UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS
ALEXSANDRA PEREIRA RODRIGUES
Avaliação do efeito da interesterificação enzimática nas
características físico-químicas de nanoemulsões de óleo de
buriti
CAMPINAS 2016
ALEXSANDRA PEREIRA RODRIGUES
Avaliação do efeito da interesterificação enzimática nas características físico-químicas de nanoemulsões de óleo de buriti
Orientadora: Profa. Dra. GABRIELA ALVES MACEDO Co-orientadora: Dra. PAULA SPERANZA
CAMPINAS 2016
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA ALEXSANDRA PEREIRA RODRIGUES, E ORIENTADA PELA PROFA. DRA. GABRIELA ALVES MACEDO
Dissertação apresentada à Faculdade de Engenharia de Alimentos da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em CIÊNCIA DE ALIMENTOS.
BANCA EXAMINADORA
____________________________________ Profa. Dra. Gabriela Alves Macedo
Membro Titular FEA/UNICAMP
____________________________________ Profa. Dra. Juliana Neves Rodrigues Ract
Membro Titular
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS/USP
____________________________________ Profa. Dra. Samantha Cristina de Pinho
Membro Titular USP/ZFEA
____________________________________ Profa. Dra. Ana Paula Badan Ribeiro
Membro Suplente DTA-FEA/UNICAMP
____________________________________ Profa. Dra. Eliana Setsuko Kamimura
Membro Suplente USP/ZFEA
Ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
AGRADECIMENTOS
Em especial agradeço a Deus por sempre me dar forças nas dificuldades enfrentadas, o que me proporcionou sabedoria para as próximas que virão.
A Universidade Estadual de Campinas – Unicamp pela oportunidade de realização deste trabalho.
Agradeço a minha orientadora professora Doutora Gabriela Alves Macedo pelo acolhimento, orientação, amizade, compreensão e proporcionar os recursos necessários para execução do projeto.
Aos colegas de trabalho que auxiliaram durante as analises, pesquisas, aperfeiçoamento e finalização do trabalho.
À banca de avaliadores, fico grata por aceitarem ao convite para presenciarem este momento de minha vida.
E agradeço aos meus pais e irmãos, que são o bem mais precioso que tenho. Que mesmo distantes, estão sempre presentes ao meu lado nos meus pensamentos.
RESUMO
O buriti é um fruto que cresce em palmeiras na região amazônica. Seu óleo é rico em carotenoides e tocoferóis e é usado pela população local no tratamento de diversas enfermidades e, portanto apresenta grande importância econômica. A interesterificação do óleo de buriti pode melhorar ainda mais as propriedades biológicas e o seu efeito sobre as propriedades físico-químicas das nanoemulsões. Os ácidos graxos predominantes no óleo antes e após a reação de interesterificação foram o ácido oleico e palmítico. As classes de triacilgliceróis encontrados no óleo de buriti foram de 39% para palmítico-oleico-oleico (POO) e 32,7% para oleico-oleico-oleico (OOO), após a reação o óleo de buriti interesterificado por 6 horas apresentou 34,2% de POO e 36,3% de OOO e no óleo interesterificado por 24 horas os valores obtidos foram de 32,6% para POO e 37% para OOO. O conteúdo de compostos fenólicos foram maiores para as amostras interesterificadas. O teor de β-caroteno não apresentou diferença significativa entre as amostras analisadas. As nanoemulsões produzidas com o óleo interesterificado apresentaram menores diâmetros e não alteraram a carga líquida das gotículas. Na análise para avaliar a atividade antioxidante pelo método de redução do ferro (FRAP) não houve diferença da atividade entre as nanoemulsões, já para o método de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), observa-se que a interesterificação do óleo de buriti reduziu a formação de peróxidos. Estes resultados mostram que a reação de interesterificação enzimática produziu um lipídio estruturado que quando nanoemulsionado apresentou melhoria na estabilidade físico-química.
Palavras-chave: Lipídio estruturado, ácido oleico, interesterificação enzimática, triacilglicerol.
ABSTRACT
Buriti is a fruit that grows on palm trees in the Amazon region. Their oil is rich in carotenoids and tocopherols and is used by the local population for the treatment of various diseases, and therefore presents economic importance. The interesterification buriti oil can further improve the biological properties and their effect on the physico-chemical properties of nanoemulsions. The predominant fatty acids in oil before and after interesterification reaction were oleic acid and palmitic acid. Triacylglycerol classes found in the buriti oil were 39% for palmitic-oleic-oleic (POO) and 32.7% for oleic-oleic-oleic (OOO), after the reaction interesterified buriti oil for 6 hours showed 34.2% POO and 36.3% of OOO and interesterified oil for 24 hours the values were 32.6% for POO and 37% for OOO. Phenolic compounds were higher for samples interesterified. β-carotene content was no significant difference between the samples analyzed. Nanoemulsions produced with the interesterified oil had smaller diameters and did not change the net charge of the droplets. In the analysis to evaluate ferric-reducing antioxidant potential (FRAP) there was no difference between the antioxidant activity nanoemulsion, to the method of thiobarbituric acid reactive substances (TBARS), was observed that the interesterification buriti oil reduced the formation of peroxides. These results show that the enzymatic interesterification reaction produces a structured lipid which when introduced emulsified improved physicochemical stability.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Fruto Buriti (Mauritia flexuosa L.f). ... 17 Figura 2. Representação esquemática da atuação da lipase nos ácidos graxos de posição sn-1,3. P= Ácido palmítico e I= Ácido graxo insaturado. ... 21
Figura 3. Representação de uma partícula (a) e a dispersão dos seus componentes na gotícula (b). ... 26
Figura 4. Mostra a dupla camada elétrica sobre uma partícula carregada negativamente, por cima da superfície das partículas, existe uma camada fortemente aderente (subcamada, conhecida como camada de Stern), seguido pelo plano de cisalhamento que juntos informam o potencial zeta da partícula. ... 27
Figura 5. Estrutura química do 4-hidroxi-2nonenal (HNE), Malondialdeído (MDA) e Acroleína. ... 29
Figura 6. Diâmetro médio superficial (D3,2) das gotículas emulsionadas no
período de 30 dias. ... 46 Figura 7. Nanoemulsão produzida com óleo de buriti interesterificado e não interesterificado armazenados por 30 dias sob a temperatura ambiente. A: óleo de buriti; B: óleo de buriti interesterificado por 6h e C: óleo de buriti interesterificado por 24h. ... 47
Figura 8. Nanoemulsão produzida com óleo de buriti interesterificado e não interesterificado armazenados por 30 dias sob a temperatura de refrigeração. A: óleo de buriti; B: óleo de buriti interesterificado por 6h e C: óleo de buriti interesterificado por 24h e óleo de buriti não interesterificado (D). ... 48
Figura 9. Comportamento das cargas elétricas superficiais das nanoemulsões durante o período de armazenamento. ... 49
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
TLL - Thermomyces lanuginosus
TL IM - Thermomyces lanuginosus imobilizada TAG – Triacilglicerol
PCS – Espectrocospia de Correlação de Fóton ROS – Espécie Reativa de Oxigênio
MDA – Malondialdeído HNE - 4-hidroxi-2-nonenal ROO• - Radical peroxil
EAG – Equivalentes de ácido gálico TBA – Ácido 2-tiobarbitúrico
TBARS – Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico TCA – Ácido tricloroacético
TEP – 1,1,3,3-tetraetoxipropano FRAP – Método de redução do ferro POO – Palmítico-oleico-oleico OOO – Oleico-oleico-oleico POS - Palmítico-oleico-esteárico SSS – Tri-saturado SSU – Di-saturado-mono-insaturado SUU – Mono-saturado-di-insaturado UUU – Tri-insaturado OOL – Oleico-oleico-linoleico OOLn – Oleico-oleico-linolênico MAG – Monoacilglicerol DAG – Diacilglicerol
BO – Óleo de buriti não interesterificado
I 6 – Óleo de buriti interesterificado por 6 horas I 24 – Óleo de buriti interesterificado por 24 horas
