INIBIÇÃO DE PROTEÍNAS TIROSINA FOSFATASES: DIFERENTES MECANISMOS DE AÇÃO DE UM DERIVADO
DE CHALCONA
Dissertação submetida ao Programa de Pós-Graduação em Bioquímica da Universidade Federal de Santa Catarina para a obtenção do Grau de Mestre em Bioquímica.
Orientador: Prof. Dr. Hernán Terenzi Coorientador: Profa. Dra. Angela C. O. Menegatti
Florianópolis 2018
Souza, Ana Caroline Arruda de
Inibição de proteínas tirosina fosfatases : diferentes mecanismos de ação de um derivado de chalcona / Ana Caroline Arruda de Souza ; orientador, Hernán Terenzi, coorientador, Angela Camila Orbem Menegatti, 2018.
100 p.
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas,
Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2018.
Inclui referências.
1. Bioquímica. 2. Proteína tirosina fosfatase. 3. Llinfoide tirosina fosfatase-LYP. 4. inibidores. 5. chalconas. I. Terenzi, Hernán. II. Menegatti, Angela Camila Orbem. III. Universidade Federal de Santa Catarina. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica. IV. Título.
A Alex Melo de Oliveira, meu amado esposo.
Primeiro, a Deus, a quem devoto minha fé, a quem me criou e quem significou minha existência. A Ele toda honra, toda glória e todo louvor. As incontáveis palavras são ainda muito poucas para exprimir a minha gratidão a Ti por ter me guiado até aqui.
Ao meu amado esposo, Alex, a quem divido meus dias, minhas alegrias e compartilho meus sonhos. Pela paciência, carinho, palavras de apoio e a constante disposição em me ajudar.
A meus queridos pais, que apesar da distância geográfica que nos separam, sempre demostram o carinho e apoio em minhas decisões, por me ensinarem os valores essenciais. À minha irmã, pelo companheirismo, amizade e incentivo. Aos demais familiares por sempre torcerem pelo meu sucesso.
Ao meu orientador, professor Dr. Hernán Terenzi e coorientadora professora Drª. Angela Menegatti, pela oportunidade, confiança, ensinamentos, apoio, orientação e por disponibilizar todo o material e equipamento necessário para o desenvolvimento deste trabalho.
Ao Laboratório Estrutura e Atividade do Departamento de Química da UFSC, sob a coordenação do Prof. Dr. Ricardo José Nunes pela colaboração com os compostos estudados no trabalho. Ao aluno Luiz Felipe responsável pela síntese e a Larissa, que auxilia em novas sínteses e que se tornou uma grande amiga.
Aos integrantes, amigos e companheiros do CEBIME: Beatriz, Elis, Martina, Nathalia Castilho, Natália Porto, Philipe, Ruth, Vanessa, Vânia, pelas contribuições, discussões, ideias, ajuda, amizade, pelo apoio, ensinamentos, e pelos momentos de conversas descontraídas que tornam a rotina mais agradável e alegre.
À UFSC e ao Programa de Pós-Graduação em Bioquímica pela disponibilização de toda a estrutura e ensino. À CAPES pela concessão da bolsa, e ao CNPq, MCT, FINEP, FAPESC e Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em Biologia Estrutural e Bioimagem (INBEB) pelo financiamento direto e indireto deste trabalho.
Proteínas tirosina fosfatases (PTPs) são uma família de enzimas essenciais para muitos processos celulares, e têm sido validadas como alvos terapêuticos para doenças humanas. Consequentemente, há uma crescente demanda por pequenas moléculas inibidoras de PTPs. A linfoide especifica tirosina fosfatase (LYP), codificada pelo gene
PTPN22, tem atraído atenção como um importante fator de risco e,
consequentemente, um potencial alvo de fármacos para doenças autoimunes. O objetivo deste trabalho foi investigar a capacidade inibitória de novas chalconas frente esta enzima. Escherichia coli foi utilizada para expressar a proteína recombinante, os ensaios in vitro para investigar o potencial inibitório de 23 chalconas sintéticas em LYP foram conduzidos espectrofotometricamente usando p-nitrofenil fosfato (pNPP) como substrato. Na triagem inicial somente um composto denominado Q11 mostrou inibição em LYP superior a 50% da atividade residual na concentração de 25 µM, sendo seu valor de IC50 = 11,5 µM. Os testes de seletividade para o Q11 mostraram pouca potência e seletividade para LYP quando comparada a outras PTPs. Por esta razão, análises cinéticas e estruturais do complexo enzima-inibidor foram realizadas com o objetivo de entender melhor o mecanismo de ação desta única molécula em PtpA, PtpB, YopH, LYP, PTP-PEST e PTP1B. Os ensaios cinéticos para PtpA, YopH e PTP1B revelaram um modo de inibição não-competitiva, e para PtpB, LYP e PTP-PEST revelaram uma inibição competitiva com valores de Ki menores que 15 µM. Ensaios de reversibilidade mostraram um mecanismo de inibição irreversível para YopH, enquanto para as outras o mecanismo foi reversível. Além disso, ensaios de inibição em diferentes tempos de incubação mostram que o inibidor é tempo-dependente. As análises de proteólise limitada de YopH e LYP na presença ou na ausência do composto Q11 confirmaram o modo de inibição apresentado pelas cinéticas, os espectros de MS mostraram proteção do sítio ativo em LYP, e em YopH proteção em uma região diferente do sítio ativo. A análise de estabilidade térmica por CD e fluorescência demonstrou que YopH não sofre alteração na estabilidade ou mudanças estruturais na presença do inibidor (a fluorescência não apresentou deslocamento de emissão máxima λmax). Estudos de modelagem molecular estão sendo realizados para melhor compreender os mecanismos de ligação de um único composto a
diferentes enzimas.
Palavras-chave: Proteína tirosina fosfatase, linfoide tirosina fosfatase-LYP, inibidores, chalconas
Protein tyrosine phosphatases (PTPs) are a family of enzymes essential for numerous cellular processes, and several PTPs have been validated as therapeutic targets for many human diseases. Consequently, there is an increased demand for potential PTPs small molecule inhibitors. The lymphoid tyrosine phosphatase LYP, encoded by the PTPN22 gene, has attracted attention, as an important risk factor and, consequently, a potential drug target for human autoimmune diseases. The objective of this work was to investigate the inhibitory capacity of new synthetic chalcones against this enzyme. Escherichia coli was used to express the recombinant protein, the in vitro assays to investigate the inhibitory potential of 23 synthetic chalcones in LYP were carried out spectrophotometrically using p-nitrophenyl phosphate (pNPP) as substrate. At the initial screening, only one compound showed inhibition of LYP greater than 50%, at a concentration of 25 µM, this compound named Q11 showed an IC50 value of 11.5 µM. Further, the selectivity tests showed little potency and selectivity for LYP when compared to other PTPs. For this reason, structural analyses of the enzyme-inhibitor complex were performed with the aim of better understand the mechanisms of action of this single molecule against PtpA, PtpB, YopH, LYP, PTP-PEST and PTP1B. The kinetic assays for PtpA, YopH and PTP1B revealed a non-competitive inhibition and for PtpB, LYP and PTP-PEST revealed a competitive inhibition with Ki values lower than 15 µM. Reversibility assays showed an irreversible inhibition mechanism for YopH, while for the others the mechanism was reversible. In addition, inhibition assays at different incubation times showed that the inhibitor is time-dependent. The limited proteolysis analyses of YopH and LYP in the presence or in the absence of the compound confirmed its modes of inhibition, previously shown by kinetic analysis, furthermore limited proteolysis analysis showed the protection of the active site of LYP, and for YopH protection of a region other than the active site – an allosteric site. Thermal stability analysis measured by CD or intrinsic fluorescence showed that YopH does not undergo changes in stability or structural changes in the presence of the inhibitor. Molecular modeling studies are under way to better understand the mechanisms of binding of this single compound to different enzymes.
Keywords: Protein tyrosine phosphatases, lymphoid tyrosine phosphatase - LYP, inhibitor.
Figura 1- Classificação das Proteínas Tirosina Fosfatases (PTPs).
