TÍTULO: ESTUDO DAS ALTERAÇÕES RENAIS EM CÃES COM CINOMOSE TÍTULO:
CATEGORIA: EM ANDAMENTO CATEGORIA:
ÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E SAÚDE ÁREA:
SUBÁREA: MEDICINA VETERINÁRIA SUBÁREA:
INSTITUIÇÃO: UNIVERSIDADE DE FRANCA INSTITUIÇÃO:
AUTOR(ES): PALOMA COUTINHO SILVA AUTOR(ES):
ORIENTADOR(ES): LEANDRO ZUCCOLOTTO CRIVELLENTI ORIENTADOR(ES):
UNIVERSIDADE DE FRANCA
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA
ELETROFORESE DAS PROTEÍNAS SÉRICAS E URINÁRIAS EM CÃES COM CINOMOSE
PROJETO DE PESQUISA – INICIAÇÃO CIENTÍFICA – FAPESP.
Graduanda: Paloma Coutinho Silva
Orientador: Prof. Dr. Leandro Z. Crivellenti
FRANCA 2014
RESUMO
A eletroforese em gel de poliacrilamida é um dos melhores métodos para obtenção das frações proteicas presentes tanto no sangue quanto na urina, seja em seres humanos como em animais. Propõem-se com o presente ensaio estudar as alterações renais túbulo-glomerular no âmbito da eletroforese sérica e urinária de 15 cães naturalmente infectados por cinomose. Para controle serão usados 10 animais saudáveis sem alterações clinicas e laboratoriais em conjunto de sorologia e reação em cadeia de polimerase (PCR) negativos para as doenças comumentes encontradas na região. Os animais serão advindos da rotina do Hospital Veterinário da Universidade de Franca (UNIFRAN), Franca-SP e do Hospital Veterinário Governador Laudo Natel da UNESP, Jaboticabal-SP. Através desse experimento será possível melhor compreensão das alterações renais neste grupo de pacientes tanto ao nível tubular quanto glomerular.
Palavras-chave: Caninos, Cinomose, proteinúria, glomerulopatia, tubulopatia.
ABSTRACT
Polyacrylamide gel electrophoresis is an important method for obtaining fractions of protein in blood and urine, either in humans and animals. It is proposed with this assay investigate tubule-glomerular alterations by electrophoresis. Fifteen dogs naturally infected with distemper will be used. For the control group 10 healthy dogs without laboratorial alterations and serology and polymerase chain reaction (PCR) negative for commonly diseases found in the region. The animals will be selected from the routine of Veterinary Teaching Hospital UNIFRAN and UNESP, Jaboticabal. Through this experiment will improve our understanding of renal impairment and asses the tubular and glomerular damages in this group of patients.
INTRODUÇÃO
A cinomose é uma doença infecciosa grave que afeta principalmente cães e outros canídeos (DEEM et al., 2000). O agente causador é o virus da cinomose, que pertence ao género Morbillivirus da família Paramyxoviridae (WANG et al., 2012).
A doença, desde seu descobrimento vem atingindo uma gama de hospedeiro, que inclui, Canidae, Mustelidea, Procyonidae, Ursidae, Viverridae, Felidae (APPEL et al., 1994; EVERMAN, 2001; KELLER et al., 2012; SEIMON, 2013). Ademais, atualmente outras espécies vêm sendo acometidas como primatas (SAKAI et al., 2013) evidênciando, ainda a possibilidade de acometer humanos (GREENE e APPEL; 2006; SAKAI et al., 2013; OTSUKI et al., 2012), por provável similariedade ao vírus do sarampo (PRATAKPIRIYA et al., 2012), e ao fato da proximidade genética entre macacos e humanos (SAKAI et al., 2013).
Esse fato, vem provocando uma preocupação mundial, pelo potencial risco de infecção em humanos, uma vez que o SLAM e Nectin-4 demonstram uma elevada similaridade em suas sequências de aminoácidos entre primatas (SAKAI et al., 2013), tornando assim, a cinomose um importante objeto de estudos futuros.
O quadro clínico é dependente de variáveis como as características do vírus, estado imunológico e idade do hospedeiro e fatores ambientais. Geralmente quando o paciente possui alta imunidade, pode levar a um quadro clínico relativamente leve ou até mesmo poderá passar despercebido. Porém, em animais jovens com deficiência imunológica, poderá apresentar sinais graves que serão notados em vários órgãos, principalmente por suas características multissistêmicas (GREENE e APPEL, 2006).