NE – Nanoemulsão com óleo de buriti não interesterificado NI 6 – Nanoemulsão com óleo interesterificado 6 horas NI 24 – Nanoemulsão com óleo interesterificado 24 horas
CF – Compostos fenólicos
NE G – Nanoemulsão com óleo de buriti não interesterificado geladeira NE AMB – Nanoemulsão com óleo de buriti não interesterificado ambiente NI 6 G – Nanoemulsão com óleo interesterificado 6 horas geladeira
NI 6 AMB – Nanoemulsão com óleo interesterificado 6 horas ambiente NI 24 G – Nanoemulsão com óleo interesterificado 24 horas geladeira NI 24 AMB – Nanoemulsão com óleo interesterificado 24 horas ambiente O/W – óleo-em-água
W/O/W – água-em-óleo-em-água
DPPH – Radical 2,2, difenil, 1 picrilhidrazila FeSO4.H2O – Sulfato de ferro heptahidratado
Fe3+-TPZT – tripiridiltriazina férrica Fe2+-TPZT – tripiridiltriazina ferrosa TE – Trolox equivalente
SUMÁRIO
AGRADECIMENTOS ... 5
RESUMO ... 6
ABSTRACT ... 7
LISTA DE FIGURAS ... 8
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ... 9
1 INTRODUÇÃO ... 13 2 OBJETIVOS ... 16 2.1 Objetivos específicos ... 16 3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 17 3.1 ÓLEO DE BURITI ... 17 3.2 REAÇÃO DE INTERESTERIFICAÇÃO ... 19 3.2.1 Interesterificação Química ... 20 3.2.2 Interesterificação Enzimática ... 20 3.2.3 Lipases... 21 3.4 EMULSÕES ... 23 3.4.1 Microemulsões ... 24 3.4.2 Nanoemulsões ... 25
3.5 PROPRIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS DAS EMULSÕES ... 27
3.5.1 Potencial Zeta ... 27 3.5.2 Tamanho de Partícula ... 28 3.5.3 Peroxidação Lipídica ... 29 4 MATERIAL E MÉTODOS ... 31 4.1 Material ... 31 4.2 Métodos ... 31
4.2.1 Caracterização em ácidos graxos do óleo de buriti ... 31
4.2.2 Processo de interesterificação enzimática do óleo de buriti ... 31
4.2.3 Caracterização em Triacilgliceróis do óleo de buriti ... 32
4.2.4 Determinação do teor de β-caroteno total e Compostos Fenólicos totais ... 32
4.2.5 Determinação do teor de Tocoferóis ... 33
4.2.7 Determinação do tamanho de partículas ... 34
4.2.8 Potencial Zeta ... 34
4.2.9 Peroxidação Lipídica ... 34
4.2.10 Atividade Antioxidante pelo método FRAP ... 34
4.2.11 Análise Estatística ... 35
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 36
5.1 Caracterização do óleo de buriti ... 36
5.1.1 Composição em Ácidos Graxos ... 36
5.1.2 Composição Triacilglicerólica ... 37
5.1.3 Teor de β-caroteno Totais ... 39
5.1.4 Determinação do teor de Compostos Fenólicos Totais ... 41
5.1.5 Determinação do teor de Tocoferol ... 43
5.2 Caracterização das Nanoemulsões ... 45
5.2.1 Tamanho de partículas ... 45
5.2.2 Determinação do Potencial Zeta ... 48
5.2.3 Determinação da Atividade Antioxidante ... 50
5.2.4 Determinação da Peroxidação Lipídica ... 51
6. CONSIDERAÇÕES FINAIS ... 54
7 CONCLUSÕES ... 55
8 SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS ... 56
9 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 57
ANEXO I: CURVAS DE DISTRIBUIÇÃO DO TAMANHO DA GOTA DAS NANOEMULSÕES ... 78
1 INTRODUÇÃO
No Brasil, o buriti (Mauritia flexuosa, Mart) cresce próximo de pântanos no interior da floresta Amazônica. Comercialmente é uma das palmeiras mais atraentes devido ao seu alto potencial econômico, estima-se que a produção média anual de óleo seja em torno de 57,5 ton/hct (Barbosa, Lima & Mourão, 2009).
Popularmente, o óleo extraído dos frutos é usado no tratamento de queimaduras e como vermífugo (Koolen et al., 2012). Porém, as indústrias farmacêutica e alimentícia têm feito uso do óleo de buriti devido à sua grande concentração de carotenoides e tocoferóis, que lhe conferem propriedades ópticas de absorção e de fotoluminescência (Durães et al., 2006), bem como propriedades fotoprotetoras contra UVA e radiação de UVB em células (Zanatta et al., 2010), apresentando baixa citotoxicidade. É usado também como um plastificante natural do amido (Schlemmer, Oliveira & Sales, 2007) e no tratamento e prevenção de xeroftalmia (olho seco) (Mariath, Lima & Santos, 1989).
Há uma escassez de estudos voltados para aplicação da interesterificação com lipases microbianas no óleo de buriti e seus efeitos, portanto, esta área pode ser bastante explorada. Sabe-se que algumas lipases apresentam características atraentes sobre sua especificidade posicional. Conforme pesquisa, o uso de lipases sn-1,3 específicas, apenas os ácidos graxos localizados nestas extremidades da cadeia do glicerol são reativos. Essa distribuição relativa dos ácidos graxos na molécula do triacilglicerol desempenha um papel importante tanto na funcionalidade de produtos, como na forma que são metabolizados durante a dieta (Pacheco, Crapiste & Carrín, 2015).
Tal fato é explicado pela interesterificação, reação que envolve a redistribuição inter e intramolecular dos ácidos graxos nos triacilgliceróis, até que um equilíbrio termodinâmico seja alcançado (Idris & Mat Dian, 2005; Karabulut, Turan & Ergin, 2004), resultando em novas características físico-químicas e propriedades nutricionais, gerando lipídios estruturados que podem promover benefícios à saúde, além de agregar valor ao produto final (Speranza et al., 2015).
Para a indústria alimentícia, os óleos e as gorduras desempenham papel importante no sabor, textura e saciedade dos produtos, além de benefícios ao organismo humano como carreadores de vitaminas lipossolúveis e na participação de vias metabólicas para síntese de hormônios. Devido à sua grande participação
metabólica, vários processos industriais estão sendo aplicados para melhorar e facilitar a aplicação dos óleos e gorduras nos produtos alimentícios, como as emulsões que protegem e carregam vários agentes bioativos hidrofóbicos, e assim, melhoram a bioacessibilidade e biodisponibilidade dos compostos bioativos (Ahmed et al., 2012; Pool et al., 2013; Salvia-Trujillo et al., 2013; Yang & McClements, 2013; Zheng et al., 2014).
As nanoemulsões estão sendo bastante utilizadas para encapsular e distribuir agentes bioativos lipofílicos, tais como nutracêuticos (carotenoides, flavonoides, curcumina) (Ahmed et al., 2012; Augustin et al., 2011; Gulseren, Guri, & Corredig, 2014; Svelander et al., 2011; Yu & Huang, 2012; Zheng et al., 2014), vitaminas lipossolúveis (Mayer, Weiss, & McClements, 2013; Sy et al., 2012; Yang & McClements, 2013) e polifenóis, que também superam os inconvenientes de sua instabilidade, aliviando gostos e aromas desagradáveis e melhorando a meia vida destes compostos in vivo e in vitro (Augustin & Hemar, 2009).
Por consequência, as informações supracitadas, o nosso grupo de pesquisa têm estudado os efeitos que ocorreram durante a reação de interesterificação enzimática nos óleos amazônicos, incluindo o óleo de buriti. Falcão (2015) mostrou que muitos benefícios podem ser conseguidos com o uso da interesterificação, como originar novos óleos ricos em tocoferóis e carotenoides.
Na elaboração de emulsão com o óleo interesterificado, Speranza et al. (2015) conseguiu alterar as características físico-químicas de estabilidade e diminuir o tamanho das gotículas das emulsões, além de melhorar sua atividade antimicrobiana. Por essa razão, o presente trabalho complementa estudos anteriores com o objetivo de aprofundar o estudo nos efeitos que a interesterificação enzimática pode trazer para o óleo de buriti quando aplicado nos sistemas de nanoemulsão.
Neste trabalho, apresentamos uma revisão bibliográfica sobre o fruto e óleo da Mauritia flexuosa, com descrições da sua composição nutricional, além de abordagens do uso de lipases nos processos industriais de interesterificação para produção de novos lipídios com alto valor agregado e o uso em sistemas emulsionados, ressaltando suas características.
Serão apresentados também os resultados da caracterização quanto à composição dos ácidos graxos e triacilgliceróis do óleo de buriti, antes e após o processo de interesterificação enzimática. Com base nesse estudo, são discutidos
os resultados pertinentes à composição dos ácidos graxos no triacilglicerol e compostos minoritários do óleo, como as características na nanoemulsão: potencial zeta, atividade antioxidante e peroxidação lipídica. Todas produzidas com o óleo de buriti interesterificado e não interesterificado.
