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Esterificação enzimática para obtenção de acrilatos simples e múltiplos de maltodextrina

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BIANCA MAÍRA TEIXEIRA AYRES

ESTERIFICAÇÃO ENZIMÁTICA PARA OBTENÇÃO DE

ACRILATOS SIMPLES E MÚLTIPLOS DE

MALTODEXTRINA

CAMPINAS

2014

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA

BIANCA MAÍRA TEIXEIRA AYRES

“ESTERIFICAÇÃO ENZIMÁTICA PARA OBTENÇÃO DE

ACRILATOS SIMPLES E MÚLTIPLOS DE

MALTODEXTRINA”

Tese de Doutorado apresentada à Faculdade de Engenharia Química da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para obtenção do Título de Doutora em Engenharia Química.

Orientadora: Profa Dra TELMA TEIXEIRA FRANCO Co-Orientador: Prof.Dr. GUSTAVO PAIM VALENÇA

CAMPINAS 2014

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA BIANCA MAÍRA TEIXEIRA AYRES E ORIENTADA PELA PROFA.DRA. TELMA TEIXEIRA FRANCO

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Ficha catalográfica

Universidade Estadual de Campinas Biblioteca da Área de Engenharia e Arquitetura

Luciana Pietrosanto Milla - CRB 8/8129

Ayres, Bianca Teixeira,

Ay74e AyrEsterificação enzimática para obtenção de acrilatos simples e múltiplos de maltodextrina / Bianca Maíra Teixeira Ayres. – Campinas, SP : [s.n.], 2014.

AyrOrientador: Telma Teixeira Franco. AyrCoorientador: Gustavo Paim Valença.

AyrTese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química.

Ayr1. Lipase. 2. Esterificação enzimática. 3. Maltodextrina. 4. Carboidratos. I. Franco, Telma Teixeira,1957-. II. Valença, Gustavo Paim,1960-. III. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Engenharia Química. IV. Título.

Informações para Biblioteca Digital

Título em outro idioma: Enzymatic acrylation for production of simple and multiple acrylates of

maltodextrin Palavras-chave em inglês: Lipase Enzymatic esterification Maltodextrin Carbohydrates

Área de concentração: Engenharia Química Titulação: Doutora em Engenharia Química Banca examinadora:

Telma Teixeira Franco [Orientador] Julio César dos Santos

Luuk Antonius Maria van der Wielen Ulf Friedrich Schuchardt

Fernando Rodrigo Frederico

Data de defesa: 11-12-2014

Programa de Pós-Graduação: Engenharia Química

Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)

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RESUMO

O objetivo deste trabalho foi a biocatálise de acrilatos de carboidratos, desde glicose até maltodextrina. Maltodextrinas (MD) são produtos da hidrólise do amido, caracterizadas por cadeias de 5 a 20 unidades de α-D-glicose unidas por ligações α-1,4 (principalmente). Análises por cromatografia de permeação em gel (HPSEC) caracterizou ampla distribuição de massa molar de amostras padrão ou industriais de MD, apresentando de 1 a 100 unidades de glicose (G1). O fracionamento por etanol para seleção de menores cadeias de glicose não foi efetivo pois variadas frações volumétricas de etanol forneceu contaminação de cadeias curtas no precipitado.

Os principais fatores limitantes para a esterificação enzimática da MD com ácido acrílico são baixa solubilidade do substrato sacarídico, inibição por ácido acrílico, polaridade do solvente orgânico que permita atividade enzimática, a qual depende das características da lipase imobilizada como tipo de suporte e origem da lipase. Lipases disponíveis comercialmente na forma imobilizada de

Thermomyces lanuginosa (TL IM) ou Candida antarctica (Novozyme 435) e,

imobilização por adsorção das lipases de T.lanuginosa, C.antarctica, Candida

rugosa e Rizomucor miehei em Accurel EP-100 foram investigadas em triagem

associada de solventes orgânicos. Dioxano e Novozyme 435 foram a melhor associação que alcançou maior conversão de G1 e G2. Acrilatos de maltodextrina foram também observados sob incubação com TL IM em TBA.

A solubilidade da MD é completa em água, piridina e DMSO, cerca de 1 kg L-1, mas as lipases não são ativas para esterificação nestes solventes. A água é um subproduto da esterificação e sua presença pode deslocar a reação em favor da hidrólise. A adição de DMSO como co-solvente para o sistema reacional contendo 2M2B ou TBA foi comprovado ser menos eficiente que sistemas com 100% dos solventes apolares. A maior área de taxa de aumento da produção direta de acrilatos de maltodextrina foi alcançada com

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Analogicamente, a acrilação enzimática de n-butanol foi catalisada pela Novozyme 435. Diferentemente dos acrilatos de carboidratos, o produto acrilato de butila pôde ser quantificado por cromatografia em fase gasosa (CG). Sistemas de solventes e co-solventes (tolueno, ciclohexano, 2-metil-2-butanol (2M2B), álcool terc–butílico (TBA) e associações com parcial volume de dimetilsulfoxido (DMSO)) foram estudados para determinar o efeito destes na atividade enzimática específica. O uso de ciclohexano e tolueno resultaram em atividade da enzima três vezes maior que em TBA e 2M2B. n-Butanol e MD são substratos diferenciados pela solubilidade nos solventes orgânicos, os quais devem ser apolares ou pouco polares para permitir atividade catalítica. Uma reação secundária de acrilação com o solvente orgânico, TBA ou 2M2B, foi verificada por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas.

A esterificação enzimática de maltose, de maltotriose e maltodextrina com ácido acrílico catalisada pela lipase Novozyme 435 em 2M2B foram analisadas por espectrometria de massas com ionização por eletrospray, ou acoplada à cromatografia líquida de alta eficiência. Essas análises confirmaram a presença de uma até quatro hidroxilas acriladas da maltose (G2) ou da maltotriose (G3).!

Um processo em duas etapas de biocatálise para produção de acrilatos de carboidratos foi investigado. Inicialmente, G1 ou G2 foram esterificadas enzimaticamente com propionato de vinila ou acrilato de etila por incubação com Novozyme 435 em dioxano. Em subsequente etapa, a cadeia glicosídica destes ésteres foram alongadas a partir da atividade da cicloglicosil transferase de

Bacillus macerans com α-ciclodextrina como doador de grupo glicosil.

Cromatografia líquida de alta eficiência com detecção amperométrica e aerossol carregado e cromatografia em camada delgada foram utilizados para identificar os ésteres de oligossacarídeos.

Cerca de 75% ou 55% de α-ciclodextrina foi convertida com consumo de 40.5% de propionato de glicose (G1P) ou 86.3% de propionato de maltose (G2P) pela atividade da CGTase. A composição da solução final foi, desde 2 a 14 unidades de glicose com uma unidade acrilada ou propilada.

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ABSTRACT

The aim of this work was the biocatalysis of the acrylates of carbohydrates, from glucose up to maltodextrins. Maltodetrins (MD) are starch hydrolysates consisting of α-D-glucose units bounded by α-1,4 glycosidic linkages (primarily). Analysis of standard or industrial samples of MD in gel permeation chromatography presented a huge molecular mass distribution, from 1 to 100 units of glucose (G1). An ethanol fractionation step for selection of narrow range of the chains of glucose was unsuccesfull because the precipitate and supernatant were contamined with small molecules.

The main limitant factors for enzymatic esterification of MD with acrylic acid are the catering saccharidic substrate (increase its solubility) to the lipase, to avoid (or overcome) inhibition from acrylic acid, and to allow enzymatic activity, which depends on the characteristics of the immobilized lipases (type of support, source of the lipase) and solvent of the system.

Commercial immobilized lipases from Thermomyces lanuginosa (TL IM) or

Candida antarctica (Novozyme 435) and, lipases from T.lanuginosa, C.antarctica, Candida rugosa and Rizomucor miehei immobilized by absorption

in Accurel EP-100 were investigated in a screening of organic solvents. Dioxane and Novozyme 435 were the best association for higher conversion of G1 and G2. TL IM in tert-butanol (TBA) was the only system, which produced acrylates of maltodextrina on TLC plates.

The solubility of the MD is complete in water, pyridine and dimethylsulfoxide (DMSO), about 1 kg L-1, but lipases are not active for esterification in these solvents. The water is a byproduct of the esterification and shifts the reversible reaction toward the hydrolysis. The partial addition of the co-solvent DMSO to the reactional system containing 2-methyl-2-butanol (2M2B) or TBA was tested for partial solubilization of the maltodextrin. The systems with only one organic solvent were more efficient than the presence of DMSO. The highest area in high performance liquid chromatography (HPLC) for production of the MD acrylates was achieved with 2M2B as adjuvant.

