MARCELO VALDENÉSIO FORTUNATO
PATOLOGIA DO BERBIGÃO (bivalvia, veneridae) NO LITORAL CATARINENSE
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Aquicultura da Universidade Federal de Santa Catarina, como requisito parcial para obtenção do Grau de Mestre em Aquicultura. Orientadora: Dra. Aimê Rachel Magenta Magalhães Coorientadora: Dra. Maria Alcina Martins de Castro
Florianópolis Julho/2018
AGRADECIMENTOS
Agradeço à professora Aimê pela orientação durante a pesquisa e por todas as experiências das quais pude fazer parte durante minha formação.
À Maria Alcina, mais que coorientadora, uma parceira de pesquisa, agradeço por todas as contribuições, sem isso, essa pesquisa não teria sido realizada.
Simone, faltam palavras para agradecer pelo apoio, confiança e generosidade!! Obrigada por estar na banca, no whatsapp, nos e-mails, em casa, no telefone... hahahaha... Obrigado!
Pancho, obrigado pelos valorosos comentários com relação ao trabalho. Sem dúvida, contribuíram muito para melhorar a qualidade da pesquisa.
Ana Lúcia, agradeço pelas dicas no laboratório durante o processamento das amostras.
Ao pessoal do "grupo do berbigão" - em particular à Rafaela e à Gabriela - que auxiliou nos procedimentos de coleta e análise "botando a mão na massa" e agilizando contatos.
Seu Aristides, obrigado por ter sido receptivo e por ter dado apoio fundamental nas coletas na RESEX.
Professores do PPGAQI que auxiliaram de diferentes formas, compartilhando seus conhecimentos e experiências, obrigado.
Aos professores, técnicos, funcionários e colegas, que fazem do NEPAQ/UFSC sua segunda casa e tornam o dia a dia muito mais leve e agradável, meu muito obrigado.
Agradeço também a todo pessoal que esteve comigo em algum momento dessa pesquisa!!
O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) – Código de Financiamento 001.
RESUMO
No Brasil, o cultivo de moluscos de areia ainda é inexistente. No entanto, podemos destacar a extração de várias espécies, como Anomalocardia
brasiliana (Gmelin, 1791), que possui grande importância
sócio-econômica, principalmente para as comunidades litorâneas tradicionais das regiões nordeste e sul. Diversos grupos de organismos apresentam espécies patogênicas para moluscos, como vírus, bactérias, protozoários, fungos, trematódeos, cestódeos, nematódeos, copépodes e decápodes. A presença de parasitos pode retardar o crescimento, diminuir o potencial reprodutivo, a resistência ao estresse e a sobrevivência dos moluscos. As enfermidades afetam a saúde dos bivalves marinhos em várias partes do mundo e comprometem não só a produção de cultivo, mas também o extrativismo. A Reserva Marinha Extrativista do Pirajubaé (RESEX), localizada na Ilha de Santa Catarina, Brasil, foi criada devido ao importante estoque natural do berbigão Anomalocardia brasiliana (Gmelin, 1791), molusco de areia que sustenta a atividade de explotação pela comunidade local. No verão de 2015 foi relatada a mortalidade em massa desses bivalves, cuja causa ainda não foi esclarecida. O objetivo dessa pesquisa foi estudar os patógenos de berbigões A. brasiliana distribuídos ao longo do litoral de Santa Catarina, de forma a contribuir para a compreensão das causas da mortalidade. As coletas de
Anomalocardia brasiliana foram realizadas entre os meses de abril de
2017 a fevereiro de 2018, nos municípios de Florianópolis (RESEX) e Palhoça, onde ocorreram o registro de mortalidades, Imbituba e São Francisco do Sul, onde não houve o registro desse fenômeno, sendo uma coleta por estação do ano em cada local, totalizando 870 berbigões. Foram aferidas a temperatura e a salinidade da água do mar e o comprimento dos berbigões. Na análise microscópica de patógenos de notificação obrigatória, foi adotado o protocolo definido pela OIE, incluindo a técnica RFTM. Na análise histológica foi registrado o sexo do animal, a presença de parasitos e de alterações nos tecidos dos berbigões. Análises estatísticas foram aplicadas nos cálculos de prevalência e infestação. Os resultados mostram a presença de 10 diferentes organismos em associação com os berbigões, dos quais destacam-se em alta prevalência (n=23/30) e intensidade (43,1% de tecido do patógeno na região da gônada), na amostragem do outono, os esporocistos de trematódeos, contendo larvas cercárias em diferentes estágios de desenvolvimento.
Palavras-chave: Aquicultura; Anomalocardia brasiliana; Parasito; Trematódeos; Esporocistos.
ABSTRACT
In Brazil, clam cultivation is still non-existent. However, we highlight the extraction of several species, such as Anomalocardia brasiliana (Gmelin, 1791), which has great socioeconomic importance, mainly for the coastal communities of northeast and south regions. Several groups of organisms present pathogenic species for clams as viruses, bacteria, protozoa, fungi, trematodes, cestodes, nematodes, copepods and decapods. The presence of parasites can slow down the growth and decrease the reproductive potential, the stress resistence and the survival of clams. Diseases affect the health of sea bivalves in many parts of the world and compromise not only crop production but also extractivism. The Reserva Marinha Extrativista do Pirajubaé (RESEX), located on the Island of Santa Catarina, Brazil, is an important stock of Anomalocardia
brasiliana (Gmelin, 1791); a clam that sustains the exploitation activity
of the local community. In the summer of 2015 it was reported the mass mortality of these clam, the cause of which has not yet been clarified. The objective of this research was to study the pathogens of A.
brasiliana clams distributed along Santa Catarina coast in order to
contribute to the understanding the causes of mortality reported in 2015. The collections of Anomalocardia brasiliana were carried out between April 2017 and February 2018, in Florianópolis (RESEX), Palhoça, Imbituba and São Francisco do Sul, with one collection per season in each location, totalizing 870 clams. Sea water temperature and salinity and the length of the samples were measured. In the microscopic analysis for obligatory notification pathogens we adopted the protocol defined by OIE, including the RFTM technique. In the histological analysis was recorded the sex of the animal, the presence of parasites and damage in the tissues of the clams. Statistical analyzes were applied for prevalence and infestation determination. The results show the presence of ten different organisms in association with clams, of which we highlight in high prevalence (n=23/30) and intensity (43,1% of pathogen tissue in the gonadal region) sporocysts of trematodes, containing cercaria larvae at distinct stages of development.
Key-words: Aquaculture; Anomalocardia brasiliana; Parasite; Trematodes; Sporocists.