... 24
Figura 2 - O mecanismo geral da reação catalisada por PTP Cys-dependente. ... 26
Figura 3 - Estrutura primária da família proteínas tirosinas fosfastases ... 30
Figura 4 - Superposição de PTP-PEST com as duas outras PTPs da família PEST (BDP1 e LYP). ... 32
Figura 5 - Proteínas fosfatases de bactérias infecciosas e seus diversos papéis na sinalização celular. ... 33
Figura 6 - Mecanismo de ação da PtpA e PtpB na interrupção de processos celulares do macrófago hospedeiro. ... 38
Figura 7 - Representação esquemática da clivagem do substrato pNPP realizada pelas fosfatases. ... 48
Figura 8 - Purificação PtpA, PtpB, LYP e PTP-PEST ... 55
Figura 9 - Purificação da YopH ... 57
Figura 10 - Purificação de PTP1B ... 58
Figura 11 - Gráfico Michaelis-Menten representando o mecanismo de inibição para a chalcona Q11 frente às diferentes PTPs.64 Figura 12 - Reversibilidade da inibição enzimática pela chalcona Q11 ... 69
Figura 13 - Determinação da irreversibilidade após ultrafiltração. ... 70
Figura 14 - Espectro ESI-MS de YopH na ausência (A) e presença (B) de composto Q11. ... 71
Figura 15 - Atividade enzimática após diferentes tempos de pré-incubação enzima-inibidor. ... 72
Figura 16 - Perfil peptide mass fingerprint (PMF) de YopH obtido em ausência (A), expandido em (C) e presença (B), expandido (D) do composto Q11. ... 73
Figura 17 - Proteção da clivagem tríptica da YopH pelo composto Q11. ... 74
Figura 18 - Perfil peptide mass fingerprint (PMF) de LYP obtido em ausência (A) e presença (B) do composto Q11. ... 76
Figura 19 - Visão expandida do espectro de massas em ausência de Q11 (A) e presença de Q11 (B) na região m/z 2155. ... 76
Figura 20 - Visão expandida do espectro de massas em ausência de Q11 (A) e presença de Q11 (B) na região m/z 3414. ... 77
Figura 21 - Proteção da clivagem tríptica da LYP pelo composto Q11... 77
Figura 22 - Intensidade da fluorescência intrínseca de YopH em diferentes concentrações de inibidor. ... 78
Figura 23 - Perfil de desnaturação térmica da enzima YopH na presença ou ausência do composto Q11. ... 79
Figura 24 - Gráfico Michaelis-Menten representando o mecanismo de inibição para o Ácido Chicórico frente à YopH . ... 80
Figura 25 - Reversibilidade da inibição enzimática pelo Ácido chicórico em YopH ... 82
Figura 26 - Perfil peptide mass fingerprint (PMF) de YopH obtido em ausência (A) e presença (B) do ácido chicórico. ... 83
Tabela 1 - Concentração das enzimas utilizadas nos testes enzimáticos. ... 49
Tabela 2 - Chalconas sintéticas com seus respectivos resultados de inibição para LYP. ... 59
Tabela 3 - Valores de IC50 e índice de seletividade do composto Q11 frente a modelos de PTPs. ... 62
Tabela 4 - Parâmetros cinéticos do composto Q11 frente às PTPs em estudo. ... 66
Tabela 5 - Parâmetros cinéticos do composto Ácido Chicórico frente à YopH. ... 81
ACN Acetonitrila
Da Dalton
DP Desvio Padrão
DTT Ditiotreitol
EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético
ESI Electrospray Ionization
FAK Cinase de adesão focal
IPTG Isopropil-β-D-tiogalactopiranosideo IRS-1 Substrato do Receptor de insulina-1 JAK2 Janus cinase 2
kcat Constante catalítica
Ki Constante de inibição
Km Constante de Michaelis–Menten
Lck Lymphocyte-specific protein tyrosine kinase
LepR Receptor leptina
LMW Low Molecular Weight
Loop Laço
LYP Proteína tirosina fosfatase linfoide-especifica
m/z Razão massa carga
MALDI Matrix-assisted laser desorption/ionization
MPT Modificação pós-traducional
Mtb Mycobacterium tuberculosis
PDB Protein Data Bank
pH Potencial hidrogeniônico (-log [H+]) PTKs Proteínas tirosina cinases
PTP1B Proteina tirosina fosfatase 1B humana
PtpA Proteína tirosina fosfatase A de M. tuberculosis PtpB Proteína tirosina fosfatase B de M. tuberculosis PTPs Proteínas tirosina fosfatases
SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis (Eletroforese em gel de
poliacrilamida usando dodecil sulfato de sódio) SI Índice de seletividade
SKAP-HOM Small kinetochore-associated protein-homologue
TFA Ácido trifluoracético Tris Tris-hidroximetilaminoetano
UV Ultravioleta
Vmáx Velocidade Máxima
Ysc Yop secretion
αCHCA Ácido α-ciano-4-hidroxicinâmico
pNP p-Nitrofenol
pNPP p-Nitrofenilfosfato
1 INTRODUÇÃO ... 23
1.1 Proteínas tirosina fosfatases ... 23
1.2 Proteínas tirosina fosfatases humanas ... 27
1.2.1 PTP1B ... 27
1.2.2 LYP ... 28
1.2.3 PTP-PEST ... 30
1.3 Proteínas tirosina fosfatases bacterianas ... 32
1.3.1 YopH de Yersinia spp ... 33
1.3.2 PtpA e PtpB de Mycobacterium tuberculosis ... 36
2 OBJETIVOS ... 41
2.1 Objetivo Geral ... 41
2.2 Objetivos Específicos ... 41
3 MATERIAIS E MÉTODOS ... 43
3.1 Preparo de células competentes para transformação ... 43
3.2 Transformação das bactérias Escherichia coli ... 43
3.3 Expressão e purificação das proteínas recombinantes .... 44
3.3.1 Expressão e purificação da YopH de Y. enterocolítica e da PTP1B humana. ... 44
3.3.2 Expressão e purificação da PtpA e PtpB de Mtb e das enzimas humanas PTP-PEST e LYP. ... 46
3.4 Avaliação da inibição enzimática (in vitro) de LYP ... 47
3.5 Determinação do IC50 do composto Q11 frente à LYP e ensaios de seletividade ... 48
3.6 Determinação dos parâmetros cinéticos e mecanismo de inibição do composto Q11 ... 49
3.7 Ensaio de reversibilidade da atividade enzimática ... 50
3.8 Análises de irreversibilidade e ESI-MS ... 51
3.9 Ensaio de atividade enzimática em YopH com diferentes tempos de pré-incubação ... 52
3.11 Avaliação da interação proteína-inibidor por fluorescência intrínseca de YopH ... 53 3.12 Análise da estabilidade térmica da YopH por Dicroísmo Circular (CD) ... 53 3.13 Avaliação do mecanismo de inibição, atividade enzimática e estruturais do Ácido Chicórico em YopH como instrumento comparativo ... 54 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 55 4.1 Expressão e purificação da PtpA e PtpB de Mtb e das enzimas humanas PTP-PEST e LYP ... 55 4.2 Expressão e purificação da YopH de Y. enterocolítica e da PTP1B humana ... 56 4.3 Avaliação da inibição enzimática (in vitro) de LYP ... 58 4.4 Determinação do IC50 do composto Q11 frente à LYP e
ensaios de seletividade ... 62 4.5 Determinação dos parâmetros cinéticos e mecanismo de inibição do composto Q11... 63 4.6 Ensaio de reversibilidade da atividade enzimática ... 68 4.7 Análises de irreversibilidade e ESI-MS. ... 69 4.8 Ensaio de atividade enzimática em YopH com diferentes tempos de pré-incubação ... 71 4.9 Proteólise limitada do complexo enzima-inibidor ... 72 4.10 Avaliação da interação proteína-inibidor por fluorescência intrínseca de YopH. ... 78 4.11 Análise da estabilidade térmica da YopH por Dicroísmo Circular (CD) ... 79 4.12 Avaliação do mecanismo de inibição, atividade enzimática e estruturais do Ácido Chicórico em YopH como instrumento comparativo ... 80 4.12.1 Determinação dos parâmetros cinéticos e mecanismo de inibição. 80
4.12.2 Ensaio de reversibilidade da atividade enzimática ... 81 4.12.3 Proteólise limitada do complexo enzima-inibidor ... 82
1INTRODUÇÃO
1.1 Proteínas tirosina fosfatases
O sucesso da existência de organismos multicelulares depende da comunicação entre as suas células, através da sinalização bioquímica, que regula as respostas aos estímulos tanto intracelulares como os extracelulares. A fosforilação reversível de proteínas é um dos principais mecanismos de modificação pós-traducional (MPT) utilizada pelas células, esta modificação está envolvida no controle de diversos processos celulares básicos, tais como divisão, motilidade, metabolismo, expressão gênica, tráfego de organelas e imunidade. Este mecanismo é considerado um processo ubíquo, de alta ocorrência nas vias de transdução de sinais desencadeada por efetores externos como citocinas, hormônios, impulsos nervosos, entre outros (Barford et al., 1995; Manning et al., 2002; Reddy et al., 2017).
