AUGUSTO MUZILLI JUNIOR
ESTUDO COMPARATIVO ENTRE DIABETES TIPO 1 E TIPO 2 NO
DESENVOLVIMENTO DE HIPOALGESIA INDUZIDA PELO DIABETES
NA ARTICULAÇÃO TEMPOROMANDIBULAR DE RATOS
PIRACICABA 2019
AUGUSTO MUZILLI JUNIOR
ESTUDO COMPARATIVO ENTRE DIABETES TIPO 1 E TIPO 2 NO
DESENVOLVIMENTO DE HIPOALGESIA INDUZIDA PELO DIABETES
NA ARTICULAÇÃO TEMPOROMANDIBULAR DE RATOS
Tese apresentada à Faculdade de Odontologia de Piracicaba da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutor em Odontologia, na área de Fisiologia Oral.
Orientadora: Profa. Dra. Michelle Franz Montan Braga Leite
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELO ALUNO AUGUSTO MUZILLI JUNIOR E ORIENTADO PELA PROFª. DRª MICHELLE FRANZ MONTAN BRAGA LEITE
PIRACICABA 2019
À Deus por tudo que tenho e por dar sentido à vida;
Aos meus pais Cleyde e Augusto pelo amor incondicional e o exemplo de vida;
Aos meus filhos Tatiana, Tiago, Christina, Marina e Augustinho e aos meus netos o meu eterno amor e dedicação por vocês;
Aos meus irmãos Oscar, Carlos Alberto e Marcelo pela amizade fraterna e incentivo;
Ao grande amor da minha vida, minha esposa Cely, o meu eterno agradecimento pela dedicação, compreensão e apoio.
À Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), em nome do seu magnífico Reitor Prof. Dr. Marcelo Knobel e à Faculdade de Odontologia de Piracicaba (FOP), em nome de seu Diretor Prof. Dr. Francisco Haiter Neto, pelo privilégio em ser aluno desta instituição e por oferecer uma excelente qualidade de ensino e infraestrutura para a realização desse trabalho.
À minha orientadora Profa. Dra. Michelle Franz Montan Braga Leite por todo apoio e dedicação dada;
Ao Programa de Pós-Graduação em Odontologia, pela oportunidade oferecida;
Aos Professores do Departamento de Biociências pelos ensinamentos ministrados e pelo apoio à pesquisa;
À Profa. Dra. Juliana Trindade Clemente Napimoga pelo apoio irrestrito e incentivo sempre presentes;
A todos os professores da Faculdade de Odontologia de Piracicaba que, pelo constante apoio e ajuda contribuindo para um melhor aprendizado;
Aos colegas da pós-graduação, sempre presentes e participativos durante toda fase experimental;
A todos os funcionários e amigos por tudo que fizeram e fazem para mim e pelos alunos de modo geral.
‘Quando alguém deixa de aprender, deixa de escutar, deixa de ver e de fazer perguntas novas, então é tempo de morrer.’
ADA - Associação Americana de Diabetes AMPc - Adenosina monofosfato cíclico ATM - Articulação temporomandibular DM - Diabetes Mellitus
ADG - Diacilglicerol
EDTA- Ácido etilenodiamino tetra-acético NG - Normoglicêmico
OMS - Organização Mundial de Saúde PKC - Proteinoquinase
SBD - Sociedade Brasileira de Diabetes STZ - Estreptozotocina
RESUMO
Este estudo avaliou se a hiperglicemia mantida no diabetes tipo 1 e tipo 2, apesar de etiologias diferentes, induz a uma hiponocicepção na articulação temporomandibular de ratos associado a alteração no nível proteico das isoformas de proteinoquinase PKC-α, PKC-βI e PKC-βII. Para isto, ratos Wistar foram tratados com uma injeção peritoneal de estreptozotocina (75 mg/Kg) para indução de diabetes tipo 1 ou tratados com uma dieta hiperlipídica durante 84 dias para indução de diabetes tipo 2. Após os tratamentos, grupos separados de animais foram submetidos ao teste comportamental nociceptivo induzido por uma injeção intra-articular de formalina 1.5% nos dias 7, 14, 21, 28, 35 e 42 após os tratamentos. Imediatamente após a análise comportamental os animais foram mortos por decapitação e amostras do tecido periarticular foram removidas para análise do nível proteico das proteinoquinases PKC-α, PKC-βI e PKC-βII. Os resultados demonstraram que os animais com diabetes tipo 1 apresentaram perda significativa de peso corporal e aumento da glicose plasmática (> 300 mg/dl) quando comparado aos animais normoglicêmicos (p<0.05: Two-way ANOVA, teste de Bonferroni). Os animais com diabetes tipo 2, após o período de dieta hiperlipídica (84 dias) apresentaram-se obesos (score > 0.3, índice de Lee) e com aumento significativo da glicose plasmática (≥ 200 mg/dl) (p<0.05). Os animais diabéticos tipo 1 e diabéticos tipo 2 apresentaram significativa redução da sensibilidade dolorosa induzida pela formalina na articulação temporomandibular (p<0.05) associado a um aumento significativo do nível proteico da PKC-α. Os animais diabéticos tipo 1 apresentaram aumento significativo do nível proteico da PKC-βI e PKC-βII. Este estudo demonstrou que o diabetes tipo 1 e o diabetes tipo 2 diminuem a sensibilidade dolorosa da articulação temporomandibular. A redução da sensibilidade dolorosa na articulação temporomandibular induzida pelo diabetes tipo 1 e tipo 2 apresentam como fator comum a hiperglicemia mantida e o aumento do nível proteico da PKC-α nos tecidos periarticulares.
This study evaluated whether the maintained hyperglycemia in type 1 and type 2 diabetes, despite different etiologies, induces a hyponociception in temporomandibular joint of rats associated to changes in the protein level of the protein kinase isoforms PKC-α, PKC-βI and PKC-βII. For that, Wistar rats were treated with a peritoneal injection of streptozotocin (75 mg / kg) for induction of type 1 diabetes or treated with a higher fat diet for 84 days for induction of type 2 diabetes. After the treatments, separate groups of animals were submitted to the nociceptive behavioral test induced by an intra-articular injection of formalin 1.5% 7, 14, 21, 28, 35 and 42 days after the treatments. Immediately after the behavioral analysis the animals were killed by decapitation and samples of the periarticular tissue were removed for analysis of the protein level of the PKC-α, PKC-βI and PKC-βII proteinoquinases. The results showed that animals with type 1 diabetes showed significant loss of body weight and increased plasma glucose (> 300 mg / dl) when compared to normoglycemic animals (p <0.05: Two-way ANOVA, Bonferroni test). The animals with type 2 diabetes after the hyperlipid diet period (84 days) were obese (score> 0.3, Lee index) and with a significant increase in plasma glucose (≥ 200 mg / dl) (p <0.05). Type 1, obese and diabetic type 2 diabetic animals presented a significant reduction of pain sensitivity induced by formalin in the temporomandibular joint (p <0.05) associated with a significant increase in the protein level of PKC-α. Type 1 diabetic animals showed a significant increase in the protein level of PKC-βI and PKC-βII. This study demonstrated that type 1 diabetes, obesity and type 2 diabetes decrease the pain sensitivity of the temporomandibular joint. The reduction of pain sensitivity in the temporomandibular joint induced by type 1 and type 2 diabetes has as a common factor the maintained hyperglycemia and the increase of the protein level of PKC-α in the periarticular tissues.
