado por HI para CPV-2 foi 14 dias após o início dos sinais clínicos
O diagnóstico pode ser feito através de imunomicroscopia eletrônica ou pela reação em cadeia da polimerase (PCR) de amostras fecais. A sensibilidade da microscopia eletrônica é relativamente baixa devido a grande quantidade de vírus necessária para o resultado positivo do teste (ESFANDIARI e KLINGEBORN, 2000).
Anticorpos podem ser usados para detectar a localização intracelular de estruturas ou proteínas particulares em alta resolução por microscopia eletrônica, uma técnica conhecida por imunoeletromicroscopia. Anticorpos contra o antígeno de interesse são marcados com partículas de ouro e aplicados sobre secções ultrafinas para exame no microscópio eletrônico de transmissão. Anticorpos marcados com partículas de ouro de diferentes diâmetros permitem que duas ou mais proteínas sejam estudadas simultaneamente. A dificuldade com essa técnica está na coloração adequada da seção ultrafina, pois poucas moléculas do antígeno estão presentes em cada corte (JANEWAY, 2007).
A reação em cadeia da polimerase (PCR) é um método eficaz para amplificação de segmentos específicos de DNA, distinto da clonagem e propagação no interior de uma célula hospedeira. Esse procedimento é realizado inteiramente de forma bioquímica, ou seja, in vitro. A PCR utiliza a enzima DNA polimerase, responsável pela síntese de DNA a partir de substratos de desoxinucleotídeos sobre um molde de DNA de fita simples. A DNA-polimerase sintetiza DNA na direção 5´ para 3´ e pode adicionar nucleotídeos à extremidade 3´ de um oligonucleotídeo sintético. Assim, o anelamento de um
oligonucleotídeo sintético a um molde de fita simples que contenha uma região complementar ao oligonucleotídeo, na presença de DNA-polimerase, pode iniciar a reação, pela extensão da extremidade 3´ do iniciador na direção 5´ par 3´, gerando uma região estendida de DNA de fita dupla (WATSON et al., 2006).
A reação em cadeia da polimerase tem alta sensibilidade e especificidade para a detecção do vírus da parvovirose canina (SCHMITZ, et al. 2009). Porém uma amostra fecal com resultado positivo para CPV na PCR não é suficiente para o diagnóstico de parvovirose canina. Como alternativa, o diagnóstico deveria ser baseado na combinação de histórico, achados clínicos e laboratoriais (especialmente leucopenia) além de amostra fecal positiva para CPV (SCHMITZ, et al. 2009).
Segundo Schmitz et al. (2009) comparando os três testes comerciais (SNAP parvo antigen test, FASTest parvo strip e Witness parvo card.) versus PCR e IEM a especificidade foi alta, porém a sensibilidade foi baixa.
Em um estudo realizado por Schmitz et al. (2009), existe uma pequena percentagem de cães saudáveis e cães com diarréia crônica que mostraram resultado positivo na PCR, isso pode ser devido á infecção assintomática ou persistente, ou passagem intestinal do vírus.
Análise de PCR Real Time tem sido estabelecida para rápida identificação dos tipos 2a, 2b e 2c utilizando sonda TaqMan com conjugado MGB (minor groove binder) (DECARO et al, 2006).
A detecção e caracterização do CPV-2 pode ser obtida utilizando a técnica de Real-Time PCR com sonda Taq-Man MGB. O ensaio utilizando a sonda MGB representa uma ferramenta efetiva para rápida diferenciação de CPV-2 vacinal e a cepa do vírus de campo, uma vez que é capaz de detectar a cepa vacinal ou a cepa de campo, que ocorre simultaneamente nas fezes de animais vacinados, mesmo considerando a existência de baixos títulos da cepa vacinal (DECARO et al., 2006).