Portanto, o óleo de buriti pode ser modificado e usado pela indústria de alimentos em aplicações específicas como na formação de óleos e gorduras de uso nutricional e funcional e, na formulação de nanoemulsões com propriedades físico-químicas indicadas para a aplicação tecnológica.
2 OBJETIVOS
Obtenção de lipídio por interesterificação enzimática do óleo de buriti e avaliação do efeito deste processo nas características e estabilidade de nanoemulsões.
2.1 Objetivos específicos
- Quantificar os principais compostos antioxidantes do óleo de buriti e dos lipídios estruturados obtidos após o processo de interesterificação enzimática (carotenoides, tocoferóis e compostos fenólicos totais);
- Avaliar a estabilidade das nanoemulsões produzidas com estes óleos; - Avaliar a capacidade antioxidante pelo método FRAP e a peroxidação lipídica das nanoemulsões produzidas com o óleo interesterificado e não interesterificado.
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 ÓLEO DE BURITI
O buriti (Mauritia flexuosa L.f), pertencente à família Arecaceae do gênero Mauritia, é uma palmeira amplamente distribuída na Floresta Amazônica (Delgado, Couturier, & Mejia, 2007; Koolen et al., 2013). Estas palmeiras tropicais dioicas (plantas que apresentam flores masculinas e femininas separadas) possuem alto valor ecológico, cultural e econômico.
O buriti cresce em diferentes áreas e regiões do Brasil e tem sido usado tradicionalmente para a preparação de bebidas e doces na região amazônica (Ribeiro, Coelho, & Barreto, 2012). Os frutos de M. flexuosa são globosos, de casca dura e escamosa (Figura 1), medindo 4-6 cm por 3-5 cm (Khorsand Rosa & Koptur, 2013), de coloração vermelha, e contém uma polpa amarelo-escura avermelhada macia e oleosa. Entre 20-30% do peso total do fruto é composto de um óleo avermelhado, com maior concentração de carotenoides em relação a outros óleos vegetais, e uma camada branca de celulose entre a polpa e a semente (França et al., 1999; Silva et al., 2009).
Figura 1. Fruto Buriti (Mauritia flexuosa L.f).
Na indústria de alimentos, os óleos e as gorduras apresentam importância para nutrição humana, pois são as principais fontes de energia para o corpo humano. Diversos óleos vegetais possuem alto valor nutritivo e são encontrados como reservas abundantes de algumas plantas, e podem ser facilmente obtidos. Entretanto, o conhecimento dos benefícios de uma grande variedade de produtos
naturais da região amazônica ainda é patrimônio da população nativa (Albuquerque et al., 2003).
O buriti desperta interesses aos pesquisadores, devido suas altas concentrações de carotenoides, podendo ser usado como uma nova fonte natural para obtenção de β-caroteno que desempenha grande importância à saúde humana, por ser precursor da vitamina A (Albuquerque et al., 2003).
Altos níveis de fitoquímicos, especialmente antioxidantes, são comumente encontrados em muitas plantas, sendo uma destas a palmeira de buriti (Zanatta et al., 2010). De acordo com Ribeiro, Coelho & Barreto (2012), os óleos de buriti bruto apresenta altas concentrações de ácidos graxos insaturados, comparados com os óleos de outras plantas, como oliva e abacate (Gunstone & Padley, 1997; Danieli, 2006). Também contém cerca de 1706 ± 54 µg de carotenoides totais/g, sendo 90% de β-caroteno (Garcia-Quiroz et al., 2003). O óleo de buriti é composto em sua maioria por ácidos graxos insaturados (Tabela 1), sendo o principal o ácido oleico, que corresponde a 75-88% do conteúdo total no óleo buriti (Ribeiro, Coelho, & Barreto, 2012) e também apresenta quantidades consideráveis de α-tocoferol (643,2 mg/g) (Costa, 2007). Os tocoferóis atuam como antioxidantes naturais e são apresentados na Tabela 2 a seguir.
Tabela 1. Composição dos ácidos graxos do óleo de buriti.
Ácidos Graxos Quantidade (% massa)
Mirístico Palmítico Esteárico Oleico Linoleico Linolênico 0,1 17,34 – 19,2 2,0 73,3 – 78,73 2,4 – 3,93 2,2
Tabela 2. Teor de carotenoides e tocoferóis totais do óleo de buriti. Substância Quantidade (ppm)
Carotenoides
Tocoferóis
1700 800
3.2 REAÇÃO DE INTERESTERIFICAÇÃO
As aplicações tecnológicas das gorduras dependem das propriedades físicas e químicas. Tanto estas propriedades quanto as propriedades nutricionais são limitadas pela composição dos ácidos graxos (FAs) e a estereoquímica dos triacilgliceróis (TAGs) das gorduras (Gunstone, 2006). Para melhorar as aplicações tecnológicas e preservar os atributos sensoriais das gorduras nos alimentos, têm-se realizado modificações usando-se o fracionamento e misturas entre óleos e gorduras.
Dessa forma, a interesterificação recebeu muito interesse na indústria de óleo comestível por ser um método alternativo para melhorar as propriedades físicas de óleos e gorduras. Ela modifica as propriedades físicas dos óleos rearranjando a distribuição de ácidos graxos sem alterar a sua composição química, minimizando o teor de ácidos graxos trans, especialmente na produção de margarinas (Fauzi, Rashid & Omar, 2013).
A interesterificação é uma reação que envolve a redistribuição inter e intra-molecular dos ácidos graxos nos triacilgliceróis, até que um equilíbrio termodinâmico seja alcançado (Idris & Mat Dian, 2005; Karabulut, Turan & Ergin, 2004). Ou seja, os ácidos graxos são trocados entre os TAGs (Houmøller, Kristensen & Rosager, 2007; Holm & Cowan, 2008). Os produtos resultantes mantêm a composição dos ácidos graxos e o grau de saturação das misturas (Karabulut, Turan, & Ergin, 2004; Rodrigues & Gioielli, 2003), mas a presença de um triacilglicerol estereoquimicamente diferente resulta em novas características físico-químicas e propriedades nutricionais (Klinkesorn et al., 2004).
Por ser uma reação bastante complexa; em alguns casos a interesterificação é confundida com a transesterificação, que reage um éster com um álcool. Esta é uma diferença, pois a interesterificação pode ser realizada utilizando uma mistura composta por vários óleos; ou um óleo com um ácido graxo esterificado. Esta estratégia é uma das estratégias mais amplamente utilizada para produzir lipídios estruturados (Garcia-Galan et al., 2013). Os lipídios estruturados são produzidos através da modificação química ou enzimática dos triacilgliceróis (Willis & Marangoni, 1999).
3.2.1 Interesterificação Química
A interesterificação química ocorre mais rápido do que a interesterificação enzimática (Klinkesorn et al., 2004), mas não possui estereoespecificidade, por ser uma reação aleatória, produz uma randomização dos ácidos graxos no triacilglicerol. Neste processo a reação envolve o uso de metais alcalinos como catalisadores.
Atualmente, sob a perspectiva da redução de custos e aplicação em larga escala, a interesterificação química parece ser o método mais atraente. No entanto, no ponto de vista da produção de lipídios com composições específicas visando aplicações funcionais e médicas, a interesterificação enzimática é mais atraente para as indústrias (Silva et al., 2009b).
A interesterificação química apresenta algumas desvantagens que incluem a troca ao acaso dos grupos acil, contaminação do produto final e do meio ambiente com o resíduo do catalisador e a formação de sabões (sais de sódio dos ácidos graxos, monoacilgliceróis e diacilgliceróis) (Erickson, 1995), ocorrendo perdas de óleo neutro.
3.2.2 Interesterificação Enzimática
A interesterificação enzimática muda o comportamento físico e térmico dos óleos e, sua otimização é requerida para obtenção do rendimento máximo do produto com qualidades desejáveis (Debnath, Ravi & Lokesh, 2011). Nesse processo utilizam-se enzimas, lipases comerciais, produzidas a partir de fontes vegetais, animais e microbiana. As lipases são bem conhecidas pela sua eficácia sob condições mais brandas de temperatura, pH e pressão (Rodrigues & Gioielli, 2003; Yankah & Akoh, 2000; Silva et al., 2009a). O uso de lipases durante a reação também reduz a poluição ambiental, uma vez que há pouca produção de produtos secundários (Chu et al., 2001; Silva et al., 2009a).