1. INTRODUÇÃO 13 2. REVISÃO DA LITERATURA 15 3. PROPOSIÇÃO 22 4. MATERIAL E MÉTÓDOS 23 5. RESULTADOS 28 6. DISCUSSÃO 38 7. CONCLUSÃO 41 REFERÊNCIAS 42 ANEXOS 48
Anexo 1 - Certificado 2 de aprovação da Comissão de Ética no Uso de Animais
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Anexo 2 - Certificado 2 de aprovação da Comissão de Ética no Uso de Animais
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1. INTRODUÇÃO
O termo diabetes mellitus (DM) descreve uma desordem metabólica de etiologia múltipla, caracterizada por hiperglicemia crônica, com distúrbios no metabolismo de carboidratos, gorduras e proteínas, como resultado de alterações na produção de insulina e/ou na resposta dos tecidos à insulina (Alberti & Zimmet, 1998; SBD, 2015).
O diabetes mellitus é uma das mais frequentes doenças da humanidade, e as mudanças no comportamento e estilo de vida dos seres humanos no último século, tem resultado em um dramático aumento na incidência desta doença no mundo. Segundo a Federação Internacional do Diabetes, 425 milhões de pessoas no mundo tem a doença e estima-se que para o ano de 2035 este número chegue a 592 milhões de pessoas. São dados alarmantes tendo em vista que as complicações da doença causam um alto índice de morbidade e mortalidade (Lin et al., 2014; Albers,2014).
A Associação Americana de Diabetes (ADA) e a Organização Mundial de Saúde (OMS) classificam o diabetes como:
- Diabetes Mellitus tipo 1 (insulinopênico),
-Diabetes Mellitus tipo 2 (resistência à insulina ou insulinopenia relativa), -Diabetes Mellitus gestacional - Outros tipos específicos de Diabetes Mellitus.
As duas formas(DM tipo 1 e DM tipo 2) de apresentação desta doença apresentam complicações similares, dentre elas as anormalidades vasculares e as neuropatias (Singleton et al., 2003; Daulhac et al., 2006; Tesfaye et al., 2010; Tesfaye e Selvarajah, 2012; Gilbert, 2013; Fatehi et al., 2013; Feldman et al., 2017).
Especificamente em relação às neuropatias periféricas sensoriais induzidas pelo diabetes, estas representam complicações debilitantes afetando mais de 50% dos pacientes diabéticos (Boulton et al., 2004). São descritas como distúrbios no sistema nervoso periférico, ocasionados por alterações estruturais nas fibras neuronais – como rompimento das células de Schwann (desmielinização), degeneração e perdas axonais; lesões microvasculares e alterações nas sinalizações bioquímicas intracelulares (Arezzo and Zotova, 2002). Estas neuropatias induzem a uma variedade de alterações na condução nervosa incluindo
dor espontânea, hiperalgesia e alodínea, assim como quadros de hipoalgesia e analgesia (Calcutt, 2004, Barbosa,2019).
Neste sentido, estudos em humanos tem sugerido que as alterações sensoriais decorrentes do diabetes também estão relacionadas com distúrbios do sistema estomatognático, tais como perda precoce de elementos dentais, disfunções temporomandibulares, dor orofacial, síndrome da ardência bucal e periodontite (Collin et al., 2000; Arap et al., 2010; Zhu and Nilolajczyk, 2014). No entanto, apesar de bem estabelecido pela literatura as consequências decorrentes da neuropatia periférica induzida pelo diabetes, os mecanismos celulares e moleculares envolvidos com o início e manutenção destas neuropatias ainda são pouco compreendidos (Daulhac et al., 2006; Johnson et al., 2007, Sloan et al 2018). A literatura sugere que o estado hiperglicêmico mantido cronicamente induz a complicações neurovasculares através de múltiplas vias bioquímicas ocasionando alterações intra e extra-celulares vinculadas a vias de transdução de sinais, expressão gênica e atividades proteicas, resultando em disfunções celulares e injúrias (Evcimen & King, 2007). A via Diacilglicerol / Proteinoquinase C (DAG/PKC) é uma das mais importantes vias estudadas na sinalização celular induzida pelo diabetes (Evcimen & King, 2007). Apesar de seus mecanismos ainda não serem totalmente esclarecidos, estudos imunohistoquímicos tem demonstrado a presença de diferentes isoformas da PKC no tecido neural, e sugerem que a ativação da PKC contribui para a neuropatia diabética através de mecanismos neurovasculares, como por exemplo, alterações no fluxo sanguíneo tecidual e velocidade de condução nervosa (Borghini et al., 1994; Roberts & McLean , 1997).
Corroborando a literatura, foi realizado um estudo piloto (Muzilli, 2014), onde foi demonstrado que a fase inicial do diabetes tipo 1 induz hiponocicepção na ATM de ratos associado a modulação de diferentes isoformas da PKC no tecido periarticular.
Considerando a diferença etiológica entre diabetes tipo 1 e tipo 2, este estudo tem como proposta avaliar se a hiperglicemia mantida no diabetes tipo 2 induz a hiponocicepção na ATM de ratos como demonstrado no diabetes tipo 1; e se a alteração na expressão de diferentes isoformas da PKC são comuns aos subtipos da doença.
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1. DIABETES MELLITUS
O Diabetes (do grego: sifão), assim denominado por Areteus devido a exagerada eliminação de água pelos rins, é uma doença metabólica onde a principal característica clínica é o aumento anormal da glicemia acompanhado de sintomas clínicos característicos como a poliúria, a polifagia e a polidipsia. Os sinais clínicos relacionados com o diabetes e mesmo algumas de suas complicações são conhecidos desde os tempos mais remotos: O papiro de Ebers (1500 a.C.) já descrevia o tratamento da poliúria, referindo que a urina tinha gosto doce; Galeno considerava a doença como uma fraqueza dos rins; e os japoneses e chineses no século II a.C. já a chamavam de “doença da sede”(Thomaz,1977).
Willian Cullen, no século XVIII, acrescentou o adjetivo mellitus ao termo diabetes para diferenciar do diabetes insipidus, que pode ser causado pela deficiência na produção, na secreção ou na ação do hormônio antidiurético e não apresenta hiperglicemia. E partindo desta época, surgiram os estudos descrevendo teorias sobre a etiologia e mecanismos envolvidos com o desenvolvimento da doença, no intuito de desenvolver tratamentos.