O animal poderá apresentar sinais clínicos como: anorexia, depressão, conjuntivite, hiperqueratose dos coxins digitais, inflamação catarral dos brônquios e laringe, vômitos e diarréia, e pústulas intensas no abdômen e coxas, quando o sistema
nervoso é afetado é possível notar sinais como: paraplegia, tetraplegia, atrofia muscular, vocalização, tremor, incontinência, coma e cegueira (CARVALHO, 2012). Os achados laboratoriais podem incluir linfopenia absoluta causada por esgotamento linfoide (mais frenquente em animais jovens), além de trombocitopenia e anemia regerativa (GREENE e APPEL, 2006).
Com relação ao processo de infecção da cinomose, tem inicio no tecido linfóide da orofaringe, com posterior disseminação para o trato respiratório, digestivo, urogenital e sistema nervoso central (SUMMERS et al., 1995). Embora o trato urinário, seja pouco abordado, existem apenas citações de maior risco de infecções (CARVALHO, 2012), sendo que as alterações tubulo-glomerulares ainda não foram estudadas.
Outra característica ainda não estudada é da avaliação da proteinúria. Esse dado ainda se torna mais importante quando estudado por meio da eletroforese. Com essa metodologia é possível avaliar a carga e o tamanho das proteínas, dado esse importante para diferenciação de glomerulopatias seletivas e não-seletivas. Já, no caso da proteinúria tubular são encontradas proteínas de baixo peso molecular decorrente da não reabsorção protéica nos túbulos (GRAUER, 2005; BARROS et al., 2006)
Alguns vírus são importantes causadores de lesão renal e proteinúria em humanos, como o vírus BK (vírus da nefropatia humano). Acomete principalmente pacientes que foram submetidos a transplante renal e utilizam imunossupressores. Apresentam lesão principalmente no túbulo proximal, e usa suspeita ocorre diante de reijeição do enxerto sem causa aparente (CELIK, 2004).
Sabendo das possibilidades do futuro acometimento humano pela cinomose e em decorrência dos poucos trabalhos visando a avaliação renal de cães acometidos pelo vírus, propôem-se investigar a eletroforese de proteínas séricas e urinárias, com o fito na avaliação glomérulo-tubular.
OBJETIVO
O principal objetivo será avaliar as proteínas séricas e urinárias através do método de eletroforese por SDS-page em cães com cinomose.
MATERIAIS E MÉTODOS Local e grupo experimental
O experimento fará parte do Auxílio Regular a Pesquisa recentemente aprovado (Processo FAPESP: 2014/21506-2).
Serão empregados neste estudo dois grupos experimentais. O grupo I (controle) será composto de 10 cães clinicamente saudáveis e sem quaisquer manifestações ou sinais de doença, e com exames negativos para Ehrlichia canis, A. plattys e Babesia sp. Salienta-se que o estado de saúde dos cães do grupo controle Salienta-será aquilatado pela realização de cuidadoso exame físico, associado à avaliação do quadro hematológico e bioquímico sérico e urinário, sorologias e PCR.
O grupo II será composto por 15 cães com sinais neurológicos compatíveis com a doença em conjunto do diagnóstico molecular de cinomose, advindos dos atendimentos da rotina do Serviço de Clínica Médica de Pequenos Animais do Hospital Veterinário da Universidade de Franca UNIFRAN-SP e do Serviço de Clínica Médica de Pequenos Animais do Hospital Veterinário da FCAV/UNESP campus de Jaboticabal. Os pacientes farão parte do estudo após consentimento dos proprietários, através de ficha assentido o protocolo experimental.
Serão excluídos os animais com sinais clínicos de qualquer ordem e história clínica e/ou exames compatíveis com endocrinopatias ou neoplasia de qualquer ordem.
METODOLOGIA
Amostras de sangue, dos animais de ambos os grupos, serão coletadas por venopunção jugular (5 mL), e será envasada em tubo sem anticoagulante (Vacutainer®), previamente identificado. Após coagulação do sangue, o sistema será centrifugado a 800G, durante 5 minutos, para separação do soro. Uma vez separado, o soro será transferido, em subaliquotas de 1-2 mL, para microtubos (eppendorf) identificados, e congelados à -20°C.