No trabalho de Speranza et al. (2015) foram apresentados resultados mostrando que o processo de interesterificação enzimática produziu lipídios com novas características físico-químicas e biológicas, e alterações no ponto de fusão e de cristalização. A disponibilidade das lipases a partir de uma grande variedade de fontes biológicas oferece um enorme potencial para modificação de subprodutos de aplicação industrial (Yamane, 1987).
Contudo, a característica mais importante da interesterificação enzimática é a regioespecificidade na troca dos ácidos graxos (Debnath, Raghavarao & Lokesh,
2011; Farfán et al., 2013). Por exemplo, em óleos vegetais, as lipases hidrolisam as posições sn-1,3 para promover a incorporação de ácidos graxos nessas posições, preservando o ácido graxo essencial poliinsaturado.
Como é possível observar na Figura 2, a distribuição regioespecífica natural do triacilglicerol sempre mantem na posição sn-2 o ácido graxo insaturado e mesmo após a reação de interesterificação enzimática o ácido graxo desta posição não é alterado.
Figura 2. Representação esquemática da atuação da lipase nos ácidos graxos de posição sn-1,3. P= Ácido palmítico e I= Ácido graxo insaturado.
3.2.3 Lipases
O uso das enzimas como catalisador industrial é uma alternativa muito promissora para processos químicos convencionais, pois as enzimas são bastante específicas, seletivas e exibem alta atividade em condições experimentais brandas (baixa pressão e temperatura, meio pouco hidrofílico) (Robles-Medina et al., 2009; Akoh et al., 2008; Brenna, Fuganti & Serra, 2008; Woodley, 2008; Patel, 2008; Patel, 2008a; Chen, Liu & Tao, 2007).
Entre as várias enzimas utilizadas, as lipases têm apresentado destaque importante. Em oposição a outras enzimas, as lipases exibem uma extensiva especificidade e reconhecimento de diferentes substratos, fato baseado na sua vasta disponibilidade na natureza e ampla aceitação ao substrato, permitindo seu uso como catalisador para diferentes reações (Silva et al., 2014).
As lipases (triacilglicerol hidrolase, E.C. 3.1.1.3) são enzimas que catalisam reações por hidrólise de triacilgliceróis a glicerol, ácidos graxos livres,
mono e diacilgliceróis (Sarda & Desnuelle, 1958; Reis et al., 2009). Tem recebido atenção, devido à sua fácil manipulação e disponibilidade comercial (Bornscheuer & Kazlauskas, 2005; Busto, Gotor-Fernández & Gotor, 2011), demonstrando alta aplicabilidade com finalidade sintética, sendo a enzima mais empregada em processos industriais nas ultimas três décadas (Silva et al., 2014). Essas enzimas também possuem a capacidade de catalisar diversas outras reações como esterificação, interesterificação, transesterificação, aminólise, entre outras, em ambientes com baixa quantidade de água (Zaks & Klibanov, 1985; Adlercreutz, 2013; Kapoor & Gupta, 2012).
Entre elas, a lipase fúngica do Thermomyces lanuginosus (TLL), anteriormente conhecido por Humicola lanuginosa, tem recebido muita atenção devido à sua alta atividade e especificidade em um amplo espectro de substratos naturais e artificiais (Fernandez-Lafuente, 2010; Wang, Li & Zong, 2009; Gupta et al., 2013). A lipase do Thermomyces lanuginosus é a enzima responsável pela atividade lipolítica, e está disponível na forma imobilizada (Lipozyme IM®). A Lipozyme TL-IM® é uma lipase solúvel de preparação comercial fornecida pela Novozymes, produzida em escala industrial através da cepa de Aspergillus oryzae geneticamente modificada como organismo hospedeiro (Miranda et al., 2014, Prathumpai et al., 2004; Gouka et al., 1996).
A referida lipase consiste de uma cadeia proteica simples contento 269 aminoácidos e massa molecular de 31,7 kDa. Seu sítio ativo inclui a típica tríade catalítica formada por serina-histidina-aspartato (Ser-His-Asp). Um dos quatro resíduos de triptofano do Thermomyces lanuginosus, o Trp89, localiza-se na extremidade do sítio ativo (Fernandez-Lafuente, 2010). Um dos principais usos das lipases está na modificação e produção de novos óleos e gorduras, que podem compor alimentos mais saudáveis (Hamam, Duan & Shahidi, 2005; Villeneuve et al., 2007; Porsgaard et al., 2005; Hamam & Shahidi, 2006) e lipídios especiais conhecidos como lipídios estruturados.
Os lipídios estruturados (SLs) são triacilgliceróis que foram rearranjados quanto à distribuição posicional, e, portanto são referidos como óleos e/ou gorduras modificadas ou sintéticas, que apresentam características favoráveis como aplicação funcional ou nutracêutica, redução do valor calórico ou modificação do ponto de fusão (Silva et al., 2009b). Os lipídios estruturados que requerem distribuição específica dos ácidos graxos, nomeados MLM-SLs (ácidos graxos de M- cadeia
média e L-cadeia longa) não podem ser sintetizados quimicamente, mas por ação enzimática através da regioespecificidade das lipases (Xu, 2000).
Neste caso, a regioespecificidade é a maior vantagem no uso tecnológico de lipases na indústria óleoquímica na elaboração de produtos com alto valor agregado como equivalentes da manteiga de cacau, substitutos da gordura do leite humano e outras estruturas específicas lipídicas (Xu, 2000). Sendo assim, a posição específica das lipases tem prioridade, e essa propriedade é o alvo de exploração para desenvolvimentos comerciais e industriais, uma vez que os métodos químicos não apresentam tal especificidade (Fernandez-Lafuente, 2010).
Entretanto, a limitação do uso industrial das enzimas, incluindo a lipase microbiana T. lanuginosus, se deve ao elevado custo, que pode ser superado com técnicas de imobilização em suportes sólidos (Miranda et al., 2014).
3.4 EMULSÕES
As emulsões são sistemas coloidais comercialmente usados pelas indústrias de alimentos, farmacêuticas e cosméticas. Estes sistemas coloidais consistem de pequenas gotas dispersas em um carreador líquido, com o composto ativo sendo encapsulado pela gota (Velikov & Pelan, 2008). Convencionalmente, um colóide é um sistema disperso com características dimensionais principais entre 1 e 1000 nm (Evans & Wennerstrom, 1999), porém o termo “sistema coloidal” é amplamente usado incluindo outros sistemas de partículas com estrutura e propriedades similares.
Emulsões óleo-em-água consistem de gotas de óleo dispersas em um meio aquoso, onde sua interface apresenta uma fina camada de moléculas emulsificantes que estabilizam as gotículas contra a agregação (McClements, 2012). As moléculas surfactantes são usadas para facilitar a formação e aumentar a estabilidade das dispersões coloidais (Rao & McClements, 2012b).
As emulsões geralmente são classificadas de acordo com o arranjo de dois sistemas com líquidos imiscíveis como óleo-em-água (O/W) ou de água-em-óleo (W/O) (McClements, 2012), mas também podem ser encontradas como água-em- óleo-água-óleo (O/W/O) ou óleo-água-óleo-água (W/O/W), entre outras.
As gotas das emulsões normalmente têm diâmetros de aproximadamente 100 nm a 200 µm de diâmetro, por isso são consideradas termodinamicamente
instáveis (McClements & Rao, 2012; Leal-Calderon & Cansell, 2012) devido à sua energia livre de separação das fases oleosa e aquosa ser mais baixa do que a da própria emulsão (McClements, 2011; McClements & Rao, 2012). Consequentemente, elas tendem a se desestabilizar ao longo do tempo através de uma variedade de mecanismos, incluindo separação gravitacional, floculação, inversão de fase e maturação de Ostwald (McClements, 2005; Tcholakova et al., 2006).
A taxa de ocorrência desses processos depende das propriedades físico-químicas das duas fases (exemplo, polaridade, densidade e viscosidade), da camada interfacial (exemplo, espessura, carga, empacotamento) e das características das partículas (tamanho da partícula, concentração e estado físico) (Evans & Wennerstrom, 1999; McClements, 2005). As características das gotículas lipídicas formadas dependem da composição e do método utilizado (Li & McClements, 2014).
