UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS
FABIANE CRISTINA PETRY
CULTIVARS: COMPOSITION, CHANGES DURING RIPENING AND BIOACCESSIBILITY
CAROTENOIDES E ÉSTERES DE CAROTENOIDES EM DIFERENTES CULTIVARES DE CITROS: COMPOSIÇÃO, MUDANÇAS DURANTE O
AMADURECIMENTO E BIOACESSIBILIDADE
CAMPINAS 2017
Universidade Estadual de Campinas
Biblioteca da Faculdade de Engenharia de Alimentos Claudia Aparecida Romano - CRB 8/5816
Petry, Fabiane Cristina,
P449c PetCarotenoids and carotenoid esters in different citrus cultivars: composition, changes during ripening and bioaccessibility / Fabiane Cristina Petry. –
Campinas, SP : [s.n.], 2017.
PetOrientador: Adriana Zerlotti Mercadante.
PetTese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos.
Pet1. Carotenoides. 2. Digestão in vitro. 3. LC-MS. 4. Identificação. 5. Quantificação. I. Mercadante, Adriana Zerlotti. II. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Engenharia de Alimentos. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Carotenoides e ésteres de carotenoides em diferentes cultivares
de citros: composição, mudanças durante o amadurecimento e bioacessibilidade
Palavras-chave em inglês: Carotenoids In vitro digestion LC-MS Identification Quantification
Área de concentração: Ciência de Alimentos Titulação: Doutora em Ciência de Alimentos Banca examinadora:
Adriana Zerlotti Mercadante Juliana Azevedo Lima Pallone Lilian Regina Barros Mariutti Rodrigo Rocha Latado
Solange Guidolin Canniatti Brazaca
Data de defesa: 27-06-2017
Programa de Pós-Graduação: Ciência de Alimentos
Comissão Examinadora:
________________________________________________________________ Profª Drª Adriana Zerlotti Mercadante (Orientadora)
Faculdade de Engenharia de Alimentos – UNICAMP
________________________________________________________________ Profª Drª Juliana Azevedo Lima Pallone (Membro Titular)
Faculdade de Engenharia de Alimentos – UNICAMP
________________________________________________________________ Profª Drª Lilian Regina Barros Mariutti (Membro Titular)
Faculdade de Engenharia de Alimentos – UNICAMP
________________________________________________________________ Prof. Dr. Rodrigo Rocha Latado (Membro Titular)
Instituto Agronômico de Campinas
________________________________________________________________ Profª Drª Solange Guidolin Canniatti Brazaca (Membro Titular)
Departamento de Agroindústria, Alimentos e Nutrição – ESALQ, USP
________________________________________________________________ Profª Drª Flavia Maria Netto (Membro Suplente)
Faculdade de Engenharia de Alimentos – UNICAMP
________________________________________________________________ Profª Drª Neuza Mariko Aymoto Hassimotto (Membro Suplente)
Faculdade de Ciências Farmacêuticas – USP
________________________________________________________________ Profª Drª Veridiana Vera de Rosso (Membro Suplente)
Departamento de Biociências – UNIFESP
A Ata de Defesa, assinada pelos membros da Comissão Examinadora, encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
AGRADECIMENTO
À minha orientadora, Profª Drª Adriana Zerlotti Mercadante, pelos conhecimentos repassados, pelo exemplo de profissionalismo e caráter e pela amizade ao longo desses quatro anos. À Unicamp, em particular, ao corpo docente e funcionários da Faculdade de Engenharia de Alimentos pela contribuição indispensável. Aos colegas e funcionários do Laboratório de Química de Alimentos, pelo agradável convívio diário e pela troca de experiências. Levarei para sempre a recordação.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo, pelos quatro anos de bolsa concedida.
Ao Centro de Citricultura Sylvio Moreira, em especial ao Dr. Rodrigo Rocha Latado, pela parceira formada e pelo fornecimento das amostras.
À banca examinadora pela disponibilidade, atenção e sugestões.
À Universidade Federal do Rio Grande, pela formação profissional. Aos professores do curso Engenharia de Alimentos e da Pós-Graduação em Engenharia e Ciência de Alimentos da FURG por contribuírem na construção do alicerce que me permitiu chegar até aqui. Em especial, agradeço às professoras Eliana Badiale Furlong e Maria Isabel Queiroz, por quem tenho grande admiração e considero exemplo de dedicação e amor à profissão.
Às pessoas mais importantes da minha vida, minha família. Pela torcida e vibração nas conquistas e pela constante presença nas dificuldades. Pelo amor sem medida, dedicação, confiança, conselhos, orações e muitas vezes até renúncias. A distância que nos separa já há alguns anos é compensada pela alegria de cada reencontro. Ao meu namorado Leonardo, acima de tudo grande amigo, pelo amor demonstrado em cada pequeno gesto, e, principalmente, por toda a ajuda e suporte emocional no final deste ciclo. Não tenho palavras para agradecer! Aos amigos que fizeram parte da minha caminhada até aqui. Obrigada por estarem sempre presentes e compartilhando comigo todos os momentos. Amo vocês!
Enfim, a todos que tiveram alguma participação na conclusão deste trabalho, ou que pelo fato de conviverem comigo, contribuíram com o meu crescimento pessoal ou profissional, o meu mais sincero muito obrigada.
Agradeço a Deus, acima de tudo, pela vida concedida, pelas oportunidades e pelas pessoas especiais que colocou em meu caminho.
RESUMO
Os carotenoides, responsáveis pela cor da maioria dos citros, apresentam importantes ações biológicas em humanos e podem estar presentes tanto na forma livre ou esterificados com ácidos graxos em frutas. Portanto, é necessário determinar a composição nativa de carotenoides nos alimentos, pois esta é a forma como os mesmos são ingeridos. Também é fundamental determinar a fração destes compostos que será absorvida e estará apta a realizar a sua função bioativa. No presente estudo, foram investigados os carotenoides em diferentes cultivares de citros, envolvendo aspectos relacionados à composição, mudanças durante o amadurecimento e bioacessibilidade. Em alguns estudos, a manga foi utilizada como parâmetro de comparação com os citros devido à sua composição de carotenoides simples e bem estabelecida na literatura. Foi desenvolvido um novo método de extração de carotenoides de polpa liofilizada de citros a partir de agitação magnética. Os solventes utilizados foram acetato de etila e metanol, com adição de carbonato de sódio e a transferência líquido-líquido foi realizada em centrífuga. Este método é mais rápido que o usualmente empregado no laboratório, exato, preciso e foi aplicado com sucesso para a determinação da composição de carotenoides de laranja cv. ‘Valencia’ e de manga. Este método foi aplicado também para analisar os carotenoides em tangor cv. ‘Murcott’, laranja cv. ‘Pera’, e novos híbridos entre estas cultivares, em diferentes estádios de maturação. Os híbridos foram desenvolvidos pelo Instituto Agronômico de Campinas a fim de ampliar do número de variedades, visando contornar perdas econômicas causadas por problemas fitossanitários e aliando resistências de tangerinas e laranjas a diferentes doenças. Os híbridos apresentaram coloração mais intensa que o parental laranja cv. ‘Pera’, sendo, mais apropriados para a utilização pela indústria de suco e consumo in natura, além de maiores valores de pró-vitamina A. Como resultado da intensa biossíntese de carotenoides durante o amadurecimento, houve aumento no teor de carotenoides da polpa em todas as amostras, bem como alterações características na cor da casca e da polpa. A composição nativa de carotenoides em laranjas cvs. ‘Valencia’ e ‘Pera’, tangor cv. ‘Murcott’ e manga foi determinada neste trabalho, sendo que muitos compostos foram identificados pela primeira vez nessas amostras. Nas cultivares de laranja foram identificados 9 carotenoides livres, 38 monoésteres e 60 diésteres, sendo que os derivados de violaxantina, luteoxantina e anteraxantina foram os majoritários. Em tangor, foram identificados 8 carotenoides livres, 34 monoésteres e 33 diésteres, sendo que os ésteres de β-criptoxantina e violaxantina foram os majoritários. Em citros, os carotenoides estão esterificados principalmente com ácido cáprico, láurico, mirístico, palmítico e oleico. Em manga foram identificados 5 carotenoides livres, 2 monoésteres e 19 diésteres. Por fim, a composição e a bioacessibilidade de carotenoides (carotenos, xantofilas livres e esterificadas) foram determinadas pela primeira vez em tangerinas cultivadas no Brasil. Diferenças entre as variedades tanto no conteúdo de carotenoides, quanto no composto majoritário foram observadas A bioacessibiliade variou de 11 a 41%, dependendo do cultivar e da polaridade dos carotenoides. A bioacessibilidade da (all-E)-β-criptoxantina livre foi maior em relação aos seus ésteres e ao (all-E)-β-caroteno.