LISTA DE FIGURAS INTRODUÇÃO GERAL
Figura 1. (A) Anomalocardia brasiliana. (B) Setas: espécimes enterrados no substrato areno-lodoso ... 18 Figura 2. Ciclo de vida do Bucephalus sp. (FERREIRA; MAGALHÃES, 2004) ... 24 CAPÍTULO I
Figura 1. Litoral catarinense, ressaltando os quatro locais de coleta do berbigão Anomalocardia brasiliana. Local I = RESEX; II = Palhoça; III = Lagoa da Ibiraquera e IV = São Francisco do Sul ... 33 Figura 2. Temperatura da água do mar (Cº) por local e estação do ano ... 35 Figura 3. Salinidade da água do mar (‰) por local e estação do ano ... 35 Figura 4. Pseudomyicola sp. encontrado na cavidade palial de Anomalocardia brasiliana. Setas= saco de ovos ... 36 Figura 5. Prevalência (%) do copépode Pseudomyicola sp. encontrado nos berbigões estudados da RESEX, Palhoça e São Francisco do Sul, através da análise macroscópica ... 37 Figura 6. Quantidade média do copépode Pseudomyicola sp. encontrado nos berbigões estudados da RESEX, Palhoça e São Francisco do Sul, através da análise macroscópica ... 37 Figura 7. Metacercária encistada no reto de Anomalocardia brasiliana. Seta grossa = espessa parede do cisto; seta fina = coroa de espinhos ... 38 Figura 8. Prevalências (%) de metacercárias encontradas no reto dos berbigões analisados de cada local de coleta e estação do ano e a média geral por local ... 39 Figura 9. Quantidade média de metacercárias encistadas no reto dos berbigões após período de incubação em RFTM ... 39 Figura 10. Metazoário não identificado encistado na brânquia de Anomalocardia brasiliana. Seta grossa = metazoário encistado; seta fina = par de ocelos ... 40 Figura 11. Prevalências (%) de metacercárias encontradas nas brânquias dos berbigões analisados de cada local de coleta e estação do ano ... 40 Figura 12. Quantidade média de metazoários encistados nas brânquias dos berbigões de cada local de coleta após período de incubação em RFTM ... 41 Figura 13. Metazoário não identificado isolado da brânquia de Anomalocardia brasiliana e corado pelo método de regressão para
helmintos. Oo= par de ocelos pigmentados. Ve= vesícula excretora. Vo= vesícula oral. Vv= vesícula ventral ... 42 Figura 14. Hipnósporos de Perkinsus-like encistados na brânquia de Anomalocardia brasiliana após período de incubação em meio RFTM ... 42 Figura 15. Ciliado não identificado (setas) presente na cavidade palial (A); nas brânquias (B) e no folículo masculino (C) ... 43 Figura 16. Gônada de Anomalocardia brasiliana repleta de esporocistos de trematódeos não identificados, contendo larvas cercárias em diferentes fases de desenvolvimento. E = esporocisto; seta grossa = cercária; seta fina = massa germinativa ... 44 Figura 17- Prevalência (%) de esporocistos de trematódeos encontrada nos berbigões coletados nos diferentes locais e estações do ano ... 45 Figura 18. Porcentagem média do tecido da gônada dos berbigões parasitados, coletados nos diferentes locais e estações do ano, substituída por tecido de esporocistos de trematódeos ... 45 Figura 19. Grau de infestação por esporocistos de trematódeos nos berbigões, analisados através da gratícula de Weibel ... 46 Figura 20. Metacercária não identificada encistada no manto de Anomalocardia brasiliana. Setas finas = metacercária; seta grossa = coroa de espinhos ... 46 Figura 21. Prevalência (%) de metacercárias de trematódeos encistadas no manto de Anomalocardia brasiliana coletados na RESEX e em Palhoça ... 47 Figura 22. Quantidade média de metacercárias de trematódeos encistadas nos berbigões coletados da RESEX e Palhoça nas diferentes estações do ano ... 47 Figura 23- Metazoário encistado na brânquia de Anomalocardia brasiliana. Seta grossa = metazoário encistado; seta fina = vesícula oral ... 48 Figura 24. Prevalência (%) de metazoário encistado nas brânquias da Anomalocardia brasiliana coletadas na RESEX, em Palhoça e São Francisco do Sul... 48 Figura 25. Quantidade média de metazoários encistados nas brânquias de Anomalocardia brasiliana coletadas nos diferentes locais de coleta e estações do ano ... 49 Figura 26. Larva em encapsulamento do Cestoda Tylocephalum sp. encistado no tecido conjuntivo, próximo à glândula digestiva. Seta fina = cápsula; seta grossa = larva... 49 Figura 27. Esporocistos de Steinhausia-like parasitando o citoplasma de oócitos de Anomalocardia brasiliana. Cabeça de seta = folículo gonádico; seta grossa = oócitos; seta fina = esporocistos ... 50
LISTA DE TABELAS INTRODUÇÃO GERAL
Tabela 1. Patógenos registrados em berbigões A. brasiliana no litoral brasileiro, a partir de Boehs et al. (2012) e Sühnel et al. (2016) ... 20 CAPÍTULO I
Tabela 1. Patógenos registrados em berbigões Anomalocardia brasiliana no litoral brasileiro, a partir de Boehs et al. (2012) e Sühnel et al. (2016) ... 31 Tabela 2. Quantidade de animais observados nos níveis de infestação leve, moderado e pesado, parasitados por metacercárias de trematódeos encistadas no reto, metazoários encistados nas brânquias e encontrados nos berbigões analisados por locais (n=120), após incubação em RFTM ... 41 Tabela 3. Dados de prevalência (%) de ciliados registrados nos berbigões dos diferentes locais de coleta e estações do ano, observados através da análise histopatológica ... 44 Tabela 4. Prevalência (%) de Tylocephalum sp. e Steinhausia-like registrado nos berbigões analisados ... 50 Tabela 5. Dados de intensidade média dos patógenos registrados nos berbigões dos diferentes locais de coleta e estações do ano, observados através da análise histopatológica ... 51
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO GERAL ... 17
CAPÍTULO I ... 27
Patologia do berbigão do litoral catarinense... 27
1-INTRODUÇÃO ... 29
2-MATERIAIS E MÉTODO ... 32
2.1-Análise estatística ... 34
3-RESULTADOS ... 35
3.1- Variáveis ambientais, biometria e sexagem ... 35
3.2-Parasitos externos ... 36 3.3-Achados no RFTM ... 38 3.4- Histopatologia ... 43 4-DISCUSSÃO ... 51 5-CONCLUSÃO ... 56 REFERÊNCIAS ... 56
INTRODUÇÃO GERAL
A aquicultura participa de maneira efetiva na produção de alimentos, na fixação de comunidades tradicionais litorâneas e na geração de trabalho e renda. No ano de 2014, a aquicultura ultrapassou a pesca na oferta de animais aquáticos destinado ao consumo humano, produzindo aproximadamente 73,8 milhões de toneladas e gerando mais de 160 bilhões de dólares. Os principais animais cultivados foram os peixes (67,5%), seguido pelos moluscos (21,8%) e crustáceos (9,3%). Dentre os moluscos cultivados, podemos destacar os moluscos de areia, que a partir de 2010 superaram os ostreídeos em termos de toneladas produzidas (FAO, 2016).
No Brasil, o cultivo de moluscos de areia ainda é inexistente. No entanto podemos destacar a extração de várias espécies, como
Anomalocardia brasiliana (Gmelin, 1791), que possui grande
importância sócio-econômica, principalmente para as comunidades litorâneas tradicionais das regiões nordeste e sul (SILVA-CAVALCANTI; COSTA, 2011).
Anomalocardia brasiliana (Figura 1A) é popularmente conhecida
como berbigão, vôngole, maçunim e chumbinho, em função da região onde ocorre (BOEHS et al., 2008). Pertence à família Veneridae, que abriga espécies de grande interesse comercial em todo o mundo, como
Ruditapes philippinarum e Mercenaria mercenaria. Segundo Rios
(2009), A. brasiliana ocorre desde as Antilhas até o Uruguai, incluindo todo o litoral brasileiro. Prefere solos areno-lodosos costeiros, localizados em áreas abrigadas da ação das ondas e correntes, sendo encontrado em baías, enseadas e estuários, na faixa entremarés e no infralitoral raso, enterrando-se superficialmente no substrato (Figura 1B). O berbigão A. brasiliana é um bivalve eurihalino e euritérmico, ou seja, suporta ampla faixa de salinidade e temperatura, respectivamente, sobrevivendo também por longos períodos de anoxia (SCHAEFFER-NOVELLI, 1976; LEONEL et al., 1983).
Pesquisas referentes à biologia reprodutiva do berbigão A.
brasiliana do litoral brasileiro já foram realizados por Narchi (1976);
Grotta e Lunetta (1980); Boehs (2000); Araújo (2001); Barreira e Araújo (2005); Aveiro et al. (2011), comprovando que a espécie apresenta ciclo gametogênico variado em função da região e suas diferentes condições climáticas e ambientais. Na região nordeste do Brasil por exemplo, foi observado indivíduos produzindo gametas durante todo o ano (GROTTA; LUNETTA, 1980). Já na região sul, no
inverno, foi constatado período de repouso parcial (BOEHS, 2000) e total.
Figura 1. (A) Anomalocardia brasiliana. (B) Setas: espécimes enterrados no substrato areno-lodoso.
O berbigão A. brasiliana apresenta potencial para o cultivo. Estudos visando a produção de larvas e sementes em condições de laboratório já foram iniciados nos estados de Santa Catarina, Pernambuco e Rio Grande do Norte, fruto de uma parceria entre o governo canadense e o governo brasileiro (LAGREZE et al., 2014). As pesquisas geraram conhecimentos sobre a maturação de reprodutores, visando maximizar a obtenção de gametas maduros e sobre a larvicultura, assentamento e manutenção das sementes. Lagreze et al. (2014) consideram que para a sustentabilidade da exploração e cultivo do berbigão é necessário um maior entendimento da biologia desta espécie, como parte da elaboração de um manual de cultivo. Segundo os autores, esses estudos tornaram possível a produção de sementes de berbigão no Laboratório de Moluscos Marinhos da UFSC. No entanto, ainda se fazem necessários maiores conhecimentos sobre alguns aspectos técnicos, tais como: tamanho e a densidade das sementes para transferência para o mar; melhor época do ano de semeadura; eficiência do processo de transferência; manejo das sementes no mar e o estado de saúde dos animais.