Em 1869, o alemão Paul Langherans descreve que o pâncreas é constituído de inúmeras ilhas, posteriormente sendo denominadas de Ilhotas de Langherans. A degeneração das Ilhotas de Langherans foi correlacionada com o diabetes por Oppie em 1900, cuja função endócrina foi reconhecida. Em 1907, Lane, pela primeira vez, fez a distinção entre as células alfa e beta pancreáticas. Em Toronto, Banting em colaboração com Best (1921), descobriu e isolou a insulina (do latim: que vem das ilhas), determinando um marco culminante na história da ciência. No ano seguinte, em janeiro de 1922, foi aplicada, pela primeira vez, a insulina no homem que passou a ser regularmente usada a partir de 1924, trazendo profunda modificação na evolução dos diabéticos, melhorando a expectativa de vida (Thomaz, 1977). No entanto, o tratamento com dieta, hipoglicemiantes orais e reposição de insulina não fez declinar significativamente as manifestações das doenças vasculares na população diabética (Thomaz, 1977).
Saúde (OMS) classificam o diabetes como: Diabetes Mellitus tipo 1 (insulinopênico), tipo 2 (resistência à insulina ou insulinopenia relativa), Diabetes Mellitus gestacional e outros tipos específicos de Diabetes Mellitus. Há ainda duas categorias, referidas como pré-diabetes, que são a glicemia de jejum alterada e a tolerância à glicose diminuída. Estas não são entidades clínicas, mas fatores de risco para o desenvolvimento de DM e doenças cardiovasculares (SBD, 2015). A maioria dos casos de DM divide-se entre as duas principais categorias etiopatogênicas - DM tipo 1 e tipo 2 (ADA, 2014; SBD,2015).
O DM tipo 1 é caracterizado por destruição das células beta do pâncreas, que levam a deficiência de insulina, sendo subdividido em tipos 1A (autoimune) e 1B (idiopático). A fisiopatologia do DM tipo 1A envolve fatores genéticos e ambientais. Entre os fatores ambientais potenciais para o desencadeamento da autoimunidade em indivíduos geneticamente predispostos estão infecções virais, fatores nutricionais, deficiência de vitamina D e outros. A taxa de destruição das células beta é variável, sendo, em geral, mais rápida entre as crianças. A forma lentamente progressiva ocorre em adultos, a qual se refere como diabetes autoimune latente do adulto. O DM tipo 1B, ou idiopático, não possui etiologia conhecida e corresponde à minoria dos casos de DM1. Os indivíduos com esse tipo de DM podem desenvolver cetoacidose e apresentam graus variáveis de deficiência de insulina (SBD, 2015).
O DM tipo 2 é a forma de maior prevalência, acometendo de 90 a 95% dos casos e caracteriza-se por defeitos na ação e secreção da insulina e na regulação da produção hepática de glicose. A resistência à insulina e o defeito na função das células beta estão presentes precocemente na fase pré-clínica da doença. É causada por uma interação de fatores genéticos e ambientais. Entre os fatores ambientais associados estão sedentarismo, má alimentação e envelhecimento. A maioria dos pacientes com esse tipo de DM apresenta sobrepeso ou obesidade. O DM2 pode ocorrer em qualquer idade, e pessoas cada vez mais jovens estão sendo diagnosticadas. Os pacientes não dependem de insulina exógena para sobreviver, no entanto podem precisar de tratamento com insulina para obter controle metabólico adequado (SBD, 2015).
A evolução para o DM2 ocorre em um período de tempo variável, passando por estágios intermediários que recebem a denominação de glicemia de jejum alterada e tolerância à glicose diminuída. Tais estágios são decorrentes de
uma combinação de resistência à ação insulínica e disfunção das células beta do pâncreas. No DM1, o início geralmente é abrupto, com sintomas claros. O critério para o diagnóstico foi modificado, em 1997, pela ADA e, posteriormente, aceito pela OMS e pela SBD. As modificações foram realizadas com a finalidade de prevenir de maneira eficaz as complicações micro e macrovasculares do DM (SBD, 2015).
Apesar do Diabetes, especialmente Tipo 1 e 2, apresentarem etiologias diferentes, compartilham sinais e sintomas comuns, como por exemplo, intolerância à glicose, hiperglicemia e hiperlipidemia.
2.2 NEUROPATIA PERIFÉRICA SENSORIAL INDUZIDA PELO DIABETES
O diabetes tipos I e II mesmo sendo de etiologias diferentes, as duas formas apresentam complicações similares, divididas em agudas e crônicas.
As complicações agudas são representadas principalmente pelo quadro de cetoacidose ou pelo coma hiperosmolar, a desidratação e as diferentes infecções em diversas localizações, sendo o pé diabético uma das mais preocupantes. Já as complicações crônicas são representadas pelo depósito de gordura na parede arterial, a retinopatia diabética, a insuficiência renal progressiva, além de alterações metabólicas com destaque para as anormalidades vasculares e as neuropatias (Singleton et al., 2003; Daulhac et al., 2006).
Dentre as complicações crônicas, o desenvolvimento das neuropatias periféricas sensoriais induzidas pelo diabetes está diretamente associado com a falta do controle glicêmico, tempo de instalação da doença, fatores microvasculares (microangiopatias) e fatores de risco cardiovasculares (hipertensão, hiperlipidemia, obesidade e fumo) (Tesfaye et al., 1996; Boulton et al., 2004; Tesfaye and Selvarajah, 2012). Estas neuropatias induzem a uma variedade de alterações na condução nervosa incluindo dor espontânea, hiperalgesia e alodínea, assim como quadros de hipoalgesia e analgesia (Calcutt, 2004).
Neste sentido, estudos clínicos tem demonstrado que a principal queixa de pacientes diabéticos é, frequentemente, a perda de sensibilidade nas extremidades (hipoalgesia), que em estágios avançados pode evoluir para completa analgesia (ausência da sensibilidade dos nervos periféricos), facilitando a ocorrência de acidentes que acarretam em danos teciduais e quadros infecciosos, podendo levar, em casos mais graves, à amputação do membro afetado (Calcutt, 2004).
Estudos em humanos tem sugerido que as alterações decorrentes do diabetes também estão relacionadas com distúrbios do sistema estomatognático, tais como perda precoce de elementos dentais, disfunções temporomandibulares, dor orofacial, síndrome da ardência bucal e periodontite (Collin et al., 2000; Arap et al., 2010; Zhu and Nilolajczyk, 2014; Borgnakke WS,2015). Em particular, a neuropatia periférica induzida pelo diabetes está relacionada como fator de risco para o desenvolvimento de disfunção temporomandibular severa( SBD,2016). Considerando que pacientes com neuropatia diabética também desenvolvem quadros de hipoalgesia, tem sido sugerido que a perda de sensibilidade na articulação temporomandibular (ATM) pode induzir a desordens articulares e deformidades como, por exemplo, as articulações de Charcot (Collin et al., 2000). A articulação de Charcot, uma neuroartrite, é consequência da lesão dos nervos, como no caso da neuropatia induzida pelo diabetes, que impede a percepção da dor articular acarretando em lesões e fraturas insignificantes e repetidas (de forma despercebida) até a deterioração permanente da articulação (Rogers et al., 2011).