Proteínas tirosina cinases (PTKs) transferem o grupo γ-fosforil (PO3) do ATP para um resíduo de tirosina na proteína alvo. Em contrapartida, proteínas tirosina fosfatases (PTPs) removem o grupo fosfato gerando uma proteína alvo defosforilada e um fosfato inorgânico. Deste modo, a fosforilação é um processo controlado pelo equilíbrio da ação de ambas, proteínas cinases versus fosfatases (Brautigan, 2013; Ruddraraju et al., 2017; Shi, 2009).
Estimativas apontam que 30% de todas as proteínas celulares tenham uma ligação covalente com o grupo fosfato em pelo menos um resíduo de aminoácido (Cohen, 2000). A adição ou remoção do grupo fosfato pode ter profundas consequências sobre a atividade e características estruturais dessas proteínas (Barford et al., 1998). Assim, fosforilação de uma proteína pode desencadear tanto a sua ativação quanto a sua inibição, muitas vezes através de mudanças conformacionais, ou ainda, proporcionar sítios de reconhecimento para outras proteínas, e interferir na sua localização e na sua estabilidade. Em eucariotos essa MPT acontece principalmente nos resíduos de serina - 86,4%, treonina - 11,8 % e tirosina - 1,8 %. Embora menos comum, a fosforilação em resíduos de Tyr é extremamente importante à saúde e às doenças (Johnson, 2009).
O genoma humano codifica 90 PTK, sendo 85 delas com atividade enzimática, e 107 PTP, sendo 11 delas inativas, 2 atuam sobre RNAm e 13 atuam sobre fosfolipídios. Há, portanto, 85 PTK e 81 PTP controlando a fosforilação de proteínas, algo que representa um
equilíbrio na expressão destas enzimas em humanos (Alonso et al., 2004; Irving et al., 2017).
Em conjunto, a fosforilação de resíduos de Tyr também possui grande importância na sinalização celular em uma variedade de espécies bacterianas, em alguns procariontes, patógenos de humanos e animais, as PTPs e PTKs regulam o processo de infecção, mais uma vez ressaltando a importância do estudo e caracterização dessas enzimas (Cozzone et al., 2004; Sajid et al., 2015).
Levando em conta o papel fundamental das PTK e PTPs na sinalização celular, não é surpreendente que a interrupção da regulação normal resulte em proliferação, sobrevivência, motilidade, diferenciação e metabolismo celular anormal, levando ao desenvolvimento de diversas doenças, além do envolvimento na patogênese de um gama de microrganismos, fato que torna essas enzimas alvos terapêuticos promissores (Irving et al., 2017; Tonks, 2006).
PTPs são enzimas caracterizadas pela presença de resíduos de cisteína no sítio ativo, que age como nucleófilo durante a catálise (Irving
et al., 2017; Tonks, 2006). Elas podem ser subdivididas dentro de quatro
subfamílias, baseando-se na sequência de aminoácidos dos seus sítios ativos e a especificidade dos substratos alvos (figura1).
Figura 1- Classificação das Proteínas Tirosina Fosfatases (PTPs).
Classes I-IV no círculo central e os seus substratos específicos no círculo de fora. Fonte: (Irving et al., 2017). A Classe I engloba as PTPs clássicas Tirosina
específicas e a as fosfatases de dupla especificidade DSPs (do inglês Dual-specificity phophatases), com 38 e 61 membros, respectivamente. Como o nome sugere, DSPs pode defosforilar resíduos de fosfoserina e fosfotreonina, além disso algumas têm a preferência por fosfoinositídeos e mRNAs como substrato. As 38 PTPs clássicas podem ser subdivididas em transmembranares receptoras (RPTPs) e citosólicas e não receptoras (NRPTPs). A classe II codifica uma proteína LMW-PTP (do inglês low molecular weight PTP). A classe III engloba três homólogos da CDC25 responsáveis em defosforilar resíduos de tirosina e treonina de cinases dependentes de ciclina (CDK). A última classe, IV, engloba as proteínas Eya que atuam como reguladores transcricionais (He et al., 2014; Irving et al., 2017; Navis et al., 2010).
Uma característica marcante dos membros da família das PTP é a sequência conservada de aminoácidos (H/V)C(X)5R(S/T), que define o sítio ativo dessas enzimas, ou seja, o local de ligação do resíduo de aminoácido fosforilado, também referenciado como P-loop. Nesta sequência, os resíduos invariantes de Cys e Arg são essenciais à catálise. Além do P-loop outros dois loops são necessários para completar a reação de desfosforilação, o WPD loop e o Q loop (Tonks, 2013).
O mecanismo catalítico é realizado em dois passos: Primeiro, o resíduo de cisteína realiza o ataque nucleofílico ao grupo fosfato do substrato, resultando na formação do cisteinil-fosfato e a liberação do resíduo de tirosina. No segundo passo, ocorre a hidrólise do intermediário cisteinil-fosfato pelo ataque de uma molécula de água, liberando o fosfato inorgânico e a proteína regenerada. O resíduo de arginina conservado está envolvido na ligação do substrato e na estabilização do intermediário da reação. Outro resíduo fundamental à reação é o Asp localizado no WPD-loop, que funciona como ácido geral na primeira etapa da catálise, e como base na segunda etapa (figura 2) (Alonso et al., 2016; Brandao et al., 2010; Menegatti, 2014).
Figura 2 - O mecanismo geral da reação catalisada por PTP Cys-dependente.
A catálise das PTPs ocorre em duas etapas. Na primeira o grupo tiolato da cisteína realiza um ataque nucleofílico ao fosfato da proteína substrato, levando a formação do intermediário cisteinil-fosfato. Nesta etapa o aspartato age como o ácido geral do grupo tirosil. Na segunda etapa da reação uma molécula de água, deprotonada pelo aspartato, ataca o intermediário cisteinil-fosfato. Isto leva a regeneração da proteína e a liberação do fosfato inorgânico. Fonte: (Menegatti, 2014).
PTPs têm sido um importante tópico nas ciências biomédicas nas duas últimas décadas, uma vez que um grande número de PTPs são implicadas em diversas doenças humanas, tais como câncer, diabetes, doenças autoimunes e neurológicas. Esses achados reforçaram o interesse na busca de moléculas inibitórias dessas enzimas, como alternativa para a descoberta de novos fármacos e tratamento dessas doenças (He et al., 2014; Julien et al., 2011).
Existem mais de duas dúzias de inibidores de cinases já disponíveis no mercado, bem como muitos anticorpos terapêuticos dirigidos às cinases (Wu et al., 2016). No entanto, o desenvolvimento de medicamentos voltados a inibição de PTPs está atrasado em relação as cinases, atualmente não há inibidores específicos de PTPs aprovados clinicamente. Algumas razões para isso são: primeiro, o interesse maior nas cinases está no fato de as mesmas terem sido purificadas e clonadas 10 anos antes da primeira PTP. Em segundo lugar, as cinases são muitas
vezes consideradas as principais "condutoras" da sinalização. O terceiro motivo é a dificuldade em alcançar a especificidade para uma única PTP, devido ao fato do sítio ativo que contém o motivo HCX5R ser conservado entre as PTPs (Irving et al., 2017; Tonks, 2006). Além disso, os sítios ativos de PTPs são muito mais polares do que aqueles de tirosina cinases e a maioria das moléculas inibidoras que imitam o sítio ativo são também polares ou carregadas, assim apresentando dificuldades para atravessar a membrana plasmática (Irving et al., 2017; Zhang, 2017).
Há tempos sabe-se a importância das PTKs e PTPs na patogênese de uma ampla gama de doenças humanas, desde a descoberta da importância dessas enzimas até os dias atuais tem se buscado inibidores desta classe de proteínas. Como as cinases foram descobertas antes das fosfatases, e devido uma maior de especificidade na inibição em virtude de sua diversidade estrutural, já existem alguns inibidores no mercado para cinases (Wu et al., 2016). No entanto, até o momento não há nenhum fármaco inibidor específico aprovado pela Food and Drug
Administration (FDA) direcionada às PTPs (Irving et al., 2017).
