UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
CAROLINA MORETTO CARNIELLI
ESTUDO DA COMPOSIÇÃO DE PROTEÍNAS NA ÁREA DE
INVASÃO DE CARCINOMA EPIDERMÓIDE DE BOCA POR
PROTEÔMICA BASEADA EM ESPECTROMETRIA DE
MASSAS
CAMPINAS 2018
CAROLINA MORETTO CARNIELLI
ESTUDO DA COMPOSIÇÃO DE PROTEÍNAS NA ÁREA DE INVASÃO
DE CARCINOMA EPIDERMÓIDE DE BOCA POR PROTEÔMICA
BASEADA EM ESPECTROMETRIA DE MASSAS
Tese apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do Título de Doutora em Ciências, na área de Fármacos, Medicamentos e Insumos para Saúde.
Orientadora: ADRIANA FRANCO PAES LEME
CAMPINAS 2018 ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA CAROLINA MORETTO CARNIELLI E ORIENTADA PELA PROFA. DRA. ADRIANA FRANCO PAES LEME.
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas Biblioteca do Instituto de Biologia Mara Janaina de Oliveira - CRB 8/6972
Carnielli, Carolina Moretto,
C217e CarEstudo da composição de proteínas na área de invasão de carcinoma epidermóide de boca por proteômica baseada em espectrometria de massas / Carolina Moretto Carnielli. – Campinas, SP : [s.n.], 2018.
CarOrientador: Adriana Franco Paes Leme.
CarTese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia.
Car1. Carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço. 2. Proteômica. 3. Espectrometria de massas. 4. Microdissecção e captura a laser. I. Leme, Adriana Franco Paes. II. Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Biologia. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Study of protein composition in the invasion area of squamous cell carcinoma by proteomics based on mass spectrometry
Palavras-chave em inglês:
Carcinoma, Squamous cell of head and neck Proteomics
Mass spectrometry
Laser capture microdissection
Área de concentração: Fármacos, Medicamentos e Insumos para Saúde Titulação: Doutora em Ciências
Banca examinadora:
Adriana Franco Paes Leme [Orientador] Alexandre Keiji Tashima
Diana Noronha Nunes Daniel Guariz Pinheiro Mariane Tami Amano
Data de defesa: 08-01-2018
Programa de Pós-Graduação: Biociências e Tecnologia de Produtos Bioativos
Campinas, 08 de janeiro de 2018.
COMISSÃO EXAMINADORA
Profa. Dra. Adriana Franco Paes Leme
Prof. Dr. Alexandre Keiji Tashima
Profa. Dra. Diana Noronha Nunes
Prof. Dr. Daniel Guariz Pinheiro
Profa. Dra. Mariane Tami Amano
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
AGRADECIMENTOS
A Deus, por estar sempre presente em minha vida, me dando forças e direção para vencer os mais diversos obstáculos e seguir adiante.
À minha mãe Sonia e à minha irmã Helena, pelo amor e companheirismo que sempre me acompanharam.
A todos os meus familiares, pelo seu carinho e apoio em cada momento.
À Profa. Dra. Adriana Franco Paes Leme, pela confiança em me receber em seu laboratório, pela disposição, orientação e amizade. Obrigada pelo apoio em toda essa jornada e em continuar adiante.
Ao Prof. Dr. Ricardo Della Colleta, pela disponibilidade em me auxiliar em diversas fases desse trabalho.
Ao Prof. Dr. Vitor Faça e Guilherme Lanfredi pelo auxílio nos experimentos iniciais de proteômica baseada em alvos.
Às agências CAPES e FAPESP (Projeto 2013/16483-0), pelo financiamento que permitiram o desenvolvimento desse trabalho.
Ao grupo MAS, por todo apoio e amizade durante esses quatro anos: Sami, Daniela, Romênia, Bianca, Flávia, César, Rute, Ana Karina, Tatiane e Ariane. Aos demais que já fizeram parte dessa jornada, seja no início ou no final dela, agradeço à Rebeca, Flávia Winck, Raquel e Jamile. Agradeço à Carolina Carneiro, por todo auxílio no desenvolvimento desse trabalho.
A todos do CNPEM e especialmente ao LNBio, por toda a equipe que possibilitou o desenvolvimento desse trabalho.
Ao meu amigo e companheiro, Fábio Patroni, por todo o seu amor, carinho e apoio nas mais diversas situações, fazendo a minha vida mais colorida.
RESUMO
Câncer de cabeça e pescoço é um grupo de câncer que envolve a cavidade oral, faringe e laringe. A maioria dos casos é de carcinoma oral de células escamosas ou epidermóide (CEC), o qual apresenta alta morbidade. Em câncer, mudanças no estroma dirigem a invasão e metástase, cujos processos são característicos da malignidade. Evidências recentes sugerem que a área do fronte invasivo dos carcinomas, ou seja, na interface do tumor-hospedeiro, apresenta perfil molecular e características morfológicas diferentes em comparação a outras áreas do mesmo, sendo considerada como uma região de interesse para a identificação de potenciais assinaturas de prognóstico. Dessa forma, o objetivo desse estudo foi identificar as proteínas presentes no estroma do fronte invasivo do tumor em comparação ao estroma do interior do tumor. Para isso, a microdissecção a laser (LMD) foi associada à espectrometria de massas (MS), técnicas consideradas de alta robustez quando combinadas para a identificação e quantificação de proteínas em tecidos tumorais de regiões específicas. Vinte amostras teciduais fixadas em formalina e parafina de CEC de língua foram utilizadas para isolar o estroma da região do fronte invasivo e o estroma do interior de tumores por LMD, seguida de extração e digestão das proteínas e análise por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas in tandem por proteômica baseada em descoberta (LC-MS/MS). A partir das análises, incluindo análises estatísticas e a correlação com os dados clínico-patológicos dos pacientes, cinco proteínas foram encontradas estatisticamente significantes em relação as suas abundâncias entre as regiões do fronte invasivo e do interior do estroma tumoral. As abundâncias de COL6A1 (Collagen alpha-1(VI) chain), FSCN1 (Fascin-1), ITGAV (Integrin alpha-V), MB (Myoglobin) e THBS2 (Thrombospondin-2) foram associadas ao estadiamento clínico do paciente, à presença de metástase linfonodal, à recorrência de metástase linfonodal e ao grau de diferenciação histomorfológica do tumor (p-valor<0,05, R<-0,7 ou 0,7<R e R2>0,5). Dentre essas proteínas, a localização de COL6A1 e MB foram confirmadas por imunohistoquímica em um novo conjunto de amostras de CEC oral (n=96 casos) e as proteínas COL6A1 e ITGAV foram associadas as características infiltração capsular do linfonodo, margens livres e recorrência regional. Uma vez que a ocorrência de metástase linfonodal é o principal fator associado ao pior prognóstico de CEC oral, a presença dessas proteínas foi avaliada em amostras de saliva de pacientes com CEC oral com metástase linfonodal (n=10) e em pacientes sem metástase linfonodal (n=23). Por meio da análise proteômica baseada em alvos pelo método de monitoramento seletivo de reações (SRM) foi demonstrado que COL6A1 e ITGAV (Integrin alpha-V) estão menos abundantes em amostras de saliva de pacientes com metástase linfonodal. Curvas ROC revelaram um bom desempenho dessas proteínas em classificar pacientes com ausência e presença de metástase, apresentando uma área sob a curva (AUC) de 0.8 para COL6A1
(sensibilidade=0,739; especificidade=0,9) e AUC de 0.75 para ITGAV (sensibilidade=0,696; especificidade=0,8). Portanto, este trabalho demonstra pela primeira vez por meio da combinação das técnicas de LMD e MS proteínas com distribuição espacial distinta entre as regiões de fronte invasivo e interior tumoral, presentes no estroma e também em saliva de pacientes com CEC oral, sendo capazes de distinguir entre pacientes com e sem metástase linfonodal, apresentando assim potencial valor prognóstico. Os presentes resultados indicam proteínas candidatas que podem ser associadas ao prognóstico para CEC de boca que podem guiar estratégias terapêuticas na prática clínica.