3.4.1 Microemulsões
Para produção das micro e nanoemulsões os ingredientes são os mesmos (óleo, água e surfactantes), mas em proporções diferentes (Mason et al., 2006; Sonneville-Aubrun, Simonnet & L’Alloret, 2004; Tadros et al., 2004). Para as microemulsões, a concentração de tensoativo é muito mais elevada (Rao & McClements, 2011), sendo o usual de 20% ou mais, entretanto para as nanoemulsões sua concentração está entre 3-10% (Bouchemal et al., 2004).
A microemulsão é uma dispersão coloidal monofásica, transparente, termodinamicamente estável, isotrópica e de baixa viscosidade, que consiste em microdomínios de óleo e/ou água estabilizados por um filme interfacial de moléculas surfactantes (Lawrence, & Rees, 2000; Kale, & Patravale, 2008) com diâmetro de 5-50 nm (McClements, 2010). Devido ao tamanho das suas partículas em escala nano e certos componentes agindo como intensificadores de permeação, as microemulsões, são muito utilizadas como sistema de carreadores transdérmicos (aplicação na pele) (Zhao et al., 2014).
O pesquisador McClements (2011) definiu que a principal diferença entre esses dois tipos de dispersão coloidal seria o fato da nanoemulsão ser termodinamicamente instável, enquanto que as microemulsões termodinamicamente estáveis (Tabela 3). No entanto, deve-se enfatizar que as microemulsões são
termodinamicamente estáveis, mas podem se desestabilizar quando essa condição é alterada, como exemplo devido a diluição, adição de ingredientes ou mudanças na temperatura. Uma vez que as nanoemulsões são sistemas termodinamicamente instáveis, elas podem desestabilizar durante o armazenamento (Rao & McClements, 2012a).
Tabela 3. Comparação entre as diferentes dispersões coloidais.
Emulsão Microemulsão Nanoemulsão
Tamanho das
gotículas 100 μm – 100 nm 10 – 200 nm < 200 nm Aparência Turva e leitosa Transparente Transparente e
translúcida Estabilidade Termodinamicamente instável Termodinamicamente estável Termodinamicamente instável Tensão
interfacial Alta Muito Baixa Muito Baixa
Quantidade
de tensoativo Baixa Alta Baixa
Fonte: Rao & McClements (2011).
Entretanto, Anton & Vandamme (2011) sugeriram uma técnica para determinar se o sistema corresponde a uma micro ou nanoemulsão, que pode ser examinado através da ordem em que os componentes são adicionados à mistura. Para formação das microemulsões é muito importante que, primeiramente, o surfactante seja misturado junto à fase oleosa e para as nanoemulsões está ordem não importa.
As microemulsões, óleo-em-água, são dispersões muito utilizadas na indústria de bebidas para encapsulação e distribuição de componentes lipofílicos (McClements & Rao, 2012), porque possuem a capacidade de liberar flavours de moléculas lipofílicas dentro de produtos aquosos. Além disso, possuem boa estabilidade física e química tanto na forma concentrada como diluída (Given, 2009).
3.4.2 Nanoemulsões
As propriedades físico-químicas (como cor, solubilidade, viscosidade, força do material e toxicidade) e propriedades biológicas das estruturas e sistema em escala nano, são substancialmente diferentes que a escala macro, devido as
interações dos átomos e moléculas individuais, que oferecem aplicações novas e funcionais (Neethirajan & Jayas, 2011).
As nanoemulsões, representadas esquematicamente na Figura 3, podem apresentar numerosas vantagens sobre as emulsões devido à proteção da bioatividade contra degradação ou interação com outros ingredientes, redução do impacto nas propriedades organolépticas dos alimentos (Donsi et al., 2011), controle da liberação do composto bioativo (Sari et al., 2015; Ghosh et al., 2013). Tais propriedades ocorrem pelo aumento da solubilidade e da taxa de dissolução (Müller et al., 2000), alta estabilidade física, baixa turvação e alta biodisponibilidade fazendo destas um sistema atrativo para aplicação nas indústrias de alimentos, cosmética e farmacêutica (Ghosh et al., 2013).
Figura 3. Representação de uma partícula (a) e a dispersão dos seus componentes na gotícula (b).
Nanoemulsões são dispersões metaestáveis, óleo-em-água, com diâmetro de 50-200nm (Kong & Park, 2011). Em razão do pequeno tamanho das partículas, possuem grande área superficial, o qual pode mudar as taxas de digestão, alta taxa de liberação de compostos ativos, difusão mais rápida através da camada da mucosa intestinal e aprimorar a permeabilidade das células do epitélio intestinal (Sivakumar, Tang & Tan, 2014; Ting et al., 2014; Yu & Huang, 2013). Por conta destes fatores, as nanoemulsões podem inibir a oxidação de compostos bioativos quimicamente lábeis, devido ao caráter líquido das gotículas de óleo, e desse modo, aumentam o shelf life e reduzem a degradação no trato gastrointestinal (GIT) (Müller et al., 2007; Augustin et al., 2011; Frede et al., 2014).
3.5 PROPRIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS DAS EMULSÕES
3.5.1 Potencial Zeta
O potencial zeta é o potencial elétrico no plano de cisalhamento, o qual é definido como a distância da superfície inferior da partícula onde íons opostos permanecem fortemente ligados à mesma, quando ela se move num campo elétrico (Kaszuba et al., 2010; Bhattacharjee, 2016) (Figura 4), sendo uma medida indireta da estabilidade física das emulsões e da influência sobre a cinética de liberação das nanopartículas.
Figura 4. Mostra a dupla camada elétrica sobre uma partícula carregada negativamente, por cima da superfície das partículas, existe uma camada fortemente aderente (subcamada, conhecida como camada de Stern), seguido pelo plano de cisalhamento que juntos informam o potencial zeta da partícula.
Para alcançar uma nanosuspensão com boa estabilidade eletrostática, é requerido um mínimo de potencial zeta de ±30mV, enquanto que no caso de uma combinação na estabilização eletrostática e aumento da entropia, um mínimo de ±20mV de potencial zeta é desejável (Lakshmi & Kumar, 2010; Mitri et al., 2011).
Se todas as partículas em suspensão têm um alto potencial zeta positivo ou negativo elas se repelem entre si e as partículas não terão tendência à agregação (Wissing & Müller, 2002). Partículas carregadas positivamente têm
tendência a associar com a superfície ou componentes (biológico) carregadas negativamente, e vice-versa. O potencial zeta pode ser determinado convencionalmente por instrumentos analíticos baseados na mobilidade eletroforética/eletroacústica (McClements, 2005).
3.5.2 Tamanho de Partícula
O significado de distribuição e tamanho da partícula, usualmente indicados como polidispersidade são as características mais importantes para as nanodispersões, pois determinam as suas estabilidade física, solubilidade, performance biológica, taxa de liberação, turvação e estabilidade química (Lakshmi & Kumar, 2010).
Durante a produção das emulsões, o tamanho final das partículas é influenciado por uma série de fatores, dependendo do método utilizado. Na maioria dos métodos usados para produção de micro/nanoemulsão, a fase óleo/orgânico é dispersa na fase aquosa que contém emulsificante e pode, portanto, ser considerado como a homogeneização de uma emulsão. O tamanho das partículas obtidas nas emulsões depende da cinética de absorção do emulsificante, da tensão interfacial entre a fase dispersa e contínua, viscosidades da fase dispersa e contínua, frações do volume da fase dispersa e da energia mecânica necessária para deformar e romper as gotículas (Gramdorf et al., 2008).
Determinar alterações no tamanho da partícula é o melhor método para monitoramento da estabilidade física das emulsões. A estabilidade da dispersão em óleo depende do equilíbrio do emulsificante na interface óleo-água e a natureza da fase oleosa (Martini & Herrera, 2008).
Existem diversos instrumentos baseados nas técnicas convencionais de medida do tamanho de nanopartículas, sendo um deles a Espectroscopia de Correlação de Fotón (PCS), que é designada para analisar dispersões diluídas onde o feixe de laser passa sobre uma dispersão e depois é transmitindo ao detector (Horne, 1995). A espectroscopia de correlação de fotón mede a variação da intensidade da dispersão do feixe do laser. As técnicas com a luz dinâmica de dispersão são capazes de analisar partículas com diâmetros entre alguns nanômetros até cerca de 3 microns (Mehnert & Mäder, 2012) ao qual apresentam um movimento Browniano (movimento das partículas) perceptível e não são capazes de detectar partículas com maiores dimensões. Depois da análise do tamanho da
partícula pela espectroscopia de correlação de fotóns, a dispersão deve ser corretamente diluída para uma concentração onde os efeitos da dispersão sejam insignificantes.