ABSTRACT
Carotenoids are responsible for the color from most citrus cultivars. Besides color properties, they also show important biological actions in humans. Carotenoids are present in both free form and esterified with fatty acids in fruits; therefore, determination of the native composition of carotenoids in meals is necessary, since this is the actual form they are ingested. Along with carotenoid composition of foods, knowledge about the amount of carotenoid that will be absorbed and available to play their bioactive function is also important. In this study, carotenoids from different citrus cultivars were investigated for composition, changes during ripening and bioaccessibility. In some studies, mango was employed for comparison with citrus due to its simple and well-established carotenoid composition. Herein, a new method for carotenoid extraction and analysis in freeze-dried citrus pulp was developed. Carotenoids were extracted by magnetic stirring with ethyl acetate and methanol, and sodium carbonate was added previously to extraction. Liquid-liquid partition was carried out in centrifuge. The developed method is accurate, precise, faster than the maceration with mortar and pestle traditionally employed for carotenoid extraction, and was successfully applied to determine carotenoid composition of orange cv. ‘Valencia’ and mango. This developed method was also employed for carotenoid analysis in tangor cv. ‘Murcott’, orange cv. ‘Pera’ and new hybrids between these cultivars, in different ripening stages. The hybrids were developed by the Agronomic Institute of Campinas to overcome economic losses caused by phytosanitary disorders of citrus, by increasing the number of citrus cultivars and combining resistance of mandarins and orange against different diseases. All hybrids showed higher provitamin A content and more appropriate colors for juice industry as well as for in natura consumption compared with the parental orange cv. ‘Pera’. Moreover, as a result of the intense carotenoid biosynthesis during ripening, an increase in the carotenoid contents in pulp was observed in all citrus samples, as well as characteristic alterations in peel and pulp colors. Native carotenoid composition of carotenoids in orange cvs. ‘Valencia’ and ‘Pera’, tangor cv. ‘Murcott’ and mango was also determined, and most compounds were reported for the first time in these samples. In orange cultivars, 9 free carotenoids, 38 monoesters and 60 diesters were identified, and the major compounds were violaxanthin, luteoxanthin and antheraxanthin derivatives. In tangor, 8 free carotenoids, 34 monoesters and 33 diesters were identified, and β-cryptoxanthin and violaxanthin esters were the major compounds. In citrus samples, carotenoids were esterified mainly with lauric, myristic, palmitic, palmitoleic and oleic acids. In mango, 5 free carotenoids, 2 monoesters and 19 diesters were identified. Finally, the composition and bioaccessibility of carotenoids (carotenes, free and esterified xanthophylls) were determined for the first time in mandarin cultivars harvested in Brazil. Differences in the carotenoid content and the major compound were observed among cultivars. Bioaccessibility of carotenoids ranged from 11% to 41% and was influenced by mandarin cultivar and carotenoid polarity. Bioaccessibility of (all-E)-β-cryptoxanthin was higher than that of its esters and that of (all-E)-β-carotene in all the cultivars.
SUMÁRIO CAPITULO I
INTRODUÇÃO GERAL E OBJETIVOS
1. INTRODUÇÃO GERAL ... 13
2. OBJETIVOS ... 15
3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 16
CAPITULO II REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 1. Citrus: origem e classificação botânica ... 20
2. Citricultura brasileira ... 21
3. Carotenoides ... 22
4. Biossíntese de carotenoides ... 25
5. Carotenoides em laranja e tangerina ... 28
5.1 Extrato saponificado ... 28
5.2 Extrato não saponificado ... 31
6. Relação entre carotenoides e cor ... 34
7. Biodisponibilidade e bioacessibilidade de carotenoides ... 36
8. Referências Bibliográficas ... 38
CAPITULO III New method for carotenoid extraction and analysis by HPLC-DAD-MS/MS in freeze-dried citrus and mango ABSTRACT ... 48 INTRODUCTION ... 49 EXPERIMENTAL ... 50 Chemicals ... 50 Samples ... 51 Method development ... 51 Extraction ... 51 Liquid-liquid partition ... 52
Total carotenoid quantification by UV/vis ... 53
Saponification ... 53
HPLC-DAD-MS/MS analysis ... 53
Method validation ... 54
Statistical analysis ... 55
RESULTS AND DISCUSSION... 55
Evaluation of pre-chromatographic steps for carotenoid analysis: extraction and liquid-liquid partition ... 55
Method validation ... 58
New method for carotenoid extraction and liquid-liquid transference of lyophilized orange pulp ... 60
Identification of carotenoids in the saponified extract from pulp of orange
cv. ‘Valencia’ and mango cv. ‘Tommy Atkins’ ... 61
ACKNOWLEDGEMENTS ... 67
REFERENCES ... 67
CAPITULO IV Evolução do acúmulo de carotenoides e dos parâmetros de qualidade durante o amadurecimento em novos híbridos interespecíficos entre tangor cv. ‘Murcott’ e laranja cv. ‘Pera’ Resumo ... 74
1. Introdução ... 75
2. Material e métodos ... 76
2.1 Reagentes... 76
2.2 Amostras ... 76
2.3 Determinação da cor da casca e do suco ... 77
2.4 Análise de carotenoides ... 78
2.4.1 Extração ... 78
2.4.2 Saponificação ... 78
2.4.3 Determinação dos carotenoides totais por espectrofotometria no UV/visível ... 78
2.4.4 Análise por HPLC-DAD-MS/MS ... 79
2.5 Análise estatística ... 80
3. Resultados e discussão ... 80
3.1 Caracterízação das amostras ... 80
3.2 Cor da casca ... 84
3.3 Acúmulo de carotenoides e variação da cor da polpa durante o amadurecimento ... 86
3.3.1 Identificação dos carotenoides ... 86
3.3.2 Teores de carotenoides em TM, LP e seus híbridos ... 93
3.3.3 Cor do suco de TM, LP e seus híbridos ... 98
4. Conclusão ... 102
Referências bibliográficas ... 103
CAPITULO V Composition by LC-MS/MS of new carotenoid esters in mango and citrus INTRODUCTION ... 113
MATERIALS AND METHODS ... 121
Materials ... 121
Samples ... 121
Carotenoid Extraction ... 121
HPLC-DAD-MS/MS Analysis ... 121
RESULTS AND DISCUSSION ... 121
MS Fragmentation Pattern of Carotenoid Esters ... 121
Carotenoid and Carotenoid Ester Composition of Mango and Citrus ... 127
Free Xanthophylls in Mango and Citrus ... 127
Carotenes ... 127
Carotenoid Esters ... 127
REFERENCES ... 129
CAPITULO VI Carotenoids and their esters in pulp of three mandarin cultivars: composition and bioaccessibility Abstract ... 132
1. Introduction ... 133
2. Material and Methods ... 135
2.1 Chemicals ... 135
2.2 Samples ... 135
2.3 Bioaccessibility assay ... 136
2.4 Carotenoid analysis ... 136
2.4.1 Carotenoid extraction from mandarin pulp... 136
2.4.2 Carotenoid extraction from the supernatant containing the micellar fraction ... 136
2.4.3 Separation, identification and quantification by HPLC-DAD-MS/MS ... 137
2.4.5 Bioaccessibility calculation ... 138
2.5 Statistics... 138
3. Results and Discussion ... 138
3.1 Carotenoid composition in mandarin ... 138
3.2 Carotenoid composition in the supernatant resultant from the in vitro digestion ... 141
3.3 Carotenoid bioaccessibility in mandarin ... 144
References ... 149 CAPITULO VII DISCUSSÃO GERAL ... 159 CAPITULO VIII CONCLUSÃO GERAL ... 164 CAPITULO IX REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 167 CAPITULO X ANEXO ... 183
CAPITULO I
1. INTRODUÇÃO GERAL
O Brasil é responsável por 60% da produção mundial de suco de laranja, que é o principal produto da citricultura brasileira, e as suas exportações renderam US$ 860 milhões ao país no período de janeiro a maio de 2016 (Mapa, 2016). O principal parque citrícola brasileiro contempla os Estados de São Paulo, com mais de 300 municípios dedicados à produção de laranja, e alguns municípios de Minas Gerais (Neves et al., 2010). A safra brasileira de laranja 2016/17 foi estimada em 244 milhões de caixas de 40,8 Kg (Fundecitros, 2017). A produção de tangerinas no Brasil é bem menos expressiva, sendo que o país é responsável por cerca de 3,5% da produção mundial (IEA, 2016).
Apesar da sua importância para a economia nacional, a citricultura brasileira está baseada em um baixo número de variedades, o que contribui para a sua vulnerabilidade frente a problemas fitossanitários. As perdas agronômicas e econômicas irreversíveis devido à ocorrência de problemas fitossanitários, entre outros motivos, resultaram em queda de aproximadamente 38% no número de citricultores paulistas no período compreendido entre 2010-2013 (Conab, 2013).