ABSTRACT
Head and neck cancers are a group of cancers that involve the oral cavity, pharynx and larynx. The majority of head and neck cancers are squamous-cell carcinoma (SCC), which has high morbidity. In cancer, changes in the stroma drive invasion and metastasis, the hallmarks of malignancy. Recent evidence suggests that the invasive tumor front area of carcinomas, ie, the tumor-host interface, have different molecular profile and distinct morphological features compared to other areas of the tumor and may be considered as a region of interest to identify prognostic markers. Thus, the aim of this study is to identify the proteins present in the stroma of the invasive tumor front compared to the stroma of the inner tumor. The combination of laser microdissection (LMD) and mass spectrometry (MS) has been considered as an approach with high robustness to protein identification of specific regions of tumor tissues. Twenty samples of CEC of tongue tissues fixed in paraffin and in formalin were used to isolate the stroma from the invasive tumor front and from the inner tumor by LMD, followed by protein extraction, protein digestion and liquid-chromatography coupled to mass spectrometry in tandem by discovery-based proteomics (LC-MS/MS). Statistical analysis and correlation analysis with clinicopathological data revealed five spatially distinct proteins between the stroma regions. The abundance of COL6A1 (Collagen alpha-1(VI) chain), FSCN1 (Fascin-1), ITGAV (Integrin alpha-V), MB (Myoglobin) and THBS2 (Thrombospondin-2) were associated to clinical stage, lymph node metastasis and lymph node recurrence (p-valor<0.05, R<-0.7 or 0.7<R and R2>0.5). The location of COL6A1 and MB were confirmed by immunohistochemistry in a new set of 96 patient samples of oral SCC (OSCC) and association to lymph node capsular infiltration, margin status and local recurrence. Once lymph node metastasis is the main poor prognostic factor in OSCC, the selected proteins were evaluated in saliva samples of patients with metastasis (n=10) and without metastasis (n=23). Targeted proteomics analysis based on SRM method (Selected Reaction Monitoring) demonstrated that COL6A1 and ITGAV were found with lower abundance in patients with lymph metastasis and able to distinguish between the two groups of samples by ROC analysis with an area under curve (AUC) of 0.8 for COL6A1 (sensitivity: 0.739; specificity: 0.9) and AUC of 0.75 for ITGAV (sensitivity: 0.696; specificity: 0.8). Taken together, by the association of LMD and MS (DDA and SRM) approaches, this project demonstrate for the first time proteins spatially organized in the stroma of different regions of the tumor, the invasive tumor front and the inner tumor, that are also present in saliva samples of OSCC patients and able to distinguish between those with metastasis and without metastasis, thus, with potential prognostic value. These results indicate new candidate prognosis markers for OSCC that may guide therapeutic strategies in clinical routine.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1. Representação esquemática dos componentes básicos de uma neoplasia
de células escamosas.. ... 18
Figura 2: Imagens de cortes histológicos mostrando tecidos em diferentes condições, do normal ao carcinoma. ... 19
Figura 3. Lesões de carcinoma oral de células escamosas (CEC). ... 20
Figura 4. Composição estrutural e proteica da matriz extracelular (ECM)... 31
Figura 5. Componentes básicos de um espectrômetro de massas. ... 43
Figura 6. Representação esquemática da fragmentação de peptídeos. ... 45
Figura 7. Comparação do fluxograma de proteômica baseada em descoberta versus proteômica baseada em alvos. ... 49
Figura 8. Fotomicrografia de um corte histológico de CEC oral de língua. ... 56
Figura 9. Sequência de LMD em um corte de CEC de língua. ... 73
Figura 10. Representação das proteínas identificadas nas regiões estroma do fronte invasivo tumoral (ITF) e estroma do interior tumoral. ... 75
Figura 11. Associação entre as proteínas com expressão diferencial significativa entre fronte invasivo tumoral (ITF) e interior tumoral à sobrevida livre de doença em meses. ... 81
Figura 12. Perfil da abundância das proteínas selecionadas como alvos para experimentos de verificação. ... 82
Figura 13. Marcação imunohistoquímica para as proteínas alvos em cortes de CEC oral ... 84
Figura 14. Análise de sobrevida Kaplan-Meier para valores de score de IHC e dados de fechamento clínico. ... 88
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Definições de TNM para câncer oral de acordo com o World Health Organization (WHO) Classification of Tumours. ... 22 Tabela 2. Estadiamento e classificação TNM para câncer oral de acordo com o World Health Organization (WHO) Classification of Tumours. ... 23 Tabela 3. Dados clínico-patológicos dos pacientes com CEC de língua utilizados no estudo de proteômica baseada em descoberta. ... 55 Tabela 4. Dados clínico-patológicos dos pacientes com CEC de língua utilizados no estudo de proteômica baseada em descoberta quanto ao grau de diferenciação histológica e estágio clínico de CEC. ... 56 Tabela 5. Dados clínico-patológicos dos pacientes com CEC oral utilizados para as análises por imunohistoquímica. ... 58 Tabela 6. Método de score baseado na intensidade e porcentagem de marcação das proteínas para avaliação da marcação imunohistoquímica nas áreas fronte invasivo e interior tumoral de CEC oral. ... 64 Tabela 7. Dados clínico-patológicos de pacientes com CEC oral utilizados para análise por proteômica baseada em alvos. ... 66 Tabela 8. Transições utilizadas para monitorar as proteínas de interesse por proteômica baseada em alvos. ... 68 Tabela 9. Proteínas com diferentes abundâncias entre as regiões do estroma do fronte tumoral invasivo (ITF) e estroma do interior do tumor que apresentam correlação com dados clínico-patológicos por análise de regressão linear. ... 77 Tabela 10. Associação dos dados demográficos e clínico-patológicos com a expressão de três proteínas alvos presentes no estroma de amostra de CEC oral. . 85 Tabela 11. Taxa de sobrevida de pacientes com CEC oral de acordo com a expressão de proteínas. ... 89
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AUC: Área sob a curva (area under curve) BD: Tumor de brotamento (tumor buddings)
CAF: Fibroblastos associados ao carcinoma (carcinoma-associated fribroblasts) CEC: Carcinoma de células escamosas ou epidermóide
CID: Dissociação induzida por colisão (collision induced dissociation) DDA: Aquisição dependente de dados (data-dependent acquisition) ECD: Dissociação por captura de elétrons (electron capture dissociation) ECM: Matriz extracelular (extra cellular matrix)
emPAI: Índice modificado de abundância de proteínas de forma exponencial
(exponentially modifed protein abundance index)
EMT: Transição epitélio-mesenquimal (epitelial mesenchymal transition) ESI: Ionização por eletrospray (electrospray ionization)
ETD: Dissociação por transferência de elétrons (electron-transfer dissociation) FFPE: formalin-fixed paraffin-embedded
FT-MS: Fourier transform ion cyclotron mass spectrometer
FWHM: Largura total do pico na metade de sua altura máxima (full width of the peak
at half its maximum height)
GAG: Glicosaminoglicanos
HCD: Dissociação induzida por alta energia de colisão (high-energy collisional
dissociation)
HPV: Papilomavírus humano
HRM: Modelo de risco histológico (histological risk model) IHC: Imunohistoquímica (immunohistochemistry)
ITF: Fronte invasivo tumoral (invasive tumor front)
iTRAQ: Etiquetas isobáricas para quantificação relativa e absoluta (isobaric tag for
relative and absolute quantitation)
LC-MS/MS: Cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas in tandem
(liquid-chromatography tandem-mass spectrometry)
LFQ: Quantificação label-free (label-free quantification)
LHR: Resposta linfocítica do hospedeiro (lymphocytic host response) LMD: Microdissecção a laser (laser microdissection)
MALDI: Ionização a laser auxiliada por matriz (matrix-assisted laser
desorption/ionization)
MG: Classificação das margens (margin grading) MRM: Multiple reaction monitoring
NSAF: Fator de abundância espectral normalizado (normalized spectral abundance
factor)
dNSAF: Fator distribuído de abundância espectral normalizado (distributed
normalized spectral abundance fator)
PAI: Índice de abundância de proteínas (protein abundance índices) PG: Proteoglicanos
PNI: Invasão perineural (perineural invasion)
