FRANKLIN JÚNIOR MOREIRA DA SILVA
EFEITO DO PROCESSAMENTO À ALTA PRESSÃO ISOSTÁTICA NAS CARACTERÍSTICAS DE QUEIJO MINAS FRESCAL
CAMPINAS 2015
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS Departamento de Tecnologia de Alimentos
FRANKLIN JÚNIOR MOREIRA DA SILVA
EFEITO DO PROCESSAMENTO À ALTA PRESSÃO ISOSTÁTICA NAS CARACTERÍSTICAS DE QUEIJO MINAS FRESCAL
Dissertação apresentada à Faculdade de Engenharia de Alimentos/
Departamento de Tecnologia de
Alimentos da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestre em Tecnologia de Alimentos
Orientador: Prof Dr. Marcelo Cristianini
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELO ALUNO
FRANKLIN JÚNIOR MOREIA DA SILVA, E
ORIENTADO PELO PROF° DR. MARCELO CRISTIANINI
CAMPINAS 2015
Comissão Examinadora:
Prof° Dr. Marcelo Cristianini - UNICAMP
Prof° Dr. Maurilio Lopes Martins - IF SUDESTE MG
Profª Dra. Dirce Yorika Kabuki- UNICAMP
Profª Dra. Patrícia Blumer Zacarchenco- ITAL
Prof° Dr. Salvador Massaguer Roig
A Ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho a minha mãe Ana Maria Patrício Moreira, irmã Flávia Aparecida Moreira, meu pai Amarildo Carvalho da Silva, minha avó Malvina, demais amigos e
AGRADECIMENTOS
Gostaria de agradecer a todos que me ajudaram a chegar até aqui. Foram muitas pessoas que contribuíram direta e indiretamente para a execução deste trabalho, porém, não posso deixar de referenciar alguns nomes:
Joaquim Mario Neiva Lamas Maurílio Lopes Martins Marcelo Cristianini
Eliane Maurício Furtado Martins Bruno Ricardo Castro Leite Júnior
A equipe do laboratório de tecnologias emergentes (LABTEM) Minha mãe Ana Maria Patrício Moreira.
RESUMO
EFEITO DO PROCESSAMENTO À ALTA PRESSÃO ISOSTÁTICA NAS CARACTERÍSTICA DE QUEIJO MINAS FRESCAL
O queijo Minas frescal está entre os produtos lácteos mais consumidos no Brasil. Porém, sendo um queijo fresco, este produto apresenta características intrínsecas muito favoráveis para o desenvolvimento de microrganismos. A tecnologia de alta pressão isostática vem sendo apresentada como um método promissor para a eliminação de microrganismos, causando danos mínimos aos produtos e preservando suas características nutricionais. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito de alta pressão isostática na inativação de Listeria innocua, Escherichia coli e
Lactobacillus plantarum inoculados em queijo Minas Frescal bem como estudar sua
vida de prateleira. Os resultados demonstraram que o aumento da pressão e tempo apresentam efeito significativo na inativação de L. innocua e E. coli. Com relação a
Listeria, pressões acima de 550 MPa/5 min/25°C foram suficientes para inativar mais
de 5 ciclos logarítmicos, enquanto para E. coli foi necessário a aplicação de pressões acima de 600 MPa/5 min/25°C para alcançar o mesmo número de reduções. Dentre os três microrganismos estudados, L. plantarum foi o que apresentou maior resistência ao tratamento de pressão. Os queijos submetidos ao tratamento de alta pressão (620 MPa/5 min/25°C) se mantiveram microbiologicamente estáveis durante 45 dias de armazenamento a 4°C. O queijo adicionado de L. plantarum apresentou textura mais granulosa e maior ressecamento superficial durante a dessoragem. O tratamento de pressão influenciou os parâmetros de cor e textura do queijo fazendo com que este apresentasse uma coloração amarelada e maior dureza, com uma massa compacta. De modo geral, os resultados obtidos neste estudo foram otimistas quanto ao uso de alta pressão para inativar microrganismos patogênicos e deterioradores naturalmente presentes em queijo Minas Frescal, permitindo o aumento de vida de prateleira e garantindo segurança do alimento. Estudos futuros devem ser realizados para verificar também os impactos sensoriais desta nova tecnologia no produto e sua aceitação pelos consumidores.
ABSTRACT
EFFECT OF HIGH ISOSTATIC PRESSURE PROCESSING ON FRESH CHEESE
Minas frescal cheese is among the dairy products most consumed in Brazil. However, being a fresh cheese, this product shows very favorable intrinsic characteristics to the growth of microorganisms. High isostatic pressure technology has been presented as a promising method to eliminate microorganisms, causing minimal damage to products and preserving their nutritional characteristics. The aim of this study was to evaluate the effect of high isostatic pressure on Listeria innocua,
Escherichia coli and Lactobacillus plantarum inoculated in Minas frescal cheese and
evaluate studying its shelf life. The results demonstrated that the increase of pressure and time present a significant effect on inactivation of L. innocua and E.
coli ATCC. Regarding the Listeria, pressures above 550 MPa/5 min/25°C are
sufficient to inactivate more than 5 logarithmic cilcos, while for E. coli pressures above 600 MPa/5 min/25° is necessary to achieve the same number of log reductions. Among the three microorganisms studied, L. plantarum showed the greatest resistance to the treatment pressure. The cheeses subjected to high pressure treatment (620 MPa/5 min/25°C) was microbiologically stable over 45 days of storage at 4°C. Cheese added of L. plantarum showed a more granular texture and greater surface dryness during the syneresis time. The pressure treatment parameters influenced the color and texture of the cheese, causing it to present a yellowish color and greater hardness with a compact mass. In general, the results obtained in this study were optimistic about the use of high pressure to inactivate Gram positive and Gram negative microorganisms increasing its shelf life and food safety. Future studies should be conducted to also check the sensory impacts of this new technology on the product.
ILUSTRAÇÕES
Figura 1 Fluxograma de fabricação de queijo Minas frescal com L.
plantarum... 33
Figura 2 Efeito de alta pressão isostática sobre Listeria innocua ATCC 33090 inoculada em queijo Minas frescal armazenado a 4°C por 1 dia... 44 Figura 3 Efeito de alta pressão isostática sobre E. coli ATCC
11229 inoculada em queijo Minas frescal armazenado a 4°C por 1 dia... 47 Figura 4 Efeito de alta pressão isostática sobre L. plantarum
inoculado em queijo Minas frescal armazenado a 4°C por 1 dia... 49 Figura 5 Contagem microbiana ao longo do armazenamento a
4°C do queijo Minas frescal inoculado com L. plantarum. 52 Figura 6 Contagens microbianas ao longo do armazenamento a
4°C do queijo Minas frescal sem a adição de L.