A ampliação do número de variedades com potencial para utilização em plantios comerciais tem sido responsabilidade do Instituto Agronômico de Campinas (IAC), através do Centro APTA Citros Sylvio Moreira. Os pesquisadores deste Instituto vêm constantemente avaliando e ampliando os acessos contidos em seu Banco Ativo de Germoplasma de Citros. Desde 1997, o Centro APTA Citros Sylvio Moreira/IAC realiza também melhoramento genético de citros via cruzamentos dirigidos. Novos híbridos entre tangor (Citrus reticulata x Citrus sinensis) cv. ‘Murcott’ e laranja (Citrus sinensis) cv. ‘Pera’ têm sido obtidos pelo IAC, por meio de cruzamentos controlados, com o objetivo de ampliar a oferta de variedades cítricas para uso industrial (produção de suco) e para o consumo como fruta in natura. As novas variedades se encontram em fase de avaliação agronômica e de qualidade de frutos e de suco.
A polpa da grande maioria das variedades de laranja e tangerina apresenta coloração característica que varia do amarelo ao vermelho, devido à presença de carotenoides (Mercadante, 2008). Os carotenoides possuem um extenso cromóforo constituído por ligações duplas conjugadas, gerando um sistema de elétrons π que se desloca sobre toda a cadeia poliênica, proporcionando a estes compostos alta reatividade química e absorção de luz na região do visível (Britton, 1995a). Os
carotenoides são classificados em dois grupos: xantofilas, que apresentam grupos funcionais contendo oxigênio (epóxido, hidroxila e cetona, por exemplo), e carotenos, que são constituídos apenas por carbono e hidrogênio (Strain, 1938).
Além da função corante, os carotenoides quando consumidos também apresentam importantes atividades biológicas. Animais não são capazes de sintetizar os carotenoides de novo, porém são capazes de metabolizar alguns deles em vitamina A (retinol), um nutriente essencial ao corpo humano (Maiani et al., 2009; Fernandez-García et al., 2012). Além disso, estudos epidemiológicos têm associado o consumo de dietas ricas em carotenoides com a redução da incidência de doenças crônico-degenerativas, tais como câncer, doenças cardiovasculares, degeneração macular e formação de cataratas (Meyers et al., 2014; Sharoni et al., 2012).
Os carotenoides estão naturalmente presentes em frutas na forma livre ou esterificados com diferentes ácidos graxos. No entanto, durante a análise de carotenoides, é comum a realização de uma etapa de saponificação do extrato, a fim de remover compostos interferentes como triacilgliceróis e clorofilas. Esta etapa também provoca a hidrólise da ligação éster, e a informação sobre a composição dos carotenoides na sua forma nativa (livres ou esterificados) é perdida (Mercadante et al., 2016).
A composição de carotenoides de citros é considerada complexa, pois apresenta um grande número de carotenoides, 58 carotenoides no extrato saponificado (Gross et al., 1971) e até 62 no extrato não saponificado (Dugo et al., 2008). A composição de carotenoides do extrato saponificado de laranja já foi extensamente reportada na literatura (Carmona et al., 2012; Stinco et al., 2012; Plaza et al., 2011; Fanciullino et al., 2008; Agócs et al., 2007; Meléndez-Martínez et al., 2007b; Gama & Sylos, 2005; Meléndez-Martínez et al., 2005a; Meléndez-Martínez et al., 2005b; Schlatterer et al., 2005; Kato et al., 2004; Rodrigo et al., 2004), porém a composição nativa de frutas cítricas tem sido estudada por apenas um grupo italiano (Giuffrida et al., 2010, Dugo et al., 2009; Dugo et al., 2008). Além disso, não há na literatura um método rápido e de consenso para determinação da composição de carotenoides em citros. Por outro lado, a composição de carotenoides de manga é simples e bem-estabelecida na literatura, e é caracterizada pela presença de epóxi-carotenoids, principalmente violaxantina and (9Z)-violaxantina, além de (all-E)-β-caroteno (Mercadante et al., 1997). Além disso, a manga é uma das culturas de frutas tropicais mais importantes economicamente a nível mundial (FAO, 2017).
Apesar de não alterar as propriedades do cromóforo da molécula do carotenoide, a esterificação das xantofilas com ácidos graxos modifica a polaridade, e, portanto, a solubilidade, além de influenciar a termoestabilidade, localização dos carotenoides nas micelas e consequentemente, a sua bioacessibilidade (Pérez-Gálvez & Mínguez-Mosquera, 2005).
Conhecer a bioacessibilidade de um nutriente ou composto bioativo é de grande importância prática, visto que ela corresponde à fração que está disponível para absorção após o processo digestivo, e, por sua vez poderá ser utilizada ou armazenada pelo corpo (Fernández-García et al., 2012). Estudos têm demonstrado que a composição de carotenoides do alimento ingerido (carotenos x xantofilas x ésteres de carotenoides), a composição da matriz (presença de gordura ou fibras, por exemplo) e processamento (alta pressão e tratamento térmico) podem afetar a bioacessibilidade de carotenoides (Ryan et al., 2008; Palafox-Carlos et al., 2011; Courraud et al., 2013; Verrijssen et al., 2014; Xavier et al., 2014).
Assim como para a composição de ésteres de carotenoides em citros, poucos trabalhos tratam da bioacessibilidade dos carotenoides nessas matrizes. Nesse sentido, tanto o estudo da composição nativa de carotenoides nos extratos não saponificados, bem como da bioacessibilidade in vitro de carotenoides e seus ésteres em citros são necessários para avaliar a fração de carotenoides ingeridos que está apta a ser absorvida e realizar sua função bioativa. A análise de extratos não saponificados de carotenoides em citros pode ser considerada um desafio, não apenas pela complexidade da matriz, mas também pela existência de poucos padrões de ésteres de carotenoides disponíveis comercialmente, levando ao pequeno número de estudos existente na literatura. Desta forma, é imprescindível a utilização de cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a detectores de UV/vis e de massas para a separação, identificação e quantificação destes compostos.
2. OBJETIVOS
Diante do exposto, este estudo apresenta os seguintes objetivos:
1) Desenvolver e validar um novo método de extração de carotenoides de polpa liofilizada de citros, e aplicar este método para analisar os carotenoides de laranja e manga.
2) Monitorar o perfil de carotenoides, a cor e parâmetros de qualidade (tamanho e massa dos frutos, sólidos solúveis totais e acidez) de frutos de 5 variedades híbridas entre tangor cv. ‘Murcott’ e laranja cv. ‘Pera’, e de seus parentais, em diferentes estádios de maturação.
3) Identificar carotenoides e ésteres de carotenoides de diferentes variedades de citros e manga.
4) Determinar a composição e a bioacessibilidade de carotenoides e ésteres de carotenoides de diferentes variedades de tangerinas.
3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Agócs, A., Nagy, V., Szabó, Z., Márk, L., Ohmacht, R., & Deli, J. (2007). Comparative study on the carotenoid composition of the peel and the pulp of different citrus species. Innovative Food Science and Emerging Technologies, 8, 390–394.
Britton, G. (1995a). Carotenoids: Spectroscopy. In G. Britton, S. Liaaen-Jensen, & H. Pfander (Eds.), UV/visible spectroscopy Basel: Birkhäuser, pp. 13–62.
Carmona, L., Zacarías, L., & Rodrigo, M.J. (2012). Stimulation of coloration and carotenoid biosynthesis during postharvest storage of ‘Navelina’ orange fruit at 12°C. Postharvest Biology and Technology, 74, 108-117.
Conab, 2013. Acompanhamento da safra brasileira de laranja. Safra 2013/14. Terceiro Levantamento - São Paulo e Triângulo Mineiro Dezembro/2013. ISSN 2318-793X. Courraud, J., Berger, J., Cristol, J-P. & Avallone, S. (2013). Stability and bioaccessibility of different forms of carotenoids and vitamin A during in vitro digestion. Food Chemistry, 136, 871-877.
Dugo, P., Giuffrida, D., Herrero, M., Donato, P., & Mondello, L. (2009). Epoxycarotenoids esters analysis in intact orange juices using two-dimensional comprehensive liquid chromatography. Journal of Separation Science, 32, 973–980. Dugo, P., Herrero, M., Giuffrida, D., Ragonese, C., Dugo, G., & Mondello, L. (2008). Analysis of native carotenoid composition in orange juice using C30 columns in tandem. Journal of Separation Science, 31, 2151-2160.
Fanciullino, A.L., Cercós, M., Dhuique-Mayer, C., Froelicher, Y., Talón, M., Ollitrault, P., & Morillon, R. (2008). Changes in carotenoid content and biosynthetic gene expression in juice sacs of four orange varieties (Citrus sinensis) differing in flesh fruit color. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 56, 3628–3638.