PRM: Monitoramento de reações paralelas (parallel reaction monitoring) ROC: Curvas de características de operação do receptor (receiver operating
characteristic)
SIL: Marcação isotópica estável (stable isotope-labelled) SILAC: Stable isotope-based labeling with amino acids
SRM: Monitoramento seletivo de reações (selected reaction monitoring) TME: Microambiente tumoral (tumor microenvironment)
TNM: Tumor-node-metastasis TOF: tempo de voo (time-of-flight) WHO: World Health Organization
WPOI: Pior padrão de invasão (worst pattern of invasion)
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 15
1.1 Epidemiologia do câncer oral ... 15
1.2 Patogênese do câncer oral ... 17
1.3 Tratamento, prognóstico e sobrevida ... 20
1.4 Sistemas de classificação histológica em CEC oral ... 24
1.5 Região de fronte invasivo tumoral ... 27
1.6 Ambiente tecidual em câncer – estroma ... 29
1.7 Alvos terapêuticos e marcadores de prognóstico em CEC oral ... 33
1.8 A complexidade do CEC oral e a importância da proteômica clínica ... 35
1.9 Proteômica baseada em descoberta e proteômica baseada em alvos ... 39
1.10 Associação da microdissecção a laser à proteômica baseada em espectrometria de massas ... 50
2 OBJETIVOS ... 52
2.1 Objetivo geral ... 52
2.2 Objetivos específicos ... 52
3 MATERIAL E MÉTODOS ... 53
3.1 Aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa ... 53
3.2 Seleção das amostras teciduais ... 53
3.3 Processamento das amostras teciduais e microdissecção a laser (LMD) ... 59
3.4 Extração de proteínas e digestão enzimática para proteômica baseada em descoberta ... 60
3.5 Análise por espectrometria de massas em tandem (LC-MS/MS) com aquisição dependente de dados (DDA) ... 60
3.6 Análise dos dados brutos de proteômica baseada em descoberta ... 61
3.7 Correlação da abundância de proteínas identificadas por proteômica baseada em descoberta com dados clínico-patológicos dos pacientes ... 63
3.8 Análise imunohistoquímica dos tecidos de CEC oral ... 63
3.9 Coleta de amostras de saliva ... 64
3.10 Seleção dos peptídeos proteotípicos e das transições ... 66
3.11 Preparação das amostras de saliva para proteômica baseada em alvos ... 70
3.12 Verificação dos peptídeos por proteômica baseada em alvos ... 70
3.13 Análise quantitativa e estatística dos dados de proteômica baseada em alvos (SRM) ... 71
3.14 Predição do valor prognóstico de proteínas para CEC oral ... 72
4 RESULTADOS ... 73
4.1 Proteínas identificadas a partir da associação da microdissecção a laser e espectrometria de massas por proteômica baseada em descoberta ... 73
4.2 Dados clínico-patológicos correlacionados com a abundância de proteínas identificadas por proteômica baseada em descoberta no estroma de CEC oral .... 76
4.3 Verificação da abundância das proteínas selecionadas por imunohistoquímica e correlação com dados clínico-patológicos ... 83
4.4 Avaliação das proteínas alvos em saliva de pacientes com CEC oral por proteômica baseada em alvos ... 89
5 DISCUSSÃO ... 93 6 CONCLUSÃO ... 99 APÊNDICE 1 ... 110 APÊNDICE 2 ... 113 ANEXO 1 ... 114 Anexo 2 ... 117 Anexo 3 ... 118
1 INTRODUÇÃO
1.1 Epidemiologia do câncer oral
O termo câncer oral engloba um conjunto de neoplasias de cabeça e pescoço que acometem a cavidade oral em suas mais variadas etiologias e aspectos histopatológicos. O carcinoma oral de células escamosas ou epidermóide (CEC) é considerado o tipo mais comum de câncer da cavidade oral, apresentando alta prevalência, com uma estimativa de 300 mil novos casos no mundo por ano, além de alta recorrência e mortalidade, com 145 mil mortes por ano e sobrevida de aproximadamente 5 anos (Ferlay et al. 2015; Chi et al. 2015).
A distribuição geográfica de câncer oral é variável nas diferentes regiões do mundo devido a diferentes hábitos, cultura, expectativa de vida e educação preventiva da população (Petti 2009; Túri et al. 2013; Jadhav & Gupta 2013). Em muitos países o câncer oral tem sido considerado um crescente problema de saúde pública, uma vez que seu diagnóstico é realizado em estágios avançados da doença, o que acarreta em um baixo prognóstico (Scully & Felix 2005). Segundo dados do GLOBOCAN 2012, a incidência de câncer de lábios e da cavidade oral representa cerca de 2% de todos os novos casos de câncer diagnosticados mundialmente (Ferlay et al. 2015). No Brasil, estima-se que no ano de 2016, surgiram 11.140 novos casos de câncer da cavidade oral em homens e 4.350 em mulheres. Tais valores correspondem a um risco estimado de 11,27 casos novos a cada 100 mil homens e 4,21 a cada 100 mil mulheres (Instituto Nacional de Cancer José Alencar Gomes da Silva 2016). Essas taxas de incidência de câncer da cavidade oral também apresentam variações entre as regiões do Brasil, sendo mais frequente nas regiões sul e sudeste entre homens, e na região sudeste e nordeste entre mulheres do país (Instituto Nacional de Cancer José Alencar Gomes da Silva 2016).
Entre as localizações de mais alto risco para o desenvolvimento do CEC oral estão o lábio inferior, as margens póstero-laterais, a base da língua e o assoalho bucal, podendo ocorrer também na gengiva e nas glândulas parótidas e salivares (Bagan et al. 2010; Rivera 2015). O CEC oral possui uma etiologia multifatorial, com a participação de fatores tanto extrínsecos quanto intrínsecos, podendo também
ocorrer a participação de mais de um fator (cocarcinogênese) no desenvolvimento da doença (Petti 2009; Scully & Felix 2005). Entre os fatores de risco extrínsecos encontram-se o uso de tabaco, o consumo de álcool, exposição à radiação ultravioleta, além da infecção pelo papilomavírus humano (HPV) principalmente dos subtipos 16 e 18, enquanto os fatores intrínsecos que podem estar envolvidos no desenvolvimento da doença compreendem alterações genéticas, deficiências nutricionais e imunossupressão (Winn et al. 2015; Instituto Nacional de Cancer José Alencar Gomes da Silva 2016).
Muitos casos apontam um aumento no número de pessoas que desenvolvem câncer devido à exposição a agentes etiológicos. O consumo de tabaco e o álcool tem sido relatado na literatura como os principais fatores de riscos para o desenvolvimento de CEC oral. Um consórcio realizado pelo International Head and
Neck Cancer Epidemiology (INHANCE) com 35 estudos abrangendo 25.500 casos de
câncer de cabeça e pescoço e 37.100 controles apontou o papel significante do uso de tabaco e álcool na etiologia do câncer oral (Winn et al. 2015). O consumo de tabaco por fumo demonstrou um aumento no risco de desenvolvimento de câncer da cavidade oral, bem como etilistas com alto consumo de álcool. Juntos, o consumo de tabaco por fumo e de álcool estavam presentes em 64% dos casos de câncer da cavidade oral, demonstrando o elevado risco de desenvolvimento da doença apresentado por esse comportamento. Além disso, uma diminuição no risco de desenvolvimento de câncer oral foi observada em pessoas que deixaram de usar tabaco por fumo, e após 20 anos sem consumo, o risco chega a ser comparável ao de não fumantes.
O perfil epidemiológico clássico dos pacientes com câncer da cavidade oral compreende homens da quinta a oitava décadas de vida, tabagistas e etilistas crônicos. Entretanto, tem sido observado uma mudança nesse perfil devido ao aparecimento de novos casos em pacientes jovens e pacientes do sexo feminino possivelmente associados a fatores como predisposição genética e HPV, além da mudança do hábito tabagista entre as mulheres (Túri et al. 2013; Van Monsjou et al. 2013; Fakhry & D’Souza 2013). O HPV está etiologicamente envolvido com o câncer cervical, entretanto, estudos têm investigado a prevalência de HPV em pacientes de câncer de cabeça e pescoço (Van Monsjou et al. 2013; Antonsson et al. 2015; Ndiaye et al. 2014), demonstrando uma associação entre a infecção por HPV e a ocorrência
de CEC da cavidade oral e de orofaringe durante a carcinogênese (Hansson et al. 2005). Embora a prevalência de infecções por HPV esteja associada ao comportamento sexual, alguns estudos discutem se o consumo de álcool e de tabaco apresentam alguma associação ao câncer oral causado por HPV, tendo ainda controversas entre resultados provenientes de diferentes populações (McCullough et al. 2010; Túri et al. 2013). Propriedades oncogênicas tem sido atribuídas às proteínas E6 e E7 do HPV, as quais conferem o fenótipo de maior risco da doença e atuam na degradação do supressor tumoral p53 e Rb (proteína retinoblastoma), respectivamente, acarretando também na desregulação do controle do ciclo celular (Van Monsjou et al. 2013).