As Baías Sul e Norte da Ilha de Santa Catarina possuem extensos estoques naturais de A. brasiliana, onde se desenvolve a prática da extração (BOEHS; MAGALHÃES, 2004). Segundo relato de extrativistas dessas regiões, ocorreu mortalidade massiva dos berbigões, num curto período, de cerca de 20 dias, em fevereiro de 2015 e, desde então, não se observou recuperação dos estoques naturais dessa espécie (ABRAHÃO et al., 2017). Os motivos pelos quais os animais morreram ainda não foram esclarecidos e podem estar relacionados a fatores
antropogênicos, como poluição e sobre-explotação, e/ou ambientais, como salinidade, temperatura ou ainda devido a ocorrência de enfermidades.
Gosling (2003) e Magalhães e Ferreira (2006) afirmam que diversos grupos de organismos apresentam espécies patogênicas para moluscos, como vírus, bactérias, protozoários, fungos, trematódeos, cestódeos, nematódeos, copépodes e decápodes. A presença de parasitos pode retardar o crescimento, diminuir o potencial reprodutivo, a resistência ao estresse e a sobrevivência dos moluscos. As enfermidades afetam a saúde dos bivalves marinhos em várias partes do mundo e comprometem não só a produção de cultivo, mas também o extrativismo (BOEHS et al. 2012). Segundo Figueras (2011), a prevenção e o controle das doenças são alguns dos principais desafios da malacocultura mundial.
Dentre os patógenos, estão sete espécies de notificação obrigatória à Organização Mundial da Saúde Animal (OIE, 2018): os protozoários Perkinsus marinus; Perkinsus olseni; Bonamia exitiosa;
Bonamia ostrea; Marteilia refringens; a bactéria Xenohaliotis
californiensis e o herpesvírus do abalone. Todos os organismos que
compõem a lista já causaram grandes prejuízos socio-econômicos e foram associados a mortalidades em massa de determinadas espécies de moluscos ao redor do mundo, sendo considerados verdadeiros problemas.
Segundo Villalba et al. (2004), espécies do gênero Perkinsus estão entre os patógenos de bivalves marinhos mais estudados no mundo, devido à sua alta patogenicidade. Perkinsus marinus devastou cultivos inteiros da ostra americana Crassostrea virginica nos Estados Unidos da América, na década de 1940. Já Perkinsus olseni é responsável pela limitação na produção dos moluscos de areia Ruditapes
philippinarum e Ruditapes decussatus em países como Portugal,
Espanha, França e Itália (JUSTINE, 2008).
No Brasil ainda não se tem registro de grandes mortalidades de moluscos devido a ação de patógenos. Entretanto, segundo Boehs et al. (2012), as pesquisas com enfermidades que afetam bivalves marinhos ao longo do litoral brasileiro avançaram significativamente nos últimos anos e vêm revelando a presença de alguns agentes potencialmente patogênicos do grupo das bactérias, fungos, protozoários (Ciliophora, Apicomplexa, Perkinsozoa e Microspora) e metazoários (Turbellaria, Digenea, Cestoda, Polychaeta, Pinnotheridae e Copepoda) nas principais espécies de importância sócio-econômica da costa brasileira como as ostras (Crassostrea rhizophorae, Crassostrea gasar e Crassostrea
gigas), os mexilhões (Perna perna, Mytella guyanensis e Mytella falcata), as vieiras (Nodipecten nodosus) e os moluscos de areia
(Anomalocardia brasiliana, Tagelus plebeius, Lucina pectinata,
Iphigenia brasiliana e Mesodesma mactroides).
Os parasitos mais comuns em bivalves marinhos no Brasil são os poliquetos, como Polydora websteri e os trematódeos digenéticos da família Bucephalidae, sendo os esporocistos desses trematódeos considerados, até o momento, a maior ameaça para indivíduos e populações de bivalves da costa brasileira (BOEHS et al., 2012).
Os principais estudos realizados no Brasil sobre a ocorrência de patógenos no berbigão A. brasiliana, estão apresentados na tabela 1, ressaltando locais e autores.
Tabela 1. Patógenos registrados em berbigões A. brasiliana no litoral brasileiro, a partir de Boehs et al. (2012) e Sühnel et al. (2016).
As enfermidades podem contribuir significativamente para a mortalidade em massa de moluscos bivalves (BOWER et al., 1994). Segundo Malham et al. (2012), parasitas, patógenos e comensais podem prejudicar a saúde de berbigões a nível individual ou populacional, embora haja atualmente uma falta de compreensão da ligação entre infestação e mortalidade em massa. Burdon et al. (2014) consideram provável que o impacto desses organismos possa contribuir indiretamente para a mortalidade em massa, enfraquecendo indivíduos ou infectando indivíduos que já tenham sido estressados por outros fatores.
O primeiro registro de uma espécie do gênero Perkinsus no Brasil foi realizado por Sabry et al. (2009) em ostras Crassostrea
rhizophorae no estado do Ceará. Na ocasião, foi feita notificação ao
Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) e o diagnóstico oficial revelou Perkinsus beihaiensis. O primeiro caso de notificação obrigatória à OIE ocorreu em 2013, quando Da Silva et al. (2013) encontraram o protozoário Perkinsus marinus em ostras C.
rhizophorae do Rio Paraíba, estado da Paraíba, também no nordeste
brasileiro. Em ambos os casos, a presença do parasita não foi associada a danos no hospedeiro.
No estado de Santa Catarina foram registrados em 2012 grandes mortalidades de Crassostrea gasar no litoral do município de São Francisco do Sul. Em análises posteriores entre janeiro de 2013 e dezembro de 2014, abrangendo os principais pontos de produção de moluscos em Santa Catarina, Cunha (2016) confirmou a presença de
Perkinsus beihaiensis parasitando C. gasar na localidade de Balneário
Barra do Sul e P. marinus infectando Crassostrea gigas e C. gasar em São Francisco do Sul. Esse foi o primeiro relato do protozoário P.
marinus infectando C. gigas na América do Sul. Apesar da presença do
patógeno, não foi evidenciada sua relação com mortalidade das ostras. Em pesquisa realizada por Ferreira et al. (2015) no estado do Ceará, foi encontrado Perkinsus beihaiensis infectando o berbigão
Anomalocardia brasiliana. Apesar do parasitismo, não houve relato de
mortalidades do molusco. Este foi o primeiro registro desta espécie, parasitando um bivalve que não é da família Ostreidae, no mundo.
Em moluscos de areia, Villalba et al. (1999) encontraram alta prevalência da bactéria Rickettsia-like ao pesquisarem Venerupis
rhomboides coletados na costa da Galícia/Espanha. Os bivalves
apresentavam colônias da bactéria nas células dos divertículos da glândula digestiva, além de hipertrofia extrema e lise nas células da base dos filamentos branquiais, o que, segundo o autor, compromete o bom
funcionamento das brânquias e pode ser apontado como a provável causa de mortalidades em massa de algumas populações deste bivalve. Carballal et al. (2001) também encontraram colônias intracelulares da mesma bactéria parasitando o epitélio das brânquias (prevalência média de 13%) e as células digestivas (prevalência média de 15%) do bivalve de areia Cerastoderma edule da costa da Galícia.
No Brasil, colônias de bactérias Rickettsia-like foram encontradas com baixa prevalência em A. brasiliana do litoral cearense, causando também hipertrofia às células infectadas e, em alguns casos, lise celular (ROMÃO et al., 2014). Resultado semelhante também foi observado por Cremonte et al. (2005), ao estudarem os bivalves de areia
Pitar rostrata coletados no Uruguai. As espécies de bivalves Mytella guyanensis coletados na Bahia (BOEHS et al., 2010) e Crassostrea gigas em Santa Catarina (PONTINHA, 2009) são outros hospedeiros de
ocorrência no Brasil que apresentaram baixa prevalência e ausência de danos aparentes.