FAO 2017. Available from <http://www.fao.org/docrep/006/y5143e/y5143e1a.htm> Acessed February 19, 2017.
Fernández-García, E., Carvajal-Lérida, I., Jarén-Galán, M., Garrido-Fernández, J., Pérez-Gálvez, A. & Hornero-Méndez, D. (2012). Carotenoids bioavailability from foods: From plant pigments to efficient biological activities. Food Research International, 46, 438-450.
Fundecitros, 2017. Orange production forecast upadte for the 2016-2017 season of São Paulo and west-southwest of Minas Gerais citrus belt – February/2017 forecast. Disponível em: <http://www.fundecitrus.com.br/pes/estimative> Acesso em 20 de fevereiro de 2017.
Gama, J.J.T., & Sylos, C.M. (2005). Major carotenoid composition of Brazilian Valencia orange juice: Identification and quantification by HPLC. Food Research International, 38, 899–903.
Giuffrida, D., Dugo, P., Salvo, A., Saitta, M., & Dugo, G. (2010). Free carotenoid and carotenoid ester composition in native orange juices of different varieties. Fruits, 65, 277-284.
Gross, J., Gabai, M., & Ufshitz, A. (1971). Carotenoids in juice of Shamouti Orange. Journal of Food Science, 36, 466-473.
Kato, M., Ikoma, Y., Matsumoto, H., Sugiura, M., Hyodo, H. & Yano, M. (2004) Accumulation of carotenoids and expression of carotenoid biosynthetic genes during maturation in citrus fruit. Plant Physiology, 134, 824–837.
Maiani, G., Castrón, M.J.P., Castata, G., Toti, E., Cambrodón, I.G., Busted, A., Granado-Lorencio, F., Olmedilla-Alonso, B., Knuthsen, P., Valoti, M., Bohn, V., Mayer-Miebach, E., Behsnillian, D., & Schlemmer, U. (2009). Carotenoids: actual knowledge on food sources, intakes, stability and bioavailability and their protective role in humans. Molecular Nutrition and Food Research, 53, S194-S218.
Mapa, 2016. Disponível em: <http://www.agricultura.gov.br/vegetal/culturas/citrus > Acesso em novembro de 2016.
Meléndez-Martínez, A.J., Britton, G., Vicario, I.M., & Heredia, F.J. (2007a). Relationship between the colour and the chemical structure of carotenoid pigments. Food Chemistry, 101, 1145-1150.
Meléndez-Martínez, A.J., Britton, G., Vicario, I.M., Heredia, F.J. (2005b). Identification of zeinoxanthin in orange juices. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 53, 6362-6367.
Meléndez-Martínez, A.J., Vicario, I.M., Heredia, F.J. (2007b). Carotenoids, Color, and Ascorbic Acid Content of a Novel Frozen-Marketed Orange Juice. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 55, 1347-1355.
Mercadante, A.Z. (2008). Food Colorants – Chemical and Functional Properties. In C. Socaciu (Ed.), Carotenoids in Foods: Sources and Stability during Processing and Storage. New York: CRC Press, pp. 213–235.
Mercadante, A.Z., Rodrigues, D.B. Petry, F.C., & Mariutti, L.R.B. (2016). Carotenoid esters in foods - A review and practical directions on analysis and occurrence. Food Research International, In Press. DOI: 10.1016/j.foodres.2016.12.018.
Mercadante, A.Z., Rodriguez-Amaya, D.B., & Britton, G. (1997). HPLC and mass spectrometric analysis of carotenoids from mango. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 45, 120−123.
Meyers, K.J., Mares, J.A., Igo, R.P., Truitt, B., Liu, Z., Millen, A.E., Klein, M., Johnson, E.J., Engelman, C.D., Karki, C.K., Blodi, B., Gehrs, K., Tinker, L., Wallace, R., Robinson, J., LeBlanc, E.S., Sarto, G., Bernstein, P.S., SanGiovanni, J.P., & Iyengar, S.K. (2014). Genetic evidence for role of carotenoids in age-related macular degeneration in the carotenoids in age-related eye disease study (CAREDS). Investigative Ophthalmology & Visual Science, 55(1), 587–599.
Neves, M.F., Trombin, V.G., Milan, P., Lopes, F.F., Pereira, F.C., & Kalaki, R.B. (2010). O retrato da citricultura brasileira. Ribeirão Preto: Editora Marcos Fava Neves, p.137. Palafox-Carlos, H., Ayala-Zavala, J.F. & González-Aguilar, G.A. (2011). The Role of Dietary Fiber in the Bioaccessibility and Bioavailability of Fruit and Vegetable Antioxidants. Journal of Food Science, 76, R6–R15.
Pérez-Gálvez, A., & Mínguez-Mosquera, M.I. (2005). Esterification of xanthophylls and its effect on chemical behavior and bioavailability of carotenoids in the human. Nutrition Research, 25, 631-640.
Plaza, L., Crespo, I., Pascual-Teresa, S., Ancos, B., Sánchez-Moreno, C., Muñoz, M., & Cano, M.P. (2011). Impact of minimal processing on orange bioactive compounds during refrigerated storage. Food Chemistry, 124, 646–651.
Rodrigo, M.J., Marcos, J.F., & Zacarias, L. (2004). Biochemical and molecular analysis of carotenoid biosynthesis in flavedo of orange (citrus sinensis l.) during fruit development and maturation. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52, 6724-6731.
Ryan, L., O’connell, O., O’sullivan, L., Aherne, S.A. & O’brien, N.M. (2008). Micellarisation of carotenoids from raw and cooked vegetables. Plant Foods for Human Nutrition, 63, 127-133.
Schlatterer, J., & Breithaupt, D.E. (2005). Cryptoxanthin structural isomers in oranges, orange juice, and other fruits. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 53, 6355−6361.
Sharoni, Y., Linnewiel-Hermoni, K., Khanin, M., Salman, H., Veprik, A., Danilenko, M., & Levy, J. (2012). Carotenoids and apocarotenoids in cellular signaling related to cancer: A review. Molecular Nutrition & Food Research, 56(2), 259–269.
Stinco, C.M., Fernández-Vázquez, R., Escudero-Gilete, M.L., H, F.J., Meléndez-Martínez, A.J., & Vicario, I.M. (2012). Effect of orange juice’s processing on the color, particle size, and bioaccessibility of carotenoids. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 60, 1447−1455.
Strain, H.H. (1938). Leaf xanthophylls. Carnegie Institution of Washington.147p. Verrijssen, T.A.J., Balduyck, L.G., Christiaens, S., Van Loey, A.M., Van Buggenhout, S. & Hendrickx, M.E. (2014). The effect of pectin concentration and degree of methyl-esterification on the in vitro bioaccessibility of β-carotene-enriched emulsions. Food Research International, 57, 71–78.
Xavier, A.A.O., Mercadante, A.Z., Garrido-Fernández, J. & Pérez-Gálvez, A. (2014). Fat content affects bioaccessibility and efficiency of enzymatic hydrolysis of lutein esters added to milk and yogurt. Food Research International, 65, 171-176.
CAPITULO II
1. Citrus: origem e classificação botânica
O gênero Citrus, que contém algumas das principais frutas cultivadas no mundo, pertence à família Rutaceae. Não há consenso sobre o número exato de espécies naturais pertencentes ao gênero Citrus, porém a classificação que tem sido mais utilizada é o sistema Swingle (Swingle & Reece, 1967) que reconhece 16 espécies, agrupadas em dois subgêneros: Citrus, contendo 10 espécies, onde estão incluídas laranja, tangerina e limão, por exemplo, e gênero Papeda, contendo 6 espécies. Outro sistema de classificação bastante aceito é o proposto por Tanaka (1977), que reconhece 162 espécies, distribuídas em diversas seções, dentro de dois subgêneros: Archicitrus e Metacitrus. Enquanto que Swingle considera muitos dos representantes do grupo Citrus como híbridos, Tanaka os considera como espécies verdadeiras. A dificuldade de classificar as espécies de Citrus é principalmente devido a possibilidade de realizar repetidas polinizações cruzadas e ao fenômeno conhecido como embrionia nuclear adventícia, que estabiliza e perpetua os táxons híbridos (Scora, 1975). Além disso, também não há consenso sobre qual o grau de diferença que justifica a atribuição de uma nova espécie (Roose et al., 1995). Além destas, existem ainda outras classificações propostas, porém menos utilizadas.