Em geral, quando um resultado positivo é obtido nos testes rápidos para parvovirose canina é provável que esteja correto. Entretanto, um teste com resultado negativo, não pode ser considerado um diagnóstico diferencial para diarréia hemorrágica. Nesses casos, testes adicionais deveriam ser considerados, preferencialmente através de IEM ou PCR (SCHMITZ, et al. 2009).
Anticorpos contra um peptídeo sintético dentro da região codificadora de VP2 são um meio de diagnóstico conveniente para a infecção pelo vírus da parvovirose canina (VIHINEN-RANTA et al., 1996)
O isolamento do vírus a partir de fezes ou de tecidos pode ser realizada em células de origem canina, como as MDCK e A-72, e/ou células CRFK de origem felina. (FLORES, 2007).
Conforme Decaro et al. (2007a), muitos veterinários e proprietários de cães acreditam que muitas enterites sejam subsequentes a administração de uma vacina contra CPV, que resultaria da reversão da virulência do vírus da vacina viva modificada (MLV).
Anteriormente, existiam poucas possibilidades para abordar esse assunto, uma vez que cães vacinados podem liberar o vírus da vacina viva modificada nas fezes isoladamente ou com o vírus responsável pela doença. Em ambos os casos, testes convencionais não forneciam resultados definitivos. De fato, o isolamento do vírus presente nas fezes, em cultivo celular apresenta baixa sensibilidade, especialmente em infecções mistas; além disso, tal técnica permite apenas o isolamento do vírus vacinal ou do vírus responsável pela doença. A não ser que o sequenciamento de muitos clones seja efetuado, PCR pode ser selectivamente, ou mais eficiente, para amplificar cada um dos vírus, de modo que outros agentes permaneçam indetectáveis. Além disso, o uso de testes convencionias, como hemaglutinação, imunocromatografia, isolamento viral, ou PCR, podem resultar em um diagnóstico errado para diarréia em cães como em a presença de CPV nas fezes, devido a presença de MLV. Por outro lado, o ensaio com a sonda MGB representa um ferramenta efetiva...
Reversão da virulência do CPV MLV tem sido frequentemente referida, mas nunca demonstrada, como a atenuação da virulência revelou ser altamente estável.
Quando a cepa vacinal foi detectada em amostras fecais de cães com diarréia, detectou-se também a cepa responsável pela infecção, ou com outros patógenos geralmente associados á enterite em cães. Mesmo nos casos de diarréia com baixas quantidades de cepas vacinais nas fezes, sugere-se que seja diarréia relacionada a outros patógenos não detectados pelos testes realizados. Causas não-infecciosas, como alteração súbita de dieta, também podem ocasionar diarréia em filhotes.
Outro achado notável foi a detecção do vírus da cinomose (CDV) nas fezes de cães infectados simultaneamente por CPV-2a e MRV.
A reversão da virulência do CPV MLV não foi detectada, Decaro et al. (2007a) demonstrou que a maioria dos casos de gastroenterite subsequente a vacinação está relacionada com a infecção por parvovírus de campo em um curto período anterior ou posterior a administração da vacina.
2.1.5 Controle e Profilaxia
O tratamento da gastrenterite pelo CPV é de suporte baseiando-se na reposição de fluidos e eletrólitos, na antibioticoterapia de amplo espectro e no controle de vômitos, para minimizar as perdas líquidas e eletrolíticas. Terapias específicas com antivirais têm sido estudadas, sendo que o interferon-omega felino apresentou bons resultados em cães com parvovirose. É possível que essas substânciãs possam fazer parte do tratamento de rotina no futuro. (FLORES, 2007).
Cães com parvovirose devem ser isolados e receber tratamento em um local específico. A limpeza e desinfecção do ambiente com equipamentos devem ser feitas com hipoclorito de sódio a 0,175%.(FLORES, 2007).