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Analogically, the acrylation of n-butanol by Novozyme 435 was studied to better understand the enzymatic acrylation, since the quantification of the product butyl acrylate is possible by gas chromatography (GC). Solvent systems (toluene, cyclohexane, 2M2B, TBA and partial volume of DMSO) were studied to determine the effect of the solvents on the specific enzymatic activity. It was found that cyclohexane and toluene achieved 3-fold the enzyme activity that in TBA and 2M2B. However, n-butanol and MD as substrate are mainly differentiated regards to the solubility in non polar organic solvents which are more suitable for lipase activity. A side reaction of acrylation of the organic solvent, TBA or 2M2B, was verified by GC-Mass Spectrometry. Meanwhile, the enzymatic esterification of maltose, maltotriose and maltodextrin with acrylic acid by Novozyme 435 in 2M2B were analyzed in electrospray ionization (ESI) mass spectrometry (MS) associated to HPLC, which confirmed the presence of mono- until tetra- acrylated hydroxyls for maltose (G2) and maltotriose (G3).

A two-step process of biocatalysis for producton of sugar acrylates was investigated. G1 or G2 was acylated with either vinyl propionate or ethyl acrylate by Novozyme 435 in dioxane. Then, the elongation of the chain by cyclodextrin glucanotransferase (CGTase) from Bacillus macerans with α-cyclodextrin as acyl donor provided maltoligosaccharides esters. CGTase from Bacillus macerans converted these products from the first step and α-cyclodextrin into oligosaccharide esters. HPLC coupled to charged aerosol detector and amperometric exchange and thin layer chromatography were used to identify the oligosaccharide esters.

About 75% or 55% of α-cyclodextrin was converted under consumption of 40.5% of glucose propionate (G1P) or 86.3% of maltose propionate (G2P) by CGTase activity. The composition of the final solution was since 2 to 14 glucose units with one acrylate or propionate moiety.

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SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ... 27 1.1 Objetivos ... 3 1.1.1 Objetivo geral ... 3 1.1.2 Objetivos específicos ... 3 1.2 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 4 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 7

2.1 BIOMATERIAIS DE MALTOLIGOSSACARÍDEOS E AMIDO ... 9

2.2 MALTODEXTRINAS ... 11

2.2.1 DISTRIBUIÇÃO DA MASSA MOLAR DAS MALTODEXTRINAS ... 12

2.3 ACRILATOS E ÁCIDO ACRÍLICO ... 14

2.3.1 USOS E APLICAÇÕES DO ÁCIDO ACRÍLICO ... 14

2.3.2 SUBSTRATO ÁCIDO PARA BIOCATÁLISE ... 16

2.3.3 ACRILATOS DE CARBOIDRATOS ... 17

2.4 REAÇÕES CATALISADAS PELAS LIPASES ... 18

2.4.1 ESTERIFICAÇÃO ENZIMÁTICA DE AÇÚCARES ... 19

2.4.2 SOLUBILIDADE DOS MALTOLIGOSSACARÍDEOS NOS SOLVENTES ORGÂNICOS ... 21

2.4.3 INTERAÇÃO SOLVENTE/ENZIMA ... 22

2.5 MICROEMULSÃO ... 24

2.6 MÉTODOS ANALÍTICOS PARA ÉSTERES DE AÇUCARES DE CADEIA CURTA (POLARES) ... 25

2.7 ASSOCIAÇÃO DE PROCESSO EM DUAS ETAPAS PARA PRODUÇÃO DE ÉSTERES DE MALTOLIGOSSACARÍDEOS: 1) SOLVENTE ORGÂNICO 2) SOLUÇÃO TAMPÃO ... 27

2.8 ADIÇÃO DE MICHAEL COMO REAÇÃO LATERAL ... 30

2.9 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 33

Capítulo 3 - CARACTERIZAÇÃO DO SUBSTRATO MALTODEXTRINA ... 43

(12)

3.2 MATERIAIS ... 45

3.3 MÉTODOS ... 46

3.3.1 Determinação da Massa molar média das maltodextrinas por Cromatografia de Permeação em Gel de Alta Eficiência (HPSEC) com detecção por índice de refração (RI) ... 46

3.3.2 Composição das frações da precipitação por etanol analisadas por Cromatografia de troca aniônica de Alta Eficiência com detecção eletroquímica pulsada (HPAEC/PED) ... 46

3.3.3 Fracionamento da maltodextrina por etanol ... 47

3.4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 48

3.4.1 Caracterização da polidispersividade das maltodextrinas ... 48

3.4.2 HPAEC/PED ... 54

3.4.3 FRACIONAMENTO DE MALTODEXTRINA POR ETANOL ... 56

3.5 SOLUBILIDADE DE CARBOIDRATOS EM SOLVENTES ... 60

3.6 CONCLUSÕES ... 62

3.7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 63

Capítulo 4 - ESTERIFICAÇÃO ENZIMÁTICA DIRETA (ÁCIDO ACRÍLICO COMO DOADOR DE ACIL) POR LIPASE IMOBILIZADA ... 65

4.1 RESUMO ... 67

4.2 MATERIAIS ... 67

4.3 MÉTODOS ... 68

4.3.1 Atividade Enzimática ... 68

4.3.2 Cromatografia Gasosa ... 69

4.3.3 Síntese do liquido iônico 1-butil-3-metilimidazolium [BMIm][dca] ... 69

4.3.4 Reação de Esterificação de Acrilatos de Carboidratos em solventes orgânicos ... 69

4.3.5 Reação de acrilação de maltotriose em [BMIm][dca] ... 70

4.3.6 CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA COM DETECÇÃO DE ÍNDICE DE REFRAÇÃO (CLAE/RI) ... 71 !

(13)

4.3.7 CLAE ACOPLADA A ESPECTROMETRIA DE MASSAS COM

IONIZAÇÃO POR ELETROSPRAY (CLAE-ES-MS) ... 71

4.4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 72

4.4.1 SELEÇÃO DO SISTEMA DE SOLVENTE PARA ATIVIDADE ENZIMÁTICA ... 72

4.4.2 INFLUÊNCIA DA DISPONIBILIDADE DE CARBOIDRATOS ... 74

4.4.3 ACRILAÇÃO DE MONO-, DI- E TRISSACARÍDEO ... 79

4.4.4 CARACTERIZAÇÃO DOS ACRILATOS DE CARBOIDRATOS POR ESI-MS ... 83

4.4.4.1!Acrilação!de!maltodextrina!em!líquido!iônico...!89!

! 4.5 CONCLUSÕES ... 91

4.6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 91

5 Capítulo 5 - TRANSESTERIFICAÇÃO vs ESTERIFICAÇÃO ENZIMÁTICA.93 5.1 RESUMO ... 95

5.2 MATERIAIS ... 95

5.3 MÉTODOS ... 95

5.3.1 Cromatografia de Camada Delgada (CCD) ... 95

5.3.2 Imobilização de lipases em MP1000 ... 99

! 5.3.2.1!Triagem!de!lipases,!suportes!de!imobilização!e!solventes!orgânicos.!99! 5.3.3 Transesterificação enzimática por lipase ... 100

5.4 RESULTADOS ... 100

5.4.1 Immobilização das lipases de C.antarctica, T.lanuginosa, R.miehei e C.rugosa ... 100

5.4.2 Triagem de lipases e solventes orgânicos ... 101

5.5 CONCLUSÕES ... 103

5.6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 104

6 Artigo “veep Process for Preparation of Oligosaccharide Propionates and Acrylates Using Lipase and cyclodextrin glycosyl transferase (CGTase)” .. 105

7 Artigo “Acrylates Of Oligosaccharides From Acrylic Acid And Maltoligosaccharides By Enzymatic Esterification” ... 121

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8 Artigo “Driven production of fructose mono- and diacrylates by direct enzymatic acrylation: optimization of the reaction conditions toward

monoacylation” ... 139

9 APÊNDICE A ... 166

10 CONCLUSÕES ... 168

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AGRADECIMENTOS

Por todos estes anos de desenvolvimento deste projeto, desde 2010 a 2014, agradeço a muitas pessoas que passaram e marcaram minha vida. Nesta página posso enumerar apenas algumas delas, mas quero que todos tenham a certeza que fizeram diferença em cada conversa. Portanto, agradeço:

Primeiramente, agradeço à professora Dra. Telma Franco por toda

orientação, amizade, profissionalismo e apoio em todas as etapas deste projeto. Agradeço ao meu co-orientador Prof.Dr.Gustavo Paim Valença pelo

apoio, amizade orientação e discussão nos mais diversos assuntos.

Agradeço ao meu co-orientador Prof.Dr. Patrick Adlercreutz do projeto BEPE/FAPESP durante um ano na Universidade de Lund, Suécia. Aprendi muito a desenvolver o trabalho, discutir em grupo, além da oportunidade de trabalhar em seu país.