Outros patógenos muito comuns em bivalves de interesse econômico ao redor do mundo são as gregarinas do gênero Nematopsis (BOWER et al., 1994). Os Nematopsis são protozoários intrahemocíticos e sua forma infectante é conhecida como oocisto, encontrado habitualmente nas brânquias e no manto dos bivalves (BOEHS et al., 2012), apesar de várias espécies de gregarinas terem seu ciclo de vida em diferentes tecidos de bivalves marinhos (AZEVEDO; CACHOLA, 1992). Normalmente não causam danos significativos aos seus hospedeiros (BOWER et al., 1994). No entanto, quando presentes com alto grau de infecções, podem causar reações hemocitárias focais e lesões moderadas (CARBALLAL et al., 2001). Azevedo e Cachola (1992) afirmaram que a mortalidade em massa de Cerastoderma edule ocorrida em Portugal, foi consequência da infestação pesada de
Nematopsis sp., que destruíram as células das brânquias dos animais
infectados, ocasionando a diminuição da eficiência de filtração e alimentação. Esses parasitos do filo Apicomplexa, utilizam os moluscos como hospedeiros intermediários e completam seu ciclo de vida no trato intestinal de crustáceos.
No Brasil, segundo revisão de Sühnel et al. (2016), oocistos de
Nematopsis sp. foram encontrados em Anomalocardia brasiliana, do
estado da Bahia; em ostras Crassostrea gigas, de Santa Catarina; em C.
rhizophorae dos estados da Bahia, Ceará, Santa Catarina e São Paulo;
em C. gasar dos estados da Paraíba e Sergipe; nos mexilhões Perna
perna do Rio de Janeiro e Santa Catarina e Mytella guyanensis do
associados a mortalidades, pois ocorreram em baixa prevalência, com danos restritos aos animais com taxas de infestações mais elevadas.
Steinhausia mytilovum são parasitos microsporídeos
intracelulares que aparentam completar seu ciclo de vida em um único hospedeiro. No entanto, por ocorrerem geralmente em baixa prevalência e com poucos cistos/oócitos, não apresentam importância econômica (LAUCKNER, 1983). Foi observado por Carballal et al. (2001) em
Cerastoderma edule sem apresentar lesões significativas nos
hospedeiros. No Brasil, segundo revisão de Sühnel et al. (2016), foi registrada a ocorrência da espécie S. mytilovum em Mytella guyanensis, coletados no estuário do rio Amazonas (MATOS et al., 2005). Outros autores registraram a ocorrência de Steinhausia sp. parasitando oócitos de A. brasiliana (DA SILVA et al., 2012; SÜHNEL et al., 2016) e
Crassostrea gigas (PONTINHA, 2009), no estado de Santa Catarina; de C. rhizophorae do estado do Ceará (SABRY et al., 2013) e de Santa
Catarina (SABRY et al., 2011) e de C. gasar oriundas de Sergipe (DA SILVA et al., 2015).
Segundo Lauckner (1983), os trematódeos digenéticos estão entre os parasitos mais comuns e importantes de bivalves marinhos, podendo levar à castração parasitária. Esses organismos apresentam diferentes fases de desenvolvimento e envolvem em seu ciclo de vida a presença de dois hospedeiros intermediários e um hospedeiro definitivo (figura 2). Segundo o autor, as espécies das famílias Bucephalidae, Sanguinicolidae e Fellodistomidae utilizam os bivalves como primeiros hospedeiros intermediários (fase de esporocistos e cercárias) e as espécies da família Echinostomatidae, como segundos hospedeiros intermediários (fase de metacercária). Já as espécies da família Gymnophallidae e Monarchidae podem utilizar os bivalves tanto como primeiros ou segundos hospedeiros intermediários. Muito raramente esses patógenos utilizam os bivalves como hospedeiros definitivos.
Thieltges e Reise (2006), ao estudarem notável mortalidade de
Cerastoderma edule na Alemanha, concluíram que esporocistos de
trematódeos, como Gymnophalus choledochus, podem levar à castração parasitária e devem ser considerados como provável fator de mortalidade em populações de berbigões adultos. Jonsson e André (1992) concluíram que a intensidade de infestação por esporocistos de trematóides causou danos nos tecidos de Cerastoderma edule, prejudicando a capacidade dos animais de se enterrarem, sendo provavelmente a causa de mortalidades em massa dessa espécie de berbigão na Escandinávia, região geográfica da Europa setentrional.
Figura 2. Ciclo de vida do Bucephalus sp. (FERREIRA; MAGALHÃES, 2004).
No Brasil, segundo revisão de Sühnel et al. (2016), esporocistos de bucefalídeos já foram relatados em A. brasiliana dos estados do Ceará, Santa Catarina e São Paulo. Também já foram observados nos mitilídeos Perna perna do Rio de Janeiro, Santa Catarina e São Paulo e
Mytella guyanensis da Bahia, além de ostras Crassostrea rhizophorae,
da Bahia. Marchiori et al. (2010) identificaram a espécie Bucephalus
margaritae utilizando mexilhões Perna perna de Santa Catarina como
primeiro hospedeiro intermediário. Schaeffer et al. (2017) encontraram esporocistos de B. margaritae com prevalência média de 16,1 e 14,4% nos mexilhões de cultivos de Florianópolis e Palhoça, respectivamente, localizados na Baía Sul da Ilha de Santa Catarina.
Os bucefalídeos causam nos mitilídeos a doença conhecida como bucefalose ou “doença laranja”, evidenciada pela coloração alaranjada no manto (MAGALHÃES; FERREIRA, 2006). Esse mesmo padrão de coloração não se observa em outros bivalves, como as ostras e berbigões por exemplo. Os esporocistos destroem as gônadas do hospedeiro em função dos danos mecânicos e da decomposição fisiológica de tecidos (WINSTEAD et al., 2004). Em caso de alta infestação, além das gônadas, é possível observá-los em outros órgãos, como glândula digestiva, manto, pé e brânquia.
Metacercárias de trematódeos, não identificadas, já foram registradas com baixa prevalência parasitando o tecido conjuntivo da glândula digestiva de A. brasiliana no litoral sul da Bahia (SOUZA; BOEHS, 2008; BOEHS et al. 2010). Da Silva et al. (2012) registraram a ocorrência de metarcercária de família não identificada encapsulada no
tecido dos rins de berbigão coletado em Santa Catarina, o que, segundo os autores, poderia sugerir que o trematódeo pertença à família Monarchiidae. Metacercárias de Parvatrema sp. (família Gymnophalidae) foram observadas encistadas, com alta prevalência, no manto de Tagelus plebeius da Praia da Daniela, Baía Norte da Ilha de Santa Catarina. Nas gônadas desses mesmos moluscos, também foram observadas metacercárias encistadas de trematódeos da família Echinostomatidae (DA SILVA et al., 2009).
Apesar das metacercárias de trematódeos não provocarem a castração parasitária e apresentarem danos menos significativos aos bivalves do que os esporocistos, elas podem induzir uma grande variedade de respostas fisiológicas, bioquímicas, morfológicas e comportamentais em seus respectivos hospedeiros, tais como: debilitação geral; dificuldade para o bivalve se fechar; deformidades na concha; erosão química na concha; hipertrofia ou atrofia dos tecidos infestados, comprimindo tecidos adjacentes; alterações no comportamento dos hospedeiros, facilitando a detecção e a predação pelo hospedeiro final; aumento no consumo de oxigênio e taxa metabólica; mudanças na resposta do hospedeiro ao estresse ambiental; autotomia de partes do corpo (sifões) e, em infestações intensas, a morte do hospedeiro (LAUCKNER, 1983).