Apesar de bem demonstrado pela literatura as complicações envolvidas com a neuropatia periférica induzida pelo diabetes, os mecanismos celulares e moleculares envolvidos com o início e manutenção destas neuropatias ainda não estão totalmente compreendidos (Daulhac et al., 2006; Johnson et al., 2007).
Muitas informações quanto à teoria das neuropatias diabéticas têm sido publicadas frequentemente, porém é bastante improvável que haja apenas uma causa envolvida neste processo, mas sim uma associação de diferentes anormalidades, culminando em um quadro clínico comum de neuropatia (Tesfaye et al.,2010). Neste sentido, a literatura sugere uma relação direta entre o estado hiperglicêmico, mantido cronicamente, e as complicações micro e macrovasculares, suportando a hipótese de que a hiperglicemia é o fator determinante na gênese das complicações do diabetes (Boulton et al.,2005).
Assim, têm sido hipotetizados mecanismos bioquímicos envolvidos nas anormalidades estruturais e funcionais relacionadas à exposição prolongada dos tecidos vasculares à hiperglicemia, tais como formação de produtos da glicação não enzimática, aumento da atividade aldose-redutase, alteração dos radicais livres e ativação da Proteinoquinase C (PKC) através da via do Diacilglicerol (Forbes et al.,2005).
A glicose presente no compartimento extracelular é transportada para o compartimento intracelular por difusão, por ação de transportadores de glicose. Esta glicose intracelular é metabolizada por glicólise. Mesmo em condição de hiperglicemia, uma pequena parte da glicose intracelular é metabolizada pela via aldose-redutase, o que resultaria em um aumento da via do sorbitol com alteração das vias de transdução de sinais, como por exemplo, a via Diacilglicerol/Proteinoquinase C (DAG/PKC) (Idris et al., 2001).
O DAG pode ser derivado da hidrólise de fosfatidil-inositídeos, pelo metabolismo da fosfatidilcolina por ação da fosfolipase C; ou pela síntese "de novo" através dos intermediários glicolíticos (com aumento do sorbitol), fosfato de diidroxiacetona e gliceral-3-fosfato; com subsequente ativação da PKC (Evcimen and King, 2007). A via DAG/PKC também pode ser ativada pela hiperglicemia como resultado do aumento do estresse oxidativo, como por exemplo, pelo aumento de peróxido de hidrogênio, o qual é um conhecido ativador da PKC, seja de forma direta ou indireta pelo aumento da produção do DAG. (Konishi et al., 1997; Nishikawa et al., 2000). A PKC, é um grupo de proteínas, membros da família de proteinoquinases dependentes do cálcio, que apresenta múltiplas funções celulares e afeta muitas vias de transdução de sinais (Geraldes and King, 2010).
O DAG é o principal ativador fisiológico da PKC. O aumento dos níveis de DAG no diabetes pode ocorrer através de múltiplas vias (Evcimen and King, 2007) e sua ativação está diretamente relacionada com a hiperglicemia dos pacientes diabéticos e desenvolvimento das alterações neurovasculares (Evcimen and King, 2007).
Um dos mecanismos fisiológicos importante na regulação de proteínas intracelulares é o de adicionar ou remover grupos fosfatos, tornando essas proteínas em enzimas, receptores ou segundo-mensageiros. Uma série de respostas celulares mediadas por receptores e pelas vias metabólicas pode ser ativada ou desativada por quinases (com adição de grupo fosfato) intracelulares. A PKC é uma das três principais quinases serina-treonina (são aquelas que fosforilam proteínas em resíduos serina e treonina) estando envolvida em eventos de transdução de sinais, respondendo à estímulos específicos hormonais, neuronais e de fatores de crescimento (Geraldes and King, 2010).
A família da PKC apresenta pelo menos 12 isoformas (α, βI, βII, δ, ε, γ, t, ƞ, λ, μ, θ, ζ), classificadas em: (1) Convencionais (α, βI, βII e γ) que são
cálcio-dependentes ativadas pela fosfatidil-serina e pelo DAG; (2) Originais (δ, ε, θ e ƞ) que são cálcio-independentes, reguladas pelo DAG e fosfatidil-serina); e (3) Atípicas (ζ, t e λ) que são cálcio-independentes e não requerem DAG para ativação (Whiteside and Dlugosz, 2002; Geraldes and King,2010).
O mecanismo pelo qual a PKC contribui para o desenvolvimento da neuropatia diabética ainda não está esclarecido, no entanto, tem sido demonstrado que algumas isoformas da PKC contribuem para o desenvolvimento das neuropatias induzidas pelo diabetes interferindo em mecanismos neurovasculares tais como fluxo sanguíneo e velocidade de condução nervosa (Geraldes and King, 2010). Neste sentido, inibidores de duas classes de PKC, PKC- α e PKC-β (isoformas I e II), tem sido utilizado no tratamento de retinopatias e alterações microvasculares induzidas pelo diabetes (Frank, 2002; Clark and Dodson, 2007; Pathak et al., 2012)
A PKC-α é umas das isoformas menos estudadas, apesar de estudos terem demonstrado sua presença em tecidos neuronais (Evcimen and King, 2007), existe uma escassez de estudos demonstrando seu papel em alterações neurovasculares. Em tecido cardíaco, apesar de estudos iniciais sugerirem que a PKC-α tenha um importante papel para estimular a hipertrofia destes tecidos, pesquisas em ratos, suportam a teoria de PKC-α no tecido cardíaco tem um papel regulador da contratilidade tecidual ao invés da indução de hipertrofias (Evcimen and King, 2007). A PKC-β está envolvida em várias funções celulares diferentes, tais como a ativação de células B, a indução de apoptose, proliferação de células endoteliais, e a absorção intestinal de açúcares. Tem sido a isoforma mais estudada em relação à neuropatia. Estudos mostram que a utilização de inibidores de PKC-β em casos de animais diabéticos induzidos por estreptozotocina aumentou o fluxo sanguíneo no nervo ciático bem como sua velocidade de condução, sugerindo que a microcirculação e a isquemia estejam envolvidas na neuropatia diabética, bem como a ativação desta isoforma da PKC (Sasase et al., 2004; Pathak et al., 2012).
2.3. DIABETES COMO FATOR PREDISPONENTE DE DISFUNÇÃO
TEMPOROMANDIBULAR
As alterações sensoriais induzidas pelo diabetes também acometem o sistema estomatognático, incluindo a ATM. Estas alterações podem induzir a desordens articulares e deformidades, similares a articulação de Charcot (Collin et al.,
2000). A articulação de Charcot é uma neuroartropatia decorrente da lesão dos nervos, como no caso da neuropatia diabética(NPD), que impede a percepção da dor articular acarretando em lesões e fraturas insignificantes e repetidas (de forma despercebida) até a deterioração permanente da articulação (Rogers et al., 2011; Larson e Burns, 2012). Esta neuroartropatia é altamente degenerativa e pode resultar na amputação do membro afetado, e possui prevalência em torno de 7,5% dos pacientes diabéticos, acometendo, geralmente, pacientes na 5ª e 6ª décadas de vida. É mais comum o acometimento unilateral das extremidades, embora possa ocorrer de forma bilateral (La Fontaine et al., 2016).