Outros fatores também podem estar associados com a ocorrência de câncer oral. A exposição crônica à radiação ultravioleta pode aumentar o risco do desenvolvimento de câncer nos lábios (Gallagher & Lee 2006; Gallagher et al. 2010) e outros fatores como desnutrição, baixo nível econômico e higiene também apresentam associação ao desenvolvimento de câncer oral (Winn et al. 2015). Assim, a prevenção depende parcialmente em evitar os fatores de risco, enquanto o diagnóstico precoce é de suma importância para o manejo dos pacientes com CEC oral, o que está relacionado a um melhor prognóstico (Ford & Farah 2013).
1.2 Patogênese do câncer oral
O CEC oral é uma neoplasia maligna de origem epitelial, derivada do epitélio escamoso estratificado da mucosa oral (Rivera & Venegas 2014). Os componentes básicos desta neoplasia são: 1) parênquima, composto por células neoplásicas da camada escamosa do epitélio oral de superfície displásica e 2) o estroma tumoral, composto por tecido conjuntivo subjacente, vasos sanguíneos, células inflamatórias, fibroblastos, e outros componentes da matriz extracelular, que confere suporte para o crescimento tumoral (Figura 1). Histologicamente o CEC oral caracteriza-se por ilhas e cordões invasivos de células escamosas epiteliais malignas infiltrando os tecidos normais subjacentes (Sharma et al., 2013).
Figura 1. Representação esquemática dos componentes básicos de uma neoplasia de células
escamosas. A figura apresenta o parênquima tumoral, o qual é composto por células neoplásicas da camada escamosa do epitélio oral e o estroma tumoral, composto pelo tecido conjuntivo subjacente, vasos sanguíneos, células inflamatórias, fibroblastos, entre outros componentes da matriz extracelular. Modificado de Servier Medical Art website.
As lesões de CEC oral podem se desenvolver a partir da mucosa oral aparentemente normal. O câncer oral é formado por meio de uma série de etapas histopatológicas a partir da hiperplasia benigna à displasia epitelial para carcinoma in
situ, seguido por células escamosas invasivas (Shah et al. 2011) (Figura 2). O CEC
oral surge a partir de um epitélio de superfície displásico em que a queratinização de células epiteliais escamosas pode ser observada com a possível formação de “pérolas” de queratina associados a um padrão de crescimento invasivo. Displasias leves apresentam uma proliferação celular atípica, com células acima da região parabasal, enquanto que na displasia moderada e severa as células encontram-se próximas ao limite do epitélio (Speight et al. 1996). Tumores bem diferenciados apresentam grandes queratinócitos, que produzem abundante queratina, e células atípicas. Os tumores moderadamente diferenciados geralmente apresentam menor queratinização e distinto pleomorfismo nuclear e mitoses aberrantes e, por fim, o CEC oral pobremente diferenciado apresenta predominantemente células imaturas com numerosas mitoses aberrantes e baixa queratinização.
Figura 2: Imagens de cortes histológicos mostrando tecidos em diferentes condições, do
normal ao carcinoma. O epitélio oral normal (A/G) apresenta uma arquitetura com vários estratos definidos e com continuidade da membrana basal. Na displasia, pode-se observar vários graus de atipia celular. Quando as alterações se apresentam na camada basal ou parabasal, corresponde a uma displasia leve (B/H). Alterações atingindo a metade do epitélio correspondem a uma displasia moderada (C/I) e quando se estendem até à superfície, a displasia é avançada (D/J). No carcinoma bem diferenciado (E/K), a invasão apresenta produção de queratina (E/K), enquanto que no carcinoma pobremente diferenciado (F/L) é difícil identificar o tecido de origem, os clones perdem adesões celulares facilitando a metástase. Fonte: doação de Prof. Ricardo Della Coletta (FOP-UNICAMP).
A malignidade é geralmente precedida por lesões potencialmente malignas, cuja evolução histopatológica pode ser observada clinicamente pela presença dessas lesões antes do surgimento do CEC oral. Entre as lesões potencialmente malignas mais importantes para o CEC da cavidade oral encontra-se a leucoplasia, que se assemelha a placas brancas na mucosa oral, e a eritroplasia, caracterizada por lesões avermelhadas na mucosa oral. Para o CEC de lábio inferior, a queilite actínica apresenta-se como uma lesão potencialmente maligna para essa região anatômica (Neville & Day 2002). Tais lesões têm sido documentadas em associação ou precedendo as lesões de CEC oral (van der Waal 2009), apresentando maior risco de transformação maligna quando comparadas à mucosa normal, uma vez que as alterações histopatológicas são similares às observadas nos carcinomas pouco invasivos (Eversole 2009). Além disso, o aumento progressivo na taxa de transformação maligna está diretamente relacionado à severidade da alteração displásica do epitélio (Kujan et al. 2006).
O tamanho das lesões de CEC pode variar de alguns milímetros para vários centímetros em casos mais avançados (Bagan et al. 2010). Lesões iniciais são geralmente assintomáticas e à medida que crescem podem se tornar uma massa exofítica (formação de aumento de volume vegetante, papilar, verruciforme), ou então
podem apresentar um padrão endofítico caracterizado por uma depressão (invasiva, escavada) com uma superfície ulcerada (Neville & Day 2002) (Figura 3).
Figura 3. Lesões de carcinoma oral de células escamosas (CEC). (A) Paciente com lesão
exofítica e ulcerada na borda lateral da língua (retirado de Muñoz-Corcuera et al. 2009). (B) Paciente com lesão endofítica ulcerada na borda lateral esquerda da língua (retirado de Chi et al. 2015).
1.3 Tratamento, prognóstico e sobrevida
O objetivo do tratamento de câncer oral consiste em eliminar o tumor, restaurar a estrutura e a função da área afetada, minimizar as sequelas deixadas pela doença e tratamento e prevenir a ocorrência de novos tumores primários. Entretanto, casos em que não há cura, o objetivo passa a ser aumentar a qualidade de vida do paciente durante a sobrevida (Shah & Gil 2009).
A escolha do tratamento inicial de CEC oral deve considerar alguns fatores relacionados ao tumor primário e características relacionadas ao paciente. Dentre as características tumorais a serem consideradas são o sítio primário, tamanho, proximidade aos ossos da mandíbula e maxila, condição dos linfonodos cervicais, tratamentos prévios e características histológicas como o tipo, classificação e profundidade de invasão do tumor. Fatores relacionados ao paciente incluem idade, condição de saúde em geral, tolerância ao tratamento e estilo de vida (fumante ou etilista) e características socioeconômicas (Shah & Gil 2009).
Os métodos de tratamento de CEC oral podem incluir a combinação de terapias como radioterapia e quimioterapia seguido por cirurgia, geralmente utilizada em estágios avançados da doença, ou apenas a aplicação de uma dessas terapias isoladamente, comumente utilizado em casos iniciais da doença. Em tumores
malignos da cavidade oral, a remoção cirúrgica é um dos procedimentos mais importantes para o tratamento. Tumores pequenos e superficiais podem ser facilmente removidos por cirurgia pela abertura da boca, enquanto tumores maiores requerem outras técnicas cirúrgicas para a exposição e excisão tumoral. Alguns sítios primários da cavidade oral, como tumores primários da língua, podem ser inicialmente tratados com radioterapia, em contraste a tumores situados próximos aos ossos. Além disso, quanto maior o tumor, maior o risco de metástase linfonodal regional, sendo necessário considerar um tratamento eletivo (Shah & Gil 2009).