Metacestóides do gênero Tylocephalum (Linton, 1890) são frequentemente observadas em bivalves marinhos, principalmente
Crassostrea sacco e ostras perlíferas do gênero Pinctada, de regiões
subtropicais e tropicais. Nesses moluscos podem ser encontrados com alta prevalência e intensidade de infestação, provocando forte reação de defesa do hospedeiro (LAUCKNER, 1983). No Brasil já foram observados, sempre apresentando baixa prevalência e intensidade de infestação, em Crassostrea gigas (SABRY; MAGALHÃES, 2005; SABRY et al., 2011; DA SILVA et al., 2012); em C. rhizophorae (ZEIDAN et al., 2012; SABRY et al., 2013; SÜHNEL et al., 2016) em
A. brasiliana (FERREIRA et al., 2008; BOEHS et al., 2010; BOEHS et
al., 2012; SÜHNEL et al., 2016); em Iphigenia brasiliana (BOEHS et al., 2010); e em Perna perna (DA SILVA et al., 2012; SCHAEFER et al., 2017). Ocorrem preferencialmente nas proximidades da glândula digestiva, tubos digestivos e brânquias dos hospedeiros, provocando a formação de uma cápsula para envolver o parasito e, em alguns casos, forte reação hemocitária focal, conforme observado nas pesquisas citadas acima.
Microcrustáceos da subclasse Copepoda são considerados parasitos para bivalves marinhos (LAUCKNER, 1983) e algumas
espécies já foram associadas com moluscos comercialmente importantes. O copépode Pseudomyicola spinosus já foi registrado em mais de cinquenta espécies de bivalves ao redor do mundo, entre pectinídeos (CÁCERES-MARTINEZ et al., 2005), mitilídeos (CÁCERES-MARTINEZ et al., 1996; SCHAEFER et al., 2017), ostreídeos e venerídeos (FIGUEIRAS; VILLALBA, 1988; GOULLETQUER et al., 1998). Cáceres-Martinez e Vásquez-Yeomans (1997) descreveram efeitos histopatológicos causados por P. spinosus no manto e brânquias de Mytilus galloprovincialis e Mytilus
californianus. Já Schaefer et al. (2017) não detectaram danos em A. brasiliana e Perna perna, respectivamente.
Esses estudos que envolvem o monitoramento de enfermidades e as condições patológicas dos bivalves marinhos são importantes para se reconhecer os patógenos em potencial e incrementar o conhecimento sobre eles, facilitando desta maneira a implantação de possíveis medidas para prevenir epizootias em áreas produtoras de moluscos. Nesse contexto, o objetivo desse estudo é contribuir para o entendimento das causas da mortalidade de berbigões no litoral catarinense, através do estudo de patógenos.
CAPÍTULO I
Artigo científico a ser submetido ao Boletim do Instituto de Pesca (B1 no Qualis/CAPES quadriênio 2013-2016, área Zootecnia e Recursos Pesqueiros).
Patologia do berbigão do litoral catarinense
Marcelo Valdenésio FORTUNATO1, Maria Alcina Martins de CASTRO¹, Simone SÜHNEL¹, Claudio Manoel Rodrigues de
MELO2, Aimê Rachel Magenta MAGALHÃES¹
RESUMO
A Reserva Marinha Extrativista do Pirajubaé (RESEX), localizada na Ilha de Santa Catarina, Brasil, foi criada devido ao importante estoque natural do berbigão Anomalocardia brasiliana (Gmelin, 1791), molusco de areia que sustenta a atividade de explotação pela comunidade local. No verão de 2015 foi relatada a mortalidade em massa desses bivalves, cuja causa ainda não foi esclarecida. O objetivo dessa pesquisa foi estudar os patógenos de berbigões A. brasiliana distribuídos ao longo do litoral de Santa Catarina, de forma a contribuir para a compreensão das causas da mortalidade. As coletas de Anomalocardia brasiliana foram realizadas entre os meses de abril de 2017 a fevereiro de 2018, nos municípios de Florianópolis (RESEX) e Palhoça, onde ocorreram o registro de mortalidades, Imbituba e São Francisco do Sul, onde não houve o registro desse fenômeno, sendo uma coleta por estação do ano em cada local, totalizando 870 berbigões. Foram aferidas a temperatura e a salinidade da água do mar e o comprimento dos berbigões. Na análise microscópica de patógenos de notificação obrigatória, foi
1 Núcleo de Estudos em Patologia Aquícola (NEPAQ), Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC), Centro de Ciências Agrárias (CCA), Departamento de Aquicultura (AQI). Rodovia Admar Gonzaga, nº 1346, 88034-001, Florianópolis/SC, Brasil.
e-mail: marmarimba2@gmail.com (autor correspondente).
2 Laboratório de Moluscos Marinhos (LMM), Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC), Centro de Ciências Agrárias (CCA), Departamento de Aquicultura (AQI). Rua Dos Coroas, 503, Barra da Lagoa, 88061-600, Florianópolis/SC, Brasil
adotado o protocolo definido pela OIE, incluindo a técnica RFTM. Na análise histológica foi registrado o sexo do animal, a presença de parasitos e de alterações nos tecidos dos berbigões. Análises estatísticas foram aplicadas nos cálculos de prevalência e infestação. Os resultados mostram a presença de 10 diferentes organismos em associação com os berbigões, dos quais destacam-se em alta prevalência e intensidade (43,1% de tecido do patógeno na região da gônada), na amostragem do outono na RESEX, os esporocistos de trematódeos, contendo larvas cercárias em diferentes estágios de desenvolvimento.
Palavras-chave: Extrativismo; Anomalocardia brasiliana; Molusco de areia; Parasito; Trematódeos; Esporocistos.
Patology of Santa Catarina coast clams
ABSTRACT
The Reserva Marinha Extrativista do Pirajubaé (RESEX), located on the Island of Santa Catarina, Brazil, is an important stock of Anomalocardia
brasiliana (Gmelin, 1791); a clam that sustains the exploitation activity
of the local community. In the summer of 2015 it was reported the mass mortality of these clams, the cause of which has not yet been clarified. The objective of this research was to study the pathogens of A.
brasiliana clams distributed along Santa Catarina coast in order to
contribute to the understanding the causes of mortality reported in 2015. The collections of Anomalocardia brasiliana were carried out between April 2017 and February 2018, in Florianópolis (RESEX), Palhoça, Imbituba and São Francisco do Sul, with one collection per season in each location, totalizing 870 clams. Sea water temperature and salinity and the length of the samples were measured. In the microscopic analysis for obligatory notification pathogens we adopted the protocol defined by OIE, including the RFTM technique. In the histological analysis was recorded the sex of the animal, the presence of parasites and damage in the tissues of the clams. Statistical analyzes were applied for prevalence and infestation determination. The results show the presence of ten different organisms in association with clams, of which we highlight sporocysts of trematodes, containing cercaria larvae at distinct stages of development, in high prevalence and in RESEX clams.
Key-words: Extractivism; Anomalocardia brasiliana; Clams; Parasite; Trematodes, sporocists.
1-INTRODUÇÃO
No Brasil, até o presente momento, não há cultivo de moluscos de areia e o consumo é baseado na extração no ambiente natural. Dentre as espécies explotadas destaca-se Anomalocardia brasiliana pela sua importância sócio-econômica, principalmente para as comunidades litorâneas tradicionais das regiões nordeste e sul (Silva-Cavalcanti; Costa, 2011).
A. brasiliana é popularmente conhecida como berbigão,
vôngole, maçunim e chumbinho, variando em função da região onde ocorre (Boehs et al., 2008). Pertence à família Veneridae, que abriga espécies de grande interesse comercial em todo o mundo, como
Ruditapes philippinarum e Mercenaria mercenaria (FAO, 2016).
Ocorre desde as Antilhas até o Uruguai, incluindo todo o litoral brasileiro (Rios, 2009). Prefere solos areno-lodosos costeiros de áreas abrigadas da ação das ondas e correntes, sendo encontrada em baías, enseadas e estuários, na faixa entremarés e infralitoral raso, enterrando-se superficialmente no substrato (Rios, 2009). O berbigão A. brasiliana é um bivalve eurihalino e euritérmico, ou seja, suporta ampla faixa de salinidade e temperatura, respectivamente, sobrevivendo também por longos períodos de anoxia (Schaeffer-Novelli, 1976).
As Baías Sul e Norte da Ilha de Santa Catarina possuíam extensos estoques naturais de A. brasiliana, onde se desenvolvia a prática da extração (Boehs; Magalhães, 2004). Segundo relato de extrativistas da Reserva Extrativista Marinha do Pirajubaé (RESEX), ocorreu mortalidade massiva dos berbigões, num curto período de dias, em menos de 3 semanas, no verão de 2015 e, desde então, não se observou a recuperação dos estoques naturais dessa espécie (Abrahão et al., 2017). Os motivos pelos quais os animais morreram ainda não foram esclarecidos e podem estar relacionados a fatores antropogênicos, como poluição e sobre-explotação e/ou ambientais, como salinidade, temperatura ou ainda devido a ocorrência de enfermidades.