Tem sido demonstrado que pacientes com neuropatia diabética apresentam quadros de hipoalgesia, sugerindo que a perda de sensibilidade na ATM pode induzir às desordens articulares e deformidades, como as articulações de Charcot (Collin et al., 2000). Considerando estes achados clínicos, foi realizado um estudo preliminar no qual foi demonstrado que a fase inicial do diabetes tipo 1 induz quadro de hipoalgesia na ATM de ratos (Muzilli, 2014) associada com uma variação do nível proteico de diferentes isoformas da PKC.
Considerando a diferença etiológica entre diabetes tipo 1 e tipo 2, este estudo tem como proposta avaliar se a hiperglicemia mantida no diabetes tipo 2 induz a hiponocicepção na ATM de ratos como demonstrado no diabetes tipo 1; e se a alteração na expressão de diferentes isoformas da PKC são comuns aos subtipos da doença.
As mudanças no comportamento e estilo de vida dos seres humanos, como sedentarismo e obesidade, no último século, têm resultado em um dramático aumento na incidência do diabetes no mundo (Zimmet et al., 2001), tratando-se de um crescente problema de saúde pública, sendo responsável por um alto índice de morbidade e mortalidade (Libman et al., 1993; Lin et al., 2014), o desenvolvimento do trabalho proposto é de relevância clínica uma vez que auxilia no melhor entendimento sobre os mecanismos envolvidos nas alterações da sensibilidade somática na ATM pelo diabetes e consequente possibilidade de lesões e deterioração da articulação.
3. PROPOSIÇÃO
Este estudo tem como proposta fazer uma avaliação comparativa entre o diabetes do tipo 1 e tipo 2 na indução de um quadro de hiponocicepção na ATM de ratos associados a variação do nível proteico das proteinoquinases PKC-α, βI e βII. Para isto foi avaliado:
3.1. O efeito do diabetes tipo 1 na dor induzida pela formalina na ATM de ratos e o papel das proteinoquinases PKC-α, βI e βII neste processo;
3.2. O efeito do diabetes tipo 2 na dor induzida pela formalina na ATM de ratos e o papel das proteinoquinases PKC-α, βI e βII neste processo;
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. Animais
Para a realização deste trabalho foram utilizados 96 ratos machos Wistar provenientes do CEMIB (Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência em Animais de Laboratório) e mantidos no Biotério da FOP - UNICAMP. Os animais foram mantidos em gaiolas plásticas (4 por gaiola) contendo maravalha, em ambiente com controle de luminosidade (ciclos claro/escuro de 12h) e temperatura (23ºC +/- 1ºC), com alimentação e água, ad libitum. Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Universidade Estadual de Campinas, protocolos 2835-1 e 3384-1 (Anexo I e II) e estão de acordo com as diretrizes determinadas pelo Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal (CONCEA) e pela Associação Internacional para Estudo da Dor (IASP), em animais conscientes (Zimmermann, 1983).
4.2. Delineamento experimental
Para realização dos experimentos os animais foram divididos em 4 grupos:
GRUPO I: Normoglicêmicos (controle do diabetes tipo 1- injeção intraperitoneal de
solução tampão citrato)
GRUPO II: Diabéticos tipo 1– indução por injeção de STZ intraperitoneal -
75mg/kg
GRUPO III: Normoglicêmicos – (controle diabetes tipo 2 – alimentação padrão
industrializada)
GRUPO IV: Diabéticos tipo 2 – dieta hiperlipídica
Nos tempos 7, 14, 21, 28, 35 e 42 dias após a indução do diabetes (tipo 1 ou tipo 2), todos os animais receberam uma injeção intra-articular, na ATM direita, de 30 µI de Formalina 1.5% (Roveroni et al., 2001) e os comportamentos nociceptivos foram avaliados (item 4.4). Imediatamente após as análises comportamentais os animais foram mortos por decapitação para remoção de amostras de tecido periarticular e posterior realização das análises bioquímicas (Western Blot) (item 4.5).
Foram utilizados 4 animais por grupo experimental.
4.3. Indução do Diabetes
4.3.1. Diabetes tipo 1:
O diabetes tipo 1 foi induzido nos animais com 2 meses de idade, por meio de uma injeção intraperitoneal de estreptozotocina (STZ; Sigma-Aldrich, USA) 75 mg/kg (Courteix et al., 2007) dissolvida em 0,1 M de tampão citrato (pH 4.5). Os animais foram submetidos a um jejum de 8 horas antes da injeção de STZ. A indução da diabetes foi confirmada através da dosagem do nível de glicose plasmática por amostras de sangue da veia caudal utilizando o método enzimático glicose-oxidase (Optium Xceed; Abbott). Foram considerados para o estudo apenas os animais que apresentaram concentração plasmática de glicose maior que 300 mg/dl após jejum de 8 horas (Braga et al., 2011). Os animais normoglicêmicos (controle) receberam uma injeção intraperitoneal apenas do veículo. O peso corporal e a concentração de glicose plasmática foram avaliados semanalmente durante todo o período experimental, conforme descrito acima.
4.3.2. Indução de Obesidade e diabetes tipo 2:
A obesidade e o diabetes tipo 2 foram induzidos através de dieta rica em
gordura. Os animais controle (normoglicêmicos) foram tratados com dieta comercial Nuvilab CR-1 ad libitum por 84 dias no período de indução de obesidade dos demais grupos. Os animais com diabetes tipo 2 induzido por obesidade receberam dieta hiperlipídica contendo 200 g de banha de porco por quilo de ração (Reeves et al., 1993; King et al., 2012; Araújo et al., 2017).) ad libitum por 84 dias (Tabela 1).
Tabela 1: Dieta hiperlipídica utilizada na indução da obesidade Alimento Ração Hiperlipídica (g)# Ração Nuvilab Amido de milho 435,6 0 Caseína 200 0 Celulose 50 0 Óleo de soja 20 0 Açúcar 50 0 Pré mix mineral AIN-93M 30 * Pré mix vitamínico AIN-93M 10 * Colina 2 1,900mg Metiolina 2 4000mg Banha 200 BHT(beta hidróxido de tolueno) 0,2 100mg Vitamina E 0,2 34ul/kg
*Composição da ração NUVILAB- CR1: Vitamina A: 13.000UI/kg, Vitamina D3: 2.000UI/kg, Vitamina K3: 3mg/kg, Vitamina B1: 5 mg/kg, Vitamina B2: 6 mg/kg, vitamina B6; 7 mg/kg, vitamina B12: 22 mg/kg, Niacina: 60mg/kg, Pantoten de cálcio: 29mg/kg, ácido fólico: 1 mg/kg, Biotina: 0,05 mg/kg, Colina: 1,900mg/kg, Minerais: sódio: 2,700mg/kg, Ferro: 50mg/kg, manganês: 60mg/kg, zinco: 60mg/kg, cobre: 10mg/kg, ioda: 2 mg/kg, selênio: 0,05mg/kg, cobalto: 1,5mg/kg, flúor: 80 mg/kg, aminoácidos: lisina: 12g/kg, metionina: 4.000 mg/kg, aditivos: BHT: 100mg/kg; umidade: 125g/kg, proteína bruta: 220g/kg, extrato etéreo: 40g/kg, matéria mineral: 90g/kg, fibra bruta: 70g/kg, cálcio 10,14g/kg, fósforo: 8.000mg/kg
A ração hiperlipídica foi preparada a cada 15 dias na quantidade de 8 kg; todos os insumos foram misturados e a massa resultante foi manuseada para a formação dos pellets. Após o preparo dos pellets a ração foi congelada e servida para os animais em temperatura ambiente.