As pesquisas têm avançado no sentido do desenvolvimento de inibidores bivalentes em PTPs, os quais interagem com sítio ativo e com um sítio alostérico (Zhang, 2017). Por exemplo, o trodusquemine (MSI-1436) é um inibidor alostérico não-competitivo da PTP1B, atualmente em ensaios clínicos de fase 1 para câncer de mama e estudos clínicos de fase 2 para diabetes tipo 2 (Thompson et al., 2017). Ressaltando a importância da busca por inibidores não competitivo dessas enzimas, em razão principal pelos seus sítios ativos serem bem conservados entre a família.
O presente trabalho apresenta o estudo de inibição de 6 PTPs, sendo três produzidas por bactérias patogênicas: PtpA e PtpB de
Mycobacterium tuberculosis, e YopH de Yersinia enterocolitica, e três
proteínas humanas: PTP1B, LYP e PTP-PEST. 1.2 Proteínas tirosina fosfatases humanas
1.2.1 PTP1B
A Proteína tirosina fosfatase 1B (PTP1B) pertence as PTPs clássicas, também chamada proteína tirosina fosfatase não-receptora tipo 1, localizada na superfície citosólica do retículo endoplasmático (massa molar ˷50 kDa), atua como reguladora negativa da sinalização da insulina e leptina (Baskaran et al., 2012; Johnson et al., 2002) . Para
esclarecer o papel da PTP1B como uma reguladora negativa do receptor de insulina (IR), Elchebly e colaboradores realizaram estudos avaliando camundongos que não apresentavam o gene para PTP1B em seu genoma, os resultados demonstram que estes apresentaram hipersensibilidade à insulina e baixos níveis de glicemia (Elchebly et al., 1999). Essa enzima é amplamente expressa em tecidos humanos tais como: tecido adiposo, fígado, músculo, e cérebro (Zabolotny et al., 2008). A PTP1B vem sendo estudada ao decorrer de vários anos, esses estudos revelam a relação dessa enzima à várias doenças. Nesse sentido, notáveis evidências indicam que a PTP1B faz parte da regulação na sinalização de insulina e leptina, a PTP1B defosforila o substrato do
receptor de insulina-1 (IRS-1), reduzindo assim a sensibilidade à
insulina ou desligando a sinalização. Na via de sinalização de leptina, PTP1B tem a função de defosforilação do receptor leptina (LepR) e janus cinase 2 (JAK2). Problemas nesta sinalização estão implicados em obesidade, e recentemente relacionados à doença de Alzheimer (Vieira et al., 2017). Consequentemente, inibidores de PTP1B têm emergido como potenciais alvos de fármacos para o tratamento da obesidade e diabetes tipo 2 (Cho, 2013; Zhao et al., 2017).
PTP1B foi a primeira PTP a ser isolada, servindo como modelo para outras PTPs. Ela foi purificada a partir da placenta humana como uma proteína de 321resíduos de aminoácidos, apesar de o cDNA indicar que esta é a porção NH2-terminal derivada da molécula completa que possui 435 resíduos de aminoácidos (Tonks et al., 1988). As características estruturais principais são o sítio ativo que consiste dos resíduos de His214 a Arg221 (PTP-loop) também chamado de P-loop, contendo o resíduo catalítico Cys215, o WPD-loop (Trp179, Pro180, Asp181) e o secundário sítio de ligação ao fosfato (Johnson et al., 2002). Puius et al. (1997), identificaram um segundo sítio de ligação ao fosfato e este sítio não é conservado nas PTPs, sendo um alvo promissor para a busca de inibidores específicos. PTP1B possui duas conformações em relação ao WPD-loop, na conformação aberta, o WPD-loop permite a ligação do substrato. Já na conformação fechada, o WPD-loop fecha-se sobre o sítio ativo facilitando a hidrólise do substrato fosforilado (Kumar et al., 2018; Lipchock et al., 2017; Puius et
al., 1997).
1.2.2 LYP
A linfoide especifica tirosina fosfatase (LYP) codificada pelo gene PTPN22 é uma clássica NRTP, expressa exclusivamente em
células de origem hematopoiéticas. Ela pertence ao domínio ou família PEST (prolina, ácido glutâmico, serina e treonina), juntamente com a PTP-PEST (referenciada como PTPN12) e PTP hematopoiética da fração de células estaminais (PTP-HSCF) [também denominado do inglês brain-derived phosphatase 1 (BDP1), PTP20, PTP-K1, PTPN18, etc]. Essas PTPs compartilham uma organização estrutural comum, incluindo um domínio fosfatase amino-terminal (figura 3) (Veillette et
al., 2009). LYP é uma proteína intracelular de 105 kDa, que contém
dois domínios funcionais, o domínio N-terminal contém o único domínio catalítico de ∼300 resíduos de aminoácidos, no qual o P-loop compreende os resíduos de 226 a 233, a Cys227 é o resíduo catalítico, um loop de reconhecimento à pTyr (resíduos 54-60), o WPD-loop (contêm o Asp195 catalizador geral ácido-base,(resíduos 193-204)), e o Q-loop (contêm a conservada Gln274 requerida para posicionar e ativar a molécula de água para o ataque nucleofílico, (resíduos 274-301)) (Tsai
et al., 2009). Já o domínio não catalítico, o C-terminal apresenta ∼200
resíduos de aminoácidos e contém quatro domínios SH3 ricos em prolina. A proteína LYP interage com diversas moléculas intracelulares, principalmente com a proteína regulatória negativa Csk (do inglês,
C-terminal Src kinase) durante a ativação dos linfócitos T (Burn et al.,
2011). Além do sítio catalítico alguns autores identificaram um segundo sítio de ligação ao substrato em LYP, que corresponde aos resíduos Phe28, Leu29, e Arg33 localizados na hélice α2, próximo do segundo sítio de ligação identificado em PTP1B, comparando a estrutura das duas enzimas (Stanford et al., 2011; Yu et al., 2007).
LYP tem recebido enorme importância como regulador do sistema imune, por causa das recentes descobertas de que um único nucleotídeo polimórfico (SNP), C1858T, no gene PTPN22 está associado a diversas doenças autoimunes, incluindo diabetes tipo 1 (Bottini et al., 2004), artrite reumatoide (Wu et al., 2005) e lúpus eritematoso sistêmico (Kyogoku et al., 2004). O produto do gene polimórfico apresenta um resíduo de triptofano na posição 620 ao invés de um resíduo de arginina (R620W). A LYP-R620W é uma proteína variante que apresenta ganho de função, o aumento na sua atividade fosfatase leva a uma diminuição na interação com domínio SH3 da Csk, efeito que potencializa a atividade inibitória de LYP na sinalização das células T, e faz desta variante um importante fator patogênico em doenças autoimunes. No entanto, o mecanismo de ação da proteína variante LYP-R620W em doenças de autoimunidade ainda não está muito esclarecido. Desta forma, a descoberta de inibidores específicos para essa enzima tem um grande potencial terapêutico para doenças
autoimunes, especialmente para pacientes que portam o polimorfismo R620W (Hou et al., 2015).
Figura 3 - Estrutura primária da família proteínas tirosinas fosfastases PEST.
Representação esquemática de três PTPs da família PEST - (Prolina, Ácido Glutâmico, Serina e Treonina). A posição do domínio catalítico, da região central não-catalítica e do domínio de homologia carboxi- terminal (CTH) conservado está indicado na figura 3. Em destaque encontra–se os motivos envolvidos em interação proteína-proteína, os parceiros de ligações e os sítios conhecidos de fosforilação em resíduos de Serina (S) e Tirosina (Y). O local onde ocorre o polimorfismo (R620W) em LYP é especificado. P, motivo rico em prolina; NPxH, Asparagina-prolina- qualquer resíduo-histidina; N, amino-terminal; C, carboxi-terminal Fonte: (Veillette et al., 2009).