As amostras de urina serão obtidas por micção espontânea ou cateterização vesical para realização de urinálise. Após centrifugação frações do sobrenadante serão acondicionadas e mantidas a -20°C até o momento das análises de eletroforese. A proteína e creatinina urinária serão obtidas a partir do sobrenadante.
As dosagens de proteínas e creatinina urinária serão obtidas a partir do sobrenadante. Para a determinação da razão proteína/creatinina urinária (UP/C), serão feitas dosagens de proteína urinária pelo método de vermelho de pirogalol (kit Sensiprot1) e creatinina pelo método de picrato em meio alcalino, ambas com leitura em aparelho semi-automático2 em modo colorimétrico.
• Razão proteína/creatinina urinária
Para o cálculo da razão proteína/creatinina urinária utilizar-se-á da fórmula:
U-P/C =
UPt (mg/dL) Ucr (mg/dL) Onde:
U-P/C = razão proteína/creatinina urinária
1 Labtest Diagnóstica – Belo Horizonte – MG – Brasil
UPt= concentração urinária de proteínas Ucr = concentração urinária de creatinina
ELETROFORESE DE PROTEÍNA SÉRICA E URINÁRIA
O fracionamento eletroforético das proteínas do soro e urina serão realizados, e processados de acordo com a rotina do Laboratório de Patologia Clínica Veterinária do Hospital Veterinário da UNESP, Jaboticabal-SP.
Após preparar o gel de poliacrilamida, este será colocado entre as placas de vidro. Serão realizados poços de aplicação das amostras e para que haja a polimerização, será inserido também certa quantidade de água destilada, através de uma seringa de tuberculina, sobre a linha horizontal do gel impedindo a entrada de oxigênio. Na etapa seguinte a placa será mantida por 45 minutos em repouso. Depois de polimerizado, a água é retirada, e em seguida coloca-se o gel de empilhamento, da mesma forma como foi colocado o gel de poliacrilamida.
Em cada poço será colocada uma amostra e o espaço que restar será completado com tampão dos compartimentos eletrolíticos. A placa será acomodada e fixada na cuba de eletroforese, conectando-se os cabos com a fonte geradora de voltagem. O processo eletroforético desenvolverá do polo negativo para o positivo.
Após todos esses feitos, será estabelecido o tempo necessário (150 volts por 2 a 3 horas). Depois de terminada a corrida eletroforética, o gel será retirado cautelosamente das placas e mergulhado no local contendo a solução corante (Ponceau S, negro de amido ou azul de bromofenol) e a descoloração será feita com ácido acético a 7%.
Uma vez obtido o traçado, este será caracterizado pela migração das frações protéicas (albumina, alfa, beta e gamaglobulinas) no gel de poliacrilamida. Após serão
realizadas leituras densitométricas através do programa SDS-60, cujos valores absolutos
e relativos, de cada fração, serão obtidos.
ANÁLISE ESTATÍSTICA
Será submetido a analise de variância os resultados através do t teste de para
verificar se existe diferença entre o grupo controle e o grupo infectado com cinomose .O
teste de Tukey será usado para comparar as médias entre os grupos estudados. Valores de
p < 0,05 serão considerados significativos.
CRONOGRAMA DE EXECUÇÃO
ATIVIDADES 2015 2016
A M J J A S O N D J F M
Atualização Bibliográfica X X X X X X X X X X X X Colheita de material X X X X X X
Padronização das técnicas X X X X Procedimentos
Laboratoriais X X X X X X X X X
Eletroforese das proteínas
séricas e urinárias X X X X X X X
Análise das Preparações
Eletroforese das proteínas X X X
Redação e Divulgação X X
REFERÊNCIAS
BARROS, R. T.; ALVES, M. A. R.; DANTAS, M.; KIRSZTAJN, G. M.; SENS, Y. A. S. Glomerulopatas: patogenia, clínica e tratamento. São Paulo: Sarvier, 2006, 2ed, 457p.
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PRATAKPIRIYA, W.; SEKI, F.; OTSUKI, N.; SAKAI, K.; FUKUHARA, H.; KATAMOTO, H.; HIRAI, T.; MAENAKA, K.; TECHANGAMSUWAN, S.; Nguyen THI LAN, N.; TAKEDA, M.; YAMAGUCHI, R.; Nectin4 Is an Epithelial Cell Receptor for Canine Distemper Virus and Involved in Neurovirulence. Journal of Virology, v: 86 p. 10207–10210, 2012
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