A espectroscopia de correlação de fotóns fornece o tamanho da partícula como média ponderada em função da intensidade do diâmetro hidrodinâmico e do índice de polidispersidade (PI; 0 ≤ PI ≤ 1) como uma medida da largura da distribuição do tamanho da partícula. O PI tem um efeito importante na estabilidade física das nanosuspensões e tanto quanto possível, deverá ser baixa para manter uma estabilidade térmica a longo prazo das nanosuspensões. Os valores de PI de 0,1-0,25 mostram uma distribuição de tamanho bastante restrito, onde um valor de PI superior a 0,5 indica uma distribuição muito ampla (Lakshmi & Kumar, 2010).
3.5.3 Peroxidação Lipídica
A oxidação dos lipídios pode ocorrer através das reações não-enzimáticas e enzimática quando pelas enzimas oxidantes. Especialmente, os lipídios poliinsaturados que possuem mais de duas duplas ligações cis, cada um separado por um grupo metileno e seus ésteres são facilmente oxidados (Niki, 2014), com isto, eles apresentam elevada propensão de serem atacados pelos radicais livres, causando uma série de reações autocatalíticas que produzem vários produtos intermediários (Singh, Kapoor & Bhatnagar, 2015). Conduzindo na formação de aldeídos eletrófilos altamente reativos, incluindo o malondialdeído (MDA), 4-hidroxi-2-nonenal (HNE), os produtos mais abundantes, e a acroleína metaestáveis, o mais reativo (Figura 5) (Esterbauer, Schaur & Zollner, 1991; Pryor, Porter, 1990; Loidl-Stahlhofen, Hannemann & Spiteller, 1994).
Figura 5. Estrutura química do 4-hidroxi-2nonenal (HNE), Malondialdeído (MDA) e Acroleína.
A partir da oxidação em cadeia de radicais livres, muitos estudos mostram que essa reação danifica o DNA das células e inativa as proteínas e enzimas, levando a várias perturbações e doenças. Os produtos da peroxidação lipídica têm sido usados como mediadores tóxicos, mas agora eles são conhecidos por exercer diversos efeitos biológicos (Niki, 2012; Leonarduzzi et al., 2012; Higdon et al., 2012), como no caso do MDA.
O MDA é um dos mais abundantes subprodutos da peroxidação lipídica, ele é gerado através da decomposição oxidativa de ácidos graxos poliinsaturados, mas é muito menos reativo que o HNE (4-hidroxi-2-nonenal) ou a acroleína. O MDA é um biomarcador muito utilizado para análises de estresse oxidativo. Durante a peroxidação lipídica, os hidroperóxidos instáveis resultantes a partir das reações em cadeia do radical peroxil (ROO•) dependente, são quebrados em produtos menores e mais estáveis, como no caso do MDA ou outras substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico. Assim, estes produtos são considerados importantes marcadores de estresse oxidativo (Singh, Kapoor & Bhatnagar, 2015).
Vários antioxidantes endógenos regulam a produção de espécies reativas de oxigênio como as enzimas (superóxido-dismutase, glutationa peroxidase e catalase) e pequenos compostos (glutationa). Os antioxidantes exógenos contidos nos alimentos (vitaminas C e E, polifenóis, carotenoides) também contribuem na ação antioxidante. Os efeitos em longo prazo do estresse oxidativo vêm sendo muito estudados, porque estão intimamente ligados com várias doenças, como por exemplo, as cardiovasculares, doença de Alzheimer e patologias do fígado (Valko et al.,2007).
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Material
O óleo de buriti foi adquirido da empresa Brasquim (São Paulo, Brasil) e a enzima Lipozyme TL-IM da empresa Novozymes® (Curitiba, Brasil). O processo de interesterificação enzimática, assim como a composição de triacilgliceróis dos óleos antes e após este processo foi desenvolvido com base nos trabalhos anteriores do nosso grupo de pesquisa (Speranza et al., 2015; Speranza, Ribeiro & Macedo, 2016). Para elaboração das nanoemulsões, foi utilizado o Tween-80 (Polisorbato 80) como agente emulsificante e água ultrapura, purificada em sistema Milli-Q® (Merck Millipore, Alemanha). Todos os reagentes utilizados nos experimentos foram de grau analítico e todas as soluções foram preparadas com água ultrapura.
4.2 Métodos
4.2.1 Caracterização em ácidos graxos do óleo de buriti
A análise cromatográfica dos ácidos graxos do óleo de buriti foi realizada com a utilização do cromatógrafo a gás (Shimadzu, QP2010S) acoplado ao detector FID, após reação de esterificação de acordo com o método de AOCS Ce 2-66 (AOCS, 2009). A separação dos ésteres metílicos do ácido graxo foi feita em coluna DB-23 com 60 m de comprimento. Os parâmetros cromatográficos foram definidos: vazão: 1,0 mL min-1; velocidade linear: 24 cm s-1; temperatura do detector: 280°C; temperatura do injetor: 250°C; temperatura do forno: 110°C (5 min); 110–215°C (5°C min-1); 215°C (24 min); gás de arraste: hélio; volume injetado: 1,0 μL. A composição qualitativa foi determinada através do tempo de retenção e dos picos com dos respectivos padrões.
4.2.2 Processo de interesterificação enzimática do óleo de buriti A reação de interesterificação enzimática do óleo de buriti foi realizada com nitrogênio em banho termostático com agitação (150 rpm) constante à 40°C durante o tempo de reação de 6 horas e 24 horas, utilizando 2,5% (m/m) da lipase comercial Lipozyme TL-IM (Speranza, Ribeiro & Macedo, 2016). Ao final da reação, a mistura interesterificada foi filtrada (membrana filtrante de 0,45 μm) (Speranza et al., 2015).
Depois da interesterificação, as amostras foram purificadas com etanol aquecido para remoção dos ácidos graxos livres mono e diacilgliceróis gerados durante a reação de interesterificação enzimática. Seguindo a metodologia (Farmani, Safari & Hamedi, 2006), com algumas modificações. Foram adicionadas as amostras interesterificadas etanol P.A. 96% aquecido a 50°C, com breve agitação e deixados em repouso no banho por 30 minutos a 45°C. A fase etanólica foi removida, sendo tal procedimento foi repetido por 3 vezes. Após, as amostras foram colocadas na estufa a vácuo a 40°C por 6 horas para evaporação do etanol remanescente. Em seguida, o óleo foi transferido para frascos âmbar com nitrogênio gasoso e congelado a -18°C para análises posteriores.
4.2.3 Caracterização em Triacilgliceróis do óleo de buriti
A análise da composição triacilglicerólica do óleo de buriti foi realizada no cromatógrafo (Agilent 6850 Series CG System, Santa Clara, CA, USA) gasoso usando a metodologia AOCS Ce 5-86 (AOCS, 2009) com a coluna DB 17HT com 15 m de comprimento. Para as condições de análise: temperatura da coluna: 250°C programada até 350°C (5°C min-1); gás de arraste: hélio; vazão: 1,0 mL min-1; temperatura do injetor: 360°C; temperatura do detector: 375 °C; volume injetado: 1,0 µL; concentração da amostra: 100 mg em 5 mL de tetrahidrofurano. A identificação dos grupos de triacilglicerol (TAG) foi realizada através da comparação do tempo de retenção, segundo Antoniosi Filho, Mendes & Lanças (1995). O mesmo procedimento foi utilizado para as amostras interesterificadas.
4.2.4 Determinação do teor de β-caroteno total e Compostos Fenólicos totais
O teor de β-caroteno total foi determinado segundo a metodologia de Ferreira de França et al. (1999) com algumas modificações. Foram pesados 0,1g de óleo e o volume foi completado para 25 mL com a solução de hexano e acetona (7:3 v/v). A leitura foi realizada em 450 nm. A curva padrão foi feita com a solução de β-caroteno em diferentes concentrações (0 a 1,4 mg mL-1) e os valores foram expressos em µg de β-caroteno por g de óleo de buriti.