Os animais foram submetidos aos testes de dor na ATM em 7, 14, 28 35 e 42 dias após o período de dieta hiperlipídica (84 dias). No momento dos experimentos, o peso corporal e a glicose sanguínea foram mensurados. Os ratos com glicemia ≥ 200 mg/dl foram considerados diabéticos (Wang et al., 2013). O índice de Lee foi calculado para indicar obesidade nos ratos. Os valores do Índice de Lee – razão da raiz cúbica do peso corporal (g) pelo comprimento craniocaudal (cm) – superior a 0.3 é indicativo de obesidade (Araújo et al., 2017).
4.4. Avaliação do desenvolvimento de condições comportamentais na ATM de ratos
As sessões de teste foram realizadas durante a fase clara entre 9 h e 17 h em sala silenciosa, com temperatura ambiente mantida a 25 °C (Rosland, 1991). Durante o teste os animais não tiveram acesso à água ou à comida. Para minimizar o estresse durante as sessões experimentais, os animais foram previamente manipulados pelo pesquisador por um período de 7 dias. Na realização das análises comportamentais usou-se uma caixa de observação medindo 30x30x30 cm com base e 3 laterais espelhadas e frente de vidro. Cada animal foi inicialmente colocado e mantido na caixa por 10 minutos para habituar-se ao ambiente de experimentação e minimizar o estresse (Abbott et al. 1986).
4.4.1. Injeções na região da ATM:
Para administração de formalina na região da ATM direita os animais foram brevemente anestesiados por inalação de Isoflurano. A seguir, uma agulha calibre 30G, conectada a uma seringa de microlitro Hamilton (50 µl) por um tubo de polietileno P50, foi inserida na porção inferior da borda póstero-inferior do arco zigomático, sendo avançada em direção anterior até contactar a região póstero-lateral do côndilo.
4.4.2. Teste comportamental:
Imediatamente após a injeção intra-articular o animal já consciente, foi recolocado na câmara de observação e as respostas comportamentais caracterizadas pelo ato de coçar a região injetada com a pata dianteira ou traseira e pelo ato de levantar reflexamente a cabeça foram quantificadas durante 45 min para os animais tratados com formalina. O tempo em segundos que o animal permaneceu coçando a região orofacial foi quantificado através da utilização de um cronômetro, e o número de vezes que o animal levantou reflexamente a cabeça foi quantificado por um contador de células (Roveroni et al., 2001). Considerando que o ato de levantar reflexamente a cabeça segue um padrão uniforme de 1 s de duração, a intensidade da resposta nociceptiva foi quantificada somando-se esse comportamento ao ato de coçar a região injetada, como previamente padronizado (Roveroni et al., 2001).
4.5. Avaliação da expressão das isoformas da PKC no tecido periarticular - Western Blot
As amostras do tecido periarticular foram homogeneizadas em tampão PBS, pH 7.4, contendo inibidores de protease: etilenodiaminatetracetato de sódio (EDTA) 10 mM, Benzamidina 1 mM, fluoreto de fenilmetilsulfonila (PMSF) 0,3 mM, Aprotinina 0,3 mM e β-mercaptoetanol 2 mM, em banho de gelo. Uma alíquota do homogeneizado foi separada para dosagem de proteínas. Em seguida as proteínas foram separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE 10% e transferidas para membranas de nitrocelulose. As membranas foram incubadas "overnight" a 4°C com tampão de bloqueio {PBS 5% (p/v) de leite desnatado e 0,1% Tween 20}. As membranas foram lavadas três vezes com PBS 0,1% Tween 20. Em seguida foram incubadas em solução de PBS contendo 5% de leite desnatado e 0,1% Tween 20 contendo anticorpo primário específicos para cada isoforma testada. Após a lavagem, as membranas foram incubadas com anticorpo secundário conjugado HRP e novamente lavadas. As membranas foram então reveladas com kit de quimioluminescência (ECL, Amershan Pharmacia Biotech, Little Chalfont, U.K.) como descrito no manual de instruções. O controle negativo foi obtido pela omissão do anticorpo primário. A densitometria das bandas foi realizada através do programa Image J. Os dados foram normalizados considerando o controle (NG) igual ao valor 1.
4.6. Análise dos Resultados
Os dados foram avaliados pela análise de variância a dois critérios de avaliação (Two-way ANOVA). As comparações múltiplas foram feitas pelo Teste de Tukey. Para todos os testes o nível de significância foi estabelecido em p<0,05. O programa GraphPad Prism 4.0 foi utilizado para a realização dos cálculos estatísticos.
5. RESULTADOS
5.1. Diabetes tipo 1:
Todos os animais foram pesados e a glicemia quantificada imediatamente antes da indução do diabetes (STZ 75mg/Kg i.p.) ou aplicação do veículo. Durante o experimento foram feitas medidas da glicemia e do peso corporal após um jejum de 8 horas. Os animais diabéticos tipo 1 demonstraram diminuição significativa de peso corporal a partir de 21 dias de indução da doença, mantida até o 42º dia, quando comparados aos animais normoglicêmicos (Figura 1A). Os animais diabéticos tipo 1 apresentaram aumento significativo da concentração plasmática de glicose (valores > 300 mg/dl) a partir do 7º dia de indução da doença, mantido até o 42º dia (Figura 1B), confirmando a indução e manutenção da doença (Daulhac et al., 2006; Courteix et al., 2007; Lei et al., 2013).
Os valores estão expressos como a média ± desvio padrão (DP). (A) Peso corporal (g). O símbolo (*) indica peso corporal significativamente maior quando comparado ao respectivo controle (p<0,05: Two-way ANOVA, Teste de Tukey). (B) Glicemia (mg/dl). O símbolo (*) indica valor de glicose no sangue significativamente maior quando comparado ao respectivo controle (p<0,05: Two-way ANOVA, Teste de Tukey). Fonte: autoria própria.