A origem exata do gênero Citrus e gêneros correlatos é controversa, mas acredita-se que tenha ocorrido em regiões subtropicais e tropicais do continente Asiático e Arquipélagos Malaios (Webber, 1967). Evidências científicas indicam que tangerina, toranja e cidra sejam os ancestrais do gênero Citrus de onde todas as demais espécies evoluíram (Barkley et al., 2006; Frederici et al., 1998; Barret & Rhodes, 1976). A propagação de citros para o norte da África e Sul da Europa foi gradual, motivada pelo comércio entre as nações e as guerras durante a Idade Média. Já a sua introdução no continente americano foi realizada pelos europeus, sendo que os primeiros pomares surgiram na Flórida e na Califórnia por volta de 1655 e 1769, respectivamente. Desde então, a produção, processamento e comércio global de citros aumentou significativamente, colocando-os entre as principais frutas no mundo (Ramana et al.,1981).
Atualmente variedades do gênero Citrus são cultivadas em diversas regiões do mundo em mais de 140 países. No entanto, a maior parte da produção se concentra em regiões tropicais e subtropicais (Ramana et al., 1981). A laranja doce (Citrus sinensis) é a espécie do gênero Citrus mais cultivada mundialmente, seguido
de tangerina (Citrus reticulata), limão (Citrus limon), lima (Citrus aurantifolia), pomelo (Citrus paradisi) e toranja (Citrus grandis) (USDA, 2016).
2. Citricultura brasileira
O Brasil é responsável por 60% da produção mundial de suco de laranja e é o maior exportador mundial deste produto. A safra brasileira de laranja 2016/17 foi estimada em 244 milhões de caixas de 40,8 Kg, sendo que as cultivares Valencia, Valencia Folha Murcha e Pera Rio foram responsáveis pelos maiores volumes de produção (Fundecitrus, 2017). Grande parte da produção nacional de laranja é destinada à elaboração de sucos industrializados e, entre janeiro e maio de 2016, as exportações deste produto renderam US$ 860 milhões ao país (Mapa, 2016). Em contrapartida, a proporção de frutas destinadas ao consumo in natura, que representava 24% em 1995 caiu para 14% em 2009 (Neves et al., 2010). A baixa proporção de frutos destinada ao consumo in natura está relacionada principalmente à utilização de variedades mais apropriadas ao processamento, bem como à qualidade dos frutos produzidos (Spósito & Bassanezi, 2002). Para reverter este quadro, é necessário que o setor invista em novas tecnologias e materiais, utilizando mudas de melhor qualidade e novos materiais genéticos específicos para a produção e comercialização como fruta fresca.
O cultivo de tangerina vem crescendo e ganhando mercado nos últimos anos, e a sua produção mundial é liderada pela China (50,3%). O Brasil é responsável por somente cerca de 3,5% da produção mundial de tangerina. Os principais pomares de tangerina no Brasil se localizam nos Estados do Sul e Sudeste, e diferentemente da laranja, a sua produção atualmente está voltada principalmente para o consumo in natura e visa atender ao mercado interno (IEA, 2016).
Um dos maiores problemas enfrentados pela citricultura brasileira são as perdas agronômicas e econômicas decorrentes de problemas fitossanitários. A vulnerabilidade dos citros a pragas e doenças se deve principalmente ao cultivo de um número reduzido de variedades, com estreita base genética, em grandes extensões de área (Neves, 2010). O melhoramento genético, que além da produção de materiais mais produtivos, via hibridização e uso de modernas técnicas de biotecnologia, envolve também a introdução e seleção de genótipos superiores,
adaptados às diferentes condições edafoclimáticas e resistentes a doenças (Agência Fapesp, 2016).
A coleção de germoplasma do Centro APTA Citros Sylvio Moreira/IAC, em Cordeirópolis-SP, é considerada a mais completa e diversificada no Brasil e dela se originou a maioria das variedades comerciais cultivadas atualmente no Estado de São Paulo. Além da exploração da grande diversidade do seu Banco de Germoplasma, e tendo em vista a importância de se ampliar o número de variedades existentes, como forma de superar problemas bióticos e abióticos da cultura, uma das metas do programa de melhoramento do Centro APTA Citros Sylvio Moreira/IAC têm sido a obtenção de híbridos de copas e o lançamento de novas variedades para serem utilizadas na citricultura paulista e brasileira. Estes cruzamentos têm como objetivos principais aliar a resistência das tangerinas às doenças Pinta preta, CVC e leprose, com a resistência da laranja à Mancha marrom de Alternaria.
Como resultados de experimentos de hibridação foram obtidos até o momento cerca de 1500 novas combinações de híbridos, sendo aproximadamente 340 híbridos entre laranja cv. ‘Pera’ e tangor cv. ‘Murcott’. Estas novas combinações híbridas estão sendo testadas numa rede experimental formada por cinco campos experimentais instalados no Estado de São Paulo e mais um localizado no Estado do Paraná. Os experimentos estão sendo conduzidos para avaliar tanto a resistência das plantas em campo à várias doenças, como as características de importância agronômica e àquelas relacionadas à qualidade da fruta de mesa e do suco (Agência FAPESP, 2013). Dentre os híbridos entre laranja cv. ‘Pera’ e tangor cv. ‘Murcott’ desenvolvidos no IAC, podem-se destacar três grupos distintos, em função das características dos frutos: os semelhantes ao parental materno (tangor cv. ‘Murcott’), os semelhantes ao parental paterno (laranja cv. ‘Pera’) e os que produzem frutos com características intermediárias ou sem semelhança com nenhum dos parentais.
3. Carotenoides
Estudos epidemiológicos têm associado o consumo de frutas e vegetais com a redução da incidência de doenças crônicas e degenerativas, incluindo problemas cardiovasculares e alguns tipos de câncer (Karppi et al., 2011; Voutilainen et al., 2006; Zhang et al., 2007). Um possível mecanismo que media este efeito protetor é atribuído às propriedades antioxidantes dos compostos bioativos presentes
em frutas e vegetais, que minimizariam os danos oxidativos in vivo induzidos por espécies reativas de oxigênio e nitrogênio (Woodall et al., 1997; Rock, 2009). Frutas e vegetais contêm uma gama de diferentes tipos de antioxidantes, tais como compostos fenólicos, ácido ascórbico e carotenoides.
Os carotenoides são um grupo de pigmentos naturais, lipossolúveis, bio-sintetizados por plantas superiores, algas e alguns micro-organismos, responsáveis pela coloração amarela, laranja ou vermelha de grande parte das frutas e vegetais (Britton, 1995b), incluindo os citros. No reino vegetal, os carotenoides são parte essencial do aparelho fotossintético, e sua função é captar energia e proteger as células contra o dano foto-oxidativo, além de atrair agentes polinizadores e dispersores de sementes através de sua cor. Além disso, alguns carotenoides também são precursores de hormônios vegetais (Matusova et al., 2005; Parry & Horgan, 1991).
A estrutura básica dos carotenoides consiste em um tetraterpeno com 40 átomos de carbono, constituídos por oito unidades de isopreno com simetria invertida no centro. Estas moléculas possuem uma série de ligações duplas conjugadas, que constitui o seu cromóforo, e que gera um sistema de ressonância de elétrons π que se desloca por toda a cadeia poliênica. Devido a esta característica estrutural, estes compostos são altamente reativos e absorvem luz na região visível do espectro eletromagnético (390-750 nm) (Mercadante et al., 2008). Assim, o cromóforo é responsável pela cor e pelas propriedades fotoprotetoras dos carotenoides. Os carotenoides podem ser classificados em dois grupos: xantofilas, que apresentam oxigênio como parte de um grupo funcional na molécula, e carotenos, que apresentam apenas a cadeia hidrocarbônica e não contêm grupos funcionais oxigenados. A adição de grupos polares (epóxido, hidroxila e cetona) altera a polaridade de carotenoides e afeta suas funções biológicas (Britton, 2008). Na Figura 1 podem ser observadas as estruturas da (all-E)-violaxantina (Figura 1A), uma xantofila que apresenta diferentes grupos funcionais oxigenados em sua estrutura (dois grupamentos hidroxila e dois grupamentos epóxido), e do (all-E)-β-caroteno (Figura 1B).
Figura 1. Estruturas químicas de carotenoides. (A) (all-E)-violaxantina e (B) (all-E)-β-caroteno.
Os seres humanos não sintetizam carotenoides, e, portanto, dependem da dieta para a sua obtenção. Em países desenvolvidos, 70-90% da ingestão de carotenoides é proveniente do consumo de frutas e vegetais, e dos mais de 50 carotenoides presentes em alimentos frequentemente consumidos, apenas alguns estão presentes em quantidades significativas no plasma sanguíneo humano, incluindo β-caroteno, α-caroteno, β-criptoxantina, luteína, zeaxantina e licopeno (Van den Berg et al., 2000).