Para determinação dos fenólicos totais, foi usado o método de Hrnciriki e Fritsche (2004) com algumas modificações. Foram pesados 0,5g de óleo, a extração foi feita com a solução de hexano e metanol 60% (1:1 v/v), após a centrifugação,
uma alíquota de 1000 µL foi retirada do extrato metanólico. Depois adicionou-se o reagente de Folin-Ciocalteu e carbonato de sódio a 35%, as leituras foram realizadas a 725 nm. A curva foi feita com uma solução padrão de ácido gálico e os resultados foram expressos em µg em equivalentes de ácido gálico (EAG) por g de óleo de buriti.
4.2.5 Determinação do teor de Tocoferóis
A análise de α, β, γ e δ-tocoferóis foi realizada conforme metodologia da AOCS Ce 8-89 (AOCS, 2009) em cromatógrafo líquido HPLC (Perkin Elmer serie 200a, Shelton, CT 06484-4784, USA). A coluna micro particulada de sílica possuía 250 mm de comprimento e 4 mm de diâmetro. O detector de fluorescência foi ajustado em 290 nm com comprimento de onda de emissões de 330 nm. A fase móvel foi composta por hexano grau HPLC: isopropanol (99:1, v/v). A composição qualitativa de tocoferóis se deu pela comparação dos tempos de retenção dos picos com os respectivos padrões. A composição quantitativa foi realizada através da normatização da área sob o pico, sendo expressa em μg kg-1
(Pereira et al., 2013). A análise foi realizada em duplicata.
4.2.6 Processo de emulsificação do óleo de buriti
As nanoemulsões foram compostas por 10% (m/m) de fase lipídica, produzida com a utilização da técnica de homogeneização de alta pressão a quente. Essa técnica foi a quente para que houvesse a fusão do óleo. A fase aquosa também foi aquecida a 85°C, a qual estava composta por 1,2% de Tween-80 em água ultrapura. A fase lipídica a 85°C foi adicionada à fase aquosa com agitação contínua (7000 rpm) por 5minutos utilizando o turrax (Ultra-Turrax T 18 Basic). Após a formação da pré-emulsão, esta foi homogeneizada a 85°C em um homogeneizador de alta pressão com dois ciclos a 800 bar (Niculae et al., 2014). Para realização de todas as análises, foram preparados 500 mL de emulsão e depois foram fracionadas em relação ao período (1, 15 e 30 dias) e a temperatura de armazenamento (refrigeração (8°C) e ambiente (25°C)). O mesmo processo também foi realizado para produção das nanoemulsões com o óleo de buriti interesterificado.
4.2.7 Determinação do tamanho de partículas
A análise do tamanho da partícula foi realizada pela Espectroscopia de Correlação de Fóton (PCS) utilizando o equipamento Mastersizer Plus 2000 (Malvern Instruments, Worchestershire, UK). Para realização das análises todas as amostras foram diluídas com água deionizada até alcançar a sensibilidade do equipamento (Ma & Zhong, 2015). Os resultados foram realizados em triplicata.
4.2.8 Potencial Zeta
O valor do potencial zeta foi determinado a partir da medição da mobilidade eletroforética utilizando a equação de Smoluchowski presente no software do equipamento Zetasizer Nano 2000 (Malvern Instruments, Worchestershire, UK).
4.2.9 Peroxidação Lipídica
O ensaio com ácido tiobarbitúrico baseia-se na reação entre o reagente ácido 2-tiobarbiturico (TBA) e as carbonilas, que formam a coloração em condições ácidas. As análises foram realizadas em tubos de centrifuga para determinação da estabilidade oxidativa da nanoemulsão medindo a mudança de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) (Ke e Woyewoda, 1979). O teste foi realizado com 100 µL nanoemulsão e 1 mL de reagente TBA (TBA 0,04 M em ácido acético, sulfato de sódio 0,3 M e clorofórmio) foram agitados nos tubos com tampas de rosca. Os tubos permaneceram no banho a 90°C durante 45 minutos, e, em seguida, transferidos para um banho com a água a temperatura ambiente para resfriar. A seguir adicionou-se a solução de ácido tricloroacético (TCA). Os tubos foram centrifugados até a separação do sobrenadante. A absorbância foi medida a 532 nm. O reagente 1,1,3,3-tetraetoxipropano (TEP) foi usado para curva de calibração para determinar a concentração de µM TBA mL-1.
4.2.10 Atividade Antioxidante pelo método FRAP
A capacidade antioxidante através do método de redução do ferro (FRAP) condiz com a redução do complexo tripiridiltriazina férrica (Fe3+-TPTZ) para a forma ferrosa (Fe2+-TPTZ) (Benzie & Strain, 1996; Liu et al., 1982), seguida pela formação de coloração. O método foi realizado de acordo com Benzie & Strain (1996), com algumas modificações. O volume de 270 µL do reagente (25 mL tampão acetado 0,3
M, 2,5 mL TPTZ 10 mM e 2,5 mL cloreto férrico) foi misturado a uma alíquota de 30 µL de nanoemulsão. O tampão misturado com o reagente FRAP foi usado como branco. O teste foi realizado a temperatura de 37°C seguido de agitação e leitura no comprimento de onda de 593 nm. Analisou-se a cinética de reação por 4 minutos. Os resultados foram expressos em µM Trolox equivalente por mL a partir da curva de calibração.
4.2.11 Análise Estatística
As análises de variância ANOVA foram pelo teste de Tukey em nível de 5% e os testes estatísticos de média foram feitos usando o software Sisvar (Ferreira, 2005).
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Caracterização do óleo de buriti
5.1.1 Composição em Ácidos Graxos
Os ácidos graxos presentes no óleo de buriti são mencionados como sendo de cadeia longa (França et al., 1999), em sua maioria são compostos pelos ácidos graxos de cadeia insaturada (oleico) e saturada (palmítico) representando cerca de 75% e 18%, respectivamente (Albuquerque et al., 2005; Silva et al., 2009). Dessa forma, os valores obtidos estão em conformidade com a literatura estudada, onde o maior percentual encontrado foi para os ácidos oleico e palmítico, com valores de 73,5% e 20,7%, respectivamente (Tabela 4). Silva et al. (2009a)também encontrou resultados próximos para oleico (74,06%) e palmítico (17,78%) em seu trabalho.
Tabela 4. Composição em ácidos graxos presentes no óleo de buriti.
Ácido Graxo Quantidade (% massa)
Palmítico (C16:0) Esteárico (C18:0) 20,7 1,4 Oleico (C18:1) Linoleico (C18:2) Linolênico (C18:3) Outros* Σ Saturados Σ Monoinsaturados Σ Poliinsaturados 73,5 1,4 1,0 2,0 22,1 73,5 2,4
*Soma dos ácidos graxos que apresentaram valores abaixo de 1,0%.
Em trabalhos anteriores do nosso grupo de pesquisa com o óleo de buriti, o percentual de ácido graxo monoinsaturado (oleico) foi 65,5% e para o saturado (palmítico) foi de 19,2% (Speranza, Ribeiro & Macedo, 2016), sendo maiores os valores encontrados no trabalho atual. Entretanto, a quantidade de ácidos graxos poliinsaturados totais, representados pelos ácidos linoleico e linolênico, foram
superiores (13,2%) no trabalho de Speranza e et al. aos apresentados neste estudo (2,4%).
Albuquerque et al. (2003) determinaram cerca de 17,3-19,2% para palmítico, 73,3-78,7% para oleico e um total de ácidos graxos poliinsaturados que variaram cerca de 4,8-6,1%. Valores semelhantes foram encontrados por Cunha et al. (2012) usando o método de extração por fluido supercrítico, com 77,0% para oleico e 15,9% para palmítico. Estas diferenças na quantidade de ácidos graxos poliinsaturados totais pode ser devido às condições de temperatura do processo de extração ou armazenamento, como também das espécies de frutos de buriti, por exemplo, a região de cultivo e clima.
5.1.2 Composição Triacilglicerólica
A estrutura molecular dos triacilgliceróis fornece informações importantes para as áreas da tecnologia de alimentos, nutrição e bioquímica, pois são responsáveis pelo seu comportamento no processo de cristalização e durante o processamento ou nas propriedades de palatabilidade (Janssen et al., 2003; Nasa et al., 2013; Ruiz-Samblás, Gonzáles-Casado & Cuadros-Rodríguez, 2015). Com isso, a análise da composição dos triacilgliceróis informa a relação entre a estrutura do TAG e as características físicas do lipídio, bem como suas funções fisiológicas (Noh & Yoon, 2012).