5.2. Obesidade e o desenvolvimento de diabetes tipo 2:
Os animais tratados com dieta hiperlipídica durante 84 dias apresentaram peso corporal (g) significativamente maior quando comparado com os animais tratados com dieta convencional (p<0.05) (Fig. 2A). De acordo com o Índice de Lee, os animais tratados com dieta hiperlipídica apresentaram valores acima de 0.3 sendo classificados como animais obesos (Fig. 2B). A obesidade foi associada com um aumento significativo de glicose sanguínea quando comparado ao grupo controle (p<0.05) (Fig. 2C). Após 14 dias do período de dieta hiperlipídica (84 dias) foi observado que os animais apresentaram níveis de glicose sanguínea igual ou superior a 200 mg/dl o que nos permitiu classificar estes animais como diabéticos tipo 2 (Fig. 2C).
Os valores estão expressos como a média ± desvio padrão (DP). (A) Peso corporal (g). (B) Índice de Lee (g/cm). (C) Glicemia (mg/dl). O símbolo (+) indica peso corporal significativamente maior quando comparado ao respectivo controle (p<0,05: Two-way ANOVA, Teste de Bonferroni). Fonte: autoria própria.
5.3 Diabetes tipo 1, Obesidade e Diabetes tipo 2 reduz os comportamentos nociceptivos induzidos pela formalina na ATM.
Os animais diabéticos tipo 1 (Figura 3A), animais obesos (7 dias após o período de dieta hiperlipídica) e animais diabéticos tipo 2 (14, 21, 28 35 e 42 dias após o período de dieta hiperlipídica) (Figura 3B) apresentaram resposta comportamental nociceptiva induzida pela injeção intra-articular de formalina 1.5% significativamente diminuída quando comparado aos seus respectivos grupos controles (normoglicêmicos) (p<0.05). Os animais diabéticos tipo 1 apresentaram redução da resposta comportamental nociceptiva induzida pela formalina mais significativa quando comparado aos animais diabéticos tipo 2 nos tempos 21 e 28 dias (Figura 3C).
Os valores estão expressos como a média ± desvio padrão (DP). (A) Diabéticos tipo 1 X Normoglicêmicos. O símbolo (*) indica comportamento nociceptivo significativamente menor quando comparado ao respectivo controle (p<0,05: Two-way ANOVA, Teste de Tukey). (B) Obesidade e Diabéticos tipo 2 X Normoglicêmicos. O símbolo (*) indica comportamento nociceptivo significativamente menor quando comparado ao respectivo controle (p<0,05: Two-way ANOVA, Teste de Tukey). (C) Diabéticos tipo 1 X Diabéticos tipo 2. O símbolo (*) indica comportamento nociceptivo significativamente maior quando comparado ao grupo diabéticos tipo 1 (p<0,05: Two-way ANOVA, Teste de Tukey). Fonte: autoria própria.
5.4 Diabetes tipo 1 e Diabetes tipo 2 aumenta o nível proteico da PKC-alpha.
Os animais diabéticos tipo 1 (Figura 4A) e animais diabéticos tipo 2 (Figura 4B) apresentaram aumento significativo (p<0.05: Two-Way ANOVA, Teste de Bonferroni) no nível proteico da PKC-α no tecido periarticular. Os animais diabéticos tipo 1 apresentaram um maior aumento do nível proteico da PKC-α no tecido periarticular em relação ao diabetes tipo 2, no entanto, não há diferença estatística nos tempos 35 e 42 dias entre os grupos (Figura 4C).
Os valores estão expressos como a média ± desvio padrão (DP). (A) Diabéticos tipo 1 X Normoglicêmicos. O símbolo (*) indica nível proteico significativamente maior quando comparado ao respectivo controle (p<0,05: Two-way ANOVA, Teste de Tukey). (B) Obesidade e Diabéticos tipo 2 X Normoglicêmicos. O símbolo (*) indica nível proteico significativamente maior quando comparado ao respectivo controle (p<0,05: Two-way ANOVA, Teste de Tukey). (C) Diabéticos tipo 1 X Diabéticos tipo 2. O símbolo (+) indica nível proteico significativamente maior quando comparado ao grupo diabéticos tipo 2 (p<0,05: Two-way ANOVA, Teste de Tukey). Fonte: autoria própria.
5.5 Diabetes tipo 1 e Diabetes tipo 2 aumenta o nível proteico da PKC-beta I.
Os animais diabéticos tipo 1 (Figura 5A) e animais diabéticos tipo 2 (apenas no tempo de 21 dias) (Figura 5B) apresentaram aumento significativo (p<0.05: Two-Way ANOVA, Teste de Tukey) no nível proteico da PKC-βI no tecido periarticular. Os animais diabéticos tipo 1 apresentaram um maior aumento do nível proteico da PKC-βI no tecido periarticular quando comparado aos animais diabéticos tipo 2 (Figura 5C).
Os valores estão expressos como a média ± desvio padrão (DP). (A) Diabéticos tipo 1 X Normoglicêmicos. O símbolo (*) indica nível proteico significativamente maior quando comparado ao respectivo controle (p<0,05: Two-way ANOVA, Teste de Tukey). (B) Obesidade e Diabéticos tipo 2 X Normoglicêmicos. O símbolo (*) indica nível proteico significativamente maior quando comparado ao respectivo controle (p<0,05: Two-way ANOVA, Teste de Tukey). (C) Diabéticos tipo 1 X Diabéticos tipo 2. O símbolo (+) indica nível proteico significativamente maior quando comparado ao grupo diabéticos tipo 2 (p<0,05: Two-way ANOVA, Teste de Tukey). Fonte: autoria própria.
5.6 Diabetes tipo 1 e Diabetes tipo 2 aumenta o nível proteico da PKC-beta II.
Os animais diabéticos tipo 1 (Figura 6A) mas não os animais diabéticos tipo 2 (Figura 6B) apresentaram aumento significativo (p<0.05: Two-Way ANOVA, Teste de Tukey) no nível proteico da PKC-βII no tecido periarticular.
Os valores estão expressos como a média ± desvio padrão (DP). (A) Diabéticos tipo 1 X Normoglicêmicos. O símbolo (*) indica nível proteico significativamente maior quando comparado ao respectivo controle (p<0,05: Two-way ANOVA, Teste de Tukey). (B) Obesidade e Diabéticos tipo 2 X Normoglicêmicos. O símbolo (*) indica nível proteico significativamente maior quando comparado ao respectivo controle (p<0,05: Two-way ANOVA, Teste de Tukey). (C) Diabéticos tipo 1 X Diabéticos tipo 2. O símbolo (*) indica nível proteico significativamente maior quando comparado ao grupo diabéticos tipo 2 (p<0,05: Two-way ANOVA, Teste de Tukey). Fonte: autoria própria.
6. DISCUSSÃO
Os resultados deste estudo demonstraram que tanto o diabetes tipo 1 quanto o diabetes tipo 2 resultam em uma diminuição significativa na sensibilidade dolorosa na articulação temporomandibular indicativo de uma neuropatia sensorial periférica induzida pelo diabetes (Collin et al., 2000; Arap et al., 2010; Zhu & Nilolajczyk, 2014; Barbosa M et al.,2019).