Em um estudo realizado na Espanha, evidenciou-se que sete vegetais e cinco frutas, dentre os quais estão melancia, tangerina, laranja, cenoura e vegetais folhosos, contribuíram com 90% do consumo de carotenoides da população espanhola durante o período avaliado (Granado et al., 2007). Um estudo semelhante levando em conta a população brasileira revelou que no país a ingestão média de frutas e vegetais é baixa (Vargas-Murga et al., 2016). O mesmo estudo ainda indicou que os vegetais, principalmente saladas cruas, abóbora, couve e cenoura, contribuem mais para a ingestão de pró-vitamina A do que as frutas (70,3% contra 21,5%). Além disso, todos os alimentos considerados continham β-caroteno, sendo os teores mais expressivos fornecidos por couve, abóbora e manga. Já β-criptoxantina é obtida principalmente através do consumo de laranja, tangerina e mamão, enquanto o licopeno foi encontrado apenas em goiaba, melancia e tomate. Luteína é fornecida principalmente por vegetais (couve e alface crespa, entre outros), e entre as frutas banana, laranja e açaí se destacam como principais fontes de luteína. O aporte de violaxantina e neoxantina é principalmente devido a vegetais folhosos. Por fim, poucos alimentos são responsáveis pela ingestão de zeaxantina, entre eles laranja, manga,
salada de frutas (composta por maça, banana, mamão, laranja e abacaxi) e batata (Vargas-Murga et al., 2016).
Atualmente se sabe que as propriedades antioxidantes dos carotenoides estão intimamente relacionadas com a sua estrutura química, incluindo número de ligações duplas conjugadas, grupos terminais e substituintes oxigenados (El-Agamey et al., 2004). Além da propriedade antioxidante, alguns carotenoides agem como precursores da vitamina A (retinol), um nutriente essencial para a visão, manutenção das superfícies epiteliais, resposta imunológica, reprodução, desenvolvimento e crescimento embrionário (Olson, 1994). Menos de 10% dos carotenoides apresentam a estrutura requerida para agir como precursores da vitamina A, que consiste na presença de pelo menos um anel β-ionona não substituído. Dentre os carotenoides com atividade pró-vitamina A estão β-caroteno, β-criptoxantina e α-caroteno. Saini et al. (2015) destacaram ainda que os carotenoides têm um papel importante na diferenciação celular, metabolismo ósseo e apresentam ação anti-inflamatória. Além disso, nos alimentos, carotenoides também podem minimizar ou retardar a oxidação lipídica, aumentando a vida útil dos produtos (Choe & Min, 2006).
4. Biossíntese de carotenoides
A via biossintética de carotenoides, ilustrada na Figura 2, inicia-se com a condensação de duas moléculas de geranil-geranil difosfato (GGPP), para formar o carotenoide incolor fitoeno, em uma reação catalisada pela fitoeno-sintase (PSY). GGPP é também precursor de outros metabólitos, entre eles clorofilas e tocoferóis. O fitoeno passa por quatro reações sequenciais catalisadas por duas dessaturases e duas isomerases para formar licopeno: fitoeno-dessaturase (PDS), ζ-caroteno dessaturase (ZDS), carotenoide-isomerase (CRTISO) e ζ-caroteno isomerase (ZISO). Em seguida, ocorre a ciclização do licopeno pela ação das enzimas licopeno β-ciclase (LCYb) e licopeno ε-ciclase (LCYe), formando respectivamente δ-caroteno e γ-caroteno. Neste ponto há uma ramificação na via biossintética de carotenoides (Britton, 1998).
No primeiro ramo, LCYb atua nas duas extremidades do licopeno introduzindo um anel β-ionona a cada uma delas para formar β-caroteno. Já no outro ramo, há a participação de duas enzimas, LCYb e licopeno LCYe, que introduzem respectivamente um anel β-ionona e um anel ε-ionona no licopeno para formar
α-caroteno (Hirschberg, 2001; Bramley, 2002). O β-α-caroteno pode sofrer a adição de grupamento hidroxila, catalisada por uma hidroxilase (HYb) e formar β-criptoxantina, e subsequentemente zeaxantina (Britton, 1998). No outro ramo, α-caroteno ao sofrer uma hidroxilação (HYb) forma zeinoxantina, que pode ser então hidroxilada novamente (HYe), e formar luteína (Britton, 1998). Zeaxantina pode sofrer ainda epoxidação e formar anteraxantina, e subsequentemente violaxantina, através da ação da enzima zeaxantina epoxidase (ZEP) (Bouvier et al., 1996). Violaxantina pode ainda ser convertida à neoxantina pela ação da neoxantina sintase (NSY) (Bouvier et al., 2000).
Durante o desenvolvimento do fruto, ocorre acúmulo massivo de carotenoides concomitantemente à degradação de clorofilas. As variedades de tangerina acumulam preferencialmente β-criptoxantina no flavedo e nas vesículas de suco na fruta madura (Goodner et al., 2001; Ikoma et al., 2001), enquanto que cultivares de laranjas maduras acumulam preferencialmente isômeros de violaxantina, sendo o (9Z)-violaxantina em maior proporção (Molnár & Szabolcs, 1980; Lee & Castle, 2001).
De acordo com Kato et al. (2004), em tangerina cv. ‘Satsuma’ (cultivar que acumula β-criptoxantina), a expressão das enzimas PSY, PDS, ZDS, LCYb parece ser maior do que em laranja cv. ‘Valencia’ (variedade que acumula violaxantina). Enquanto isso, a expressão das enzimas HYb e ZEP, relacionadas com a síntese de xantofilas, costuma ser maior na cultivar de laranja. Além disso, outro fator importante seria a menor expressão associada a menor atividade da enzima HYb nas vesículas de suco da cultivar de tangerina em relação à cultivar de laranja. É interessante ressaltar que a HYb tem alta especificidade pelo β-caroteno, e, desse modo, o equilíbrio entre a alta expressão de genes que codificam enzimas de síntese do início da via (upstream) e menor expressão de HYb (alto fornecimento de β-caroteno e baixa atividade de HYb), leva ao acúmulo de β-criptoxantina nas vesículas de suco de tangerina. Por outro lado, nas vesículas de suco de laranja cv. ‘Valencia’, ocorre alta expressão de HYb juntamente com baixa expressão de genes que codificam enzimas do início da via biossintética de carotenoides, e, portanto, há baixa síntese de β-caroteno associado à alta atividade de HYb. Além disso, ocorre maior expressão da enzima ZEP nas vesículas de suco da laranja cv. ‘Valencia’ em comparação à tangerina cv. ‘Satsuma’, ocasionando rápida conversão de zeaxantina em violaxantina.
Figura 2. Biossíntese de carotenoides. Adaptado de Kato et al. (2004).
Uma particularidade que merece destaque é o acúmulo de licopeno em variedades de laranja de polpa vermelha. Este carotenoide não é usualmente encontrado nas variedades de laranja de polpa amarela (Lee, 2001). Além do licopeno, as variedades de polpa vermelha também acumulam teores incomuns de seus precursores (fitoeno e fitoflueno) e de β-caroteno (Lee, 2001; Xu et al., 2006). Acredita-se que este acúmulo diferencial de carotenoides ocorra devido à maior
expressão das enzimas PSY e PDS (up-regulation), associada com uma menor expressão da enzima LYC (down-regulation) (Fanciullino et al., 2008).
5. Carotenoides em laranja e tangerina
5.1 Extrato saponificado
Entre as diferentes espécies de citros, inclusive entre as mais importantes economicamente (laranja e tangerina), observa-se grande variabilidade na composição de carotenoides, tanto em termos quantitativos quanto qualitativos. Como já destacado, diversos estudos têm corroborado a presença majoritária de β-criptoxantina em tangerinas e produtos derivados, independentemente de outros fatores, como cultivar ou processamento. Desse modo, os teores de β-criptoxantina variam drasticamente entre diferentes espécies de citros, sendo bem maiores em todos os produtos de tangerina e relativamente baixos em produtos de laranja. Isso gera maior atividade provitamina A no suco de tangerina em relação ao suco de laranja. Nesse sentido, foi proposta a utilização deste carotenoide como fator discriminante para a classificação entre laranja, tangerina e híbridos (Goodner et al., 2001).
Lin & Chen (1995) determinaram através das técnicas de cromatografia em camada delgada (TLC) e cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) que β-criptoxantina e β-caroteno representam mais de 84% dos carotenoides presentes em suco de tangerina cv. ‘Ponkan’. Em estudo utilizando sucos de tangerina ultracongelados obtidos a partir de cultivos convencional e orgânico durante período de armazenamento de 145 dias, β-criptoxantina foi o carotenoide majoritário, seguido de luteína, zeaxantina e β-caroteno (Navarro et al., 2010). Além disso, todos os carotenoides apresentaram maiores concentrações nos sucos provenientes de tangerinas orgânicas. Após 145 dias de armazenamento, houve redução de 10% no teor de carotenoides das amostras (Navarro et al., 2010). Em tangerina cv. ‘Hernandina’ provenientes de cultivos convencional e orgânico, o carotenoide predominante foi β-criptoxantina (42,9%), seguido de cis-anteraxantina e anteraxantina (Beltrán-González et al., 2008).