plantarum (Queijo Controle)... 55
Figura 7 Diferença total de cor (ΔE*), ao longo do tempo, para os tratamentos QLp, QP e QLpP comparados com o queijo Controle (QC)... 64
TABELAS
Tabela 1 Tempos de subida de pressão para diferentes processos de pressão, tempo e temperatura... 35 Tabela 2 Inativação dos diferentes microrganismos inoculados no
queijo Minas frescal armazenadoa 4°C e submetido a diferentes pressões e tempos a 25°C... 50 Tabela 3 Valores de pH de queijo Minas frescal durante a vida de
prateleira a 4°C... 56 Tabela 4 Valores de acidez (% ác. lático) de queijo Minas frescal
durante a vida de prateleira a 4°C... 58 Tabela 5 Valores de atividade de água (Aa) de queijo Minas frescal
durante a vida de prateleira a 4°C... 59 Tabela 6 Valores de umidade (%) de queijo Minas frescal durante
vida de prateleira 4°C... 60 Tabela 7 Comparação dos valores L* em cada tempo para os
tratamentos aplicados no queijo Minas frescal... 61 Tabela 8 Comparação dos valores a* em cada tempo para os
tratamentos aplicados no queijo Minas frescal... 61 Tabela 9 Comparação dos valores b* em cada tempo para os
tratamentos aplicados no queijo Minas frescal... 62 Tabela 10 Comparação das medidas de textura em cada tempo para
os diferentes tratamentos aplicados no queijo Minas frescal... 66 Tabela 11 Comparação das medidas de textura ao longo do tempo
para os diferentes tratamentos aplicados no queijo Minas frescal... 68
ABREVIATURAS E SIGLAS
Aa Atividade de Água
ABIQ Associação Brasileira das Indústrias de Queijo ABNT Associação Brasileira de Normas Técnicas ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária AOAC Association of Official Analitical Chemists
APHA American Public Health Association
API Alta Pressão Isostática
AU/mL Unidade Arbitrária por Mililitro
BAL Bactérias Láticas
BDA Agar Batata Dextrose
BHI Caldo Infusão de Cérebro e Coração FLev Fungos Filamentosos e Leveduras
QC Controle, Queijo sem Lactobacillus plantarum
E. coli Escherichia coli
Ec Escherichia coli
GRAS Generally Recognized as Safe
HPP High Pressure Processing
L. innocua Listeria innocua
L. monocytogenes Listeria monocytogenes
L. plantarum Lactobacillus plantarum
Lis Listeria
MPa Mega Pascal
MRS Agar Man Rogosa Sharpe
NMP/g Número mais provável por grama
pH Potencial Hidrogenionico
QLp Queijo com L. plantarum
QLpP Queijo com L. plantarum + pressão
QP Queijo sem Lactobacillus plantarum + pressão
S. aureus Staphylococcus aureus
t Tonelada
TPA Análise do Perfil de Textura
TSB-YE Caldo Triptona de Soja Adicionado de Extrato de Levedura
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO... 15
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA... 16
2.1 Mercado de Queijos... 16
2.2 Queijo Minas Frescal... 17
2.3 Bactérias Láticas ... 20
2.3.1 Lactobacillus plantarum... 21
2.4 Ocorrência de Listeria sp. e E. coli em Queijo Minas Frescal... 22
2.5 Processamento por Alta Pressão Isostática... 25
2.6 Aplicação de Alta Pressão Isostática em Queijos: Efeitos nas Características Físico-Químicas... 26
2.7 Aplicação de Alta Pressão Isostática em Queijos: Efeito sobre Listeria sp. e E. coli... 28
2.8 Aplicação de Bacteriocinas em Queijos: Efeito sobre Listeria sp. e E. coli... 29
2.9 Efeito Combinado de Alta Pressão e Bacteriocinas sobre Listeria sp. e E. coli... 30
3. MATERIAL E MÉTODOS... 33
3.1 Fabricação do Queijo Minas Frescal... 33
3.2 Equipamento e Tratamentos de Pressão, Tempo e Temperatura... 34
3.3 Amostragem, Inoculação e Armazenamento... 36
3.3.1 Amostragem e Embalagem... 37
3.3.2 Preparação dos Inóculos... 37
3.3.3 Inoculação de L. innocua ATCC 33090 e E. coli ATCC 11229... 38
3.3.4 Armazenamento... 38
3.4 Avaliação da Qualidade Microbiológica de Queijo Minas Fescal... 38
3.4.1 Análise de L. innocua ATCC 33090... 39
3.4.2 Análise de E. coli ATCC 11229... 39
3.4.3 Análise de Fungos Filamentosos e Leveduras... 39
3.4.4 Análise de L. plantarum... 40
3.5 Avaliação das Características Físico-Químicas de Queijo Minas Frescal. 40 3.5.1 Análise de pH... 40
3.5.2 Análise de acidez... 41
3.5.3 Análise de Aa e Umidade... 41
3.5.4 Análise de Cor Instrumental... 41
3.5.5 Análise de Textura... 42
3.6 Análise Estatística... 43
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO... 44
4.1 Efeito da API sobre Listeria innocua e Escherichia coli inoculadas em queijo Minas Frescal Contendo L. plantarum... 44
4.2 Estudo da Vida de Prateleira de Queijo Minas Frescal... 52
4.2.1 Efeito combinado do tratamento por API e L. plantarum nas contagens microbianas... 52
4.2.2 Resultados físico-químicos... 56
5. CONCLUSÃO... 69
15 1. INTRODUÇÃO GERAL
Dentre os produtos lácteos consumidos no país, o queijo Minas frescal está entre os cinco primeiros, sendo adquirido por todas as camadas da população. A meta estabelecida pelo Ministério da saúde é que em nosso país o consumo atinja 200 litros/ habitante/ ano em equivalente leite nos próximos anos (ABIQ, 2013).
A produção de queijos no país possui importância social e econômica ao empregar dezenas de famílias. Entretanto, a mesma não se limita às famílias, existindo, atualmente, dezenas de laticínios e queijarias que comercializam seus produtos para vários estados e países.
O teor elevado de umidade, a presença de microrganismos e/ou suas enzimas proteolíticas e lipolíticas aliados à contaminação inicial da matéria prima, erros durante as etapas do processo de fabricação, acidificação ocasionado pela presença de bactérias láticas, desenvolvimento de sabor amargo devido à proteólise enzimática, são alguns dos principais problemas que acomete o queijo Minas frescal. Além disso, a proteólise causa modificação na coloração e textura do queijo, e o sal adicionado favorece a formação de casca amarelada na superfície.
Atualmente, as pesquisas realizadas mundialmente em relação à aplicação de Alta Pressão Isostática (API) em queijos tem focado, principalmente, no estudo da conservação e extensão de maturação. Tais estudos têm mostrado resultados promissores em relação ao uso da API para a extensão da vida de prateleira tanto de queijos de longa maturação como de queijos frescos. No Brasil, ainda não existe relatos da aplicação desta tecnologia para extensão da vida de prateleira de queijos, sendo este trabalho pioneiro no país.
Aliado à necessidade de ingestão de produtos lácteos, os consumidores estão mudando os seus hábitos alimentares, buscando cada vez mais alimentos naturais, sem conservantes, mais saborosos e saudáveis.
Diante destas exigências, o processamento por API exibe-se como um método muito eficaz. Sua utilização proporciona a morte microbiana sem o uso de aditivos e, por ser um tratamento não térmico, preserva as características sensoriais dos alimentos. Devido a esses e outros benefícios, tal como a
16 preservação de nutrientes e vitaminas, bem como o tratamento homogenio sobre alimentos de diferentes formatos e estruturas (alimentos sólidos, líquidos), fizeram com que o uso industrial de API aumentasse de 1 equipamento em 1990 para 130 em 2009 (PURROY, 2009). Atualmente, esta tecnologia é utilizada em várias partes do mundo para produzir alimentos, tais como: guacamole, arroz, suco de frutas, ostras, presunto fatiado, produtos de sobremesa, entre outros.
Dessa forma, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito de alta pressão isostática sobre Listeria innocua, Escherichia coli e Lactobacillus plantarum inoculados em queijo Minas frescal.
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Mercado de Queijos
O Brasil é o terceiro maior produtor mundial de queijos, estando atrás da União Europeia (considerando os 27 países membros) e dos Estados Unidos (LIMA FILHO; POMBO, 2010). O estado de Minas Gerais é o maior produtor brasileiro de queijos respondendo pela metade do consumo nacional. A maior parte desta produção é feita em pequenas e médias queijarias. Em algumas regiões do estado, o setor queijeiro empregava em 2002 cerca de 30 mil famílias de pequenos proprietários rurais e movimenta, mensalmente, algo em torno de 10 milhões de reais. Estes dados ilustram a importância social e econômica do produto (PERRY, 2004 apud CERRI; DE SOUZA, 2002).
Em 2001, a produção leiteira no Brasil chegou a cerca de 20 milhões de litros, sendo 60% deste total destinado à fabricação de queijos, a qual, no ano de 2001, atingiu uma produção de 450 mil toneladas (CICHOSCKI, et al., 2002). No ano de 2009, segundo a Associação Brasileira das Indústrias de Queijo (ABIQ), foram produzidas, aproximadamente, 700 mil toneladas no país (LIMA FILHO; POMBO, 2010).
Em 2004 existia no Brasil cerca de 72 tipos de queijos, dentre os quais o queijo Minas frescal foi terceiro mais consumido, representando 9% da produção nacional, perdendo apenas para o queijo mussarela, 33% e para o
17 Prato, 24% (MARCHIORI, 2004). O queijo Minas frescal é um dos queijos mais populares do país, sendo consumido por todas as camadas da população durante o ano todo (FURTADO, 2005).
No período entre 2006 e 2011, o consumo per capita de produtos lácteos no país aumentou 4,2%, atrás apenas da China, onde a demanda cresceu 4,4% no mesmo intervalo. A ABIQ cita ‘O Dairy Report’ de 2012 que analisou 10 tradicionais produtores de leite do mundo. Além do Brasil, foram levantados dados dos Estados Unidos, Argentina, Nova Zelândia, Austrália, França, Alemanha, China, Índia e Rússia. Na Índia e na Austrália, o consumo per capita avançou 3,4% nos mesmos cinco anos. No Brasil, o consumo estimado, em 2012, foi de 180 litros per capita de lácteos. A meta é que, em nosso país, o consumo atinja, nos próximos cinco anos, ao nível de consumo recomendado pelo Guia Alimentar do Ministério da Saúde, que é de 200 litros/habitante/ano em equivalente leite (ABIQ, 2013).