À todos estes, agradeço a oportunidade de compor o grupo de trabalho deles.

Aos amigos do LEBBPOR, às conversas tanto em encontros sociais quanto no laboratório, tivemos muito trabalho em grupo que foram

imprescindíveis nesta fase!

Entre estes amigos e outros da FEQ/UNICAMP estão Andréia Anschau, Annamaria Viddoti, Antonio Freitas, Cecília Caruso, Edison Kato, Erika

Francisco, Erika Marques, Fernando Frederico, Giselle Arruda, Jaiver Figueroa, Juliana Lorensi, Michelle Xavier e Renato Coelho, Samuel Ferreira, Vinícius Maciel.

Aos demais amigos que conheci na Suécia ou brasileiros que lá estiveram para passaram para alegrar meus momentos em um país tão frio e cheio de exemplos para se aprender!

Às minhas visitas que por lá estiveram, Lívia Franco, Matilde Ayres e Junko Tsukamoto.

Entre estes amigos estão Tim Börner, Juan Mangas, Pontus Lundemo, Carl Grey, Natalia, Rosa Aragão, Fabio Farias, Wallan Grizolli, Claudia, Serena Bisagni, Mariana Duarte e Dovile Sinkunien, Amin Bornadel e Hugo Cavero.

Às minhas amigas de infância que estamos juntas até hoje e para sempre, Bibi, Camila Rigoli, Giovanna Lima, Paula Rodrigues, Rapha Borri e Vanessa Giácomo.

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Agradeço à minha família pelo apoio, em especial minha mãe Neiva, meu pai Luiz, meu irmão Caio, minha irmã Taís, Matilde e aos meus sobrinhos que são fonte de minha energia: Lucas, Gustavo e Mathys!

Agradeço ao meu companheiro, Matheus Martone, que entre muitas histórias, desde o início da graduação em 2003 me acompanha todo dia... Além das noites de laboratório, noites de relatório e noites de diversão!

Amo todos, com um amor imensurável !

Agradeço às agências de fomento do laboratório CAPES, CNPq e em especial a FAPESP, pelo total apoio com o programa de doutorado no país (processo 2009/18497-3) e o programa BEPE (2012/06859-0).

À todas as pessoas, que de alguma forma, contribuíram para que essa tese de doutorado se tornasse realidade, todos os meus sinceros agradecimentos!

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ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 2.1 – Representação esquemática de nanopartículas de maltodextrina envoltas por AOT em isooctano. (1) unímeros de AOT em isooctano sob concentração micelar crítica (CMC); (2) AOT em concentração acima da CMC com micelas e unímeros em equilíbrio; (3) micelas reversas formadas após gotejamento de solução aquosa de maltodextrina na solução de AOT em isooctano. AOT é representado pelos círculos vermelhos de filamento azul, sendo respectivamente as porções hidrofílica e hidrofóbica da molécula. ... 25 Figura 2.2 - maltooligossacarídeo e seu éster. X pode ser grupo glicosídico ramificado (ligações a-1,6) ou radicais de doador acil esterificados. Y é o número de unidades de glicose em cadeia. ... 26 Figura 2.3 – Produção de acrilatos de maltodextrina em duas etapas enzimáticas.

Inicialmente, esterificação enzimática de glicose ou maltose por Novozyme 435 a 60 ˚ C. Em seguida, os produtos iniciais foram transglicosilados com a-ciclodextrina por CGTase de B.macerans ... 29 Figura 2.4 - O mecanismo conduzido em reações de transferência de acil catalisadas por lipases geralmente é o Pingue-Pongue Bi-Bi (Esquema I). No Esquema II, reação lateral do intermediário acil-enzima (carbânion) e o acrilato de etila (receptor da adição de Michael). ... 32 Figura 2.5 – Adição de Michael entre moléculas de ácido acrílico ... 32 Figura 2.6 – Adição de Michael entre etanol (carbânion proveniente da água protonada) e acrilatos de etila. ... 32 Figura 2.7 - Comparação estrutural dos ácidos propiônico e acrílico e exemplos de propionato de maltose (G2P) esterificada em C-6 e C-6' ... 33 Figura 3.1 - Cromatograma de HPSEC/IR da maltodextrina MOR REX®1920, cuja massa molar relativa à dextrana foi 900 Da. O pico 1, com 29% da área total dos picos está associado ao Tr de moléculas de Mw 12870 Da. O pico 2,

representou 71% da área total com Mw 1326 Da. A fase móvel utilizada foi

(18)

Figura 3.2 - Cromatograma de HPSEC/IR da maltodextrina GLOBE®1915, cuja massa molar relativa à dextrana foi 1201 Da. O pico 1, com 30% da área total dos picos está associado ao Tr de moléculas de Mw 12628 Da. O pico 2,

representou 70% da área total com Mw 1352 Da. A fase móvel utilizada foi

NaNO3 aquoso (0.01 N) a 1 mL min-1. ... 52

Figura 3.3 - Cromatograma de HPSEC/IR da maltodextrina MOR REX® 1910, cuja massa molar relativa à dextrana foi 1800 Da. Os picos 1 e 2 representam aproximadamente 50% da area para cada um deles. Os Tr

estão associados, respectivamente, a moléculas de Mw 19586 Da e 1720

Da. A fase móvel utilizada foi NaNO3 aquoso (0.01 N) a 1 mL min-1. ... 53

Figura 3.4 - Cromatograma de HPSEC/IR da maltodextrina GLOBE® 1805, cuja

massa molar relativa à dextrana foi 1800 Da. Os picos 1 e 2 representam 60% e 40% da area total. Os Tr estão associados, respectivamente, a

moléculas de Mw 24554 Da e 2494 Da. A fase móvel utilizada foi NaNO3

aquoso (0.01 N) a 1 mL min-1. ... 53 Figura 3.5 – Cromatograma de HPAEC-PED da fração precipitada da solução de MD 1920 10 g L-1 em 60:40 v/v etanol:água sob agitação magnética por 20 s. ... 56 Figura 3.6 – Fração mássica de moléculas com diferentes DP no PP da solução

60:40 v/v etanol:água após 20 s de agitação. Concentração inicial de MD 1920 de 10 g L-1. ... 58 Figura 3.7 – Fração mássica de moléculas com diferentes DP no PP da solução 60:40 v/v etanol:água após 1 min de agitação. Concentração inicial de MD 1920 de 10 g L-1. ... 59 Figura 3.8 – Fração mássica de moléculas com diferentes DP no PP da solução 60:40 v/v etanol:água após 10 min de agitação. Concentração inicial de MD 1920 de 10 g L-1. ... 59 Figura 3.9 – Fração mássica de moléculas com diferentes DP no PP da solução 60:40 v/v etanol:água após 20 s de agitação. Concentração inicial de MD 1920 de 20 g L-1. ... 60

(19)

Figura 3.10 – Curva de calibração de soluções aquosas da maltodextrina (MOR REX® 1920) analisadas por HPSEC/RI. ... 62 Figura 4.1 – Cromatograma de solução aquosa de MD1920 analisado por CLAE/IR e fase móvel H2SO4 aquoso 0.01 N. ... 76

Figura 4.2 - Cromatograma da amostra de 24 h de esterificação enzimática de ácido acrílico com maltodextrina (MD 1920) em terc-butanol analisado por CLAE/IR e fase móvel H2SO4 aquoso 0.01 N. ácido acrílico* - diacrílico ... 77

Figura 4.3 – Cromatograma da amostra de 24 h de esterificação enzimática de ácido acrílico com maltodextrina (MD 1920) em sistema 4:1 v/v de 2-metil-2-butanol: DMSO analisado por CLAE/IR e fase móvel H2SO4 aquoso 0,01N.