A RESEX está localizada em zona urbana da cidade de Florianópolis e sofreu grande impacto ambiental a partir da segunda metade da década de 1990, com a autorização do Poder Público para a construção de obra viária de grande porte, conhecida como Via Expressa Sul, a qual foi construída sobre o aterro retirado do sedimento do setor mais externo da própria Reserva. Essa obra reduziu a área de extração do berbigão de 240 para 140 ha, aumentando o esforço de pesca sobre o recurso (Pezzuto e Echternacht, 1999).
As enfermidades podem contribuir significativamente para a mortalidade em massa de moluscos bivalves (Bower et al., 1994) e comprometem não só a produção de cultivo, mas também o extrativismo (Boehs et al. 2012). Segundo Longshaw e Malham (2013), uma ampla gama de parasitas, patógenos e comensais podem prejudicar a saúde de berbigões a nível individual ou populacional, embora haja atualmente uma falta de compreensão da ligação entre infestação e mortalidade em massa. Burdon et al. (2014) consideram provável que o impacto desses organismos possa contribuir indiretamente para a mortalidade em massa, enfraquecendo indivíduos ou infectando indivíduos que já tenham sido estressados por outros fatores.
No Brasil, as pesquisas com patógenos de bivalves marinhos avançaram significativamente nos últimos anos e revelaram a presença de agentes potencialmente patogênicos (Boehs et al., 2012). Os principais estudos realizados no Brasil sobre a ocorrência de patógenos em Anomalocardia brasiliana, estão apresentados na Tabela 1, ressaltando locais e autores.
O protozoário Perkinsus beihaiensis foi encontrado parasitando
A. brasiliana no Estado do Ceará, com prevalência de 14,7% e níveis de
infestação variando de muito leve (1-10 células) a leve (12-100 células) (Ferreira et al., 2015). Espécies deste gênero já foram encontradas em ostras nos estados do Ceará (Sabry et al., 2009; 2013), Paraíba (Da Silva et al., 2013; Queiroga et al., 2013), Bahia (Brandão et al., 2013), Sergipe (Da Silva et al., 2014) e Santa Catarina (Cunha, 2016). Villalba et al. (2004) afirma que as espécies deste gênero estão entre os patógenos mais estudados no mundo, devido à sua alta patogenicidade para os bivalves marinhos de maneira geral. Em estudos patológicos envolvendo
A. brasiliana da RESEX Pirajubaé coletadas entre 2008 e 2010, não foi
registrada a presença de protozoários do gênero Perkinsus (Da Silva et al., 2012; Sühnel et al., 2016).
Tabela 1. Patógenos registrados em berbigões Anomalocardia brasiliana no litoral brasileiro, a partir de Boehs et al. (2012) e Sühnel et al. (2016).
Os trematódeos são considerados a maior ameaça potencial para indivíduos e populações de bivalves marinhos no litoral brasileiro (Boehs et al., 2012) e segundo Lauckner (1983), podem levar à castração parasitária. Os esporocistos destroem as gônadas do hospedeiro em função dos danos mecânicos e da decomposição fisiológica e tecidos (Winstead et al., 2004). Thieltges e Reise (2006), ao estudar notável mortalidade de Cerastoderma edule na Alemanha, concluíram que esporocistos de tramatódeos, como Gymnophalus
choledochus, podem levar à castração parasitária e, portanto, devem ser
considerados como provável fator de mortalidade em populações de berbigões adultos. Jonsson e André (1992) concluíram que a intensidade de infestação por esporocistos de trematóides causou danos
nos tecidos de Cerastoderma edule, prejudicando a capacidade dos animais de se enterrarem, sendo provavelmente a causa de mortalidades em massa dessa espécie de berbigão na Escandinávia, região geográfica da Europa setentrional.
A presença de esporocistos de trematóides foi detectada em berbigões de diferentes pontos da Baía Sul e Norte da Ilha de Santa Catarina. As prevalências de infestações variaram em função do local de coleta e estação do ano. Boehs e Magalhães (2004) registraram prevalência de 33% em A. brasiliana de Ratones, Baía Norte, coletados no outono de 2001. Ao estudarem os berbigões da Reserva Marinha do Pirajubaé (RESEX), localizada na Baía Sul, Da Silva et al. (2012) observaram prevalência de 1,25% no verão de 2008. Em coleta na mesma Reserva, Sühnel et al. (2016) registraram 57,50 e 97,5% de prevalência no inverno de 2009 e verão de 2010, respectivamente. Considerando a diversidade de organismos patogênicos e a mortalidade massiva dos berbigões ocorrida em 2015 na RESEX, o objetivo deste trabalho foi estudar os patógenos de berbigões A.
brasiliana no litoral de Santa Catarina.
2-MATERIAIS E MÉTODO
As coletas de Anomalocardia brasiliana foram realizadas nos seguintes locais do litoral catarinense (Figura 1):
- Local I: RESEX (município de Florianópolis) (S27º38'37.8" W 048º33'12.3"), local onde ocorreu mortalidade massiva dos berbigões no verão de 2015, situado em área urbanizada na Baía Sul da Ilha de Santa Catarina;
- Local II: Praia do Furadinho (município de Palhoça) (S 27º38'37.8" W 048º33'12.3"), localizada próximo à área urbanizada na porção continental na Baía Sul da Ilha de Santa Catarina. Local onde não houve registro de mortalidade no verão de 2015. No entanto, segundo relato de moradores e antigos extrativistas, apresenta atualmente seu estoque de berbigão bastante reduzido, estando praticamente extinta a prática desta atividade;
- Local III: Lagoa da Ibiraquera (município de Imbituba) (S 28º08'33.0" W 048º40'52.6"), localizada a 50 km ao sul da Ilha de Santa Catarina. Trata-se de uma laguna de água salobra, próxima ao mar, que eventualmente tem seu canal de ligação com o ambiente marinho aberto, possibilitando o fluxo de água. Nesse local não foi observada mortalidade de berbigão no verão de 2015 e a prática de extração ocorre de forma ocasional;
- Local IV: Praia do Marquinhos (São Francisco do Sul) (S 26º15'04.8" W 048º38'37.1"). Localizada na Baía da Babitonga, próxima ao Porto de São Francisco do Sul. Nessa região não foi registrada a ocorrência de mortalidades e a prática da extração ocorre de forma regular.
Figura 1. Litoral catarinense, ressaltando os quatro locais de coleta do berbigão Anomalocardia brasiliana. Local I = RESEX; II = Palhoça; III = Lagoa da Ibiraquera e IV = São Francisco do Sul.
Foram realizadas coletas trimestrais, sendo uma coleta por estação do ano, entre os meses de abril de 2017 (outono) e fevereiro de 2018 (verão). A amostra total foi de 870 berbigões, 120 de cada local para análise microbiológica (n= 480). Para análise macroscópica foram coletados 120 da RESEX e 90 dos outros locais (n= 390).
A determinação do número (n) amostral seguiu a metodologia adotada por Villanuena-Fonseca e Escobedo-Bonilla (2013) e Góngora-Gomes et al. (2016), que sugerem n de 30 hospedeiros para uma população de menos de 10.000 indivíduos e prevalência de patógenos esperada de 10%.
A temperatura e a salinidade da água do mar, medidas a 30 cm de profundidade, foram registradas em cada coleta com o uso de multiparâmetro Hanna. Os berbigões coletados foram colocados em caixas térmicas sem água e transportados até o Núcleo de Estudos em Patologia de Organismos Aquáticos da Universidade Federal de Santa Catarina (NEPAQ/UFSC), onde foram identificados e medidos no comprimento (mm) de cada animal.
Suas valvas foram abertas através do seccionamento do músculo adutor da concha, com uso de objeto perfuro-cortante, sobre uma placa de Petri, salvando o líquido intervalvar, que também foi analisado microscopicamente quanto à presença de parasitas. Os animais
destinados para microscopia (n=480) foram processados para análise de patógenos de notificação obrigatória, de acordo com o protocolo definido pela Organização Mundial de Saúde Animal (OIE, 2018). O processo incluiu a técnica de cultivo em meio de tioglicolato de Ray (RFTM), onde se avalia a brânquia e o reto, a histologia clássica, através de corte transversal dos indivíduos (HOWARD et al., 2004), que contempla o manto, gônada, brânquia, trato digestivo e glândula digestiva.