Um recente relatório sugere que o mercado de queijos frescos deverá crescer cerca de 7,0 % no período de 2013 a 2019 (MILKPOINT, 2015).
Segundo o site de mercado Datamark (2015), foram produzidas no ano de 2014 cerca de 71.675,09t (toneladas) de queijo Minas frescal com arrecadação de, aproximadamente, 878,58 milhões de dólares. A projeção para o ano de 2015 é de produzir 80.813,69t, obtendo um montante igual a 990,60 milhões de dólares. Ainda, do ano de 2012 para o ano de 2013, houve um aumento de 13,5% na produção de queijo Minas frescal e a projeção de crescimento de 2014 para 2015 é de 12,8%. Em relação às exportações, no ano de 2014 foram exportadas 366,11t deste queijo com uma arrecadação igual a 1.397,66 mil dólares.
2.2 Queijo Minas Frescal
O queijo Minas frescal é um dos produtos de laticínios mais difundidos no Brasil e é considerado o único queijo genuinamente nacional; possui ampla aceitação no mercado e pode ser encontrado em todo o país (ISEPON; OLIVEIRA, 1995).
18 A legislação brasileira define queijo Minas frescal como um queijo fresco obtido por coagulação enzimática do leite com coalho e/ou outras enzimas coagulantes apropriadas, complementada ou não com ação de bactérias lácticas específicas (BRASIL, 1996).
Existe uma grande variedade de queijos frescos que apresentam como característica comum seu alto valor de pH e atividade de água, alta umidade, suave flavor lácteo e curta vida de prateleira (HWANG; GUNASEKARAN, 2001).
O queijo Minas frescal é um queijo semi-gordo e de alta umidade, que deve ser consumido ainda fresco. Este queijo passa por etapas de coagulação da massa e dessoramento, porém, não é prensado nem maturado e seu armazenamento não deve ser a temperatura superior a 8°C (BRASIL, 1996). A sua composição média é de 55 - 58% de umidade, 17 - 19% de gordura, pH entre 6,1-6,3 (com emprego de ácido lático) e 1,5% de sal (FURTADO; NETO, 1994).
Na fabricação deste queijo é normal um rendimento de 6,0 a 6,5 litros/ kg (FURTADO; NETO, 1994). Sua vida útil é estabelecida por legislação em trinta dias a partir da fabricação, embora devido a alta pericibilidade a vida útil deste queijo seja muito menor que isto (BRASIL, 1996).
Utiliza-se tradicionalmente culturas láticas para a acidificação de queijos frescos, porém, o emprego de ácido lático vem sendo amplamente utilizado devido a sua praticidade e conveniência para a produção ao nível industrial. A adição de ácido lático na fabricação tem como resultado principal o aumento da umidade no extrato seco total, aumento do pH final do queijo, diminuição da acidez e maior perda de sólidos solúveis no soro, quando comparado com queijos produzidos convencionalmente com culturas láticas (FURTADO; NETO, 1980; DORNELLAS, 1997). O aumento no rendimento ocorre, pois, com um coágulo menos ácido há menos favorecimento para reação do cálcio do paracaseinato com o ácido lático, resultando assim em menos lactato e menor expulsão da água (WOLFSCHOON-POMBO; FURTADO; MUNCK, 1978).
O processo de coagulação é igualmente importante, sendo este dividido em duas fases. Na primeira fase da coagulação, ocorre a clivagem específica do glicomacropeptídio hidrofílico, preferencialmente no sítio Phe105-Met106 da κ-caseína (κ-CN) que é altamente suscetível à hidrólise por proteases ácidas
19 (FOX et al., 2000; WALSTRA; WOUTERS; GEURTS, 2006). Dentre as enzimas coagulantes, a quimosina caracteriza-se por ser uma enzima de atividade altamente específica (Phe105-Met106 da κ-caseína) e com bom poder coagulante (HYSLOP, 2003; CRABBE, 2004). Na segunda fase da coagulação, a para-κ-caseína2+ (formada a partir das micelas clivadas), fica instável pela saída do glicomacropeptídeo e inicia-se um processo de coagulação sob a influência dos íons cálcio do meio (DALGLEISH, 1992; WALSTRA; WOUTERS; GEURTS, 2006).
O teor de umidade do queijo Minas frescal é, de longe, a causa mais comum da sua reduzida vida de prateleira (FURTADO, 2005). O cuidado durante o dessoramento (sinérese) é fundamental para controlar o teor de umidade da massa do queijo e também o grau e extensão de maturação e a estabilidade do queijo. Quanto maior a sua umidade, mais rápida é a maturação, porém menor será a sua estabilidade. A sinérese é promovida pela menor espessura do corte da massa de queijo, pHs baixos, presença de íons cálcio, aumento da temperatura de cozimento, velocidade de mexedura durante o cozimento, maior teor de proteínas e menor teor de gordura (PAULA; CARVALHO; FURTADO, 2009).
Dentre as várias etapas da fabricação de queijos, a salga destaca-se por sua grande importância, uma vez que o sal (NaCl) possui várias funções nestes alimentos, tais como: sabor, controle do desenvolvimento microbiano, regulagem dos processos bioquímicos e físico-químicos, durabilidade, entre outros. O sal auxilia na formação da casca que, pela desidratação superficial e, modificação da pressão osmótica, leva a sinérese da massa, estimulando a expulsão de soro e a redução da umidade do queijo. Este atua na complementação da dessoragem, pois favorece a liberação da água livre da massa. Ao penetrar na massa do queijo, o sal utiliza a água livre para a sua dissolução e parte dessa água é deslocada para a casca, a fim de manter o equilíbrio osmótico, acabando por perder-se externamente (PAULA; CARVALHO; FURTADO et al., 2009).
O queijo Minas frescal é um queijo de elevada umidade e que é fabricado na faixa de temperatura ótima para o crescimento de uma grande variedade de microrganismos (36-42°C). Além disso, sua principal matéria prima, o leite, é um substrato ideal para o desenvolvimento de diversos microrganismos
20 patogênicos e deteriorantes. Após sua fabricação não é aplicado nenhum outro método de conservação, tal como o tratamento térmico. Dessa forma, o armazenamento em temperatura de refrigeração, a embalagem a vácuo e as boas práticas de fabricação são essenciais para a segurança e qualidade deste queijo.
As bactérias do grupo coliforme são consideradas como os principais agentes causadores de contaminação associados à deterioração de queijos, causando fermentações anormais e estufamento precoce dos produtos (ALMEIDA; FRANCO, 2003). Além de coliformes, Staphylococcus aureus e
Listeria monocytogens são patógenos de elevada incidência em queijo Minas
frescal (VASCONCELOS; MARIN, 2008). Portanto, a tecnologia de API é apresentada como um método de conservação que pode ser utilizado após a fabricação, pois pode ser aplicada na peça de queijo já embalada. Essa tecnologia aliada ao armazenamento em baixas temperaturas e embalagem a vácuo pode estender significativamente a vida de prateleira de queijos (TRUJILLO et al., 2000).
2.3 Bactérias Láticas
Bactérias láticas (BAL) são descritas como bastonetes ou cocos Gram-positivos, catalase negativa, não formadores de esporos e que possuem o ácido lático como principal produto do metabolismo de carboidratos (AXELSSON, 2004). As BAL são divididas nos seguintes gêneros: Aerococcus,
Carnobacterium, Enterococcus, Lactococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Leuconostoc e Pediococcus (BERESFORD et al., 2001).
Estas bactérias são consideradas ubíquas, o que significa que estão amplamente distribuídas em diferentes ecossistemas. Elas são comumente encontradas em alimentos (produtos lácteos, carnes e vegetais). Mas também estão presentes no solo, na boca, trato gastrointestinal e urogenital de humanos e animais (LÓPEZ-DÍAS et al., 2000; SAVADOGO et al., 2006).