Em relação à composição de carotenoides de laranjas, a presença majoritária de xantofilas já é reportada há muito tempo. Gross et al. (1971) isolaram
mais de 50 carotenoides no extrato saponificado de suco de laranja cv. 'Shamouti'. Além dos carotenoides comumente encontrados em citros, os autores identificaram γ-caroteno, rubixantina, sintaxantina e seu derivado hidroxilado, bem como luteína 5,6-epóxido, entre outros, e reforçaram que as xantofilas di-hidroxiladas representavam cerca de 70% do total de carotenoides desta variedade.
Em 1973, Stewart & Wheaton (1973) comprovaram que reticulataxantina e citranaxantina, carotenoides previamente reportados em laranja, eram na verdade artefatos formados a partir de β-citraurina e β-apo-8’-carotenal, respectivamente. Em meio básico, durante a reação de saponificação, grupos aldeídos e cetonas sofrem condensação aldólica na presença de traços de acetona.
Em 1977, violaxantina, anteraxantina e criptoxantina foram reportados como os carotenoides majoritários em cultivares de laranja (Hamlin, Pineapple e Valencia), tangerina cv. ‘Dancy’ e híbridos (Murcott, Orlando e Robinson) (Stewart, 1977). Neste estudo também foi destacada a diferença na atividade de vitamina A entre diferentes espécies de citros, sendo que os teores variaram de 80 unidades internacionais (UI) a 3195 UI em laranja cv. ‘Hamlin’ e tangor cv. ‘Murcott’, respectivamente. Em suco de laranja cv. ‘Liucheng’ foi reportado que neoxantina, violaxantina, luteína e anteraxantina representam cerca de 85% dos carotenoides (Lin & Chen, 1995).
Suco de laranja ultra congelado de laranja cv. ‘Valencia’, que é obtido a partir de processamento brando, onde o suco é imediatamente congelado após a sua obtenção, apresentou como majoritários os 5,6-epoxi-carotenoides (9Z)-violaxantina e (9Z)- ou (9’Z)-anteraxantina (Meléndez-Martínez et al., 2007b). A isomerização do anel 5,6-epóxi para 5,8-furanoide em meio ácido pode ocorrer tanto durante o processamento de suco de laranja como durante a análise de carotenoides dessa fruta. Suco de laranja pasteurizado, bem como o suco de laranja concentrado congelado e comumente reconstituído até atingir a qualidade apropriada, são os principais produtos de laranja comercializados pelas indústrias. Em ambos os casos, o suco passa por tratamentos térmicos a fim de estender a sua vida útil, porém o processamento causa modificações nas suas propriedades nutricionais e sensoriais. O perfil de carotenoides, por exemplo, é bastante afetado, apresentando baixos teores de 5,6-epóxi-carotenoides (violaxantina e anteraxantina), que são os principais carotenoides em suco fresco ou oriundos de um processamento brando. Por outro
lado, há presença majoritária dos seus derivativos 5,8-epóxidos mutatoxantina e auroxantina (Meléndez-Martínez et al., 2008b).
Além dos cuidados triviais como evitar incidência de luz, contato com oxigênio e temperaturas altas (> 37°C), um agente neutralizador pode ser utilizado para evitar que o rearranjo epóxido-furanoide ocorra durante análise. Schlatterer & Breithaupt (2005) adicionaram bicarbonato de magnésio previamente à extração e relataram que não houve efeito significativo desta adição nos teores de β-criptoxantina e zeinoxantina, porém mudanças nos epóxi-carotenoides não foram consideradas. Outros trabalhos mencionaram a adição de carbonatos previamente à extração, porém o efeito na composição de carotenoides não foi avaliado (Fanciullino et al., 2008; Kato et al., 2004). Por outro lado, em muitos dos procedimentos de extração de carotenoides de citros não há adição de agente neutralizante (Lee et al., 2001; Melendez-Martínez et al., 2007b; Plaza et al, 2011).
Diversos aspectos relacionados com a composição de carotenoides de laranja têm sido investigados por um grupo espanhol. Meléndez-Martínez et al. (2005a) comprovaram por meio de diversos testes que o carotenoide previamente identificado como isoluteína ou epóxido de luteína em suco de laranja, se tratava na verdade de (9Z)- ou (9’Z)-anteraxantina. Em outro estudo, o mesmo grupo mostrou evidências que o carotenoide mono-hidroxilado de laranja que elui próximo à β-criptoxantina é a zeinoxantina, que aparece recorrentemente identificada como α-criptoxantina (Meléndez-Martínez et al., 2005b). Esta contribuição foi particularmente importante, considerando que a zeinoxantina não apresenta atividade de vitamina A, enquanto a α-criptoxantina apresenta, e desta forma alguns trabalhos anteriores apresentavam valores superestimados desta propriedade nutricional.
Posteriormente, a presença de neoxantina em laranja, reportada em diversos estudos, foi questionada no trabalho de Meléndez-Martínez et al. (2008a). Os autores analisaram diversos sucos de laranja comercializados na Espanha, e concluíram que o carotenoide previamente identificado como neoxantina era na verdade outro carotenoide com características espectroscópicas similares, porém mais polar, provavelmente latoxantina. As evidências analíticas são corroboradas à medida que a presença de neoxantina em frutos maduros não é comum, com exceção da manga (Mercadante et al., 1997; Gandul-Rojas et al., 1999). Por outro lado, na polpa de laranja, neoxantina é o carotenoide majoritário nos estádios verdes, mas
desaparece progressivamente e já não é mais detectado nos tecidos contendo cromoplastos (Rodrigo et al., 2004; Alós et al., 2006).
5.2 Extrato não saponificado
Carotenoides podem ser encontrados naturalmente tanto na sua forma livre, ou esterificados com diferentes ácidos graxos em muitas frutas, flores, animais, micro-organismos e algas. No entanto, Breithaupt & Bamedi (2001) reportaram que os seguintes vegetais e frutas não apresentam carotenoides na forma esterificada: berinjela, banana, brócolis, couve de Bruxelas, figo da Índia, cenoura, groselha chinesa, milho, pepino, agrião, dente-de-leão, funcho, groselha, granadilho, toranja, couve, limão, melão, salsa, pimenta verde, marmelo, espinafre, abobrinha, morango, tomate e melancia. De forma geral, ésteres de carotenoides não são comumente encontrados em frutas e vegetais de coloração verde escura, uma vez que a esterificação está intimamente relacionada com o amadurecimento, quando ocorre a transformação de cloroplastos em cromoplastos, juntamente com a intensa síntese de carotenoides. Tecidos vegetais ricos em gordura ou com altos teores de carotenoides, como cenoura, tomate e milho, também não apresentam carotenoides esterificados (Breithaupt & Schwack, 2000; Breithaupt & Bamedi, 2001).
A acilação de carotenoides com ácidos graxos facilita a incorporação das xantofilas nos cromoplastos, facilitando seu armazenamento no tecido vegetal devido ao aumento de sua lipossolubilidade (Minguez-Mosquera & Hornero-Méndez, 1994). Além disso, a esterificação também foi associada com um mecanismo para proteger moléculas sensíveis da foto-oxidação (Cazzonelli & Pogson, 2010). A esterificação de xantofilas ainda não é completamente entendida, mas é provavelmente catalisada por esterases (Britton, 1998; Schweiggert & Carle, 2015) ou xantofilas acil-transferases (Delgado-Pelayo & Hornero-Mendez, 2012). Diversos trabalhos já demonstraram a baixa correlação existente entre o perfil de ácidos graxos da fração lipídica e os resíduos de ácidos graxos encontrados nos ésteres de xantofilas, sugerindo alta seletividade das enzimas envolvidas na esterificação (Breithaupt & Schwack, 2000; Delgado-Pelayo & Hornero-Méndez, 2012; Mellado-Ortega & Hornero-Méndez, 2012; Delgado-Pelayo et al., 2014; Delgado-Pelayo et al., 2016).
A esterificação das xantofilas provoca uma série de modificações nas suas propriedades químicas. A lipossolubilidade das xantofilas esterificadas é maior em
relação às xantofilas livres correspondentes, e na maioria das vezes inclusive em relação aos carotenos (Fernández-García et al., 2007). Xantofilas esterificadas também são mais estáveis que as respectivas xantofilas livres (Khachik & Beecher, 1988; Khachik et al., 1988; Fu et al., 2010; Mertz et al., 2010; Schweiggert et al., 2007), uma propriedade que pode ser explorada pela indústria de alimentos.