1.2.3 PTP-PEST
PTP-PEST, também nomeada PTPN12, é uma proteína tirosina fosfatase citosólica (Yang et al., 1993). PTPN12 regula vários processos fisiológicos incluindo migração celular, resposta imune e atividade neuronal, através da defosforilação de múltiplos substratos. A estrutura terciaria dos ~280 resíduos de aminoácidos do domínio catalítico é altamente conservado entre os membros da família. O P-loop é composto pelos resíduos 230-237, na qual a Cys231 é a cisteína catalítica. O WPD-loop, está definido entre os resíduos 197-208. O loop de reconhecimento pTyr entre os resíduos 58-64 e o Q-loop entre os resíduos 278-285 (Dong et al., 2017). Como mencionado anteriormente, LYP e PTP-PEST fazem parte da mesma família de PTPs denominada PEST, apresentando bastante similaridades entre suas estruturas, porém
quatro regiões de PTP-PEST exibem diferenças conformacionais relevantes quando comparada as outras PTPs da família PEST, incluindo WPD-loop, β1-loop-β2, β3-loop-β4 e hélice-α1. Sem um ânion no sítio ativo, o WPD-loop de PTP-PEST existe em uma conformação semiaberta assemelhando entre a conformação fechada da apo-BDP1 e a conformação aberta apo-LYP (figura 4). Como pode ser visto na figura 4 a diferença mais expressiva está na inserção de cinco resíduos de aminoácidos na PTP-PEST (N12-specific insert loop), que não está presente nas outras duas PTPs, formando um loop entre as hélices α1- α2. As diferenças estruturais entre PTPN12 e os outros membros da família PTP-PEST provavelmente desempenham papéis importantes no reconhecimento de substrato e na seletividade funcional desta enzima (Li et al., 2016).
PTP-PEST é uma proteína reguladora crítica da adesão, migração celular e tumorigenese (Dong et al., 2017). Ela associa-se e defosforila diversas proteínas relacionadas ao citoesqueleto, incluindo Cas, paxilina, cinase de adesão focal (FAK), piruvato cinase (Pyk2), e prolina-serina-treonina que interage com proteína fosfatase (PSTPIP) (Lee et al., 2015; Li et al., 2016), além de defosforilar outros tipos de moléculas não associadas ao citoesqueleto, tais como Shc e vários receptores de PTKs (Rhee et al., 2013).
Foi comprovado que a PTP-PEST é necessária para o desenvolvimento normal do embrião em camundongos, animais sem o gene da PTP-PEST em seu genoma exibiram morte embrionária após 10,5 dias (Sirois et al., 2006). Estudos prévios sugerem também que PTP-PEST suprime crescimento e metástase das células do câncer humano triplo negativo (TNBC). Neste contexto, relatos recentes indicam que mutações, deleção de genes e diminuição na expressão de
PTPN12 está altamente envolvido no desenvolvimento de câncer de
mama, e também correlacionado com câncer de pulmão e hepatocelulares (Cao et al., 2015; Dong et al., 2017; Li et al., 2016; Rhee et al., 2013; Sun et al., 2011).
Figura 4 - Superposição de PTP-PEST com as duas outras PTPs da família PEST (BDP1 e LYP).
PTP-PEST está em vermelho, BDP-1 está em rosa e LYP está em azul. As setas indicam cada estrutura para ressaltar as diferenças. Fonte: (Li et al., 2016).
1.3 Proteínas tirosina fosfatases bacterianas
A função desempenhada pelas proteínas fosfatases de bactérias patogênicas vem sendo estudada extensivamente nos últimos anos, os achados demonstram a relação das proteínas Ser/Thr e Tyr fosfatases com a sobrevivência e virulência de muitas espécies. Nesse sentido, estudos bioquímicos, estruturais, funcionais e de caracterização genética têm realçado a importância dessas enzimas em bactérias (figura 5) (Sajid
Figura 5 - Proteínas fosfatases de bactérias infecciosas e seus diversos papéis na sinalização celular.
Fonte: (Sajid et al., 2015)
Dentre as diversas fosfatases de bactérias patogênicas existentes, o enfoque do trabalho foi as seguintes PTPs: YopH secretada por bactérias patogênicas do gênero Yersinia, PtpA e PtpB secretadas pelo
Mycobacterium tuberculosis.
1.3.1 YopH de Yersinia spp
O gênero Yersinia consiste em cocobacilos gram-negativos, nas quais três espécies são patogênicas aos seres humanos: Yersinia pestis, o agente causador da peste, e os dois patógenos entéricos, Yersinia
enterocolitica, e Yersinia pseudotuberculosis (Fällman et al., 2005; Pha et al., 2016).
Yersinoses foi a mais frequente zoonose relatada na União Europeia em 2015 e Y. enterocolitica foi o agente mais comum com 7202 casos confirmados em humanos (EFSA, 2016).
Y. enterocolitica e Y. pseudotuberculosis são responsáveis por
várias doenças, incluindo diarreia leve, enterocolite, linfoadenite e adenite mesentérica, artrite reativa (inflamação estéril das articulações) e irite. Em raros casos, ambas as espécies podem causar sepse. Yersinias podem ser isoladas do solo, água, carnes, leite, vários vegetais dentre outras fontes (Verbikova et al., 2018). Após a contaminação oral, as bactérias passam através do trato gastrointestinal até alcançar o íleo terminal. Nesse ponto, elas já apresentam as proteínas invasinas na superfície externa da membrana, facilitando a translocação através da barreira epitelial intestinal. As bactérias atravessam a barreira epitelial através das células M (células micropregas) que estão associadas com as placas de Payer no final do intestino delgado (Mikula et al., 2012; Viboud et al., 2005).
Por mais que existam terapias efetivas, o tratamento para infecções provocadas por estas bactérias patogênicas tornaram-se mais difíceis nas últimas décadas devido ao surgimento de resistência aos antibióticos de amplo uso como: penicilina, cloranfenicol e tetraciclina (Hu et al., 2013; Verbikova et al., 2018).
Y. pestis é um patógeno intracelular facultativo, sendo a espécie
mais virulenta e invasiva das três espécies, conhecida por causar a peste, uma das doenças infecciosas mais perigosas, que pode se manifestar de três formas: pneumônica, bubônica e septicêmica (MIKULA et al., 2013). Cada forma da peste resulta em uma infecção aguda que é delineada pelos tecidos colonizados pela Y. pestis. A peste bubônica é a forma mais comum, surgindo após mordida por uma pulga infectada por
Y. pestis. A bactéria dissemina através do sítio de inoculação no sistema
linfático. Frequentemente, a peste bubônica pode evoluir à peste septicêmica, as bactérias multiplicam-se no sangue, causando a formação de coágulos letais em todo o corpo. Já peste pneumônica é causada principalmente pela inalação de bactérias em aerossol, sendo a forma mais letal, devido à falência do sistema respiratório, coagulopatia, hemorragia ou em consequência da sépsis (Connor et al., 2018; Putzker
et al., 2001; Smego et al., 1999; Smiley, 2008; Viboud et al., 2005).
Uma estratégia utilizada por bactérias patogênicas Gram-negativas é o desenvolvimento de uma complexa maquinaria denominada sistema de secreção tipo III (T3SS), sob o contato com a célula hospedeira esse sistema injeta um grupo de proteínas bacterianas no citoplasma da mesma. As três espécies patogênicas de Yersinia têm em comum um plasmídeo de 70 kb, o qual codifica um sistema de secreção tipo III, e várias proteínas efetoras, chamadas de Yop (Yersinia
Yersinia (YopE, YopH, YopT, YopM, YpkA/YopO, and YopP/J) dentro das células hospedeiras perturba a dinâmica do citoesqueleto envolvido na fagocitose, desregula a produção de citosinas pró-inflamatória e induz apoptose celular das células alvo (Cornelis, 2002; Liang et al., 2003; Pha et al., 2016).
Das 6 Yops secretadas pela Yersinia através do T3SS, encontra-se uma proteína tirosina fosfatase, a YopH (Yersinia outer protein H). YopH, juntamente com outras três proteínas Yops (YopE, YopT e YopO/YpkA), estão envolvidas na supressão da fagocitose por perturbar o citoesqueleto de leucócitos polimorfonucleares e macrófagos (Heneberg, 2012). Sabe-se que a YopH defosforila a cinase de adesão focal (FAK), paxilina, Lck, p85, a proteína de ligação Fyn (FYB), p130Cas, SKAP-HOM, SLP-76 e LAT, dessa forma, interrompendo as adesões focais e suprimindo a produção de espécies reativas de oxigênio (ERO). Entretanto, a sua expressão não contribui apenas para a evasão da resposta imune inata, mas também, da resposta imune adaptativa, ao impedir a ativação dos linfócitos B e T, pelo menos in vitro. Além disso, a síntese da proteína quimiotática de monócitos-1 (MCP-1) e a proliferação de linfócitos também são inibidas pela ação da YopH (Aepfelbacher et al., 2007; Heneberg, 2012).