A neuropatia sensorial periférica representa uma complicação comum e debilitante em pacientes diabéticos que acomete em proporção crescente estes pacientes durante a progressão da doença (Daulhac et al., 2006). Em decorrência da debilitação severa das neuropatias induzidas pelo diabetes, estudos vêm explorando seus mecanismos para melhor entendimento da doença e assim desenvolver novas perspectivas terapêuticas para seu controle e tratamento (Boulton et al.,2005; Albers,JW, 2014; Sloan G, 2018).
A indução do diabetes tipo 1 foi realizada através de uma injeção intraperitoneal de STZ (75 mg/kg) (Daulhac et al., 2006; Courteix et al., 2007, Lei et al., 2013). Esta técnica é um modelo experimental comumente utilizado para avaliação das alterações nociceptivas induzidas pelo diabetes (Daulhac et al., 2006; Courteix et al., 2007; Lei et al., 2013). A STZ é uma nitrosamida largamente utilizada como indutora de diabetes em animais experimentais, que tem como efeito, a destruição das células beta-pancreáticas e consequentemente uma deficiência na produção de insulina (Daulhac et al., 2006; Courteix et al., 2007, Lei et al., 2013). A confirmação da instalação da doença foi feita pela dosagem periódica da concentração plasmática de glicose e avaliação do peso corporal dos animais. De acordo com a evolução da doença, os animais diabéticos tipo 1 demonstraram glicemia superior a 300 mg/dl e perda progressiva do peso corporal, validando o modelo experimental.
A indução do diabetes tipo 2 foi realizada através de uma dieta hiperlipídica resultando na obesidade dos animais e consequente aumento da glicose plasmática.
O diabetes tipo 2 apresenta alta prevalência em todo o mundo e está fortemente associado à obesidade e à resistência à insulina (Guilherme et al., 2008; Yoon et al., 2006) assim como a defeitos na função e expressão de células β-pancreáticas (Bell & Polonsky, 2001; Butler et al., 2003). Esses distúrbios metabólicos impedem a ação regulatória crítica da insulina no metabolismo da glicose, lipídios e proteínas, resultando assim, uma doença caracterizada por deficiências nesses processos
fisiológicos. Os pacientes que desenvolvem diabetes tipo 2, na maioria das vezes apresentam histórico de obesidade, redução da sensibilidade insulínica e hiperinsulinemia, como parte do perfil metabólico na fase aguda da doença. Com a progressão do diabetes tipo 2, os pacientes evoluem para uma disfunção grave das células β-pancreáticas (dependente de insulina) (Tabak et al., 2009; Prentki et al., 2006).
Apesar de o índice de obesidade do diabetes tipo 1 diferir da obesidade do diabetes tipo 2, o estado de hiperglicemia mantido foi uma característica comum nos dois modelos experimentais.
Vários são os mecanismos descritos envolvidos na gênese da neuropatia diabética como liberação de metabólicos, alterações vasculares e reações auto- imunes. No entanto, a literatura sugere uma relação direta entre o estado hiperglicêmico, mantido cronicamente e as complicações micro e macrovasculares, suportando a hipótese de que a hiperglicemia seja o fator determinante na gênese das complicações do diabetes. Tem sido demonstrado que a hiperglicemia induz as complicações neurovasculares através da ativação da via Diacilglicerol/Proteinoquinase C (DAG/PKC) (Evcimen and King, 2007).
O DAG é o principal ativador fisiológico da PKC. O aumento dos níveis de DAG no diabetes pode ocorrer através de múltiplas vias (Evcimen and King, 2007). O DAG pode ser derivado da hidrólise de fosfatidilinositídeos; pelo metabolismo da fosfatidilcolina por ação da fosfolipase C; ou pela síntese através dos intermediários glicolíticos, fosfato de diidroxiacetona e gliceral-3-fosfato; com subsequente ativação da PKC (Evcimen and King, 2007). A via DAG/PKC também pode ser ativada pela hiperglicemia como resultado do aumento do estresse oxidativo, como por exemplo, pelo aumento do oxidante H2O2, o qual é um conhecido ativador da PKC, seja de
forma direta ou indireta pelo aumento da produção do DAG. (Konishi et al., 1997; Nishikawa et al., 2000)
A PKC, é um grupo de enzimas membros da família de proteinoquinases dependentes do AMPc, que apresentam múltiplas funções celulares e afetam muitas vias de transdução de sinais. No entanto, o mecanismo pelo qual a PKC contribui para o desenvolvimento da neuropatia diabética ainda não está esclarecido. No presente estudo foi demonstrado que a hiponocicepção induzida pelo diabetes está associado ao aumento do nível proteicos das PKC-α, PKC-βI e PKC-β-II. Mais especificamente, foi demonstrado que o aumento do nível proteico da PKC-α é fator
comum nos animais diabéticos tipo 1 e tipo 2, no entanto, o aumento do nível proteico das isoformas PKC-βI e PKC-β-II estão associadas ao diabetes tipo 1.
O papel das diferentes isoformas da PKC tem sido relatado em estudos experimentais e confirmados em estudos clínicos com pacientes diabéticos com neuropatias sensoriais (Frank, 2002; Clark and Dodson, 2007; Obrosova, 2009; Pathak et al., 2012). Particularmente, a PKC-β (Sasane et al., 2005) está diretamente envolvida no desenvolvimento da hipernocicepção (incluindo hipernocicepção decorrente do diabetes), enquanto que a PKC-α está vinculada a danos neurais (Roberts et al., 1997; Sakaue et al., 2003). É importante ressaltar, que pesquisas para o desenvolvimento de possíveis tratamentos para a neuropatia induzida pelo diabetes vêm utilizando inibidores destes mediadores (Frank, 2002; Clark and Dodson, 2007; Obrosova, 2009; Pathak et al., 2012).
O aumento do nível proteico das proteinoquinases PKC-α e PKC-βI e II relacionado a hiperglicemia induzida pelo diabetes demonstrado no presente estudo, corrobora a literatura. Considerando o fato de que existe uma relação entre PKC-α e a bomba Na+/K+/ATPase (Yang et al., 2012); e que o diabetes induz uma inibição da
bomba Na+/K+/ATPase promovendo uma retenção de Na+, com consequente edema
da bainha mielínica, disjunção axoglial e degeneração nervosa (Gagliardi et al., 2003), é possível que nos tecidos da ATM a fase inicial do diabetes (tanto tipo 1 quanto tipo 2) induz um aumento na expressão PKC-α e consequentemente inibição da bomba Na+/K+/ATPase, diminuindo assim a excitabilidade neuronal e consequentemente
7. CONCLUSÃO
Este estudo demonstrou que o diabetes tipo 1, a obesidade e o diabetes tipo 2 diminui a sensibilidade dolorosa da articulação temporomandibular. A redução da sensibilidade dolorosa na articulação temporomandibular induzida pelo diabetes tipo 1 e tipo 2 apresentam como fator comum a hiperglicemia mantida e o aumento do nível proteico da proteinoquinase alpha nos tecidos periarticulares. O aumento da expressão das proteinoquinases beta 1 e beta 2 apresentam uma associação positiva com os animais diabéticos tipo 1.
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ANEXOS
ANEXO 3 – Relatório do Turnitin