ácido acrílico* - diacrílico ... 77 Figura 4.4 – Perfil da área do produto por tempo da esterificação enzimática de ácido acrílico com maltodextrina (MD 1920) para os sistemas catalisados por 20 g L-1 de Novozyme 435 em respectivos sistemas de solvente orgânico. ... 78 Figura 4.5 – Perfil de área dos picos dos acrilatos de glicose (CLAE-IR) produzidos por esterificação de glicose (3 g L-1) com excesso de ácido acrílico (razão molar 1:30) incubados com 20 g L-1 de Novozyme 435 em 25 mL de 2-metil-2-butanol ... 79 Figura 4.6 - Perfil de área dos picos dos acrilatos de maltose (CLAE-IR) produzidos por esterificação de maltose (3 g L-1) com excesso de ácido acrílico (razão molar 1:30) incubados com 20 g L-1 de Novozyme 435 em 25 mL de 2-metil-2-butanol ... 80 Figura 4.7 - Perfil de área dos picos dos acrilatos de maltotriose (CLAE-IR) produzidos por esterificação de maltotriose (3 g L-1) com excesso de ácido acrílico (razão molar 1:30) incubados com 20 g L-1 de Novozyme 435 em 25 mL de 2-metil-2-butanol ... 80 Figura 4.8 - estruturas moleculares da glicose, maltose e maltotriose para exposição das hidroxilas susceptíveis à acrilação. ... 81 Figura 4.9 – Cromatograma da acrilação da glicose após 24h de reação a 200

(20)

Análise por CLAE-RI: fase móvel de H2SO4 5 mM sob fluxo de 0.6 mL min-1 e

temperatura de 50 ˚C. ... 82 Figura 4.10 - Cromatograma da acrilação da maltose após 24 h de reação a 200 rpm e 55 ˚C em 2-metil-2-butanol incubados com lipase Novozyme 435. Análise por CLAE-RI: fase móvel de H2SO4 5 mM sob fluxo de 0.6 mLmin-1

e temperatura de 50 ˚C. ... 82 Figura 4.11 - Cromatograma da acrilação da maltotriose após 24 h de reação a 200 rpm e 55 ˚C em 2-metil-2-butanol incubados com lipase Novozyme 435. Análise por CLAE-RI: fase móvel de H2SO4 5 mM sob fluxo de 0.6 mL min-1

e temperatura de 50 ˚C………. 83 Figura 4.12 – Espectro de ESI-MS em modo positivo dos acrilatos de maltose

resultante da esterificação enzimática de maltose com ácido acrílico catalisada pela lipase Novozyme 435 em terc-butanol. Modo varredura no intervalo de m/z entre 300 e 750. M2 é maltose e AA é a porção de ácido acrílico. ... 87 Figura 4.13 – Espectro de ESI-MS em modo positivo dos acrilatos de maltotriose resultante da esterificação enzimática de maltotriose com ácido acrílico catalisada pela lipase Novozyme 435 em terc-butanol. Modo varredura no intervalo de m/z entre 500 e 1060. M3 é maltotriose e AA é a porção de ácido acrílico. ... 88 Figura 4.14 – Espectro de ESI-MS em modo negativo dos acrilatos de maltotriose resultante da esterificação enzimática de maltotriose com ácido acrílico catalisada pela lipase Novozyme 435 em terc-butanol. Modo de monitoramento de íons selecionados (SIM) para ions desprotonados. Os valores de m/z para monoacrilato de maltotriose até dez hidroxilas esterificada estão resumidos na Tabela 4.2 ... 89 Figura 4.15 - A estrutura do liquido iônico [BMIM][dca] no lado esquerdo. À direita desta figura, duas fragmentações por ionização: (I) e (II). Os fragmentos de (I) são os grupos etil (i), m/z 29 e 1-etil-3-metil-imidazolium[dicianamida] (ii) m/z 176. Os fragmentos de (II) são os grupos propila (iii), m/z 43, e 1,3-metilimidazolium dicianamida (iv) m/z 162. ... 90

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Figura 4.16 – Espectro de ESI-MS- sob injeção direta da amostra de acrilação de maltotriose em liquido iônico desde a esterificação enzimática com a lipase N435. Os íons moleculares de maltotriose (∆) foram identificados como não fragmentado com m/z 503.41 (∆), bem como com fragmentos do liquid iônico [BMIMm][dca]: (i) (∆*), (ii) (∆**), (iii) (∆’) and (iv) (∆”). O íon molecular do monoacrilato de maltotriose identificado em m/z 586.65 e 734.45, quando com os fragemntos de (i) (**), and (ii) (***), respectivamente. O tempo de reação foi de 24h ... 90 Figura 5.1 – análises qualitativas de CCD de: glicose (G), maltose (G2) e maltodextrina (MD) solubilizadas em piridina; (a) e (b) foram desenvolvidas em placa de CCD de sílica gel 60. Amostras após 24h de reação entre acrilato de etila com G (I) e G2 (II) em dioxano; MD com acrilato de etila em

terc-butanol (TBA) por Lipozyme TL IM (2); as pistas 6, 7 e 8 da placa de

CCD (a) são de transesterificação enzimática de MD com acrilato de etila (1:4) em tetrahidrofurano (TetraHF) por Lipozyme TL IM (2), por lipases imobilizadas em MP1000 de C.antarctica (3) e T.lanuginosa (4). Na placa (b) experimentos controle, sem lipase, são representados pela letra (C) e de transesterificação enzimática (R) de G, G2, maltotriose (G3), maltotetraose (G4) e de maltohexaose (G6) com 75 mM de ácido acrílico (razão molar 1:2 unidade glicose anidra: ácido) em TBA incubadas por 22 g L-1 Novozyme 435. Análises em RPCCD: na placa (c), C e R para o sistema de acrilato de etila 75 mM (razão molar 1:2) com 20 mg da fração de precipitação etanólica de MD (PP 87.5%), MD, G3 e G4; na placa (d), os padrões de G, G2 e MD e as amostras de reação I e II (descrito para a placa (a)) ... 98 Figura 5.2 – Hidrólise de butirato de p-nitrofenila ... 99

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ÍNDICE DE TABELAS

Tabela 3.1 - Dados da curva de calibração logarítmica da massa molar das dextranas padrões (Y) pelo tempo de retenção (X). Y=29.658-19.303X; R2=0.99627 ... 48 Tabela 3.2 - Caracterização da dispersão de massa molar das maltodextrinas

Corn e Sigma de acordo com análises em HPSEC/RI. Todas as amostras apresentaram dois picos de tempo de retenção próximos. Pico 1 refere-se ao pico de Tr menor, o qual representa as maiores moléculas.

Consequentemente, pico 2 representa a massa molar média relativa, em Da, das cadeias mais curtas de polímeros. ... 500 Tabela 3.3 - Curvas de calibração de maltooligossacarídeos com seus

respectivos tempos de eluição. Método analítico HPAEC-PED sob fluxo 1 mL min-1. ... 54 Tabela 3.4 – Propriedades químico-físicas dos solventes orgânicos. Tf–

temperatura de fusão; Te– temperatura de ebulição; IR – índice de refração

a 20˚C ... 60 Tabela 4.1 - Valores de atividade enzimática da lipase N435 para acrilação de

n-butanol nos sistemas de tolueno, TBA, 5:95 v/v DMSO:TBA, 20:80 v/v

DMSO:TBA e ciclohexano ... 73 Tabela 4.2– Principais íons moleculares presentes na mistura de esterificação

enzimática de di-e trissacarídeo por Novozyme 435 com ácido acrílico. Os valores entre parêntesis são os íons moleculares observados nas Figuras 8 e 9. Os outros, sem os parênteses, não foram identificadas no espectro. ... 86 Tabela 5.1 - Triagem de solvente orgânico e lipases imobilizadas por

transesterificação de acrilato de etila com glicose (G1), maltose (G2) ou maltodextrina (MD). A tabela foi construída com base na relação de escala de intensidade de cor do produto revelado. A tonalidade do produto foi comparado em intensidade decrescente, indicando maior concentração do produto por (++++) até baixa intensidade (+). Sinal negativo significou nenhum produto observado (-). ... 103

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Lista de Abreviaturas / Abbreviations

2M2B – 2-metil-2-butanol ou álcool terc-amílico or 2-methyl-2-butanol

CAD – detector de aerossol carregado marca Corona ® or Charged Aerosol Detector

CCD – cromatografia de camada delgada CG – Cromatografia gasosa

CLAE – Cromatografia Líquida da Alta Eficiência DMSO- dimetilsulfóxido or dimethylsulfoxide

ESI+ - fonte de íons eletrospray positiva or positive electrospray source ion ESI- - fonte de íons eletrospray negativa or negative electrospray source ion G1 – glicose ou glucose

G1A – acrilatos de glicose or glucose acrylate G1P – propianato de glicose or glucose propionate G2 – maltose

G2A – acrilatos de maltose or maltose acrylate G2P – propionato de maltose or maltope propionate G3 – maltotriose

GC – gas chromatography

1H RMN – Ressonância Magnética Nuclear de próton H

HPAEC-PAD – Cromatografia líquida de alta eficiencia com detecção amperométrica

HPLC – High Performance Liquid Chromatography

HPSEC – Cromatografia por Exclusão Molecular de Alta Eficiência or High Performance Size-Exclusion Chromatography

IR – detecção por índice de refração MD – maltodextrina or maltodextrin

MD 1920 – maltodextrina MOR REX® 1920 (DE=20) da empresa Corn Products MS – Espectrometria de massas or Mass Spectrometry

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MSv – Molecular sieves PM – peneira molecular

pNPB - butirato de p-nitrofenila RI – refractometer index detection

TBA – álcool terc-butílico ou terc-butanol THF - tetrahidrofurano

TLC – Thin Layer Chromatography

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Capítulo 1

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INTRODUÇÃO

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1 INTRODUÇÃO

Recentemente, o interesse na produção de ésteres contendo moléculas de açúcar vem crescendo, devido à sua potencial aplicação nas indústrias de alimentos, farmacêuticas e de detergentes. Além disso, os carboidratos são a fonte renovável mais abundante na terra e, consequentemente, uma das mais promissoras cadeias da química sustentável para o desenvolvimento de compostos com alta performance, biodegradáveis e com custo reduzido.