YopH é uma proteína de tirosina fosfatase de 51 kDa que possui 468 resíduos de aminoácidos e dois domínios: O domínio N-terminal desta proteína é responsável pelo reconhecimento de substrato (Montagna et al., 2001), enquanto o domínio C-terminal é compreendido pelos resíduos 163-468 possui atividade catalítica e é estruturalmente semelhante às PTPs eucarióticas (Stuckey et al., 1994). Em YopH o sítio catalítico está entre os resíduos de aminoácidos 403 e 410, onde a cisteína catalítica está na posição 403. Este domínio catalítico é muito similar ao encontrado na fosfatase humana PTP1B e é composto por uma mistura de padrões estruturais de folhas β e α- hélices (Whittier et al., 2014). Em predições de docking molecular alguns autores descreveram um segundo sítio de ligação ao substrato, indicando que ele se encontra nas proximidades da hélice α4 e da alça β6/β7, do lado oposto ao sítio ativo, devido este segundo sítio não ser conservado entre PTPs, o mesmo torna-se alvo promissor para a busca de inibidores específicos (Hu et al., 2006; Kuban-Jankowska et al., 2016a; Phan et al., 2003).
A importância de se buscar inibidores para Yersinia se dá por vários motivos: Yersinia são agentes causadoras de doenças desde síndromes gastrointestinais até peste; Atualmente há elevada resistência a antibióticos; Tem potencial para ser usada como uma arma biológica,
Mudanças climáticas elevam o risco dos surtos; Assim como YopH é um fator essencial para à virulência, torna-se um excelente candidato alvo para o desenvolvimento de novos fármacos (Hu et al., 2006). 1.3.2 PtpA e PtpB de Mycobacterium tuberculosis
O agente causador da tuberculose (TB), o Mycobacterium
tuberculosis (Mtb), infecta cerca de um terço da população mundial,
sendo esta epidemiologia heterogeneamente distribuída em todo o mundo e afetando principalmente países de baixa renda (WHO, 2016).
A Organização Mundial de Saúde (WHO) publica estimativas da incidência de TB a nível nacional, regional e mundial anualmente, além de informar notificações de casos oficiais. De acordo com o relatório global da OMS, publicado em 2016, havia aproximadamente 10,4 milhões de casos incidentes (142 casos por 100.000 habitantes) em todo o mundo, dos quais 3,5 milhões (34%) estavam entre as mulheres e 1,0 milhão (10%) entre crianças (Sotgiu et al., 2017).
O Mycobacterium tuberculosis (Mtb) é transmitido entre os hospedeiros por micropartículas contendo os bacilos suspensos no ar. Acomete principalmente os pulmões, podendo também afetar cérebro, baço, olhos, pele, coração, entre outros órgãos (Lawn et al., 2011). Após a inalação de bactérias de TB estabelece-se a infecção primária, podendo a pessoa infectada se curar se estiver com o sistema imunológico forte, ou ainda o Mtb pode permanecer por muitos anos em estado latente e a pessoa infectada não apresentará os sintomas e não transmitirá a doença, por outro lado se o sistema imunológico estiver ou venha a ser comprometido a pessoa infectada terá a manifestação da doença (Vasava et al., 2017).
Apesar de haver vacina para a tuberculose desde 1921 a eficácia da mesma ainda é controversa. A vacina que se tem aprovada até hoje, a Bacilo de Calmette-Guérin (BCG), desenvolvida através da atenuação de uma cepa de Mycobacterium bovis, apresenta proteção pouco confiável contra a TB pulmonar em adultos, sendo mais eficaz em casos de TB severa em crianças. Desta maneira, o desenvolvimento de novas vacinas contra a TB tem sido uma área de pesquisa em andamento por várias décadas. Mas só recentemente é que os esforços resultaram no desenvolvimento de diversos candidatos à vacina em fase de avaliação pré-clínica (Wang et al., 2013).
Um grande desafio para erradicação da TB é a resistência aos antibióticos, devido principalmente à adesão inadequada ao regime de tratamento, que é complexo, exigindo múltiplos medicamentos por no
mínimo 6 meses. A tuberculose multirresistente (MDR) (quando apresentam resistência à isoniazida e rifampicina) afeta mais de 50 milhões de pessoas, além disso há um número crescente de casos de tuberculose extremamente resistentes aos medicamentos (XDR) (quando também apresentam resistência à fluorquinolonas e a um dos três aminoglicosídeos injetáveis: capreomicina, canamicina ou amicacina), ambas formas de TB apresentam altas taxas de mortalidade devido à limitada opções de tratamento. A prevalência de cepas de TB MDR e XDR e a contínua epidemia de AIDS destaca a necessidade de identificar novos alvos terapêuticos e desenvolver estratégias inovadoras para combater a tuberculose resistente a medicamentos (Chiang et al., 2013; Dutta et al., 2016; Li et al., 2017).
Duas proteínas com sequência características de PTPs, mptpA e
mptpB, identificadas pela análise do genoma do Mtb, agem como
fatores chaves na virulência dessa bactéria, uma vez que são necessárias a sobrevivência bacteriana durante a infecção dos macrófagos hospedeiros (Mascarello et al., 2010).
A PtpA é uma LMW-PTP, com 17,5 kDa, secretada pelo M.
tuberculosis no interior do macrófago, e que desfosforila especificamente resíduos de tirosina. Ela é classificada como uma PTP Cys-dependente, com o motivo assinatura (V)CTGNICR(S), no qual o resíduo de Cys11 atua como o nucleófilo. A estrutura tridimensional da PtpA apresenta apenas um domínio com a típica arquitetura de LMW-PTP, composto por quatro-cadeias de folhas-β paralelas centrais, rodeadas por α-hélices. O sítio ativo (P-loop) situa-se entre a região C-terminal da primeira folha-β e a região N-C-terminal da primeira α-hélice e contém a Cys catalítica e o DPYY-loop, que corresponde ao WPD-loop das PTP clássicas (Menegatti et al., 2016).
A PtpB é uma tirosina fosfatase de 30 kDa classificada com uma PTP de DUSP Cys-dependente de baixa similaridade com fosfatases humanas (Silva et al., 2010). PtpB é uma fosfatase de tripla especificidade, que catalisa a defosforilação dos resíduos (serina/treonina ou tirosina) e também tem atividade fosfatase em fosfoinositideos. Seu motivo assinatura é composto pelos seguintes resíduos (H)CFAGKDR(T), no qual o resíduo de Cys160 atua como o nucleófilo. A resolução da estrutura tridimensional da PtpB revelou duas características distintas: dois sítios de ligação ao fosfato e duas α-hélices que cobrem e protegem o sítio ativo como uma tampa (lid) (Mascarello
et al., 2010; Menegatti et al., 2016; Wong et al., 2013).
Mtb PtpA previne a fusão entre lisossomo e fagossomo por
Vacuolar Protein Sorting VPS33B). A VPS33B é uma subunidade do
complexo Vps-C (class C vacuolar protein sorting complex). Esse complexo é um regulador essencial do tráfego e fusão de membranas endossomais. Mtb PtpA também é capaz de inibir a acidificação do fagossoma por se ligar à subunidade H do complexo de V-ATPase bloqueando o tráfico de V-ATPase (figura 6). Por outro lado Mtb PtpB uma vez dentro do macrófago, subverte as respostas imunes inatas por bloquear o sinal extracelular regulado por
(extracellular-signal-regulated kinases 1/2) ERK1/2 e p-38 MAPK, assim bloqueando a
produção de interleucina 6 (IL-6) estimulada por IFN-γ e impede morte celular do macrófago infectado pelo processo de apoptose, através da ativação da via Akt (proteína cinase B) e bloqueando atividade de caspase-3 (figura 6) (Chiaradia et al., 2012; Dutta et al., 2016; Menegatti et al., 2016; Wong et al., 2013).
Figura 6 - Mecanismo de ação da PtpA e PtpB na interrupção de processos celulares do macrófago hospedeiro.
A PtpA se liga à subunidade H da VATPase vacuolar permitindo a interação com sua proteína substrato VPS33B na interface de fusão do fagossomo e lisossomo. A VPS33B é uma subunidade de um complexo (Vps-C) que controla o tráfico de membrana ao longo da via endocítica. A desfosforilação de VPS33B, resulta na exclusão de V-ATPase a partir do fagossoma
micobacteriano. A atividade da PtpB secretada no citosol do macrófago diminui a fosforilação de ERK1/2 e p38 gerando uma baixa produção de IL-6. Além disso, a PtpB leva a ativação da via de sinalização que envolve Akt, isto causa bloqueio na atividade da caspase 3 e resulta em decréscimo da atividade apoptótica. Fonte: (Menegatti, 2014).