A maneira mais efetiva de prevenção da parvovirose é a vacinação sistemática de filhotes, que devem receber a primeira dose da vacina com seis a oito semanas de idade, recebendo duas doses de reforço a cada quatro semanas. Uma quarta dose pode ser efetuada aos seis meses de vida. A revacinação anual é recomendada. Esse esquema é recomendado para estimular a imunidade ativa á medida que a imunidade passiva declina, o que geralmente ocorre entre seis e 20 semanas de vida. Por um período de duas a quatro semanas, os títulos de anticorpos atingem níveis não-protetores, que interferem com a eficácia das vacinas. Ou seja, há um período em que os anticorpos passivos inativam o vírus vacinal, porém não são sufucientes para proteger os animais contra a infecção natural. Recomenda-se manter os animais isolados até completarem a fase de imunização, sempre observando a desinfecção local. (FLORES, 2007).
Vacinas com cepas pouco atenuadas podem diminuir a janela de susceptibilidade, pois o vírus replica e estimula uma imunização ativa nos filhotes, mesmo com a presença de imunidade passiva. Nesses casos, alguns animais podem apresentar uma forma branda da enfermidade (FLORES, 2007).
Segundo Lamm e Rezabek (2008), a cepa CPV-2c apresenta alta virulência, frequentemente devastando populações caninas, com alta morbidade. Além disso, discute-se a verdadeira eficácia das vacinas atuais contra CPV-2c.
O ensaio imunoenzimático (ELISA; enzyme-linked immunosorbent assay) é frequentemente usado no diagnóstico viral. Uma preparação pura de um antígeno ou anticorpo conhecido, ou ambos, é necessária para padronizar o ensaio. Para o ELISA, uma enzima é quimicamente ligada ao anticorpo. O componente não-marcado, que nesse caso é o antígeno, é ligado a um suporte sólido, tal como um poço de uma microplaca, que irá adsorver uma certa quantidade de qualquer proteína. O anticorpo marcado pode-se ligar ao antígeno não-marcado, sob condições em que a adsorção inespecífica é bloqueada; todos os anticorpos não-ligados e outras proteínas são retiradas por lavagens. A ligação do anticorpo é medida por uma reação que torna um substrato incolor em produto colorido (FIGURA). A mudança de cor pode ser lida diretamente na placa onde ocorreu, facilitando a coleta de dados. O ELISA evita o os perigos do uso da radiação, o que torna o método preferido da maioria dos ensaios de ligação direta (JANEWAY et al., 2007).
Existe a necessidade de investigação do papel epidemiológico de filhotes recuperados da infecção por CPV-2, tais como filhotes susceptíveis em contato com filhotes que foram negativos para CPV no HA e no isolamento viral por cultivo celular, mas positivos na real-time PCR (DECARO, et al., 2005a).
CONSIDERAÇÕES FINAIS
A principal causa de diarréia de origem infecciosa em cães continua sendo o CPV, que surgiu no final dos anos 1970. As alterações do CPV-2 foram adaptações genéticas, capacitando o vírus a replicar-se e disseminar-se de modo mais eficiente.
Após a introdução das vacinas para a prevenção da doença obteve-se diminuição dos casos clínicos da doença, porém ao passar dos anos acredita-se que a imunização inadequada principalmente no primeiro ano de vida acarretou a ocorrência de mutações no gene do vírus. A mutação mais recente, denominada CPV-2c é responsável por sinais clínicos mais severos e inclusive detectada em animais vacinados, conforme verificado em relatos científicos, citados no presente trabalho.
Muitos profissionais da área relacionam a vacinação com a ocorrência da doença, porém em estudo realizado detectou-se além da cepa vacinal, a presença de CPV-2 de campo ou outros patógenos associados á enterite, dessa maneira conclui-se que a reversão da virulência vacinal muitas vezes proposta, não foi comprovada em nenhum dos estudos realizados.
Falhas vacinais ocorrem em animais infectados por CPV2b, sugerindo que a vacina oferece somente proteção parcial, no caso de vacinas com a cepa CPV2. Métodos de vacinação inapropriados podem resultar em resultados falso-positivos. Vacinas vivas modificadas também podem ocasionar resultados falso positivos, mesmo quando administradas de forma correta.
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