Na análise histológica foi registrado o sexo do animal, a presença de parasitos e de alterações nos tecidos dos berbigões. Foi utilizada a estereologia, com uso da gratícula de Weibel, para análise do grau de infestação do parasito nos tecidos do hospedeiro, baseado em Garcia e Magalhães (2008).
Os demais berbigões (n= 390) passaram por avaliação macroscópica através do uso de estereomicroscópio, avaliando-se a concha e toda a parte mole do animal.
2.1-Análise estatística
O cálculo da prevalência foi realizado conforme Bush et al. (1997), em que:
Prevalência total (%) = Número de animais infectados X 100 Número de animais examinados
A infestação média é a relação entre a quantidade de patógenos encontrados e o número de animais infestados.
A quantificação da infestação por esporocistos de trematóides foi calculada por meio da estereologia, com uso da gratícula de Weibel, em microscópio com objetiva de aumento de 10x, seguindo protocolo definido por Garcia e Magalhães (2008). O grau de parasitismo foi classificado em 3 níveis: leve (<5%), moderado (de 5-50%) e pesado (>50%) e se referem à quantidade de tecido dos patógenos presente no tecido do hospedeiro.
Foram calculados os valores médios e o desvio padrão (DP) do comprimento dos berbigões coletados, salinidade e temperatura da água. Os dados de prevalência e infestação foram analisados através do teste t com permutação (não paramétrico) usando multitest proc no SAS® (Westfall et al., 1999) e do teste Fisher, com um nível de significância de 0,05. Foram avaliadas diferenças entre locais de coleta, estação do ano, temperatura e salinidade.
3-RESULTADOS
3.1- Variáveis ambientais, biometria e sexagem
A maior e a menor temperatura da água do mar registrada ao longo da pesquisa, foram no município de Palhoça, 26,0ºC na coleta realizada no verão e 15,1ºC na coleta da primavera, respectivamente (Figura 2). A maior salinidade registrada foi de 27,2‰, na RESEX, no inverno e, a menor, 12,7‰ em Imbituba (Figura 3).
Figura 2. Temperatura da água do mar (Cº) por local e estação do ano.
Figura 3. Salinidade da água do mar (‰) por local e estação do ano.
O comprimento médio dos berbigões coletados foram: na RESEX, 30,37 ± 2,16 mm; na Palhoça 28,66 ± 3,82 mm; em Imbituba 20,64 ± 1,74 mm e em São Francisco do Sul, 25,77 ± 1,73 mm.
O sexo dos 480 berbigões estudados microscopicamente foi determinado através da análise histológica, totalizando 200 machos (41,67%), 224 fêmeas (46,67%) e 56 indeterminados (11,67%). Os indivíduos considerados indeterminados foram decorrentes da ausência de material reprodutivo na amostra, seja pela não observação de tecido gonádico (n= 30) ou substituição do mesmo por esporocistos de trematódeos (n= 26). A quantidade de machos e fêmeas não variou significativamente (p<0,05) entre os locais e as estações do ano. A proporção sexual entre os berbigões estudados, dos diferentes locais de coleta, foram: RESEX (0,57:1) e Palhoça (0,83:1) com dominância de
fêmeas; Imbituba (1,18:1) e São Francisco do Sul (1,13:1) com dominância de machos.
3.2-Parasitos externos
Através da análise macroscópica foram observados copépodes
Pseudomyicola sp. (Figura 4), em sua fase adulta, parasitando a
cavidade do manto de berbigões em 3 dos 4 locais de coleta. Em Imbituba não foi observada a presença deste copépode. O comprimento médio dos copépodes (n= 5), incluindo os sacos de ovos, foi de 736 ± 50,97 µm, sem o saco de ovos (n= 12) foi de 575,83 ± 64,48 µm. A média das larguras dos corpos dos copépodes (n= 10) foi de 171,50 ± 15,68 µm. O comprimento médio do saco de ovos (n= 8) foi de 261,56 ± 46,74 µm e dos ovos (n= 5) 46,10 ± 5,63 µm.
Figura 4. Pseudomyicola sp. encontrado na cavidade palial de Anomalocardia brasiliana. Setas= saco de ovos.
As prevalências de Pseudomyicola sp. observadas nos berbigões da RESEX foram estatisticamente superiores (p<0,05) às encontradas em Palhoça e São Francisco do Sul em todas as estações do ano. A exceção ocorreu no inverno, em que a prevalência foi estatisticamente igual à encontrada em São Francisco do Sul (Figura 5).
Figura 5. Prevalência (%) do copépode Pseudomyicola sp. encontrado nos berbigões estudados da RESEX, Palhoça e São Francisco do Sul, através da análise macroscópica.
A prevalência média de Pseudomyicola sp. encontrada ao longo da pesquisa nos berbigões da RESEX (64,2 ± 15,0) foi significativamente (p<0,05) superior às observadas em São Francisco do Sul (23,33 ± 14,53) e Palhoça (2,22 ± 1,92). A quantidade de
Pseudomyicola sp. encontrada nos berbigões variou entre 1 e 6 na
RESEX e 1 e 2 em São Francisco do Sul.
Em cada local de coleta, não foi observada diferença significativa de prevalência de Pseudomyicola sp. entre as estações do ano. A infestação média não apresentou diferença entre os locais de ocorrência de Pseudomyicola sp (Figura 6).
Figura 6. Quantidade média do copépode Pseudomyicola sp. encontrado nos berbigões estudados da RESEX, Palhoça e São Francisco do Sul, através da análise macroscópica.
Em dois berbigões coletados na Palhoça, um na primavera e outro no verão, foi observada a presença do poliqueto Polydora sp. Em ambos os casos apenas uma das valvas apresentava um pequeno orifício e no interior da concha ainda não havia a formação dos canais em formato de “U”, típico deste parasitismo.
3.3-Achados no RFTM
No reto dos berbigões coletados da RESEX, Palhoça e São Francisco do Sul, após período de incubação em RFTM, foi observada presença de metacercárias de trematódeos encistadas (Figura 7), medindo 172,32 ± 14,85 µm de diâmetro (n= 30). Em Imbituba não foi observada a presença deste parasito.
Figura 7. Metacercária encistada no reto de Anomalocardia brasiliana. Seta grossa = espessa parede do cisto; seta fina = coroa de espinhos.
Não foi observada diferença significativa (p<0,05) entre as prevalências da RESEX (41,67 ± 5,77 %) e Palhoça (33,33 ± 13,05 %). Entretanto, ambas diferem da encontrada em São Francisco do Sul (3,33 ± 4,71 %) (Figura 8).
Figura 8. Prevalências (%) de metacercárias encontradas no reto dos berbigões analisados de cada local de coleta e estação do ano e a média geral por local.
As quantidades das metacercárias encistadas no reto dos berbigões variaram entre 1 e 210 na RESEX, 1 e 200 na Palhoça e 1 e 12 em São Francisco do Sul. Em cada local de coleta, não foi observada diferença estatística de intensidade entre as estações do ano. Também não houve diferença entre os locais dentro de cada estação (Figura 9).
Figura 9. Quantidade média de metacercárias encistadas no reto dos berbigões após período de incubação em RFTM.
Quanto à infestação por metacercária no reto, A RESEX foi o local que apresentou a maior quantidade de berbigões parasitados (n= 50), dois quais 68% foram classificados no nível de infestação leve, 24% no nível moderado e 8% no nível pesado. Já na Palhoça destacamos que 47,5% dos berbigões parasitados apresentaram nível de infestação moderado e apenas 5% no nível pesado (Tabela 2).
Nas brânquias das amostras coletadas da RESEX, Palhoça e São Francisco do Sul, após período de incubação em RFTM, foi observada a presença de metazoários encistados (Figura 10), medindo 220,28 ± 25,42 µm de diâmetro (n= 30).
Figura 10. Metazoário não identificado encistado na brânquia de Anomalocardia brasiliana. Seta grossa = metazoário encistado; seta fina = par de ocelos.