Na prática clínica, o estadiamento do câncer oral é importante para estabelecer o plano de tratamento e determinar o prognóstico do paciente. A necessidade de se classificar os casos de câncer em estádios baseia-se na constatação de que as taxas de sobrevida são diferentes quando a doença está restrita ao órgão de origem ou quando ela se estende a outros órgãos, implicando assim no prognóstico do paciente. Portanto, estadiar um caso de neoplasia maligna significa avaliar o seu grau de disseminação e para isso há regras internacionalmente estabelecidas. Essas regras são estabelecidas em sistemas de classificação, os quais obedecem a diferentes variáveis, dentre elas: a localização, tamanho ou volume do tumor, invasão direta e linfática, presença de metástases à distância, diagnóstico histopatológico, produção de substâncias, manifestações sistêmicas, duração dos sinais e sintomas, sexo e idade do paciente. O sistema mais utilizado para a classificação dos tumores, incluindo o CEC oral, é o TNM (tumor-node-metastasis), preconizado pela União Internacional Contra o Câncer (UICC) (Edge & Compton 2010), no qual T representa o tamanho do tumor primário, N indica a condição dos linfonodos regionais (acometimento linfonodal) e M indica a presença ou ausência de metástase à distância (Tabelas 1 e 2). Estes parâmetros recebem graduações, geralmente de T0 a T4, de N0 a N3 e de M0 a M1. Além das graduações numéricas, as categorias T e N podem receber subclassificações em graduações alfabéticas (a, b, c), sendo que tanto as graduações numéricas como as alfabéticas expressam o nível de evolução do tumor e do comprometimento linfonodal. As categorias T, N e M também podem ser agrupadas em combinações pré-estabelecidas e organizadas em estádios que variam de I a IV, os quais podem ser subclassificados em A e B para expressar o nível de evolução da doença.
Tabela 1. Definições de TNM para câncer oral de acordo com o World Health Organization
(WHO) Classification of Tumours.
Categoria Definição
Tumor primário (T)
TX Tumor primário não pode ser avaliado T0 Sem evidência de tumor primário Tis Carcinoma in situ
T1 Tumor de 2 cm ou menor em seu maior diâmetro T2 Tumor maior de 2 cm, mas não maior que 4 cm em seu
maior diâmetro
T3 Tumor maior que 4 cm em seu maior diâmetro T4a Doença local moderadamente avançada
Cavidade oral: tumor invade estruturas adjacentes apenas (ex.: mandíbula e maxila, musculatura extrínseca profunda da língua, seios maxilares, pele da face) T4b Doença local bastante avançada
Cavidade oral: tumor invade espaço mastigatório, a base do crânio e/ou envolve a artéria carótida interna
Linfonodo regional (N)
NX Linfonodos não podem ser avaliados N0 Sem metástase em linfonodos regionais
N1 Metástase em um único linfonodo ipsilateral, menor ou igual a 3 cm em seu maior diâmetro.
N2a Metástase em um único linfonodo ipsilateral, maior do que 3 cm, porém menor do que 6 cm em seu maior diâmetro; ou múltiplos linfonodos ipsilaterais, nenhum maior do que 6 cm em seu maior diâmetro; ou linfonodos bilaterais ou contralaterais, nenhum maior do que 6 cm em seu maior diâmetro.
N2b Metástase em múltiplos linfonodos ipsilaterais, maior do que 3 cm, porém menor que 6cm em seu maior diâmetro. N2c Metástase em linfonodos bilaterais e contralaterais,
nenhum maior do que 6 cm em seu maior diâmetro N3 Metástase em linfonodo maior que 6 cm em seu maior
diâmetro
Metástase à distância (M)
M0 Sem metástase à distância
M1 Presença de metástase à distância
Tabela 2. Estadiamento e classificação TNM para câncer oral de acordo com o World Health
Organization (WHO) Classification of Tumours.
Estádio Classificação TNM 0 Tis N0 M0 I T1 N0 M0 II T2 N0 M0 III T3 N0 M0 T1 N1 M0 T2 N1 M0 T3 N1 M0 IV IVA T4a N0 M0 T4a N1 M0 T1 N2 M0 T2 N2 M0 T3 N2 M0 T4a N2 M0 IVB T4b qualquer N M0 Qualquer T N3 M0
IVC Qualquer T qualquer N M1
Adaptado de (Barnes et al. 2005).
Em CEC oral, casos em estágios iniciais ou mesmo avançados são tratados cirurgicamente com a remoção de margens de 1-2 cm, podendo ser acompanhado de dissecção do pescoço se houver acometimento linfonodal ou quando há um elevado risco de metástase regional oculta (Chi et al. 2015). Quando em estágio inicial (T1 e T2), os casos são tratados com cirurgia ou radioterapia e comumente apresentam um prognóstico favorável. Tumores de estádio III ou IV geralmente requerem uma combinação de métodos de tratamento, com cirurgia para remoção do tumor primário e aplicação de radioterapia e/ou quimioterapia, cuja necessidade é definida de acordo com algumas características, incluindo presença de margens cirúrgicas positivas, invasão perineural ou linfovascular, estadiamento N2 ou N3 e extensão extracapsular do tumor nos linfonodos (Chi et al. 2015). Assim, critérios para a ressecção cirúrgica precisa são necessários, de forma que a indicação terapêutica do câncer depende do estadiamento da doença. Assim, um estadiamento bem conduzido leva a condutas terapêuticas corretamente aplicadas.
Um fator importante que afeta o resultado a longo prazo após o tratamento inicial de câncer da cavidade oral é o estágio da doença no momento do diagnóstico (Shah & Gil 2009). O diagnóstico precoce tem sido um dos principais fatores para a sobrevida do paciente. Em geral, a sobrevida de 5 anos ocorre em apenas 53% dos casos de CEC oral (Bánkfalvi & Piffkò 2005), entretanto, se detectado em estágios iniciais as taxas de sobrevida são de 80-90% em CEC oral (Bagan et al. 2010). No
entanto, mais de 60% dos casos de CEC oral são diagnosticados tardiamente, o que implica em uma maior agressividade dessa neoplasia e em tratamentos mutiladores, impactando negativamente na qualidade de vida do paciente. Uma diminuição na taxa de sobrevida também é observada quando ocorre metástase dos linfonodos regionais (Neville & Day 2002). Adicionalmente, o câncer oral apresenta alta taxa de recorrência, sendo que pacientes que sobrevivem a um primeiro quadro da doença apresentam 20 vezes mais risco de desenvolver um segundo tumor primário (Seoane Lestón & Diz Dios 2010; Shah et al. 2011). Assim, o diagnóstico precoce continua sendo uma importante etapa, podendo impactar positivamente no prognóstico do paciente e na sobrevida.
Os fatores prognósticos de CEC oral compreendem características que compõe o sistema de classificação TNM. Entretanto, tumores de um mesmo grupo de estadiamento TNM podem apresentar comportamentos diferentes, diferindo na sobrevida e na resposta ao tratamento (Takes et al. 2010). Embora o prognóstico seja pior em pacientes com tumores em estadiamentos mais avançados, o prognóstico pode diferir significativamente dentro do mesmo grupo devido a diferenças explicadas pelas características biológicas do tumor e a fatores relacionados à interação tumor-hospedeiro, informações que não são incluídas no sistema TNM. Embora esse sistema seja imperfeito, ele é amplamente utilizado no plano de tratamento e na determinação do prognóstico. Por outro lado, estudos tem demonstrado a associação de características clínico-patológicas e histopatológicas ao prognóstico de pacientes com CEC oral, incluindo o padrão de crescimento, padrão de invasão em ilhas nos tecidos subjacentes, profundidade de invasão, presença de infiltrado inflamatório, invasão perineural, invasão vascular, dentre outros (Takes et al. 2010; Brandwein-Gensler et al. 2010; Jadhav & Gupta 2013; Almangush et al. 2015; Sawazaki-Calone et al. 2015). A inclusão desses critérios dentro de um sistema de classificação pode acarretar na determinação mais precisa do prognóstico e auxiliar na decisão clínica.
1.4 Sistemas de classificação histológica em CEC oral
O estadiamento clínico com base na classificação TNM e na localização do tumor são rotineiramente os principais critérios para o prognóstico e tratamento de CEC oral (Scully & Bagan 2009). No entanto, é possível observar variações na
resposta ao tratamento e no prognóstico entre pacientes com tumores de mesmo estadiamento, ou seja, alguns pacientes podem apresentar uma sobrevida prolongada, enquanto outros podem morrer de metástase rapidamente. Diante disso, foi proposto que a gradação histopatológica detalhada dos tumores poderia ajudar os médicos na individualização do tratamento e no prognóstico de pacientes com CEC oral (Almangush et al. 2015; Brandwein-Gensler et al. 2005; Bryne et al. 1992).