As bactérias laticas caracterizam-se por serem GRAS (generally
recognized as safe – usualmente reconhecido como seguro). Além de
21 elevados níveis de vitaminas do complexo B e alguns aminoácidos, hidrolisam a lactose em produtos lácteos tornando este açúcar mais disponível (GOKTEPE, 2006). Além disso, estas bactérias possuem a capacidade de produzir mudanças desejáveis no sabor, aroma e textura, bem como inibir microrganismos patogênicos e deterioradores. Algumas estirpes também são utilizadas como probióticas, ou seja, adjuntos da dieta e terapêutica, para humanos e animais (NASCIMENTO, 2007).
As BAL são capazes de inibir o desenvolvimento de outros microrganismos por meio da competição por nutrientes, produção de ácidos orgânicos (redução do pH), enzimas bacteriolíticas, amônia, peróxido de hidrogênio, diacetil, dióxido de carbono, peptídeos antifúngicos, substâncias antimicrobianas de baixo peso molecular, bacteriocinas e outros metabólitos secundários (CHEN; HOOVER, 2003; SCHULZ et al., 2003; LEROY; DE VUYST, 2004; COTTER; HILL; ROSS, 2005; GÁLVEZ et al., 2007; ORTOLANI, 2009; DAL BELLO et al., 2010).
2.3.1 Lactobacillus plantarum
L. plantarum é uma bactéria do gênero Lactobacillus. Este microrganismo
é comumente encontrado em silagens e em produtos alimentícios fermentados. A maioria das bactérias deste gênero são homofermentativos e convertem açucares fermentáveis à lactato (DE VRIES et al., 2006).
Vários estudos vem sendo realizados a fim de isolar e caracterizar bactérias láticas que apresentam por característica a produção de substâncias antimicrobianas. Dentre essas, L. plantarum é um dos mais estudados. A ação inibitória promovida por L. plantarum se deve a produção de ácido, bem como de bacteriocinas e outras substâncias inibitórias (NASCIMENTO et al., 2008; MILLS et al., 2011; DOULGERAKi et al., 2013).
No trabalho realizado por Loessner et al. (2003), em que estudaram o efeito de pediocinas produzidas por estirpes de L. plantarum sobre L.
monocytogenes presente em diferentes queijos, foi constatado a completa
22 Também, Sharafi et al. (2013) estudaram a atividade antibacteriana e o potencial probiótico de L. plantarum HKN01. Eles verificaram que este microrganismo possui um amplo espectro de atividade contra bactérias Gram- positivas e negativas. Além disso, seu potencial probiótico foi avaliado por meio da verificação de sua resistência a enzima lisozima, a sua capacidade de crescimento na presença de bile e resistência em pH baixo (pH 2,3), semelhante ao do estômago humano. Os resultados demonstraram que, apesar da exposição a esses tratamentos, a contagem de sobreviventes foi maior do que 106 UFC∙mL-1.
2.4 Ocorrência de Listeria sp. e E. coli em Queijo Minas Frescal
Os queijos, devido à sua composição, constituem-se em excelente substrato para o crescimento de microrganismos, inclusive de L.
monocytogenes, considerada uma bactéria que possui capacidade de
multiplicação em temperaturas de refrigeração e ainda habilidade de sobreviver durante longos períodos sob condições adversas (NALDINI, 2002).
A "List of Prokaryotic names with Standing in Nomenclature" organizada pelo pesquisador J. P. Euzéby mas, atualmente, mantida pelo curador Aiden Parte, cita 17 espécies e 6 subespécies no gênero Listeria spp. Porém, oficialmente, há 15 espécies e 6 subespécies, conforme o site http://www.bacterio. net/listeria.html, sendo as mais conhecidas: L. monocytogenes, L. innocua, Listeria ivanovii, Listeria seeligeri, Listeria welshimeri e Listeria grayi (GOMES, 2015).
L. monocytogenes é um patógeno que emergiu na década de 80 como
um agente causador de uma doença transmitida por alimentos, denominada listeriose, caracterizada principalmente por septicemia, meningite e meningoencefalite, nos casos mais graves. A listeriose acomete, preferencialmente, os idosos, crianças, gestantes e pessoas imunodeprimidas. A dose necessária para que uma infecção causada por L. monocytogenes se manifeste ainda permanece obscura e varia de indivíduo para indivíduo (FARBER; PETERKIN, 1991). Sua transmissão está associada com alimentos
23 prontos para o consumo, que são estocados a temperaturas de refrigeração por um longo tempo (MCLAUCHLIN; SMERDON; JEWELL, 2004; Jay,2005).
A contaminação de produtos prontos para o consumo com L.
monocytogenes pode ocorrer em vários estágios: por meio de manipuladores
de alimentos, no local de processamento, durante a adição de ingredientes crus, ou após tratamento de letalidade na área de embalagem de alimentos (LIANOU; SOFOS, 2007).
Dentre as diversas formas de controlar a multiplicação de L.
monocytogenes em alimentos destaca-se o uso de bactérias láticas e de suas
bacteriocinas (ALVES et al., 2006; ALLENDE et al., 2007; HÉQUET, 2007). Queijo Minas frescal comercializado na região de Campinas – SP foi pesquisado em trabalhos de Vieira (2000) e Carvalho (2003). Em vinte amostras analisadas, 25% estavam contaminadas por L. monocytogenes. Analisando 93 amostras do produto, Carvalho (2003) verificou que 11,8% apresentavam contaminação por Listeria spp., sendo 3% por L. monocytogenes. Em Araguaína (TO), Vieira et al. (2001) verificaram a
ocorrência de 64% de Listeria spp. e 8% de L. monocytogenes em 50 amostras de queijo Minas frescal.
Em estudo realizado por Silva et al. (2003) em indústrias processadoras de queijo Minas frescal na Bahia, esta bactéria foi encontrada em leite cru e em piso da sala de estocagem de leite. De um total de 218 amostras coletadas em diferentes etapas do processamento deste queijo, 13 foram positivas para
Listeria spp., sendo duas caracterizadas como L. monocytogenes.
No Paraná, 100 amostras de vários tipos de queijos foram analisadas por Moscalewsky et al. (2003), sendo em 12% das mesmas detectada a presença de Listeria spp., sendo 6% caracterizadas como L. monocytogenes.
Por outro lado, o grupo coliforme é restrito as bactérias que vivem exclusivamente no trato gastrointestinal de humanos e de animais de sangue quente e inclui pelo menos três gêneros: Escherichia, Klebsiella e Enterobacter (HITCHINS; HARTMAN; TODD, 1992; SILVA; JUNQUEIRA; SILVEIRA, 2010). Dentre esses microrganismos, a bactéria E. coli é a mais conhecida e a mais facilmente diferenciada dos microrganismos não fecais, sendo a melhor indicadora de contaminação fecal conhecida até o momento (SILVA; JUNQUEIRA; SILVEIRA, 2010).
24 As bactérias do grupo coliforme são consideradas como os principais agentes causadores de contaminação associados à deterioração de queijos, causando fermentações anormais e estufamento precoce dos produtos (OLIVEIRA et al., 1998; ALMEIDA; FRANCO, 2003). Incluem todos os bacilos Gram-negativos, anaeróbios facultativos que não formam esporos e são capazes de fermentar a lactose com produção de gás em 24-48 horas a 35ºC (coliformes totais), e 44,5 ºC - 45,5 ºC (coliformes termotolerantes), em meio de cultura sólido ou líquido (SILVA; JUNQUEIRA; SILVEIRA, 2010).
Em um trabalho realizado em Campinas, Gardenal (2002) avaliou 210 amostras de queijo Minas frescal e observou que 70 (33,3%) amostras estavam em desacordo com um ou mais padrões microbiológicos estabelecidos pela legislação, sendo classificados como produtos em condições insatisfatórias e, portanto, impróprios para o consumo humano.
Barros et al. (2004) observaram que 63% das amostras de queijo Minas frescal analisadas estavam fora do limite para coliformes a 45ºC. Também Paneto et al. (2005), que analisaram 50 amostras de queijo tipo Minas frescal adquiridas em diferentes supermercados da cidade de Araguaína-TO constataram a presença de E. coli em 96% das amostras.
A Resolução n° 12 de 02 de janeiro de 2001 (BRASIL, 2001) estabelece, para queijo de muito alta umidade com bactérias láticas abundantes e viáveis, o padrão para o grupo dos coliformes termotolerantes igual a ≤ 5,0 x 103 NMP∙g-1
. Salotti et al. (2006) avaliaram 30 amostras de queijo Minas formais e 30 informais. Os resultados microbiológicos revelaram que 86,7% das amostras informais e 66,7% das formais estavam em desacordo com os padrões estabelecidos pela Anvisa (BRASIL, 2001). Para coliformes termotolerantes, 60% das amostras de queijo informais e 56,67% das formais apresentaram contagens acima do padrão aceito pela legislação brasileira.