Entre os locais de ocorrência deste patógeno foi observada diferença significativa (p<0,05) somente entre as prevalências da RESEX (79,17 ± 12,58) e Palhoça (57,50 ± 11,58) (Figura 11). Em Imbituba não foi observada a presença deste parasito. Com relação à prevalência por local, não houve diferença entre as estações.
Figura 11. Prevalências (%) de metacercárias encontradas nas brânquias dos berbigões analisados de cada local de coleta e estação do ano.
Com relação à intensidade, na RESEX observamos diferença significativa (p<0,05) apenas do verão (41,76 ± 32,31) em relação à
primavera (16,30 ± 17,67). Na Palhoça não houve diferença de intensidade de infestação entre as estações (Figura 12).
Figura 12. Quantidade média de metazoários encistados nas brânquias dos berbigões de cada local de coleta após período de incubação em RFTM.
Os diferentes níveis de infestações dos metazoários encistados nas brânquias dos berbigões variaram entre leve (n= 111), moderado (n= 122) e pesado (n= 11) (Tabela 2). Destacamos que a RESEX foi o local com a maior quantidade de berbigões infestados, sendo 65,3% classificado no nível moderado de infestação. As quantidades desse metazoário encistado nas brânquias dos berbigões variaram entre 1 e 126 na RESEX; 1 e 170 na Palhoça; 1 e 219 em São Francisco do Sul.
Tabela 2. Quantidade de animais observados nos níveis de infestação leve, moderado e pesado, parasitados por metacercárias de trematódeos encistadas no reto, metazoários encistados nas brânquias e encontrados nos berbigões analisados por locais (n=120), após incubação em RFTM.
O metazoário encontrado nas brânquias foi isolado depois de incubação em água do mar filtrada por 72h em temperatura ambiente e corado pelo método de regressão para helmintos. Foram observados vesícula oral, vesícula ventral, vesícula excretora e par de ocelos, ou olhos pigmentados (Figura 13). Não foi possível classificar a família e identificar o metazoário.
Figura 13. Metazoário não identificado isolado da brânquia de Anomalocardia brasiliana e corado pelo método de regressão para helmintos. Oo= par de ocelos pigmentados. Ve= vesícula excretora. Vo= vesícula oral. Vv= vesícula ventral.
Em amostras de 26 berbigões coletados em Imbituba foram observados organismos unicelulares muito parecidos com hipnósporos de protozoários do gênero Perkinsus, que foram denominados
Perkinsus-like (Figura 14).
Figura 14. Hipnósporos de Perkinsus-like encistados na brânquia de Anomalocardia brasiliana após período de incubação em meio RFTM.
Dos 26 berbigões parasitados, em 7 foram observados hipnósporos tanto no reto quanto na brânquia; em 17 apenas na brânquia e em 2 somente no reto. O organismo não foi observado nos outros 3 locais de coleta. Os hipnósporos encontrados nas brânquias (n= 30) e no reto (n= 30) tinham diâmetro de (Média±DP) 29,47 ± 7,31 µm e 31,09 ±
8,09 µm, respectivamente. As medidas variaram entre 15,69 e 50,27 µm nas brânquias e 9,92 e 44,62 µm no reto. As prevalências encontradas nas brânquias foram de 36,7% no outono, 10% na primavera, e 33,3% no verão. Já as prevalências encontradas no reto foram de 20% no outono, 3,3% na primavera e 6,7% no verão. Não houve diferença estatística significativa (p<0,05) da prevalência entre as estações de ocorrência deste parasito.
O nível de parasitismo de acordo com a escala de Mackin (Ray, 1954), considerando-se reto e brânquia, variou de muito leve (n= 13) a leve (n= 13). A quantidade de hipnósporos por berbigão variou entre 1 e 94 no outono, 5 e 100 na primavera e 1 e 78 no verão.
3.4- Histopatologia
Foram observados através da análise histológica 6 parasitos nos berbigões A. brasiliana, sendo eles ciliados não identificados, protozoário Steinhausia-like, esporocistos de trematódeos, metacercárias de trematódeos, cestoda Tylocephalum sp. e metazoários encistados .
A presença de ciliados não identificados foi observada na cavidade palial (Figura 15A) e entre as lamelas branquiais (Figura 15B). Apenas um único ciliado foi encontrado no tecido gonádico (Figura 15C) de um berbigão macho coletado na RESEX, na primavera.
Figura 15. Ciliado não identificado (setas) presente na cavidade palial (A); nas brânquias (B) e no folículo masculino (C).
Os ciliados foram encontrados em berbigões de todos os locais de coleta. A prevalência encontrada em São Francisco do Sul (15,83 ± 12,58) foi significativamente diferente (p<0,05) apenas da registrada na RESEX (1,67 ± 3,33) e em Imbituba (0,83 ± 1,67), que não diferenciaram entre si. A presença dos ciliados não foi constatada nas coletas realizadas no inverno. Na RESEX foram observados apenas na coleta da primavera, em Imbituba na coleta do verão e, na Palhoça, nas coletas da primavera e verão (Tabela 3).
Tabela 3. Dados de prevalência (%) de ciliados registrados nos berbigões dos diferentes locais de coleta e estações do ano, observados através da análise histopatológica.
As quantidades de ciliados observadas variaram de 1 a 7 na RESEX e Palhoça e de 1 a 9, em São Francisco do Sul. Em Imbituba foi observado apenas 1 berbigão parasitado, com 2 ciliados.
Foi observada a presença de esporocistos de trematódeos, possivelmente Bucephalus sp., contendo larvas cercárias em diferentes fases de desenvolvimento (Figura 16), nos berbigões dos quatro locais de coleta.
Figura 16- Gônada de Anomalocardia brasiliana repleta de esporocistos de trematódeos não identificados, contendo larvas cercárias em diferentes fases de desenvolvimento. E = esporocisto; seta grossa = cercária; seta fina = massa germinativa.
A prevalência média na RESEX (37,50 ± 34,25) foi diferente (p<0,05) dos outros locais de coleta. Os demais não apresentaram diferenças entre si. Além disso foram observadas diferenças (p<0,05), em relação a prevalência deste parasito no outono, entre a RESEX (83,33%) e os demais locais de coleta e no inverno, entre a RESEX (43,33%) e Imbituba (3,33%). Ao compararmos as prevalências
encontradas nas diferentes estações do ano na RESEX, observamos diferença (p<0,05) entre o outono (83,33%) e o verão (16,67%) e entre o outono e primavera (6,67%) (Figura 17).
Figura 17- Prevalência (%) de esporocistos de trematódeos encontrada nos berbigões coletados nos diferentes locais e estações do ano.
Com o uso da gratícula de Weibel observamos a porcentagem média de tecido do patógeno ocupando o espaço de tecido gonádico dos berbigões (Figura 18).
Figura 18. Porcentagem média do tecido da gônada dos berbigões parasitados, coletados nos diferentes locais e estações do ano, substituída por tecido de esporocistos de trematódeos.
O grau de parasitismo variou de leve a pesado (Figura 19). Foi observada a presença deste parasito em apenas 2 berbigões de Imbituba, sendo 1 coletado no inverno e outro na primavera. Na RESEX e Palhoça foi observado em todas as coletas e, em São Francisco do Sul, não foi observado apenas no outono.
Figura 19. Grau de infestação por esporocistos de trematódeos nos berbigões, analisados através da gratícula de Weibel.
Dos 12 berbigões da RESEX que apresentaram grau de infestação pesado por esporocistos de trematódeos (26,6% dos animais infestados), 6 estavam totalmente castrados. Já os indivíduos que apresentaram grau de parasitismo moderado, 8 estavam também nesta condição. Nos demais indivíduos, foi possível observar que, apesar do tecido gonádico bastante danificado, havia resquícios de gametas. Além da RESEX, somente Palhoça apresentou um caso de grau de infestação pesado, que corresponde a 6,25% dos animais parasitados deste local. Vale destacar que 9 dos 13 animais com infestação pesada ocorreram no outono, sendo 8 na RESEX.
Metacercárias de trematódeos não identificados (Figura 20) foram observadas encistadas no manto e na gônada de berbigões da RESEX e Palhoça. Em Imbituba e em São Francisco do Sul, não foi observada a presença deste parasito.
Figura 20. Metacercária não identificada encistada no manto de Anomalocardia brasiliana. Setas finas = metacercária; seta grossa = coroa de espinhos.