A caracterização das estruturas versáteis de polissacarídeos disponíveis ampliará a utilização deste importante grupo de biomacromoléculas, alimentando a importante estratégia de inserção destes em estudos da química verde. Além da inclusão desses biopolímeros em ciclos biológicos, sua elevada tendência para formar arquiteturas através de estruturas supramoleculares e para atuar em sistemas biológicos, sem dúvida, conduzirá a novas aplicações. A esterificação de polissacarídeos certamente desempenhará um papel importante no desenvolvimento de novos produtos. A determinação de estrutura e, consequentemente, da propriedade do material desejado pode ser direcionado desde a escolha do polissacarídeo e do ácido para a esterificação (HEINZE et al, 2006).

Há crescente interesse em substituir materiais de origem petrolífera, os quais se decompõem após dezenas, centenas ou até milhares de anos, por materiais derivados de recursos renováveis. Particularmente, amido nativo e modificado quimicamente tem sido preparado e estudado em diversas áreas.

Muitos estudos (RIVARD et al, 1995; XU et al, 2005; DERRADJU-SERGHAT et al, 1999) sobre ésteres de amido de baixo ou médio grau de substituição têm confirmado a biodegradabilidade dos materiais.

Os ésteres de açúcares são biodegradáveis, biocompatíveis e totalmente atóxicos (TORRES e ONTERO, 2001; NAOE et al., 2001). Esses compostos podem ser sintetizados tanto por processos químicos como enzimáticos. Devido à alta regioespecificidade das enzimas, a síntese enzimática é preferencial pela

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produção de produtos mais específicos (mono-éster de açúcar), sendo assim uma via potencial para a produção direcionada.

O ácido acrílico (CH2CHCOOH) e seus ésteres são, provavelmente, um

dos mais versáteis monômeros que conferem características em polímeros. As maiores aplicações para estes ésteres estão nas indústrias de tintas, têxteis, adesivos, papéis e plásticos. Os polímeros acrílicos são considerados como não tóxicos, pois o ácido acrílico é convertido no seu éster correspondente.

A utilização de fontes renováveis para a obtenção de produtos químicos tem sido assunto de interesse, por longa data, tendo sofrido significativa aceleração no início dos anos 70, quando devido à Guerra do Golfo, o preço do petróleo subiu. A oscilação do preço do petróleo desde 1997 até 2008 registrou aumento de até 400%, quando diante da crise mundial econômica o barril alcançou US$ 140 no terceiro trimestre de 2008. Caiu para US$ 40 em 2009, seguido de aumento crescente até 2011, atingindo aproximadamente US$ 120 por barril. Este dezembro de 2014, os EUA pronunciaram escassez e o Iraque aumento de produção fazendo o preço do barril ser vendido a US$ 70 (Centro Brasileiro de Infra Estrutura – CBIE). As perspectivas de extrações cada vez mais complexas e caras têm se tornado um incentivo a mais para pesquisas de fontes renováveis e alternativas para a obtenção de produtos químicos. Estudos sobre produção de ácido acrílico a partir de fonte renovável tem se ampliado (DELEPLANQUE et al, 2010, STRAATHOF et al, 2005)

SHOGREN e BIRESAW (2007) estudaram as tensões interfacial e superficial de acetato de maltodextrina e observaram que este material pode representar uma alternativa econômica e biodegradável para alguns emulsificantes e coberturas poliméricas (coating polymers) muito utilizadas atualmente.

Assim, pode se imaginar que materiais obtidos de ésteres de maltodextrinas também podem ser biocompatíveis quando esterificados com ácido acrílico. Estes acrilatos de maltodextrinas foram obtidos com maior dificuldade que mono- e dissacarídeo (glicose, frutose, maltose e sacarose)

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biomodificados em nosso laboratório (Tsukamoto, 2008; Vagetti, 2008; Ayres, 2010; Aquino, 2011). Polímeros derivados de ácido acrílico são altamente consumidos, dadas à versatilidade de aplicações possíveis, entre elas, a elevada capacidade de absorção de água.

Acilação de carboidratos deve ocorrer em solvente onde os reagentes, no caso do açúcar e do ácido acrílico, ambos polares, sejam solúveis e que permitam atividade do biocatalisador. Solventes polares como dimetilsulfóxido, dimetilformamida e piridina são capazes de dissolver maltodextrina em grande extensão, porém enzimas são inativadas devido ao rompimento de pontes de hidrogênio da estrutura proteica. Esta investigação foi incluída entre os objetivos específicos deste trabalho, assim como diferentes formas de imobilização e fonte de lipases, razão molar de ácido acrílico ou acrilatos derivados, solubilidade do sacarídeo disponível como substrato para a enzima e meio reacional aquoso para biocatálise catalisada por ciclo glicosil transferase. Além dos parâmetros da reação, o desenvolvimento de métodos analíticos de cromatografia foi imprescindível para qualificação e estimativa da quantificação da conversão.

1.1 Objetivos 1.1.1 Objetivo geral

Obtenção de acrilatos de maltoligossacarídeos, especificamente com mais de 5 unidades de glucose em cadeia (maltodextrina) via biocatálise com ácido acrílico como doador de acila.

1.1.2 Objetivos específicos

1) Seleção de suporte de imobilização e fonte de lipase para viabilidade da acrilação dos oligossacarídeos.

2) Avaliação do meio reacional orgânico sobre a atividade e estabilidade enzimática correlacionado com máxima solubilidade dos maltoligossacarídeos.

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3) Investigar outras enzimas para biocatálise ou associação de atividades catalíticas.

4) Desenvolvimento de metodologia analítica de detecção de conversão e identificação de subprodutos interferentes.

1.2 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

AQUINO, D. Esterificação enzimática para síntese de acrilato de sacarose. Tese de Doutorado, Universidade Estadual de Campinas, 2010;

AYRES, B. Obtenção de Acrilatos de Frutose por Biocatálise. Dissertação de mestrado, Universidade Estadual de Campinas, 2010;

CIE, A., LANTZ, S., SCHLARP, R., TZAKAS, M., Chemical and biomolecular engineering senior design project. Renewable Acrylic Acid, v.12, ed.9, 2012; DELEPLANQUE, J., DUBOIS, J.L., DEVAUX, J.F., UEDA, W. Production of acrolein and acrylic acid through dehydration and oxydehydration of glycerol with mixed oxide catalysts. Catalysis Today, p.351-8, v.157, 2010 ;

DERRADJU-SERGHAT, H., BUREAU, G., COUTURIER, Y., PRUDHOMME, J. Aerobic biodegradation of acetylated starch, Starch/Stärke, p.362-8, v.51, 1999; HEINZE, T. LIEBERT, T., KOSCHELLA, A. Esterification of Polysaccharides. Ed.Springer Laboratory Manuals in Polymer Science, 2006;

NAOE, K.; OHSA, T.; KAWAGOE, M.; IMAI, M. Esterification by Rhizopus delmar lipase inorganic solvent using sugar ester reverse micelles. Biochemical England

Journal, v. 9, p. 67-72, 2001;

RIVARD, C., MOENS, L., ROBERTS, K., BRIGHAM, J., KELLEY, S. Starch esters as biodegradable plastics: effects of ester group chain length and degree of substitution on anaerobic biodegradation. Enzyme Microbial Technology. p.848-52, v.17, 1995;

SHOGREN, R., BIRESAW, G. Surface properties of water soluble maltodextrin, starch acetates and starch acetates/alkenylsuccinates. Colloids and surfaces A:

Physicochem.Eng.Aspects, p.170-176, v.298, 2007;

STRAATHOF, A.J.J., SIE, S., FRANCO, T.T., VAN DER WIELEN L.A.M. Feasibility of acrylic acid production by fermentation. Applied Microbiology and

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Biotechnology, p.727-34, v.67, 2005;

TORRES, C.; OTERO, C. PartIII: Direct enzymatic esterification of lactose acid with fatty acids. Enzyme Microbial Technology, v. 29, p.3-12, 2001;

TSUKAMOTO, J.; HAEBEL,S.; VALENÇA, G.P.; PETER, M.G.; FRANCO, T.T., Enzymatic direct synthesis of acrylic acid esters of mono- and disaccharides.