Passos et al., (2009) avaliaram a qualidade microbiológica de queijos Minas frescal comercializados nas cidades de Arapongas e Londrina (Paraná). De 45 amostras analisadas, 42 (93,3%) estavam em desacordo com a legislação brasileira vigente para S. aureus ou E. coli, sendo que a maioria das amostras positivas continham mais de 103 UFC∙g-1 de E. coli.
Apolinário, Santos e Lavorato (2014) avaliaram a qualidade microbiológica de queijos Minas frescal produzidos por laticínios localizados na região da Zona
25 da Mata Mineira. Foi verificado que, de um total de 31 amostras de queijos Minas frescal, 77,4% estavam com contagens superiores ao preconizado pela legislação para coliformes totais, 54,8% para coliformes termotolerantes, 16,12% para estafilococos coagulase positiva e 9,6% para L. monocytogenes.
2.5 Processamento por Alta Pressão Isostática
A demanda dos consumidores por alimentos naturais, sem conservantes, mais saborosos e saudáveis conduziu ao desenvolvimento de novas tecnologias de processamento. Dentre estas tecnologias destaca-se a utilização de Alta Pressão Isostática - API ou hidrostática (do inglês High
Pressure Processing - HPP) como sendo capaz de produzir produtos
microbiologicamente seguros e com suas características preservadas (RODRÍGUEZ et al., 2012).
De modo geral, na área de alimentos são empregadas faixas de pressão que variam de 200 - 1000 MPa. Esta técnica é baseada em 2 princípios: o primeiro, teoria de Le Chatelier, onde afirma-se que todo fenômeno (transição de fase, mudança na configuração molecular, reações químicas) é favorecido quando acompanhado do decréscimo do volume. No segundo princípio, pressão isostática ou teoria de Pascal, a pressão é transmitida instantânea e uniformemente através do objeto ou alimento, independentemente do tamanho e forma do produto (HAYASHI et al., 1989; TAUSCHER, 1995; TRUJILLO et al., 2000). Considera-se que durante o processamento de API ocorre uma variação de temperatura durante o período de compressão (aquecimento de até ± 3°C para cada 100 MPa) e descompressão (resfriamento) do equipamento e do produto que está sendo processado. Este fenômeno é chamado de aquecimento ou resfriamento adiabático (KNORR, 1993).
O processamento por API apresenta várias vantagens, tais como: capacidade de processar o alimento à temperatura ambiente ou a baixas temperaturas; transmissão uniforme de pressão sobre o alimento, independentemente da sua forma e tamanho, promoção de morte microbiana sem o uso de aditivos químicos e utilização para o desenvolvimento de produtos com propriedades funcionais (RASTOGI et al., 2008).
26 Verifica-se ainda que características de qualidade do alimento tal como o aroma e sabor e conteúdo de vitaminas não são afetadas ou são apenas minimamente afetadas pelo tratamento de API à temperatura ambiente. O tratamento térmico inativa microrganismos, mas também causa perda de nutrientes e altera o aroma e sabor. Em contraste, o tratamento por API promete estender a vida de prateleira dos alimentos sem alterar as características nutricionais e sensoriais (TRUJILLO et al., 2000).
Os potenciais usos de API para processamento de alimentos foram relatados pela primeira vez no final do século XIX e início do século XX, quando Hite et al. (1899, 1914) demonstraram que a vida útil de leite e outros alimentos poderia ser estendida por submetê-los a API. No entanto, a API não foi utilizada comercialmente até 1991, quando produtos, principalmente doces de frutas e geléias pressurizadas, tornaram-se disponíveis no Japão. Além disso, alimentos como purê de abacate (guacamole), arroz, suco de frutas, ostras, presunto fatiado e vários produtos de sobremesa processados por API podem ser encontrados em países como Estados Unidos, Espanha, França, México e Japão (HOGAN; KELLY; SUN, 2005; SAN MARTÍN-GONZALEZ et al., 2007; DARYAEI, 2008).
Em relação aos queijos, os estudos da aplicação de API têm-se concentrado em duas áreas principais: preservação e modificação no processo de maturação (RODRÍGUEZ et al., 2012).
Esta tecnologia pode ser utilizada na produção de queijo de duas formas. Uma delas consiste em aplicar a pressão no leite para posterior fabricação de queijos. O outro caso consiste em aplicar API diretamente sobre o queijo já embalado, que traz como vantagem a redução do risco de contaminação pós-processo.
2.6 Aplicação de Alta Pressão Isostática em Queijos: Efeitos nas Características Físico-Químicas
As alterações físico-químicas, microbiológicas e sensoriais são responsáveis pela redução do vida de prateleira em queijos frescos tal como o Minas frescal.
27 Desde que a API foi reportada como um método adequado para o processamento de alimentos, alguns estudos tem focado sua utilização sobre queijos, como os de longa maturação e os queijos frescos (CAPELLAS et al., 2000; TRUJILLO et al., 2002, CAPELLAS et al., 2001; SANDRA; STANFORD; GODDIK, 2004; SHEEHAN et al., 2005; DARYAEI et al., 2008; OKPALA; PIGGOTT; SCHASCHKE, 2010; EVERT-ARRIAGADA et al., 2012; RODRÍGUEZ et al., 2012).
A combinação de pressão, tempo de exposição e temperatura são determinantes para a produção de efeitos positivos no processamento de queijo fresco (TRUJILLO et al., 2000). Por exemplo, Daryaei et al. (2006, 2008) demonstraram que API (300 – 600 MPa por 5 min a 22°C) pode aumentar a vida de prateleira de queijo fresco por até 8 semanas sem alterar a qualidade do produto.
Um dos efeitos causados pela aplicação de API é a desnaturação das estruturas terciária e quaternária de proteínas. A desnaturação protéica pode trazer consequencias positivas ou negativas. Sabe-se que a desnaturação induzida por API não se assemelha a obtida pelo tratamento térmico que é frequentemente irreversível devido à ruptura de ligações covalentes e/ou agregação de proteínas desdobradas (MOZHAEV et al., 1996). Sob tratamento API de 100-300 MPa, as proteínas podem, mas nem sempre, desnaturar, solubilizar ou precipitar de modo reversível (THAKUR; NELSON, 1998). Já pressões acima de 300 MPa são capazes de romper a estrutura da micela de para-caseina e, assim, maior quantidade de nitrogênio pode ser detectado no soro do queijo tratado por API quando comparado com o queijo não tratado (MESSENS et al., 1998).
A aplicação de API pode ocasionar um aumento da dureza em queijos frescos devido à compactação da massa. Além disso, alguns trabalhos relatam um maior dessoramento inicial (logo após a pressurização); já outros mencionam um maior dessoramento durante o armazenamento. Em relação à coloração é comum encontrar trabalhos que citem o aparecimento de coloração amarelada como efeito da aplicação de pressão. Com relação ao pH, acidez e Aa, geralmente não ocorre alteração significativa (TRUJILLO; GUAMIS; CARRETERO, 2000; CAPELLAS et al., 2001; SANDRA; STANFORD; GODDIK, 2004; EVERT ARRIAGADA et al., 2014).
28 2.7 Aplicação de Alta Pressão Isostática em Queijos: Efeito sobre Listeria
sp. e E. coli
Os queijos frescos possuem elevada umidade sendo, portanto, muito suscetíveis à contaminação microbiana, especialmente por fungos filamentosos e leveduras, microrganismos psicrotróficos e os da família enterobacteriaceae (EVERT-ARRIAGADA et al., 2012).
A resistência dos microrganismos a pressão é variável. De modo geral, as bactérias Gram-positivas são mais resistentes que as Gram-negativas. Fungos filamentosos e leveduras são muito sensíveis a baixos níveis de pressão e, quanto aos esporos, estes são mais resistentes, sendo que em alguns casos podem resistir a pressões de até 1000 MPa (SMELT, 1998).
Ao longo dos anos muitas aplicações vêm sendo sugeridas sobre a utilização de API na inativação de microrganismos em leite e queijo.
Gallot-Lavallée (1998) estudou a eficiência do tratamento de API para a inativação de L. monocytogenes em queijo feito com leite bovino e constatou redução de mais de 5,6 unidades logarítimicas quando aplicado os tratamentos de 450 MPa/10 min ou 500 MPa/5 min, sem afetar, significativamente, as características sensoriais do queijo.