Muitos estudos têm buscado determinar quais parâmetros histológicos mais contribuem para a determinação do prognóstico. O primeiro sistema de classificação histopatológica de CEC oral foi desenvolvido por Broders em 1920 (Broders 1920), o qual considera que tumores pobremente diferenciados apresentam um pobre prognóstico. Esse modelo foi mais tarde adotado pela Organização Mundial da Saúde (WHO) (Barnes et al. 2005), porém foi criticado em alguns estudos por ser subjetivo e devido à característica celular heterogênea que os tumores apresentam, podendo refletir em diferenças no comportamento invasivo e metastático (Bryne et al. 1989). Outros sistemas foram propostos para padronizar a classificação e os fatores prognósticos. Em 1984, Anneroth e colaboradores (Anneroth & Hansen 1984) propuseram um novo sistema de classificação de malignidade, o qual avalia características da região invasiva do tumor. Nesse sistema, 3 características das células tumorais das regiões menos diferenciadas do tumor, juntamente com outras 3 características histológicas da relação célula tumoral e tecido conectivo, são consideradas, sendo: grau de queratinização, número de polimorfismo, número de mitoses, padrão de invasão, estágio da invasão e infiltração de leucócitos. Ao comparar o valor prognóstico desse novo sistema com o sugerido por Broders, Bryne e colaboradores (Bryne et al. 1989) mostraram que o novo sistema de classificação maligna é um fator prognóstico altamente significativo em CEC oral, sugerindo assim que características histológicas da região invasiva do tumor são importantes para a predição do comportamento clínico do tumor, região em que as células mais se assemelham às que dão origem à metástases. Mais tarde, um novo estudo realizado por Bryne e co-autores (Bryne et al. 1992) com a avaliação histológica de 61 casos de CEC oral, demonstrou que a classificação maligna das margens invasivas (MG,
margin grading ou deep invasive margins) do tumor apresentam um alto valor
prognóstico, concluindo que essa região pode ser utilizada para auxiliar no planejamento do tratamento de CEC oral. Esse sistema de classificação de
malignidade nas margens invasivas considera o grau de queratinização, polimorfismo nuclear, padrão de invasão e infiltração linfoplasmocitária somente nas áreas mais invasivas do tumor. Mais tarde esse modelo de classificação maligna foi também utilizado em um novo estudo com a inclusão do parâmetro de invasão vascular, o qual foi fortemente associado à metástase linfonodal e sobrevida específica (Larsen et al. 2009).
Outro sistema de classificação baseado em características histológicas é o modelo de risco histológico (HRM, histological risk model), proposto por Brandwein-Gensler e colaboradores (2005), o qual se baseia em três parâmetros histopatológicos para a avaliação de espécimes cirúrgico: (1) pior padrão de invasão (WPOI, worst
pattern of invasion), (2) invasão perineural (PNI, perineural invasion) e (3) resposta
linfocítica do hospedeiro (LHR, lymphocytic host response) (Brandwein-Gensler et al. 2005). Este modelo classifica os pacientes em grupos de baixo, intermediário e alto risco e demonstrou seu poder preditivo para recidiva local e sobrevida global em CEC oral (Brandwein-Gensler et al. 2005; Brandwein-Gensler et al. 2010). De uma forma geral, o padrão de invasão tumoral pode ser descrito como o modo que o tumor infiltra no tecido subjacente, na interface tumor/hospedeiro. Esse padrão de invasão pode ocorrer de um modo disperso, com ilhas celulares ou células soltas, refletindo uma neoplasia mais agressiva do que em padrões de crescimento mais uniformes, por inteiro. A resposta linfocitária do hospedeiro pode estar presente ao redor da neoplasia, como uma faixa contínua de células inflamatórias, como placas de células inflamatórias dispersas ou então ausente. Por sua vez, a invasão perineural pode ocorrer com a presença de células e/ou ilhas neoplásicas ao longo ou dentro de um fascículo nervoso, o que está relacionada a um padrão mais invasivo do tumor (Brandwein-Gensler et al. 2005).
Recentemente, Almangush e colaboradores (2014) avaliaram a eficácia de parâmetros histomorfológicos em predizer a mortalidade de pacientes em estágios iniciais de CEC oral, afim de agrupar pacientes em grupos de alto risco para tratamentos multimodais, ou em grupos de baixo risco, no qual o tratamento cirúrgico seria suficiente (Almangush et al. 2014). Resultados revelaram que a profundidade de invasão, tumor de brotamento (do inglês tumor buddings) e pior padrão de invasão (WPOI, worst pattern of invasion) foram os únicos parâmetros capazes de predizer independentemente o prognóstico de pacientes em estágios iniciais (T1/T2N0M0) de
CEC oral de língua. Em 2015 introduziram o modelo BD, que é baseado em dois parâmetros: 1) tumor de brotamento (B, tumor buddings), composto por duas propriedades de malignidade: perda da coesão celular e ativo movimento invasivo; 2) profundidade de invasão tumoral (D, depth of tumor invasion), em milímetros. O tumor de brotamento, definido como a presença de uma única célula neoplásica ou de um pequeno grupo composto por até 5 células neoplásicas na região de fronte invasivo, foi utilizado como um parâmetro para avaliar o padrão de invasão, enquanto a profundidade da invasão foi aplicada para avaliar a profundidade de invasão do tumor nos tecidos adjacentes. A combinação desses dois fatores BD apresentaram um importante valor prognóstico associado ao alto risco de recorrência loco-regional e menor sobrevida em pacientes com CEC oral, conferindo também um aumento na acurácia e na confiabilidade da predição do prognóstico comparado ao uso desses parâmetros separadamente (Almangush et al. 2015; Sawazaki-Calone et al. 2015).
Muitos estudos tem buscado um parâmetro histológico que contribua fortemente na determinação do prognóstico, entretanto, nenhum sistema de classificação histopatológica tem sido universalmente aceito para CEC oral (Sawazaki-Calone et al. 2015). As diferenças encontradas entre os perfis histológicos de CEC oral podem estar relacionadas à agressividade do carcinoma não somente por características histomorfológicas, mas também pela composição molecular das distintas regiões do tumor, deixando evidente a necessidade de estudos detalhados nessas áreas, principalmente na região de fronte tumoral, a qual tem sido demonstrada como associada à agressividade do tumor.
1.5 Região de fronte invasivo tumoral
Em 1989, Bryne já sugeria que a histologia das áreas invasivas do tumor (ITF, Invasive Tumor Front) eram importantes para a predição do comportamento clínico do tumor de CEC oral e auxiliasse na escolha do tratamento (Bryne et al. 1989; Bryne 1998). Outros estudos também utilizaram essa região ITF para definir um sistema de classificação histológica e assim tentar predizer o prognóstico de um paciente de CEC oral (Brandwein-Gensler et al. 2005; Almangush et al. 2014).
A região de fronte invasivo tumoral é um local dinâmico e fundamental na diferenciação dos tumores malignos, sendo considerada a frente invasiva do epitélio
na margem do tecido conjuntivo na transição epitélio-mesenquimal (EMT, epithelial
mesenchymal transition) (Costa et al. 2015; Almangush et al. 2015; Salo et al. 2014).
Essa região ITF apresenta menor grau de diferenciação e alto grau de dissociação celular, sendo composta por células que apresentam características diferentes àquelas presentes nas demais regiões do tumor, mais semelhantes às células que promovem metástase do que às células de outra áreas menos invasivas do tumor (Liotta 1986; Bryne et al. 1992; Bryne 1998; Almangush et al. 2015). Além disso, as células neoplásicas da região ITF apresentam um fenótipo mais agressivo e com habilidade de invadir tecidos adjacentes, vasos sanguíneos e linfáticos e assim promover metástase (Bankfalvi & Piffko 2000).