Journal of Chemical Technology and Biotechnology, v. 83, p.1486-1492, 2008;

VAGETTI, E. Obtenção de Acrilatos de Frutose por Catálise Enzimática. Dissertação de mestrado, Universidade Estadual de Campinas, 2008;

XU, Y.X., DZENIS, Y., HANNA, M.A. Water solubility, thermal characteristics and biodegradability of extruded starch acetate foams, Industrial Crops and Products, p.361-8, v. 21, 2005.

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Capítulo 2

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REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

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2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 BIOMATERIAIS DE MALTOLIGOSSACARÍDEOS E AMIDO

O uso do amido como base para formação de biopolímeros compatíveis, formados por material renovável, de baixa toxicidade, rápida biodegradação e variadas aplicações tem sido relatado na literatura. De acordo com o Web of Knowledge, 14 trabalhos foram relatados neste âmbito em 2013 (incluindo duas patentes) e 12 em 2014. Em 2011, essa busca resultou em 30 trabalhos desde 1999. Portanto, o interesse no desenvolvimento destes materiais é exponencial ultimamente. A seguir, algumas aplicações de produtos a base de amido são exemplificadas.

Nitta e Numata (2013) revisaram a aplicação de estudos sobre eficientes nanopartículas de amido como carreadoras de drogas. Nanopartículas de propil-amido aumentaram a solubilidade do polímero em solventes orgânicos menos tóxicos e resultaram em elevada eficiência de encapsulação de drogas. A liberação controlada da doxorrubicina foi eficaz quando conjugada com nanopartículas de dialdeído de amido. O Docetaxel, um agente anti-cancerígeno, foi conjugado em nanopartículas de propil-amido hidrofóbico com grau de substituição controlado por técnica de emulsificação / difusão de solvente. A internalização do princípio ativo nas células cancerosas (células NHDF-p Caco-2 e) foi reforçada sob esta forma de nanopartícula, pois foi detectada na região perinuclear.

Hidrogéis foram preparados a partir de copolimerização. Acriloil de ácido L-aspártico foi previamente sintetizado, em seguida polimerizado por enxertia com amido. O material apresentou-se superabsorbente (32 g/g) e altamente sensível a mudança de pH após 85 minutos de exposição (VAKILI AND RAHNESHIN, 2013).

Filmes plásticos de 10-40% de amido de batata e 0-30% de outros polímeros biodegradáveis (não descritos) foram produzidos pela patente do grupo Sphere este ano (BORRAZ patente ES2399135-A1, 2013). Os filmes de

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tripla camada seriam aplicados para específica proteção amortecedora de impactos no cultivo de grãos.

Blendas de amido de milho, celulose e etileno e caprolactona já foram preparadas e tratadas com plasma para utilização em reparos ósseos (ALVEZ et al., 2006). Composição semelhante foi desenvolvida para aplicações subcutâneas, a base dos mesmos ingredientes (MARQUES et al., 2005). Foi observado por estes grupos que estes implantes a base de amido não induziram reações severas, ao contrário de outros biomateriais descritos pela literatura.

Azevedo et al. (2003) estudaram a susceptibilidade destes compósitos a base dos mesmos ingredientes à degradação enzimática. Assim, foi confirmado por microscopia eletrônica e por espectrometria de infravermelho (FTIR) que estas blendas foram susceptíveis as enzimas glicoamilase e alfa amilase, mesmo que incorporadas às blendas.

Reações cruzadas entre amido, policátions e lipídeos também foram descritas com o objetivo da formação de películas úteis para encapsulação de drogas e para curativos médicos tipo compressas (SOON-SHIONG et al, 1993, patente).

Amido tem sido modificado para ampliar seu uso em aplicações industriais inovadoras. As propriedades deste polissacarídeo modificado podem ser extensivamente alteradas pela variação da natureza química do produto derivado e do grau de substituição (DS). Por exemplo, esterificação do grupo hidroxila para um DS de 1.5-3.0 implica em termoplasticidade e resistência a água, comparado a molécula de amido não modificado (BISWAS et al, 2009).

Santos et al (1997) caracterizaram estruturalmente um biovetor (carreador supramolecular de medicamentos) constituído de éster de ácido graxo de maltodextrina e fosfolipídeo.

Hidrogéis superabsorventes foram preparados por copolimerização de ácido acrílico e amido utilizando radiação gama. A absorçãoo máxima variou conforme a solução aquosa a ser absorvida. A capacidade foi de 200 g/g para

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hidrogeis em água destilada; e a capacidade foi aumentada em caso de hidrogeis neutralizados, 350 g/g. Em solução salina de NaCl, apenas 43 g/g foi absorvido (EL-MOHDY et al, 2006).

2.2 MALTODEXTRINAS

A maltodextrina é um carboidrato complexo, produzido a partir da hidrólise de amidos. É constituída por cadeias de 3 a 20 unidades de α-D-glicose unidas por ligações α-1,4 (principalmente). Pode haver ramificações à estrutura linear por ligações α-1,6. A hidrólise do amido pode ocorrer por catalise enzimática, ácida (altas temperaturas) ou associação de ambos, o que resulta em ampla distribuição de massa molar (com números médios de massas molares variando de 103 a 104 Da). O processo, suas condições e o tipo de amido usado como matéria-prima afetam a composição e a estrutura das cadeias resultantes que, por sua vez, afetam a funcionalidade do produto obtido (Takeiti, 2007).

As maltodexrinas (Figura 2.1) são classificadas de acordo com o grau de hidrólise do amido. Dextrose equivalente (DE) é uma medida que caracteriza a extensão da hidrólise do amido e também indica a média de massa molar. Esta medição é realizada empiricamente pela quantidade de açúcar redutor presente no produto e é expresso em base seca. O valor de DE reflete o poder de redução e indica sua estabilidade e funcionalidade.

As maltodextrinas tem a habilidade de formar géis e reter água. Na indústria de alimentos são usadas como umectante, modificador de textura, substituinte de gordura, agente de volume, matriz polimérica para encapsulamento de princípios ativos ou na formação de filmes e recobrimentos. Estas três últimas aplicações são também empregadas nas indústrias farmacêutica e cosmética.

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Figure 2.1 - Molécula de maltodextrina, 4<y<21 e x ≥ 0 no caso de haver ligação α-1-6 entre as unidades de glicose, o que cara cteriza amilopectina

Como consequência, materiais obtidos de ésteres de maltodextrinas também podem ser biocompatíveis quando esterificados com ácido acrílico. Assim, estes ésteres, acrilatos de maltodextrinas, foram obtidos, com maior dificuldade que mono- e dissacarídeo (glicose, fructose, maltose e sacarose) estudados em nosso laboratório (Tsukamoto, 2008; Vagetti, 2008; Ayres, 2010; Aquino, 2011). Polímeros derivados de ácido acrílico são altamente consumidos pela elevada capacidade de absorção de água, entre outras aplicações possíveis e versáteis.

A biodegradabilidade e impacto ambiental sobre a agricultura dos considerados recursos renováveis foram objeto da revisão crítica redigida pelos autores Yates e Barlow (2013). Biopolímeros baseados em amido, ácido lático e hidroxialcanoatos tem sido investigados intensamente em laboratório e apresentado alta degradabilidade, mas ainda está nos primórdios de se tornarem mais compensatórios, no quesito de rendimento e eficiência que biomateriais oriundos de matéria-prima fóssil.

2.2.1 DISTRIBUIÇÃO DA MASSA MOLAR DAS MALTODEXTRINAS

A distribuição de massa molar das moléculas de maltodextrina comercial dificulta a metodologia analítica da acrilação, pois em uma amostra industrial (Corn Products) ou padrão Sigma foram identificadas cadeias entre 1 a 100 unidades de glicose. Isso dificulta a análise dos oligossacarídeos por

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metodologia pouco custosa e ainda mais, para a mistura reacional contendo também moléculas esterificadas. O fracionamento da maltodextrina por precipitação com etanol foi uma estratégia para reduzir o intervalo de grau de polimerização (DP) disponível, afim de excluir moléculas de baixo e alto DP - glicose (DP1), maltose (DP2) e DP maior que 20.

Defloor et al. (1998) estudaram a influência de concentrações iniciais de maltodextrina MD6 (DE médio 6) da marca Avebe (10 g L-1; 100 g L-1 e 200 g L-1) e escalonamento (0.1 L ou 1.5 L) sobre a eficiência do fracionamento da maltodextrina comercial por etanol a temperatura ambiente. Após a adição de etanol, a mistura foi agitada por 10 minutos e decantada por 12 h. Eles observaram que quanto maior a concentração inicial de MD6, menor o DP médio da fração precipitada (PP) obtida. Por exemplo, o PP com 50 % de etanol da solução de concentração inicial 100 g L-1 MD apresentou DP médio de 115, enquanto o DP médio da solução de concentração inicial 200 g L-1 foi 73. O experimento em maior escala foi reproduzido para 200 g L-1 e o DP médio foi 66. Eles observaram reprodutibilidade com aumento de escala. A solução de concentração inicial 200 g L-1 era heterogênea após adição da MD6 e necessitou centrifugação antes da adição de etanol. Este procedimento pode ter influenciado neste menor DP médio resultante em relação ao obtido com solução inicial de MD6 de 100 g L-1 , a qual não necessitou centrifugação inicial, pois as moléculas maiores foram precipitadas nesta etapa.