Trujillo, Guamis e Carretero (2000) observaram que a aplicação de 400 MPa por 10 min a 2°C resultou em queijo com baixas contagens de contaminantes. Tratamentos de 400 MPa a 2-25°C por 5 min causou redução de 7 ciclos logarítmicos na população de E. coli, resultando em contagens não detectáveis deste microrganismo.
Evert Arriagada et al. (2014) verificaram um aumento na contagem de enterobacteriaceae e fungos filamentosos e leveduras ao longo do armazenamento a 4°C para as amostras controle, mas não para as processadas a 500 MPa. Isso demonstra a eficiência do tratamento de API sobre estes microrganismos. Estes mesmos autores relataram um aumento no tempo para as células atingirem a fase log da curva de crescimento em cerca de 1 para 6 dias, quando o queijo foi submetido a API juntamente com o armazenamento refrigerado.
A completa inativação de bactérias do grupo das enterobacteriaceae é importante do ponto de vista higiênico sanitário. Daryaei et al. (2008)
29 trabalhando com queijo fresco também observaram que API foi efetiva no controle da ocorrência de fungos filamentosos e leveduras quando aplicados processos entre 300-600 MPa.
2.8 Aplicação de Bacteriocinas em Queijos: Efeito sobre Listeria sp. e E.
coli
As bacteriocinas são importantes substâncias utilizadas no controle de microrganismos patogênicos e deterioradores em alimentos (RILEY; WERTZ, 2002; ROUSE; CANCHAYA; VAN SINDEREN, 2008), especialmente L.
monocytogenes e Staphylococcus produtores de enterotoxinas,
frequentemente associados a produtos lácteos (MORGAN et al., 2001).
O potencial de bacteriocinas produzidas por bactérias do ácido lático (BAL) para o controle de microrganismos em queijos vem sendo estudado. Relata-se o efeito de bacteriocinas produzidas por culturas starter sobre diferentes bactérias patogênicas e deteriorantes, positivas e Gram-negativas, incluindo esporulados (RODRÍGUEZ et al., 2005).
As bacteriocinas podem atuar através de diferentes mecanismos de ação. Pode ligar-se ao lipídio II (principal transportador das subunidades dos peptídeoglicanos) e impedir a síntese correta da parede celular; ou podem usar o lipídio II como uma molécula de acoplamento para iniciar o processo de inserção na membrana e formação de poros, que leva a morte celular. As bacteriocinas (classe III) atuam diretamente na parede celular de bactérias Gram-positivas, lisando a célula alvo (COTTER; HILL; ROSS, 2005).
Alguns trabalhos relatam a eficiência de bacteriocinas produzidas por L.
plantarum contra microrganismos indicadores e patogênicos (LOESSNER et
al., 2003). A bacteriocina produzida por L. plantarum HKN01 foi eficiente contra
E. coli. Além disso, L. plantarum HKN01 mostrou um amplo espectro de
inibição ao inibir bactérias Gram-positivas e Gram-negativas (SHARAFI et al., 2013). Tiwari e Srivastava (2008) caracterizaram a bacteriocina produzida por
L. plantarum LR/14. O sobrenadante obtido das células apresentou atividade
inibitória contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, tais como S.
30 Rodríguez et al. (2005) utilizaram leite inoculado com três patógenos de modo a atingir, aproximadamente, 6 log UFC∙mL-1. Após 30 dias, L.
monocytoges, S. aureus e E. coli O157:H7 apresentaram contagens de 5,30,
5,16 e 4,14 log UFC.g-1, respectivamente, em queijo feito sem adição da cultura adjunta. Entretanto, quando adicionado 1% de cultura adjunta de Lctococcus
lactis CL1 e L. lactis CL2 as contagens reduziram para L. monocytoges 2,97 e
1,64 log UFC.g-1, para S. aureus 0,98 e 0,4 log UFC.g-1 e para E. coli O157:H7 0,84 e 1,69 log UFC.g-1, respectivamente.
A bacteriocina obtida da estirpe de L. plantarum mostrou-se muito eficiente contra L. monocytogenes, onde o extrato de bacteriocina apresentou atividade de 17.070 AU/mL. O extrato desta cultura apresentou halo de inibição com diâmetro de 14 mm contra a cultura de L. monocytogenes, porém, nenhuma zona de inibição foi observada quando tratada com enzimas proteolíticas. Além de L. monocytogenes, outras bactérias Gram-positivas foram afetadas pela bacteriocina produzida por L. plantarum WHE 92. Por outro lado, bactérias Gram-negativas (Salmonella, Pseudomonas e Escherichia spp.) não foram afetadas. Bacteriocinas de L. plantarum WHE 92 reduziram 3 ciclos logarítimicos de uma concentração inicial de 107 UFC.mL-1 de L.
monocytogenes e, este efeito continuou por até 60 min de incubação quando,
lentamente, retomasse o crescimento (ENNAHAR; ASSOBHEI; HASSELMANN, 1996).
Segundo Nascimento et al. (2008), o emprego de L. plantarum ALC 01 e
Enterococcus faecium FAIR-E 198 como adjuntas ao fermento lático
(Lactococcus lactis subsp. lactis ATCC 11454), na concentração de 0,5%, promoveu ação bactericida sobre Bacillus cereus K1-B041 maior que a observada no queijo controle (sem a adição das mesmas). Contudo, nenhuma atividade inibitória adicional foi observada sobre L. monocytogenes Scott A e S.
aureus ATCC 27154 nos queijos processados com as três bacteriocinogênicas,
durante estocagem a 8°C por 21 dias.
2.9 Efeito Combinado de Alta Pressão e Bacteriocinas sobre Listeria sp. e
31 Tratamento de pressão de 350 MPa por 20 min em caldo TSB-YE causou 1,1 – 1,2 reduções logarítmicas em E. coli O157:H12 e O157:H7 e 4,1 – 5,5 reduções logarítmicas em O157-M1 e O157-M2. Quando foi tratada sob API na presença de extrato de célula (32 AU/mL) de Lactobacillus casei CE, o tratamento combinado causou uma inativação significativa da estirpe O157:H7 resultando em menos de 4,3-4,6 logs de células viáveis, e este efeito sinergistico aumentou com o aumento do tempo de tratamento de pressão (CHUNG; YOUSEF, 2010a).
Chung; Yousef (2010b) mencionam que com essa combinação de pressão/ tempo/ temperatura e concentração de extrato celular de L. casei CE alcançaram um decréscimo maior que 5 log UFC.mL-1 no número de L.
monocytogenes. Resultados similares foram obtidos em produtos cárneos
submetidos a 500 MPa por 1 min e alta atividade de extrato celular de L. casei CE (100 AU/g), onde foi encontrado mais de 5 reduções decimais no número de células viáveis de L. monocytogenes Scott A. O tratamento com extrato de célula de L. casei CE (32 AU/mL) por 30 min causou redução de menos que 1 ciclo log em relação a população inicial de células. O mesmo resultado foi obtido quando somente aplicaram pressão de 350 MPa por 1 min. Entretanto, quando combinaram estes dois tratamentos o resultado foi a redução de mais que 5 ciclos log do número de L. monocytogenes em caldo TSA-YE.
Rodriguez et al. (2005) estudaram a combinação do tratamento de API e bacteriocinas produzidas por bactérias do ácido lático na inativação de E. coli O157:H7 em queijo. Quando a pressão foi aplicada no segundo dia de fabricação, verificaram um efeito sinergistico entre pressão de 300 MPa por 10 min a 10°C e bacteriocinas (lacticina, nisina, bacteriocina TAB 57 ou enterocina AS-48); sendo atingida uma contagem abaixo de 2 log de UFC.g-1 de E. coli O157:H7 após 60 dias de armazenamento de queijo feito com leite cru.
Arqués et al. (2005) no terceiro dia de armazenamento de queijo feito com leite cru obtiveram uma contagem de 7,03 log UFC.g-1 de L. monocytogenes Scott A. Este queijo feito com adição de bacteriocina produzida por cultura lática e tratada no segundo dia com pressão de 300 MPa (10 min a 10°C) apresentaram contagem de 3,83 – 5,43 log UFC.g-1
; quando tratado a 500 MPa (10 min a 10°C) o resultado foi 1,81 log UFC.g-1.