A composição molecular e morfológica da área ITF tem sido abordada em alguns trabalhos, uma vez que eventos importantes para a disseminação do tumor como o ganho e a perda de moléculas de adesão, a secreção de enzimas proteolíticas, o aumento da proliferação celular e iniciação da angiogênese ocorrem na interface de interação tumor-hospedeiro, isto é, na região de invasão do tumor (Bryne 1998; Bankfalvi & Piffko 2000; Sharma et al. 2013). Muitos processos de adesão célula-matriz e perda de adesão célula-célula são pré-requisitos para a progressão tumoral e estudos sugerem que alterações na expressão de moléculas de adesão podem ser úteis para a determinação do prognóstico. Um aumento na expressão de moléculas de adesão como caderinas, integrinas, CD44, lamininas, tenascina e glicoproteínas já foi observado na região ITF. Enzimas proteolíticas também participam do processo de invasão celular e podem ser ativadas por células do estroma ou pelas células neoplásicas da região ITF, sendo que o aumento na expressão dessas enzimas na região de ITF em comparação com as demais áreas do tumor já foi relatado em estudos de CEC oral. De forma semelhante, um aumento na expressão de moléculas relacionadas à proliferação celular também já foi encontrado na região ITF comparado às demais regiões do tumor. Outros eventos como a sinalização molecular para iniciação da angiogênese e migração celular, bem como interações entre células neoplásicas e células do sistema imunológico também ocorrem na região de fronte invasivo tumoral (Bryne 1998; Bankfalvi & Piffko 2000).
Em 2013, Usami e colaboradores (Usami et al. 2013) demonstraram que a expressão de ICAM-1, uma proteína que acredita-se estar relacionada à malignidade, é predominante na região frontal invasiva de CEC de língua, tendo sua expressão
correlacionada à invasão, metástase em linfonodos e ao aumento do número de vasos sanguíneos e linfáticos na região afetada. Adicionalmente, desequilíbrios cromossômicos foram encontrados exclusivamente na região frontal invasiva de carcinomas de laringe (Ambrosio et al. 2013), sendo que tais alterações cromossômicas revelaram genes associados a um pior prognóstico.
Portanto, vários eventos moleculares de importância para a disseminação do tumor ocorrem na interface tumor-hospedeiro, de forma que o fronte invasivo tumoral pode refletir o prognóstico melhor que outras áreas do tumor (Sharma et al. 2013). Assim, as áreas invasivas do fronte tumoral diferem das demais regiões do tumor e são de grande interesse para o estudo de malignidade em CEC oral, bem como na determinação do prognóstico e contribuir para o entendimento da interação tumor-hospedeiro.
1.6 Ambiente tecidual em câncer – estroma
O sucesso do desenvolvimento tumoral é dirigido em grande parte pelo ambiente tecidual, no qual as células do estroma do hospedeiro participam da indução, seleção e expansão das células neoplásticas. Tumores são tecidos complexos formados por células neoplásicas e pelo estroma circundante. O estroma é formado por tecido conjuntivo, contendo vários tipos de células, e atua no suporte de tecidos e órgãos. Dentre os componentes do estroma, fibroblastos são essenciais na síntese e depósito de matriz extracelular (ECM, extra celullar matrix) a partir da produção de uma variedade de colágenos e fibronectinas. Coletivamente, o tecido tumoral é referido como microambiente tumoral (TME, tumor microenvironment). Na medida que o câncer progride, o TME ao redor também evolui através de contínuas mudanças nas interações tumor-estroma (Koontongkaew 2013).
A ECM é uma estrutura tridimensional e acelular, presente em todos os tecidos. Sua função vai além de prover suporte à integridade e elasticidade de tecidos, a camadas de células na membrana basal e a células individuais como substrato para a mobilidade celular. Por ser uma estrutura dinâmica, a ECM é constantemente remodelada para controlar a homeostase tecidual (Hynes 2009). Em mamíferos, a ECM é composta por diversas proteínas, incluindo colágenos, proteoglicanos (PG,
proteínas estruturais da ECM e podem ser classificadas em fibrilares (colágenos I-III, V e VI), que proveem resistência à ECM, e não fibrilares. PGs, como aggrecan, versican, perlecan e decorin apresentam cadeias laterais de glicosaminoglicanos (GAGs, glycosaminoglycans) e são intercaladas entre colágenos fibrilares, preenchendo o espaço intersticial extracelular e conferindo hidratação. Além de sua função de modelamento da ECM, glicoproteinas como as lamininas, elastina, fibronectinas, trombospondinas, tenascinas e nidogênio também estão envolvidas na interação célula-ECM, atuando como ligantes para receptores da superfície celular como as integrinas. Há ainda outras proteínas associadas à ECM e que participam de seu modelamento, entre elas encontram-se fatores de crescimento, citocinas, metaloproteinases como as ADAMs, mucinas, lectinas, galectinas, semaforinas e plexinas (Murphy 2008; Bonnans et al. 2014).
Há dois tipos de ECM que diferem quanto à localização e composição: 1) matriz do tecido intersticial conjuntivo, que envolve células e provê suporte para tecidos e 2) membrana basal, uma forma especializada da ECM que separa o epitélio do estroma circundante e controla a organização celular e a diferenciação por meio de interações com receptores da superfície celular e outras proteínas da ECM (Bonnans et al. 2014). A matriz intersticial é composta principalmente por colágeno tipo I e fibronectina, enquanto que a membrana basal consiste em grande parte de colágeno tipo IV, lamininas, proteoglicanos e outras proteínas sintetizadas e secretadas pelas células epiteliais, endoteliais e fibroblastos (Figura 4) (Bonnans et al. 2014).
Figura 4. Composição estrutural e proteica da matriz extracelular (ECM). A ECM pode ser
dividida em dois tipos, a membrana basal, a qual separa o epitélio do estroma circundante, e a matriz intersticial, que envolve células e provê suporte para tecidos. Componentes da ECM interagem constantemente com as células epiteliais, servindo como ligantes para receptores celulares e transmitindo sinais que regulam vias e processos biológicos. (Adaptado de Bonnans et al. 2014).
A estrutura da ECM bem como as proteínas nela presentes apresentam papéis vitais na determinação, diferenciação, proliferação, sobrevivência, migração e invasão celular. Os processos de invasão celular e metástase ocorrem em diversos passos, incluindo a formação de novos vasos sanguíneos (angiogênese), invasão local, migração celular, intravasation (invasão de vasos sanguíneos ou linfáticos por células cancerígenas), extravasation (saída das células cancerígenas pelos capilares) e crescimento em um sítio secundário (Hanahan & Weinberg 2000; Zetter 1998).
Embora muitos genes estejam relacionados com a disseminação do câncer, entre os mais caracterizados estão aqueles que codificam proteases de degradação da matriz e proteínas de adesão. Por sua vez, proteases como as metaloproteases de matriz (MMPs, matrix metalloproteinases) degradam e remodelam a matriz extracelular, permitindo que células tumorais possam invadir localmente ou também formar metástase. Além de permitirem o desenvolvimento de metástases, proteases também podem ativar fatores como fator de crescimento de fibroblasto-2 (FGF-2), fator-α de transformação de crescimento (TGF-α) e fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), os quais promovem o aumento do crescimento celular, a migração celular e angiogênese. De acordo com suas funções apresentadas no processo de metástase, altos níveis de diversas proteases têm sido
associados com prognósticos em diferentes malignidades (Duffy 1996; Murphy 2008; Roy & Walsh 2014).
Assim como as proteases, moléculas de adesão também estão envolvidas em muitos estágios durante invasão e metástase. Nos estágios iniciais da via metastática, as células necessitam se soltar das células vizinhas e aderirem à membrana basal. Como as células invasoras migram através da matriz extracelular, muitos passos de adesão e liberação ganham espaço. Na circulação, células tumorais aderem a células sanguíneas e a células endoteliais. A adesão é mediada por proteínas transmembrânicas, como integrinas, caderinas e selectinas alterações na expressão dessas proteínas, especialmente as caderinas e integrinas, são frequentemente encontradas em condições de malignidade (Behrens 1993; Bendas & Borsig 2012).