O DP das moléculas determina as propriedades física e biológica, como higroscopicidade (capacidade de absorver água da atmosfera), viscosidade, doçura, estabilidade, gelificação e osmolalidade da mistura final.

Em termos de higroscopicidade, maltooligossacarídeos com DP > 9 e DP ≤ 2 são os menos higroscópicos e DP3 > DP4 = DP7 > DP5 > DP6 > DP11 > DP2 (JOHNSON e SRISUTHEP, 1975). Em geral, a viscosidade é maior quanto maior o DP, sendo que o aumento da viscosidade de moléculas com até DP7 é linear de acordo com a concentração (m/v). A viscosidade específica de DP8 a DP10 aumenta curvilinearmente (côncava) com aumento da concentração. Quanto à doçura, maltodextrina não é doce, apesar de moléculas com até DP6

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apresentarem algum nível de doçura. Esta decresce com o aumento da cadeia, com exceção da maltotetraose que é a mais doce entre os maltoligossacarídeos. Cadeias maiores ou iguais a DP7 apresentam pouca ou nenhuma doçura. Maltodextrinas são comercializadas em pó ou grânulos devido a sua elevada estabilidade para estocagem, porém quando é necessário solução aquosa com concentração acima de 50% m/m, devem ser armazenadas a 4˚C. Há evidências que moléculas acima de DP8 precipitam após poucos dias (não quantificado por indisponibilidade comercial), enquanto acima de DP11 precipitam após algumas horas (também não quantificado). (KENNEDY et al,1987; GIDLEY e BULPIN, 1987).

A metodologia para análise quantitativa destes maltooligossacarídeos foi estudada por Moreno et al (1999) e Rybak-Chmielewska et al (2006). Comparando cromatografia de camada delgada (CCD) e cromatografia líquida de alta eficiência com dois diferentes detectores, tais como índice de refração (CLAE-IR) e eletroquímico pulsado (HPAEC-PED). Foi observada reprodutibilidade para todos os métodos: desvios padrões de 0.9 a 5.5% para HPAEC-PED, 2.7 a 12.2% para CLAE-IR e 2.9 a 8.4% para CCD. As maiores diferenças foram encontradas com moléculas de DP entre 8 e 11. Assim, uma curva de calibração utilizada para quantificação de maltoheptaose (DP7) foi utilizada também para quantificar estas cadeias maiores através do método considerado mais sensível, HPAEC-PED. O mesmo procedimento foi tomado neste trabalho, com construção de curva de calibração para os padrões de DP até 7 conforme disponibilização de produtos da empresa Sigma-Aldrich.

2.3 ACRILATOS E ÁCIDO ACRÍLICO

2.3.1 USOS E APLICAÇÕES DO ÁCIDO ACRÍLICO

A produção mundial de compostos associados ao ácido acrílico é mais de três milhões de toneladas ao ano. A editora Acmite Market Intelligence lançou ao final de 2012, um relatório global sobre o mercado de resinas acrílicas. Sua respectiva demanda global em 2011 foi subestimada em relação ao valor que

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alcançou, US$ 14.5 bilhões. O mercado alcançou US$ 16.6 bilhões em 2014 e aproximará a casa dos US$ 22 bilhões pela previsão de 2020, seguindo o crescimento anual de 4-5% que tem percorrido.

As características químicas ímpares e propriedades estéticas dessas resinas agregam valor a inúmeros materiais em que são aplicadas. As principais aplicações comerciais são em tintas, revestimentos, adesivos, selantes, construção, arquitetura e a maior demanda é para o setor automotivo e equipamentos médicos. Ele é utilizado como matéria-prima na produção de ésteres acrílicos e como monômeros para ácidos e sais poliacrílicos.

O polímero acrilato mais simples é o poliácido acrílico, que absorve grandes quantidades de água (várias vezes seu próprio peso) sendo usado como matéria prima na fabricação de absorventes. Os polióis acrílicos são bastante usados em vernizes poliuretânicos para acabamento automotivo, por exemplo, caracterizados por ter resistência química e durabilidade, sendo anualmente consumidas cerca de 3.000 toneladas destes polióis na América Latina. O consumo mundial em 2014 foi de 190.000 toneladas destes polióis.

Os polióis acrílicos são obtidos pela copolimerização de monômeros acrílicos convencionais, como acrilatos de etila (EA), ou butila (BA), ácido acrílico (AA), metacrilato de metila (MMA), ou estireno (ST), com monômeros acrílicos hidroxilados como os acrilatos de 2-hidroxietila (HEA) ou 4-hidroxibutila (HBA). O poliacrilato de metila é um látex branco à temperatura ambiente e é utilizado na fabricação de elastômeros e adesivos, enquanto que o polimetacrilato de metila é um plástico duro, resistente e transparente, conhecido comercialmente como vidro acrílico ou plexiglass. Numerosas são suas aplicações como no recobrimento de superfícies, têxtil, adesivos, tratamento de papel, polimentos, couro, fibras, detergentes e materiais superabsorventes (BROCKINTON et al., 1986 e ALBAR, 1999). Atualmente, 100% do ácido acrílico é produzido via oxidação de propileno (DANNER et al., 1998).

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2.3.2 SUBSTRATO ÁCIDO PARA BIOCATÁLISE

Ácidos com diferentes valores de pKa, inclusive o ácido acrílico (pKa 4.26), foram estudados na esterificação de 1-octanol, em sistema ausente de solvente orgânico por Hollmann et al (2009). Eles observaram dependência do pKa próximo a 4.8 para atividade de esterificação pela lipase N435 e concluíram que a baixíssima atividade de esterificação determinadas pelas reações com estes ácidos (pKa menor que 4.8) ocorre devido a protonação da porção aspartato ou glutamato do sítio ativo desta lipase. Esta protonação do aminoácido Asp187 impede a efetivação de sua função na tríade catalítica da N435: ativar Ser105 (via His224) para um ataque nucleofílico sobre o doador de acila, assim inativando a lipase.

Nordblad e Adlercreutz (2008) evidenciaram que a esterificação direta do

ácido acrílico é bastante lenta e inibida pelo substrato ácido. Foi observado que a reação enzimática catalisada pela enzima N435 entre o álcool 1-octanol era uma ordem de magnitude mais rápida quando o doador ácido era substituído pelo acrilato de etila. Assim, eles encontraram que a atividade de água (Aw) ideal

para esta reação era 0.75, mas para esterificação de ácido propiônico e 1-octanol o valor ideal de Aw encontrado foi 0.45 e para a transesterificação

envolvendo acrilato de etila foi mais rápida com Aw 0.3.

Hagström et al. (2009) do mesmo grupo citado acima, observaram que N435 poderia agir ainda mais eficientemente na reação de transacrilação de um poliéster com grupo funcional OH quando imobilizada em um suporte diferente daquele empregado pela multinacional Novozymes. Assim a mesma enzima comercial na forma livre foi obtida da empresa Novozymes e imobilizada no material denominado Accurel MP1000. Foi observada maior velocidade reacional quando todo o sistema reacional foi pressurizado a 15 kPa e submetido a fluxo constante de acrilato de etila e destilação contínua para evaporação do etanol (produto da reação). Esta enzima imobilizada em Accurel revelou ser muito estável, indicando que o rendimento do produto obtido acrilato de poliéster mássico variou entre 3600 a 6200 vezes a massa da enzima

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necessária evidenciando o potencial da enzima e o impacto marginal do custo da mesma no processo.

2.3.3 ACRILATOS DE CARBOIDRATOS

Novos bioprodutos estão sendo desenvolvidos associando carboidratos em sua formulação. Esta é uma vantagem adicional de constituição de material de origem renovável.

Ésteres do tipo acrilatos de carboidratos não se encontram ainda disponíveis no mercado. Entretanto, os polímeros dos mesmos estão descritos na literatura (BOECKH et al, 2005, patente Basf) como altamente valiosos devido à propriedade de absorver elevada quantidade de água em relação ao seu peso, formando hidrogéis. Estes teriam inúmeras aplicações como absorventes na indústria cosmética, médica, cirúrgica (implantes orais e outros). De acordo com a diferença de higroscopicidade entre maltodextrinas de diferentes DP, o hidrogel resultante apresentará propriedades diferenciadas de absorção de água.