32 Capellas et al. (2000) estudou o efeito da API combinado com a aplicação de nisina em queijo fresco. Estes autores relatam a pressão de 500 MPa aplicada em 6 ciclos, nos tempos de 5, 15 e 30 min e temperaturas de 10, 25 e 40°C, como sendo o parâmetro de pressão mais efetivo quando comparado com as demais pressões estudadas, mesmo nas amostras não tratadas com bacteriocina. Sob estas condições, Staphilococcus carnosus e bactérias mesófilas aeróbias reduziram sua contagem. Em trabalhos anteriores os mesmos autores observaram que uma redução substancial de E. coli inoculada em queijo fresco era alcançada quando aplicado tratamento de API entre 400 a 500 MPa por 5 - 15 min a temperatura de 25°C (CAPELLAS et al., 1996).
33 3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Fabricação do Queijo Minas Frescal
Para a fabricação do queijo foi utilizado leite pasteurizado semi-desnatado da marca Xandô. Cuidados foram tomados para que o leite fosse fresco e obtido de mesmo lote e com o teor de gordura padronizado para 2%. O Queijo Minas frescal feito com adição L. plantarum (Danisco Brasil Holdbac®) seguiu o fluxograma apresentado na Figura 1.
34 Foi utilizado coagulante líquido (ESTRELLA® - Chr Hansen) e, o volume adicionado seguiu as recomendações do fabricante.
O queijo Controle foi feito utilizando o mesmo fluxograma, com exceção da etapa de adição do L. plantarum (Figura 1). Os queijos controle foram fabricados primeiro, de modo a evitar possível contaminação cruzada. Depois da fabricação do queijo controle, os utensílios e a cuba de fabricação passaram por limpeza com detergente neutro e sanitização com solução clorada 3,5% com 10 min de tempo de contato, e álcool 70% aplicado três vezes sobre a superfície, com tempo total de aplicação de 10 min contando o período de secagem e evaporação, com posterior enxágue com água destilada estéril, para não deixar resíduos que pudessem prejudicar a sobrevivência do L.
plantarum.
O L. plantarum foi obtido na forma liofilizada. Assim, antes de ser adicionado na fabricação do queijo Minas frescal (Figura 1), foi realizada uma ativação desta cultura adicionando-se 5g de cultura liofilizada em 200 mL de leite estéril (esterizado em autoclave a 121°C por 15 min) e incubação em estufa a 37°C/24h. Depois, os 200 mL foram transferidos para um volume maior (1800 mL de leite) totalizando 2 L de leite estéril. Estes 2 L foram novamente incubados a 37°C/24h. Passado o tempo de incubação, este leite, rico em células de L. plantarum, foi adicionado na cuba de fabricação que continha 18 L, totalizando 20 L de leite. Este método resultou em queijos que apresentaram contagens próximas a 108-109 log UFC∙g-1.
De modo geral, para produzir 1 kg de queijo Minas frescal, foram necessários 5-6 L de leite pasteurizado da marca utilizada.
3.2 Equipamento e Tratamentos de Pressão, Tempo e Temperatura
O equipamento utilizado neste experimento (modelo QFP 2L - 700 - AVURE Technologies®) possui uma câmara de volume de 2 L. Ele utiliza o método de pressurização indireto, sendo, neste estudo, utilizado como líquido pressurizante a água. Como mencionado anteriormente, foi considerado o aquecimento adiabático de 3°C para cada 100 MPa. Dessa forma, antes dos tratamentos, o recipiente foi abastecido com água gelada e, a temperatura foi
35 reduzida de modo a atingir, durante o tempo de processo, a temperatura de 25°C±2°C. No controlador do equipamento foram ajustados pressão e tempo de pressurização de acordo com a Tabela 1. O processamento é dividido em três etapas: tempo de subida ou tempo para atingir a pressão desejada, tempo de processo e despressurização. O tempo de subida deste equipamento, variou de 1 min a 3 min dependendo do tratamento de pressão aplicado (Tabela 1). A despressurização ocorreu, entre 1 e 3 segundos.
Tabela 1 - Tempos de subida de pressão para diferentes processos de pressão, tempo e temperatura
Pressão (MPa) Tempo (min) Temperatura (°C) Tempo de Subida (min) 0,1 0 25 - 300 5 25 1:11±0,1 400 5 25 1:32±0,1 500 3 25 1:51±0,2 500 5 25 550 5 25 1:46±0,2 600 3 25 1:56±0,2 600 5 25 620 5 25 2:76±0,2 650 5 25 3:01±0,3
Antes de estudar a vida de prateleira do queijo Minas frescal submetido ao tratamento de pressão, foi realizada uma primeira etapa que consistiu em avaliar as melhores faixas de pressão e tempo, a uma mesma temperatura, para a inativação de L. innocua ATCC 33090 e E. coli ATCC 11229, bem como as faixas que permitiriam a sobrevivência do L. plantarum.
Após os testes com diferentes faixas de pressão e tempo, foi escolhido, com base nos resultados, o tratamento de 620 MPa/5 min/25°C para o estudo da vida-de-prateleira. De modo geral, o critério para essa escolha foi utilizar o tratamento que resultasse em inativação significativa (superior a 5 ciclos
36 logarítmicos) de L. innocua e E. coli e maior sobrevivência do L. plantarum adicionado durante a fabricação.
Os tratamentos de API foram aplicados imediatamente após a inoculação dos queijos com L. innocua e E. coli e embalagem. Depois do tratamento de API os queijos permaneceram 15 min em temperatura ambiente (SOARES, 2005) para que as células de L. plantarum se recuperassem de possíveis estresses causados pelos tratamentos aplicados e, depois deste tempo, foram conduzidas para BOD a 4°C, onde ficaram armazenadas para serem realizadas as análises. A primeira análise foi feita após 24 horas de armazenamento, ou seja, 1 dia após o processamento por API.
3.3 Amostragem, Inoculação e Armazenamento
Depois de fabricados os queijos adicionados ou não de L. plantarum e, passadas 24 horas de dessoragem em BOD a 4°C, seguiu-se para as etapas de amostragem, inoculação e armazenamento.
Neste estudo, os tratamentos foram identificados da seguinte forma: 1 - queijo com L. plantarum (QLp),
2 - queijo com L. plantarum + pressão de 620 MPa/5 min/25°C (QLpP), 3 - queijo sem L. plantarum ou controle (QC),
4 - queijo sem L. plantarum + pressão 620 MPa/5 min/25°C (QP).
Na primeira etapa onde foi feita a avaliação das melhores faixas de pressão e tempo para a inativação de L. innocua e E. coli, bem como as faixas que permitiriam a sobrevivência do L. plantarum, sendo que alguns deles receberam inóculos de L. innocua e E. coli e foram pressurizados enquanto outros receberam os inóculos e, não foram submetidos a API.
Para as análises microbiológicas da vida-de-prateleira, as amostras de QLp, QLpP, QC e QP foram inoculadas com L. innocua e E. coli, sendo, neste caso, identificados da seguinte forma: Lis (QLp), Lis (QLpP), Lis (QC), Lis (QP) e, Ec (QLp), Ec (QLpP), Ec (QC), Ec (QP), quando inoculados com Listéria ou
E. coli, respectivamente. Portanto, os controles foram aqueles queijos
inoculados com os contaminantes mas que não receberam o tratamento de API.
37 Para as análises físico-químicas foram feitas apenas distinções entre queijos QLp, QLpP, QC e QP sem, porém, receberem os inoculos dos microrganismos contaminantes.
3.3.1 Amostragem e Embalagem
A amostragem foi preparada assepticamente em câmara de fluxo laminar previamente esterilizada com luz UV por 20 min. Os queijos foram cortados em blocos de 250g para as análises físico-químicas. Além disso, 25g dos diferentes queijos foram pesados para as análises microbiológicas. As amostras de 25g foram depositadas em embalagens flexíveis previamente esterilizadas em autoclave a 121 °C por 15 min. Quando dentro destas embalagens, foram trituradas manualmente e receberam os inóculos de L.
innocua e E. coli, separadamente por amostra. Após a inoculação, as
embalagens flexíveis foram seladas a vácuo e reembaladas em embalagens flexíveis de polietileno de alta densidade (TecMaq Brasil, 50 cm³ de O2/m².dia), para suportar o tratamento de API. Depois de embaladas, as amostras permaneciam em BOD a 4°C até os tempos de análise.