Diversos tipos celulares podem ser encontrados no TME, incluindo fibroblastos, fibroblastos associados ao carcinoma (CAFs, carcinoma-associated
fibroblasts), miofibroblastos, células do músculo liso, células endoteliais, pericitos,
células do sistema imunológico como neutrófilos, eosinófilos, basófilos, manócitos, linfócitos T e B, células natural killer e células apresentadoras de antígeno (APC), como os macrófagos e células dendríticas (Koontongkaew 2013; Kalluri 2016). Esses diferentes tipos celulares no ambiente estromal podem ser recrutados pelas células malignas para auxiliar o crescimento tumoral e facilitar a disseminação metastática (Xing et al. 2010). Muitos estudos têm demonstrado o papel desses componentes no desenvolvimento e progressão tumoral, em particular os CAFs (Salo et al. 2014; Bagordakis et al. 2016). Os CAFs são abundantes no estroma do tumor e desempenham um papel fundamental na progressão tumoral, promovendo o crescimento e invasão de células neoplásicas por diversos mecanismos (Xing et al. 2010). Seus precursores são fibroblastos normais e a trans-diferenciação em CAFs é dirigida em grande parte por citocinas como o transforming growth factor-β (TGF- β) liberadas pelas células neoplásicas (Pietras & Östman 2010; Bremnes et al. 2011; Salo et al. 2014). CAFs podem ser identificados pela expressão de α-actina de músculo liso (α-smooth muscle actin, αSMA) e sua presença tem sido associada a um pobre prognóstico à invasão de ossos em CEC oral (Bremnes et al. 2011; Elmusrati et al. 2017). Muitos reguladores moleculares secretados por CAFs apresentam papel pró-tumorigênico. A avaliação do secretoma (proteínas secretadas) de CAFs de CEC
oral indicou uma indução da produção de colágeno tipo I (PINP, type I collagen
N-terminal propeptide) por essas células estromais, sendo que altos níveis da expressão
dessa proteína foi associada a um pior prognóstico da doença (Bagordakis et al. 2016). Outros estudos demonstraram que CAFs são encontrados em aproximadamente 60% dos casos de CEC oral (Kellermann et al. 2007; Kellermann et al. 2008), frequentemente em contato com ilhas tumorais, mas não encontrados em tecidos livre de tumor e no estroma adjacente ao tumoral (Rodrigues et al. 2015), sendo sua presença também associada ao pior prognóstico de CEC oral (Dourado et al. 2017). Por sua vez, a habilidade de CAFs em influenciar o crescimento tumoral está associada à indução da angiogênese por meio do stromal cell-derived factor 1 (SDF1) derivado de CAFs e pelo recrutamento de células endoteliais derivadas da medula óssea (Kalluri 2016). Em estudos pré-clinicos, CAFs foram indicados como mediadores da resistência à terapia anti-angiogênica e à terapia com o uso de inibidores de tirosina quinase (Pietras & Östman 2010).
Nos últimos anos, a interação entre células tumorais e o estroma celular, que é altamente responsável pela progressão de tumores e suas metástases, tem sido investigada. Assim, um melhor entendimento da contribuição do estroma para a progressão do câncer pode aumentar o conhecimento atual sobre a promoção do crescimento celular por vias de sinalização e possivelmente levar a novas intervenções terapêuticas direcionadas ao estroma do tumor (Bremnes et al. 2011; Bonnans et al. 2014; Kalluri 2016).
Sabendo-se que características histológicas e alterações moleculares podem diferir amplamente de uma área para outra em um mesmo tumor, o estudo da composição de proteínas provenientes de diferentes regiões de CEC oral, especialmente do estroma da região frontal invasiva e do interior dos tumores, tem o potencial de fornecer um melhor entendimento dos eventos relacionados ao processo de malignidade, bem como determinar alterações do tecido hospedeiro em resposta ao desenvolvimento tumoral.
1.7 Alvos terapêuticos e marcadores de prognóstico em CEC oral
Procedimentos cirúrgicos continuam sendo a modalidade de tratamento principal em CEC oral, exceto em casos inoperáveis. Muitos casos apresentam
capacidade de resposta limitada à quimioterapia envolvendo o uso de drogas citotóxicas devido a mecanismos que podem tanto bloquear o transporte intracelular desses agentes quanto interferir com os alvos desses agentes moleculares. Assim, um melhor entendimento dos perfis moleculares e biológicos de CEC oral e da heterogeneidade dessa doença pode facilitar o desenvolvimento de terapias mais eficientes e específicas (Silva et al. 2011). Para isso, estudos tem buscado identificar marcadores moleculares, os quais podem ser definidos como moléculas que indiquem a presença do câncer ou que possam também informar sobre o comportamento futuro do câncer quanto à possível metástase ou reposta à terapia.
Diversos fatores moleculares têm sido estudados em câncer de cabeça e pescoço, incluindo CEC oral. O objetivo de muitos estudos na busca de um marcador é a identificação inicial de lesões potencialmente malignas e lesões malignas, bem como a identificação de padrões de marcadores para determinar o prognóstico e predizer a resposta ao tratamento. Uma vasta lista de potenciais marcadores com um papel significante no prognóstico tem sido identificada para CEC oral (Silva et al. 2011; Rivera et al. 2017). Muitos desses estudos foram incluídos em uma recente revisão sistemática para identificar e avaliar as evidências desses marcadores reportados para CEC oral (Rivera et al. 2017). Entre os critérios utilizados, os autores encontraram que a maioria dos estudos na busca por marcadores envolve a análise de proteínas como alvos, sugerindo 41 marcadores com valor prognóstico em CEC oral. Dentre esses trabalhos, MMP-2, MMP-1, caderina-1, 1, GLUT-1, mucina-4, interleucina-8, HPV-16, EGFR (epidermal growth factor receptor) e p53 tem recebido grande atenção e interesse na comunidade científica. O fator de transcrição p53, o qual é responsável por regular negativamente o ciclo celular e proteger a integridade do genoma, também atua como um supressor tumoral por meio da inibição da proliferação celular. Interessantemente, em CEC oral, estudos apontam que a maior expressão de p53 indica um pobre prognóstico em casos avançados da doença (Cutilli et al. 2013; Cutilli et al. 2016). Alterações na cascata de EGFR-Stat3 são frequentes em CEC oral, sendo que a avaliação das proteínas envolvidas nessa cascata de sinalização, incluindo as proteínas EGFR, o transdutor de sinal Stat3, fatores de transcrição como H-ras e c-myc, reguladores celulares p53, ciclina D1, p16, Rb e Bcl-2 e o marcador de proliferação celular Ki-67, demonstrou que a expressão
de p53 e de Stat3 juntamente com a perda de expressão de p16 são preditores independentes de um prognóstico desfavorável (Shah et al. 2009).
Em geral, muitos estudos abordam a investigação de outras proteínas como marcadores para CEC oral, incluindo fatores de crescimento e seus receptores, transdutores de sinais, fatores de transcrição, reguladores do ciclo celular, proteínas relacionadas à proliferação celular e apoptose, proteínas relacionadas à hipóxia e à angiogênese (Shah et al. 2009; Jadhav & Gupta 2013). A maioria dos trabalhos disponíveis na literatura utilizam apenas um marcador, enquanto que uma minoria avalia o valor prognóstico de um grupo de marcadores. A partir da análise de poucos marcadores, a relação e a complexidade dos eventos moleculares envolvidos com o desenvolvimento e progressão tumoral fica difícil de ser compreendida. Dessa forma, é clinicamente importante analisar simultaneamente uma lista de alterações moleculares e identificar as modificações mais importantes que possam auxiliar na compreensão da agressividade da doença e predizer o prognóstico, provendo uma informação mais precisa a respeito da resposta ao tratamento (Shah et al. 2009).
Atualmente, o uso de marcadores é um assunto de interesse em muitas pesquisas, uma vez que podem ter grande importância nas etapas de determinação do diagnóstico e prognóstico. Entretanto, muitos desses estudos ainda se encontram na fase de descoberta e requerem validação para serem aceitos na prática clínica. Futuramente, espera-se que um diagnóstico personalizado possa guiar o tratamento e consequentemente aumentar a chance de cura da doença.
1.8 A complexidade do CEC oral e a importância da proteômica clínica
O CEC oral é o tipo de câncer de cabeça e pescoço mais prevalente, sendo as modalidades terapêuticas ainda baseadas na predição de índices de estadiamento clínico e classificação histopatológica. Entretanto, esses critérios são subjetivos e relativamente incertos devido à natureza heterogênea do tumor e à resposta variável do paciente à terapia (Silva et al. 2011), de forma que pacientes com o mesmo estágio da doença podem apresentar uma evolução clínica e tempo de sobrevida distintos. Num esforço para um melhor entendimento da natureza biológica dessa doença, pesquisadores têm buscado abordagens alternativas que possam ser úteis para