Monoacriloil of 1-O-acriloil-D-frutose e 3-O-acriloil-D-glicose foram sintetizados via catálise ácida com grupos protetores nas hidroxilas para obtenção de esterificação seletiva. O polímero destes monômeros foram aplicados em tecnologia cerâmica de eletrônicos, combinando a química dos acrilatos com produção de cerâmica de formato convencional (WIECINSKA et al, 2014).

Em nosso laboratório, duas teses de doutorado (Denise Aquino, 2011; Junko Tsukamoto, 2006) e duas dissertação de mestrado (Érica Vagetti, 2008; Bianca Ayres, 2010) estudaram a acrilação de carboidratos (frutose e sacarose). A solubilidade de glicose e frutose em TBA a 55 ºC após 24 h foram 3 g L-1 e 18

g L-1, respectivamente. Assim o desenvolvimento e otimização dos parâmetros da reação de acrilação de frutose foram realizados: carga de lipase (20 g L-1), razão molar com excesso de ácido acrílico (1:3), conteúdo de água inicial (0.07

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% m/m), presença de peneira molecular (80 g L-1) e purificação dos acrilatos para futura polimerização. A conversão de frutose inicial após 24h foi de 79 % sob estas condições. As solubilidades em TBA da maltose e da sacarose a 55 ºC foram 4 g L-1 e 0.3 g L-1. O estudo do processo de acrilação da sacarose foi desenvolvido, porém a conversão máxima de concentração de sacarose inicial foi 20 %. Para melhor entendimento da acrilação de sacarose, um modelo cinético foi desenvolvido com o auxílio do software Polimath por Denise Aquino (2011).

2.4 REAÇÕES CATALISADAS PELAS LIPASES

A função biológica das lipases é a catálise de hidrólises de ésteres, especialmente os triacilglicerideos de cadeia longa, para produzir ácidos graxos, di– e mono-acilglicerol, e glicerol. As lipases são capazes de catalisar a reação reversa, realizando a esterificação, transesterificação (acidólise, interestificação, alcoólise), aminólises, oximólises e tiotransesterificação em solventes orgânicos anidros, sistemas bifásicos e em solução micelar com especificidade quiral (VILLENEUVE et al., 2000). As razões desse enorme potencial biotecnológico das lipases incluem fatos relacionados com:

i) alta estabilidade em solventes orgânicos; ii) não requerem a presença de co-fatores;

iii) possuem uma larga especificidade pelo substrato e,

iv) exibem uma alta enantiosseletividade (TORRES & OTERO, 2001; OLIVEIRA et al., 2000).

Embora sua função seja a de quebrar as ligações de éster de triacilgliceróis com o consumo de moléculas de água (hidrólise), as lipases são também capazes de catalisar a reação reversa sob condições micro aquosas, como por exemplo, a formação de ésteres a partir de álcoois e ácidos carboxílicos. Estes dois processos básicos podem ser combinados numa seqüência lógica para efetuar reações de interesterificação (acidólise, alcoólise e

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transesterificação), dependendo dos reagentes empregados (OLIVEIRA et al., 2000).

Ésteres podem ser preparados por catálise química, mas em alguns casos específicos da indústria, a obtenção enzimática é de maior interesse comercial. Por exemplo, fragrâncias e aromatizantes utilizados na indústria alimentícia podem ser rotulados como natural, se o éster não é oriundo de catálise química.

As lipases podem ser inseridas no meio reacional na forma livre ou imobilizada. As técnicas de imobilização visam evitar sofisticada etapa de separação da enzima do meio reacional e aumento da atividade enzimática, pois reduz efeitos sobre a estrutura conformacional da proteína.

Para efetiva imobilização da enzima neste processo estudado, o preparo deve ser cuidadoso quanto a etapas que não inativem a enzima durante imobilizaçãoo, nenhum desprendimento de enzima deve ocorrer do suporte após imobilização, a lipase deve estar completamente ativa na condição imobilizada e as limitações de transferência de massa devem ser desprezíveis (ADLERCREUTZ, 2013).

2.4.1 ESTERIFICAÇÃO ENZIMÁTICA DE AÇÚCARES

Uma importante aplicação das lipases é na síntese de ésteres de carboidratos. Estes produtos são de difícil obtenção por esterificação química, que ocorre a altas temperaturas, podendo ocasionar degradação do açúcar e formação indesejável de cor no produto final. Assim, embora a síntese de ésteres possa ser realizada via catálise ácida ou básica, o uso das enzimas oferece certas vantagens como: condições reacionais mais brandas, diminuição no número de reações paralelas e especificidade (LORTIE, 1997).

Os ésteres de carboidratos e de ácidos graxos podem ser utilizados como tensoativos nas indústrias de: alimentos, cosméticos e farmacêuticos. Diversos estudos descrevem os resultados da formação de ésteres de açúcares com ácidos graxos, entretanto no Brasil, outro grupo que também investiga este tema

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é o coordenado pela prof. H.F. Castro, da USP de Lorena (RUFINO et al, 2010; PAULA et al, 2007 e 2005). O efeito de solventes, hidrofobicidade, teor de água, entre outras variáveis tem sido extensivamente estudada por diversos grupos internacionais, na área de ésteres de carboidratos (NORDBLAD E

ADLERCREUTZ , 2008; KHALED et al., 1991; SCHLOTTERBECK et al., 1993;

GBEKELOLUWA et al., 1993; POLAT et al., 2001; SOULTANI et al., 2001; FLORES et al., 2002; FERRER et al., 2005; SABEDER et al., 2006).

De todos os trabalhos analisados da literatura não foi verificado nenhum processo de síntese direta de ésteres de ácido acrílico com carboidratos utilizando a lipase em meio orgânico. Apenas reações de esterificação indireta, utilizando vinil acrilato ou etil acrilato.

Nosso grupo de trabalho, do Laboratório de Engenharia Bioquímica da FEQ, sugere o uso de quantidade apropriada de peneira molecular para deslocamento do equilíbrio da reação para síntese exclusiva de monoéster, também sugere que o ácido acrílico torna a reação de síntese mais direta, evitando-se etapas de remoção de subprodutos e inserção inicial de carboidratos em concentração superior a solúvel. A purificação dos monoacrilatos de frutose foi sugerida por Ayres (2010) por cromatografia em coluna de sílica.

Monoésteres 6-capronato de maltotriose e de maltotetraose foram obtidos por Degn et al. (2000) em duas etapas. A primeira etapa consistiu na esterificação enzimática (Novozyme 435) de maltose com ácido caprílico em

terc-butanol para produção do 6-capronato de maltose. Em seguida, o éster

formado foi o substrato aceptor para aumento do grau de polimerização da molécula através da atividade da CGTase (Ciclodextrina glicosiltransferase) com amido ou ß-ciclodextrina como grupo doador. CGTases transferem grupos glicosil inter ou intramolecularmente, assim como hidrolisam ligações α-1-4, portanto apesar da presença de cadeias grandes de glicose (amido), estas foram hidrolisadas conforme uma das funções desta enzima e também, no

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sistema, ocorreu transferência de grupos que aumentaram o capronato de maltose em mais uma ou duas moléculas de glicose.

2.4.2 SOLUBILIDADE DOS MALTOLIGOSSACARÍDEOS NOS SOLVENTES ORGÂNICOS

Não há estudos sobre esterificação de maltodextrina com ácido acrílico na literatura. Para estudo desta reação, a maior concentração de maltodextrina solúvel em solventes que permitem atividade enzimática foi investigada. O efeito da temperatura sobre a solubilidade é diretamente proporcional à concentração de composto solúvel. A concentração máxima solúvel em determinado solvente orgânico é denominada concentração de saturação (para determinada temperatura). Embora carboidratos sejam altamente solúveis em água, a esterificação é somente favorecida em sistema micro aquoso, pois água é um subproduto desta reação reversível. A presença de água no sistema hidrolisa parcialmente o éster ocasionando a redução do rendimento do processo (PEREZ-VICTORIA et al, 2011; HORCHANI et al, 2010; POPESCU, 2010, FLORES et al, 2002).

Há muitos dados de solubilidade de açúcares em solventes não aquosos na literatura, porém muitos não se confirmam entre si, mesmo sob mesma temperatura. Além disso, a faixa de temperatura abrangida é estreita (MACEDO, 2005).

Os coeficientes de partição octanol-água (log P) dos solventes orgânicos caracterizam propriedades dos mesmos em relação à lipídeos e lipases. Em geral, log P fornece uma medição da natureza hidrofílica vs lipofílica de um composto. P descreve a distribuição de um composto em sistema bifásico e é definido como a velocidade de equilíbrio do composto da fase rica em octanol para a fase rica em água (onde água e 1-octanol estão em equilíbrio). Os valores de log P tende a ser maior para compostos com estruturas apolares maiores; e tende a ser menor ou negativo para compostos com grupos altamente polares (DAMSTRUP et al, 2005).

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