Recentemente, Dutta e colaboradores (2016) identificaram inibidores altamente potentes e seletivos de Mtb PtpA (L335-M34) e
Mtb PTPB (L01-Z08). Os autores avaliaram a atividade das moléculas
isoladas ou em combinação com o tratamento existente para tuberculose, que é a combinação de antibióticos. Eles demonstraram que a combinação do tratamento existente com essas novas moléculas teve uma moderada sinergia (Dutta et al., 2016). Esse relato evidencia a importância da identificação de novos possíveis fármacos para potencializar a atividade do tratamento padrão e combater o significante aumento de resistência aos fármacos convencionais.
Uma chalcona é uma simples estrutura química de muitos compostos que ocorrem naturalmente e tem uma ampla distribuição em vegetais, frutas, chás e outras plantas (Karthikeyan et al., 2015; Zhou et
al., 2015). A palavra “chalcona” é derivada da palavra grega “chalcos”,
que significa “bronze”, resultante das cores de muitas chalconas naturais (Sahu et al., 2012; Zhuang et al., 2017).
A privilegiada estrutura da chalcona permanece um deslumbre entre os pesquisadores do século 21, devido à sua química simples, facilidade de síntese, diversidade de substituintes, ampla gama de atividades biológicas, tais como antidiabético (Bak et al., 2011), antineoplásico (Salum et al., 2013), anti-hipertensivo (Bukhari et al., 2013), antituberculose (Mascarello et al., 2010), dentre várias outras atividades (Mahapatra et al., 2015).
Nesse sentido, nosso grupo de pesquisa vem demonstrando o potencial antimicrobiano que moléculas derivadas de chalconas possuem, uma vez que elas têm a capacidade de inibir a atividade enzimáticas de PTPs essenciais à virulência do M. tuberculosis (Chiaradia et al., 2008; Chiaradia et al., 2012; Mascarello et al., 2010) e
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
O presente trabalho teve como objetivo avaliar uma biblioteca de chalconas sintéticas buscando identificar novas moléculas com potencial inibitório da proteína tirosina fosfatase linfoide específica (LYP) relacionada à várias doenças do sistema imune.
2.2 Objetivos Específicos
Avaliar a ação in vitro dos compostos orgânicos frente à atividade da proteína tirosina fosfatase linfoide específica (LYP);
Determinar a IC50 (concentração necessária para um composto inibir 50% da atividade da enzima) dos compostos mais ativos frente às PTPs descritas previamente: PtpA, PtpB, YopH, LYP, PTP-PEST e PTP1B;
Determinar os parâmetros cinéticos, bem como o mecanismo de inibição dos compostos mais promissores;
Realizar análises de atividade enzimática e estruturais do complexo enzima-inibidor, visando o melhor entendimento dos mecanismos de ação dos inibidores mais promissores.
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Preparo de células competentes para transformação
A metodologia utilizada para obtenção de células competentes foi a descrita por Ausubel e colaboradores (Ausubel et al., 1995). As células tornaram-se aptas a receber DNA plasmidial após tratamento químico com cálcio.
Foram semeadas bactérias Escherichia coli BL21(DE3) em placas de Petri contendo LB-ágar (extrato de levedura 0,5 %, peptona 1 %, NaCl 1 %, ágar 2 % pH 7,5). Estas placas foram incubadas por um período de 16 horas a 37 °C, após foram guardadas na geladeira. Uma colônia isolada da placa foi adicionada a um tubo contendo 10 mL de meio e cultivadas em incubadora a 37ºC e 150 rpm, por aproximadamente 16 horas. No outro dia, transferiu-se o equivalente a 0,025 de densidade óptica a 600 nm para um tubo de 50 mL de meio LB (extrato de levedura 0,5 %, peptona 1 %, NaCl 1 % pH 7,5) o qual foi incubado sob agitação a 37 °C até que fosse atingida a densidade óptica de 0,4 no comprimento de onda de 600 nm. Em seguida a suspensão de células foi centrifugada a (3500 rpm por 10 minutos) e o sobrenadante foi descartado. O sedimento foi homogeneizado com 25 mL de uma solução gelada (4 °C) de CaCl2 0,1 M. A suspensão foi incubada por uma hora em gelo e novamente centrifugada. O sedimento foi então, homogeneizado com 5 mL de uma solução gelada de CaCl2 0,1 M contendo 20 % de glicerol, a suspensão foi mantida por 30 minutos em gelo e em seguida foram feitas alíquotas de 100 μL. As alíquotas foram conservadas a -80 °C (Martins, 2015).
3.2 Transformação das bactérias Escherichia coli
Os plasmídeos pET28a-LYP e pET28a-PTP_PEST codificantes das PTP humanas LYP e PTP-PEST respectivamente, foram fornecidos pelo Dr. Nuzio Bottini do Institute for Genetic Medicine em Los Angeles, Estados Unidos. O plasmídeo contendo o gene da PtpA Mt_PtpA) e o plasmídeo contendo o gene da PtpB (pET28a-Mt_PtpB) de Mycobacterium tuberculosis foram cedidos pelo Dr. Pedro Alzari (Unité de Biochimie Structurale, Institut Pasteur, Paris, França). Os plasmídeos p7-7Yop51*Δ162 e pET19b-Hs_PTP1B, codificantes da YopH de Y. enterocolitica e a PTP humana PTP1B, respectivamente, foram cedidos pelo Dr. Tiago A. S. Brandão da Universidade Federal de Minas Gerais (Departamento de Química, UFMG).
Para transformar as bactérias competentes, 100 μL de células de
E. coli BL21 (DE3) foram incubadas com 50 ng do vetor de expressão
de interesse em gelo por 20 min. Após o período de incubação, as células sofreram um choque térmico: 1 min e 30 segundos a 42 °C e 2 min a 0 °C. Em seguida, as células foram estabilizadas com a adição de 500 μL de meio LB líquido, sendo mantidas a 37 °C durante 1 hora. Por fim, as células foram semeadas em meio LB sólido suplementado com o antibiótico para o qual o plasmídeo confere resistência (vetor pT7-7 e vetor pET19b, 100 μg/mL de ampicilina e os demais vetores 50 μg/mL de canamicina) e cultivadas a 37 °C durante 15 horas (Ausubel et al., 1995).
3.3 Expressão e purificação das proteínas recombinantes
As proteínas recombinantes foram purificadas com o auxílio do cromatógrafo ÄKTA (GE Healthcare). A análise da pureza das frações obtidas após a purificação foi realizada através de eletroforese em géis de poliacrilamida sob condições desnaturantes e redutoras (SDS-PAGE - Sodium Dodecyl Sulfate- Polyacrylamide Gel Electrophoresis). Os géis foram posteriormente corados com o corante Coomassie Brilliant
Blue R-250.
As enzimas foram quantificadas através do método de Bradford (Bradford, 1976) com o uso de soroalbumina bovina como padrão e/ou através da absorbância em 280 nm na presença de hidrocloreto de guanidina 6 M (Edelhoch, 1967; Pace et al., 1995). Após o processo de purificação, todas as enzimas utilizadas no presente trabalho foram fracionadas e mantidas em freezer -80 °C.
3.3.1 Expressão e purificação da YopH de Y. enterocolítica e da PTP1B humana.
Para realizar a expressão e purificação da YopH e da PTP1B utilizou-se os protocolos previamente descritos em Brandão (Brandao et
al., 2010; Brandão et al., 2009), Chiaradia (Chiaradia et al., 2012) e
Martins (Martins, 2015) com pequenas modificações. Estas enzimas foram produzidas com a colaboração da aluna de iniciação científica Luiza de Araujo Motta.