As propriedades físico-químicas, funcionais e nutricionais dos triacilgliceróis são determinadas pela natureza e tipo de ácidos graxos presentes na estrutura dos TAGs (Jenab et al., 2014), portanto a composição do TAG é fundamental para compreender as propriedades físicas de óleos e gorduras (Buchgraber et al., 2004).
No óleo de buriti, as espécies moleculares predominantes de TAG foram as que continham os ácidos palmítico (16:0) e oleico (18:1). Os resultados mostraram que os TAGs palmítico-oleico-oleico (POO) e oleico-oleico-oleico (OOO) representando 39,0% e 32,7%, respectivamente, foram as principais formas presentes no óleo de buriti não interesterificado (Tabela 5).
Tabela 5. Composição lipídica e distribuição global dos ácidos graxos no TAG do óleo de buriti interesterificado e não interesterificado.
Triacilglicerol Quantidade (%) BO a I 6 b I 24 c PPP PPO PSO POO POL POLn SOO OOO OOL OOLn ΣSSS ΣSSU ΣSUU ΣUUU 0,4 9,8 1,8 39,0 3,9 2,7 6,1 32,7 2,8 0,8 0,4 11,6 51,7 36,3 1,0 10,1 1,6 34,2 4,5 2,9 3,6 36,3 3,5 2,3 1,0 11,7 45,2 42,1 0,9 8,3 1,0 32,6 4,2 2,8 4,3 37,0 5,4 3,5 0,9 9,3 43,9 45,9 a
BO: óleo de buriti não interesterificado
b
I 6: óleo de buriti interesterificado por 6 horas
c
I 24: óleo de buriti interesterificado por 24 horas
P: Palmítico, S: Esteárico, O: Oleico, L: Linoleico, Ln: Linolênico.
Valores maiores foram obtidos no óleo de buriti num estudo proposto por Santos et al. (2013), onde foi encontrado 39,8% de OOO e 35,9% de POO, como espécies dominantes, no entanto também foi encontrado altas concentrações de palmítico-oleico-esteárico (POS) com 9,4%. Esta espécie de TAG não foi detectada nas amostras analisadas neste estudo.
Com relação a Tabela 5, podemos observar que a interesterificação enzimática alterou a composição dos TAGs POO e OOO em relação ao óleo de buriti não interesterificado. Sendo que após a reação o óleo de buriti interesterificado por 6 horas apresentou quantidades de 34,2% de POO e 36,3% de OOO e no óleo interesterificado por 24 horas os valores obtidos foram de 32,6% para POO e 37% para OOO. Dessa forma, observa-se que durante a reação de interesterificação
enzimática a quantidade de POO diminuiu e os valores do TAG composto por OOO aumentaram, indicando que a lipase redistribuiu os ácidos graxos na cadeia do TAG.
Nota-se também que nas amostras I 6 e I 24 houve um aumento na quantidade dos TAGs UUU, com destaque aos TAGs compostos pelo oleico-oleico-linoleico (OOL) e oleico-oleico-linolênico (OOLn). O uso da interesterificação enzimática no óleo de buriti alterou também a composição da classe de lipídios nos óleos submetidos à reação, como é possível observar na Tabela 6.
Tabela 6. Classe de lipídios do óleo de buriti interesterificado e não interesterificado.
Amostras TAG (%) DAG (%) MAG (%)
BO a I 6 b I 24 c 93,3 90,7 90,8 6,7 9,3 9,2 ND ND ND a
BO: óleo de buriti não interesterificado
b
I 6: óleo de buriti interesterificado por 6 horas
c
I 24: óleo de buriti interesterificado por 24 horas
TAG: Triacilglicerol, DAG: Diacilglicerol, MAG: Monoacilglicerol, ND: Não detectado.
Pôde-se observar que a partir da reação de interesterificação com a lipase comercial houve uma redução da quantidade de TAG e um aumento de DAG nos óleos interesterificados, em comparação com BO, indicando que houve ressíntese dos ácidos graxos. Nenhuma fração de monoacilglicerol e ácidos graxos livres foram detectados. Com isso, as enzimas foram capazes de manter a estrutura do TAG sem a formação de monoacilgliceróis e ácidos graxos livres (Speranza, Ribeiro & Macedo, 2016).
5.1.3 Teor de β-caroteno Totais
Os carotenoides são pigmentos naturais metabolizados pelas plantas, mas também podem ser isolados de fungos, leveduras e algumas bactérias (Sy et al. 2013). Os carotenoides desempenham um papel importante, como precursores de vitamina A (apocarotenoides) (Haskell, 2013), necessária em muitas funções
fisiológicas, como comunicação intercelular, visão e atividade do sistema imune (Hendler & Rorvik, 2008; Skibsted, 2012; Stephensen, 2013).
Na indústria de refino são realizadas etapas para purificação de óleos, com a finalidade de retirar as impurezas do óleo vegetal bruto, tornando-o adequado para o consumo e estender o seu tempo de prateleira (Topallar, 1998), pois remove os fosfatídeos, esteróis, tocoferóis, hidrocarbonetos, ácidos graxos livres, cetonas e pigmentos que porventura podem atuar como agentes oxidantes.
Na Tabela 7 são mostrados os teores de β-caroteno presentes no óleo de buriti interesterificado e não interesterificado, antes e depois da purificação das amostras.
Tabela 7. Determinação do teor de β-caroteno totais no óleo de buriti interesterificado e não interesterificado.
Amostras β-caroteno (µg g-1)
Óleo de buriti não interesterificado 2786,8±50,73a Interesterificada por 6h Purificada 2892,2±124,82a Interesterificada por 6h Não Purificada 2979,8±367,07a Interesterificada por 24h Purificada 2665,8±276,23a Interesterificada por 24h Não Purificada 2859,7±28,24a Letras iguais na mesma coluna não apresentam diferença significativa (p>0,05).
As amostras purificadas com etanol apresentaram uma redução não significativa no teor de β-caroteno total em comparação com o óleo não interesterificado, mostrando que o processo de purificação não causa muitas perdas dos compostos bioativos presentes no óleo. O processo de purificação, cujas amostras deste trabalho foram submetidas, é necessário para reduzir o teor de acidez devido aos ácidos graxos livres presentes após a reação de interesterificação.
Nas amostras interesterificadas não purificadas, estatisticamente não houve diferença significativa, mas nota-se que estes lipídios estruturados apresentaram maiores teores de β-caroteno totais, dessa forma, podemos entender que a reação de interesterificação não causou perdas do β-caroteno solúvel no óleo de buriti.
O resultado deste estudo (2786 µg g-1) é superior ao estudo de Falcão (2015), que encontrou teores da ordem de 780 µg g-1 de β-caroteno no óleo de buriti.
Silva et al. (2009a) apresentaram uma comparação nos teores de β-caroteno nos óleos adquiridos de mercados locais entre os óleos extraídos de forma artesanal, os teores de β-caroteno variaram de 225 a 664 µg g-1 e de 1,661 a 1,890 µg g-1, respectivamente.
No óleo de palma, Zou et al. (2012) encontraram um teor total de 500-700 µg g-1 de carotenoides com concentrações de β-caroteno em cerca de 50,0-56,02 µg g-1. De Rosso & Mercadante (2007), quantificaram os carotenoides de vários frutos nativos da Amazônia, incluindo o buriti. Em seus resultados foram identificados 60 carotenoides diferentes, entre eles e o mais abundante foi o (all-E)-β-caroteno. O teor de carotenoides totais no fruto de buriti foi de 513,87 µg/g.
Diante das discussões apresentadas, pode-se concluir que a purificação das amostras, necessárias para o processo de interesterificação não interfere negativamente nas propriedades biológicas do β-caroteno, que são benéficas para a saúde, uma vez que estes permanecem com suas concentrações inalteradas. Sendo assim, a produção do lipídio estruturado conserva as propriedades de interesse para uma vida saudável.
5.1.4 Determinação do teor de Compostos Fenólicos Totais
A capacidade antioxidante de óleos e gorduras é determinada pela sua composição físico-química e pela presença de compostos lipofílicos de natureza antioxidante. Os principais antioxidantes naturais presentes nas plantas são os compostos fenólicos, que atuam como agentes protetores contra a ação de radicais livres, pois possui a capacidade de quelar metais de transição e agem como supressores de oxigênio singlete, impedindo a reação de peroxidação em cadeia dos lipídios insaturados (Shahidi, Janitha & Wanasundara, 1992) que ocorrem de forma natural nos óleos vegetais.
Dados do teor de compostos fenólicos totais das amostras avaliadas estão descritos na Tabela 8.