3.3.2 Preparação dos Inóculos
As bactérias utilizadas como indicadoras de contaminação (L. innocua ATCC 33090 e E. coli ATCC 11229) foram obtidas por doação da fundação Tropical de Pesquisas e Tecnologia André Tosselo. Uma vez obtidas, estas foram caracterizadas quanto à sua pureza, sendo feitas análises de coloração de Gram, avaliação de motilidade em meio SIM, atividade de β-hemolisina e catalase. Além disso, foram testadas nos respectivos meios seletivos Agar Oxford para Listeria e Agar Sorbitol-MacConkey (SMAC) para E. coli. Uma vez verificada sua pureza, foi feito um estoque destas culturas em eppendorfs contendo caldo triptona de soja adicionado de 1% de extrato de leveduras (Tripticase Soya Broth-TSB-YE) e 0,25% de glicerol para a L. innocua e em caldo infusão de cérebro e coração (Brain Heart Infusion-BHI) adicionado da
38 mesma quantidade de glicerol para a E. coli. Ambos os microrganismos foram mantidos em congelador a -12 °C.
3.3.3 Inoculação de L. innocua ATCC 33090 e E. coli ATCC 11229
Do estoque obtido, as bactérias foram ativadas em tubos contendo 10 mL de caldo TSB-YE para a L. innocua ATCC 33090 e em caldo BHI para a E. coli ATCC 11229. Estas bactérias foram incubadas em suas temperaturas ótimas de crescimento (30°C/24h para Listeria e 37°C/24h para E. coli) e posteriormente, 10 mL foram transferidas para 190 mL de caldo TSB-YE e BHI, respectivamente. Os caldos eram incubados a 30 e 37°C por 24h para L.
innocua e E. coli, respectivamente. Posteriormente, os estes meios passaram
por centrifugação (AllegraTM 25R Centrifuge) a 7500g por 10 min a 4°C. O sobrenadante foi eliminado e os pellets de células foram lavados com tampão fosfato de sódio 0,1 M (pH 7,0). Após a lavagem, as células foram suspensas em 20 mL de tampão fosfato e as contagens ficaram por volta de109 UFC∙mL-1, aproximadamente.
No estudo realizado para verificar as melhores faixas de pressão e tempo para a inativação de L. innocua e E. coli em queijo Minas frescal feito com L.
plantarum, foi retirado 1 mL dos tubos de 20 mL de tampão fosfato contendo
aproximadamente 109 UFC∙mL-1 de células suspensas e adicionado nas amostras de 25g de queijo, de modo a se obter cerca de 108 UFC∙g-1 em cada amostra. O mesmo procedimento foi feito no estudo da vida-de-prateleira.
3.3.4 Armazenamento
Imediatamente após a inoculação, as amostras foram seladas a vácuo, submetidas aos tratamentos de API, conduzidas a BOD e mantidas a 4°C para as análises nos respectivos tempos de estudo da vida-de-prateleira. As análises microbiológicas foram feitas nos tempos 1, 7, 21, 35 e 45 dias e, as físico-químicas nos tempos 2, 22 e 46 dias de armazenamento a 4°C.
39 3.4.1 Análise de L. innocua ATCC 33090
Para a análise de L. innocua ATCC 33090, foram coletadas porções de várias regiões da peça, cortadas em pequenos pedaços de 25g. A esta amostra foi adicionado 225 mL de água peptonada 0,1% estéril (diluição 10-1). A partir desta foram feitas sucessivas diluições decimais, tantas quanto necessárias, conforme descrito em APHA (2005). O Agar Oxford (Oxoid) adicionado de suplemento seletivo para Listeria (SR0140, Oxoid) foi utilizado para o plaqueamento em superfície (spread plate) e as amostras foram incubadas a 30 ± 1°C por 24 ± 2h. As colônias pretas características de Listeria foram consideradas na contagem. Foi considerado para a contagem o intervalo entre 15 - 150 colônias.
3.4.2 Análise de E. coli ATCC 11229
Para a análise de E. coli ATCC 11229, foram coletadas porções de várias regiões do queijo, cortadas em pequenos pedaços, sendo 25g homogeneizado manualmente, de modo a romper a massa de queijo em pequenos grânulos. A estas amostras foram adicionados 225 mL de água peptonada 0,1% estéril (diluição 10-1). A partir destas foram feitas sucessivas diluições decimais, tantas quanto necessárias, conforme descrito no APHA (2005). O Agar Sorbitol-MacConkey (SMAC, Oxoid) foi utilizado para o plaqueamento em profundidade (pour plate) e as amostras foram incubadas a 37 ± 1°C por 24 ± 2h. As colônias que apresentaram diâmetro igual ou superior a 0,5 mm com coloração púrpura ou avermelhada foram consideradas na contagem como características de E.
coli. Foi considerado para contagem o intervalo entre 25 - 250 colônias.
3.4.3 Análise de Fungos Filamentosos e Leveduras
A análise de fungos filamentosos e leveduras foi feita de acordo com APHA (2005). Amostras de 25g foram homogeneizadas em 225 mL de solução de água peptonada estéril a 0,1% (m/v) de modo a obter a diluição 10-1. A partir desta, foram feitas sucessivas diluições decimais, tantas quanto necessárias.
40 Alíquotas de 0,1 mL foram adicionadas na superfície do Agar Batata Dextrose (BDA, Oxoid) acidificado com solução de ácido tartárico a 10%, com pH ajustado a 3,5 ± 1. As placas foram incubadas a 25°C por 5 dias. O intervalo de contagem considerado foi de 15 a 150 colônias expressas em UFC∙g-1
.
3.4.4 Análise de L. plantarum
Para a análise de L. plantarum foram coletadas amostras de 25g de várias regiões da peça. Estas foram homogeneizadas manualmente de modo a romper a massa de queijo em pequenos grânulos. A este peso foi adicionado 225 mL de água peptonada 0,1% estéril (diluição 10-1). A partir desta, foram feitas sucessivas diluições decimais, tantas quanto necessárias, conforme descrito no APHA (2005). O Agar Man Rogosa Sharpe (MRS, Oxoid) adicionado de antibiótico ciprofloxacina, púrpura de bromocresol (indicador de pH) e Tween 80 foi utilizado para o plaqueamento em profundidade (pour plate) e as placas foram incubadas a 37 ± 1°C por 72 ± 2h. As colônias brancas, semelhante a grãos de arroz foram consideradas na contagem como características de L. plantarum. Foram consideradas para contagem as placas de Petri que possuiam entre 25 - 250 colônias.
3.5 Avaliação das Características Físico-Químicas de Queijo Minas Frescal
3.5.1 Análise de pH
O pH das amostras foi mensurado de acordo com a American Public
Health Association (APHA, 2005), utilizando cerca de 10g de queijo em 100 mL
de água destilada, sendo utilizado pHmetro digital (Mettler - Toledo GmbH, modelo MP 120 pH Meter). O medidor de pH foi calibrado com soluções padrão de pH 4,0 e 7,0, antes da utilização. Esta análise foi feita em triplicata de amostras por tratamento aplicado. Sendo feitas duas repetições do experimento.
41 3.5.2 Análise de Acidez
A análise físico-química de acidez foi realizada de acordo com os métodos oficiais recomendados pela Association of Official Analitical Chemists (AOAC, 1997). A acidez foi determinada através do método de titulação com NaOH 0,1 M (f = 1,0) utilizando-se como indicador de pH fenolftaleína 1%, sendo a mesma expressa em % de ácido lático.
3.5.3 Análise de Aa e Umidade
A atividade de água (Aa) foi medida em um analisador de atividade de água (Aqualab, Model Série 4 TE, Decagon Devices, Inc., Pullman, WA). Amostras de cada tratamento foram analisadas em triplicata, durante o respectivo tempo de armazenamento dos queijos (2, 22 e 46 dias).
Para a análise de umidade, foram pesadas amostras de 10g de queijo em placas de vidro previamente secas em estufa a 105°C. Após a pesagem as amostras foram secas por 24 horas em estufa a 105°C. Depois, foram retiradas e mantidas em jarras de secagem com sílica. Após o resfriamento das amostras, estas foram pesadas (AOAC, 1997).
O cálculo do valor de umidade seguiu a seguinte equação: 100xN/ P
Sendo:
N= n° de gramas de umidade (perda de massa em gramas) P= n° de gramas da amostra
3.5.4 Análise de Cor Instrumental
Para a análise de cor instrumental, amostras de queijo Minas frescal foram coletadas e cortadas em forma de cubos. Foram feitas leituras da parte superficial e da parte interna dos queijos. O equipamento utilizado nesta análise foi o MiniScan EZ System (HunterLab, Reston, VA) sendo empregado a escala CIALAB (L*, a*, b*).