Para iniciar a expressão destas enzimas foram primeiramente feito pré-inóculos de 10 mL de meio LB suplementado com 100 μg/mL de ampicilina. A estes meios foram acrescidos separadamente, uma colônia bacteriana obtida durante o processo de transformação. Os
pré-inóculos da YopH e da PTP1B foram mantidos sob agitação (150 rpm) a 37 °C por um período de 16 horas. Passado este tempo, 5 mL da suspensão bacteriana foram transferidos para uma garrafa de cultivo contendo 250 mL de meio LB suplementado com o antibiótico já citado. As garrafas de cultivo das duas fosfatases foram mantidas sob agitação (150 rpm) a 37 °C até que o valor de densidade óptica a 600 nm estivesse entre 0,7 a 0,8. Em seguida foi adicionado ao meio isopropil-β-D-tiogalactopiranosídeo (IPTG) para induzir a expressão das proteínas de interesse (0,4 mM de IPTG para a expressão da YopH e 0,6 mM para expressão da PTP1B). Ambos os cultivos foram mantidos sob agitação (150 rpm) a 25 °C por um período de 16 horas. Em seguida os cultivos foram centrifugados 5.000 x g, por 20 min, a 4 °C. O sedimento do cultivo de YopH obtido após a centrifugação foi homogeneizado com 10 mL do tampão de lise (Acetato de sódio 100 mM pH 5,7; NaCl 100 mM; EDTA 1 mM e DTT 1 mM) acrescido de um inibidor de proteases (PMSF - fluoreto de fenilmetilsulfonila) à concentração final de 40 μg/mL. As células homogeneizadas foram, então, rompidas no processo de sonicação (7 ciclos de 20 segundos em gelo), em seguida centrifugou-se o conteúdo a 4 °C, por 30 minutos a 16000 g. A proteína YopH foi purificada em condições nativas por cromatografia de troca iônica com uma coluna catiônica carregada com radicais – CH2CH2CH2SO3 (HiTrap SP HP 5 mL, GE Healthcare). Antes de ser carregada com a amostra, a coluna foi previamente equilibrada com acetato de sódio 100 mM pH 5,7, NaCl 100 mM, EDTA1 mM e DTT 1 mM. As proteínas que ligaram à coluna, devido à atração das cargas positivas (pH abaixo do ponto isoelétrico de YopH) pelos radicais – CH2CH2CH2SO3, foram eluídas com um gradiente de NaCl 10 a 500 mM, o qual compete pelos radicais –CH2CH2CH2SO3, em um fluxo de 2,5 mL/min e em frações de 2 mL. Após a purificação a enzima foi concentrada por ultrafiltração utilizando um filtro de poro 10 kDa (Amicon Ultra-15 Millipore) e seu tampão foi trocado para Bis-Tris-Propano 20 mM pH 6,5; NaCl 10 mM; DTT 1 mM e EDTA 1 mM também por ultrafiltração.
Para purificar a PTP1B, o sedimento obtido após a centrifugação foi homogeneizado com 10 mL do tampão A_PTP1B (Imidazol 20 mM pH 7,5; EDTA 1 mM, DTT 3 mM e glicerol 10%). Utilizou-se durante o processo o inibidor de proteases PMSF à concentração final de 40 μg/mL. Para a obtenção da fração solúvel, as células foram rompidas por sonicação (7 ciclos de 20 segundos em gelo) e centrifugadas a 4 °C, por 40 minutos a 16000 g. Na purificação desta enzima foram utilizados dois sistemas ÄKTA (GE Healthcare) e 3 colunas na seguinte ordem:
HiTrap™ Q HP de 1 mL (coluna trocadora de ânion da Amersham Biosciences), HiPrep™ 26/10 de 53 mL (coluna desalinizadora e trocadora de tampão) e HiTrap™ SP HP de 1 mL (coluna trocadora de cátion da Amersham Biosciences). A eluição na primeira coluna foi feita com o tampão utilizado para homogeneizar o sedimento e o tampão A+_PTP1B que possui os mesmos componentes que o primeiro e 500 mM de NaCl. A fração correspondente à enzima recolhida da primeira coluna foi eluída na segunda coluna com o tampão B_PTP1B (Bis-Tris 20 mM pH 6,5; EDTA 1 mM, DTT 3 mM e glicerol 10%). Os tampões B_PTP1B e B+_PTP1B (Bis-Tris 20 mM pH 6,5; NaCl 500 mM; EDTA 1 mM, DTT 3 mM e glicerol 10%) foram utilizados na última coluna para eluir as frações recolhidas na segunda coluna. A PTP1B purificada foi concentrada também por ultrafiltração.
3.3.2 Expressão e purificação da PtpA e PtpB de Mtb e das enzimas humanas PTP-PEST e LYP.
A expressão das enzimas PtpA, PtpB, PTP-PEST e LYP foram realizadas em primeiro lugar realizando pré-inóculos de 10 mL de meio LB suplementado com 50 μg/mL de canamicina. A estes meios foi adicionada separadamente, uma colônia bacteriana obtida durante o processo de transformação. Os pré-inóculos destas enzimas foram mantidos sob agitação (150 rpm) a 37 °C por um período de 16 horas. Após a primeira etapa de incubação, 5 mL da suspensão bacteriana foram transferidos para uma garrafa de cultivo contendo 250 mL de meio LB suplementado com 50 μg/mL de canamicina, fazendo um total de 1 litro de cultivo. As garrafas de cultivo das quatro enzimas foram mantidas sob agitação (150 rpm) a 37 °C até que o valor de DO600nm entre 0,6 e 0,8 fosse atingido. Em seguida, a expressão das proteínas foi realizada pelo acréscimo de IPTG à concentração final de 0,5 mM na temperatura ideal para expressão das enzimas (15 °C para PtpA e PtpB e 25 °C para LYP e PTP-PEST), por um período de 16 horas sob agitação (150 rpm). Os cultivos foram, então, centrifugados a 5.000 x g, por 20 min, 4 °C. Os sedimentos obtidos após a centrifugação dos cultivos foram homogeneizados com o tampão de lise (Tris-HCl 20 mM pH 8,0, NaCl 0,5 M, imidazol 10 mM e 10% glicerol) acrescido de inibidor de protease PMSF (40 μg/mL) e sonicados em gelo. Em seguida, realizou-se a centrifugação 16.000 x g por 40 minutos, a 4 ºC. Separou-realizou-se a frações solúveis para proceder com o processo de purificação.
Devido as fosfatases PtpA, PtpB, PTP-PEST e LYP possuírem um grupo de seis histidinas em sua parte N-terminal (His-Tag) facilita as
suas purificações pela metodologia de cromatografia de afinidade a metal imobilizado (IMAC- do inglês Immobilized Metal Affinity
Chromatography). As frações solúveis anteriormente obtidas foram
eluídas em colunas HisTrap (colunas contendo níquel como metal imobilizado, Amersham Bioscenences) com o uso dos tampões A (Tris-HCl 20 mM pH 8,0, NaCl 0,5 M, glicerol 10%) e tampão B (Tris-(Tris-HCl 20 mM pH 8,0, NaCl 0,5 M, glicerol 10%, Imidazol 0,5 mM, 1 β-mercaptoetanol 1 mM). Por possuir uma estrutura química semelhante à histidina, o imidazol contido no tampão B compete pelo níquel presente na coluna com a cauda de histidina das proteínas recombinantes, à medida que a concentração do imidazol aumenta, as proteínas de interesse são eluídas.
Após a purificação as frações correspondentes às proteínas de interesse foram submetidas a diálises sequenciais para a retirada gradual do imidazol. O último tampão utilizado na diálise e no qual as proteínas foram mantidas é o Tris-HCl 20 mM pH 8,0; NaCl 50 mM, EDTA 5 mM; glicerol 20%; DTT 5 mM. Logo após, procedeu-se à concentração das proteínas por ultrafiltração (Martins, 2015; Menegatti, 2014)
3.4 Avaliação da inibição enzimática (in vitro) de LYP
A síntese e a caracterização dos compostos sintéticos avaliados neste trabalho foram realizadas pelo aluno Luiz Felipe Schmitz de Souza do Laboratório Estrutura e Atividade do Departamento de Química da UFSC, sob a coordenação do Prof. Dr. Ricardo José Nunes.
Foi avaliada a atividade de uma biblioteca de 23 compostos orgânicos da classe química das chalconas, como possíveis inibidores da proteína LYP.
Os testes de avaliação da inibição enzimática pelos compostos foram realizados de acordo com metodologia já descrita (Chiaradia et
al., 2008) com algumas modificações. Os compostos avaliados neste
trabalho foram dissolvidos em dimetilsulfóxido (DMSO). A atividade enzimática de LYP foi mensurada por espectrofotometria (leitor de microplaca TECAN Infinite M200) monitorando a hidrólise do substrato artificial p-nitrofenil fosfato (pNPP) (figura 7) a 37 °C na ausência ou presença de 25 μM de cada composto. Os ensaios foram realizados em uma reação de 200 μL contendo 20 μL de imidazol 200 mM pH 7,0 (20 mM final), 5 μL de pNPP 400 mM (10 mM final), 5 μL de composto 1 mM (25 μM final – 2,5 % DMSO final), 2 μL de enzima (167 nM LYP final) e 168 μL de água ultrapura. A reação foi iniciada pela adição do substrato (pNPP 10 mM) após a pré-incubação da enzima com o