Considerando que a maior parte dos carotenoides presentes em laranja são xantofilas, o perfil de carotenoides do extrato não saponificado de laranjas é bastante complexo. A Figura 3 apresenta a estrutura de um éster de carotenoide encontrado em laranja. A comparação de dados referentes à composição de ésteres de carotenoides em laranja presentes na literatura é complicada, principalmente porque a configuração E/Z são frequentemente não é determinada. Grande parte dos trabalhos encontrados na literatura se referem a suco de laranja fresco ou produtos processados de laranja.
Figura 3. Estrutura da (9Z)-violaxantina laurato-palmitato.
A primeira identificação de ésteres em citros foi reportada por Philip (1973), que identificou criptoxantina laurato em laranjas (cv. ‘Valencia’ e cv. ‘Temple’) e tangelos, auroxantina dilaurato em laranja cv. ‘Valencia' e -citraurina laurato em laranja cv. ‘Temple’.
Dugo et al. (2008) analisaram suco de laranja (cultivar não informada) através de cromatografia bidimensional (LCxLC), e entre os 62 picos separados, apenas 19 foram identificados. Os carotenoides majoritários foram monoésteres e diésteres de violaxantina, esterificados principalmente com ácido palmítico (16:0), seguido de ácido mirístico (14:0). Em outro estudo conduzido pelo mesmo grupo (Dugo et al., 2009), apenas ésteres de epóxi-carotenoides foram investigados em sucos frescos de diversas cultivares de laranja (cv. ‘Valencia’, cv. ‘Brasiliana’, cv. ‘Washington’, cv. ‘Ovale’, cv. ‘Tarocco’ e cv. ‘Bionda’), bem como em uma amostra de suco de laranja comercial concentrado e posteriormente reconstituído. Os principais ésteres identificados foram derivados de violaxantina. O mesmo grupo ainda, estudando a composição do extrato não saponificado das mesmas variedades de laranja acima, reportou que tanto os ésteres de carotenoides majoritários, quanto o conteúdo de cada éster variaram largamente, como pode ser facilmente deduzido a partir da variação observada nos teores de carotenoides totais (2,42 a 15,8 µg/g) nos sucos de laranja frescos (Giuffrida et al., 2010). Segundo os autores, os carotenoides majoritários em laranja cv. ‘Bionda’ e ‘Moro’ foram (Z)-violaxantina miristato-palmitato e (Z)-violaxantina dimiristato, enquanto que β-criptoxantina miristato e β-criptoxantina laurato foram os majoritários em cv. ‘Brasiliana’, β-criptoxantina miristato e luteoxantina miristato em cv. ‘Ovale’, (Z)-violaxantina miristato-palmitato e β-criptoxantina laurato em cv. ‘Sanguinello’, violaxantina miristato-palmitato e (Z)-violaxantina laurato-miristato em cv. ‘Tarocco’, e por fim, criptoxantina laurato e β-criptoxantina palmitato em cv. ‘Washington’. Além disso, os autores reportaram diferentes razões entre o conteúdo de monoésteres e diésteres, que correspondeu em média a 1,45 nas cultivares cv. ‘Brasiliana’, cv. ‘Ovale’ e cv. ‘Sanguinello’, e em média 0,68 nas cultivares cv. ‘Bionda’, cv. ‘Moro’ e cv. ‘Tarocco’. Os principais ácidos graxos acilados às xantofilas foram ácido láurico (12:0) e ácido palmítico (16:0) (Dugo et al., 2009; Giuffrida et al., 2010).
Ainda de acordo com este grupo (Dugo et al., 2009), o suco de laranja cv. ‘Ovale’ fresco apresentou praticamente apenas ésteres de luteoxantina. Já em suco de laranja comercial concentrado e posteriormente reconstituído, apenas monoésteres de β-criptoxantina e luteoxantina foram identificados, sendo importante ressaltar que nenhum diéster de violaxantina ou luteoxantina foi dentificado (Dugo et al., 2009). Em suco de laranja processado (cv. ‘Valencia’ e cv. ‘Navel’), ésteres de 5,8-epóxi-carotenoides variaram de 60 a 75% do total de carotenoides, sendo auroxantina
palmitato, mutatoxantina palmitato, auroxantina dilaurato, auroxantina dimiristato, auroxantina miristato-palmitato e auroxantina dipalmitato os compostos majoritários (Philip et al., 1988). Como já enfatizado anteriormente, a ocorrência de 5,8-epóxi-carotenoides em sucos de laranja processados é esperada, uma vez que a acidez inerente à esta matriz e às altas temperaturas utilizadas durante o processo de concentração do suco catalisam o rearranjo epóxido-furanoide em violaxantina e anteraxantina, originalmente presentes em suco de laranja fresco. Outro estudo reportou a presença de carotenoides livres, principalmente zeaxantina em suco de laranja concentrado (Wingerath et al., 1996).
Informações sobre ésteres de carotenoides em tangerinas são relativamente escassas na literatura. De maneira geral, tangerinas apresentam um perfil de carotenoides no extrato não saponificado mais simples em relação às laranjas. Em suco de tangerina concentrado (variedade não informada), foram identificados basicamente ésteres de β-criptoxantina com ácido cáprico, láurico, mirístico, palmitoleico, palmítico e oleico, sendo que criptoxantina laurato e β-criptoxantina miristato foram os majoritários (Wingerath et al., 1996). Apesar de violaxantina e luteoxantina terem sido identificadas no extrato saponificado neste estudo, nenhum éster derivado destas xantofilas foi identificado no extrato não saponificado (Wingerath et al., 1996). A presença majoritária de ésteres de β-criptoxantina em suco concentrado de tangerina já havia sido indicada previamente por Philip et al. (1988), onde os ésteres desta xantofila perfizeram mais do que 40% do total de ésteres, sendo criptoxantina miristato e criptoxantina laurato os carotenoides predominantes. A composição em ésteres de carotenoides de óleo essencial de tangerina também pode ser encontrada na literatura (Giuffrida et al., 2006), e, em termos qualitativos, foi bastante semelhante à composição do suco.
6. Relação entre carotenoides e cor
Dentre os diversos sistemas de medida de cor, um dos mais usuais é representado numericamente pela escala de cor CIEL*a*b*. Nesta escala os pontos estão em um espaço tridimensional, representado pelos eixos de luminosidade L* (valor 100 representa cor branca e valor 0, cor preta) e pelas coordenadas cromáticas, a* (valores positivos representam cor vermelha e valores negativos cor verde) e b* (valores positivos representam cor amarela e valores negativos cor azul). A partir dos
valores numéricos de a* e b* pode-se calcular o croma (C), que indica a saturação da cor, e a tonalidade (h), também conhecida como ângulo hue que é o valor em graus correspondente ao diagrama tridimensional de cores: 0° (vermelho), 90° (amarelo), 180° (verde) e 270° (azul), parâmetro este que corresponde à tonalidade tal como é vista pelo olho humano.
De acordo com a classificação proposta por Bitters (1961), as laranjas podem ser divididas em dois grandes grupos, em função da coloração da polpa: as laranjas douradas (ou claras), caracterizadas pela coloração variável entre amarelo e alaranjado da polpa, devido à presença de carotenoides, e as laranjas sanguíneas, caracterizadas pela coloração vermelha-intensa da polpa devido a presença de antocianinas. Um terceiro grupo se refere às variedades de laranjas de polpa vermelha, que contêm licopeno e maiores teores de β-caroteno, conferindo cor avermelhada à polpa (Xu et al., 2002).
O comportamento de cor de diversos padrões de carotenoides (anteraxantina, auroxantina, cantaxantina, -caroteno, caroteno, -caroteno, -criptoxantina, luteína, epóxido de luteína, luteoxantina, licopeno, mutatoxantina, neocromo, neoxantina, violaxantina e zeaxantina) através do diagrama CIEL*a*b* foi relatado por Meléndez-Martínez et al. (2007a). Estes autores verificaram que o licopeno e a cantaxantina estão localizados no primeiro quadrante do plano (valores positivos de a* e b*), o que indica que estes pigmentos são mais vermelhos. Os demais estão no segundo quadrante próximo ao eixo b* (valores negativos de a* e positivos de b*), portanto apresentam coloração mais amarelada.
As mudanças de cor podem ser utilizadas para predizer ou verificar mudanças de qualidade no alimento ocorridas durante o processamento e estocagem. Além disso, os parâmetros de cor podem ser usados para acompanhar o amadurecimento de frutos. Arias et al. (2000) encontraram correlação alta e significativa entre os valores de L* (r = 0,82) e a* (r = 0,96) e a concentração de licopeno durante o amadurecimento de tomate. Durante o amadurecimento, os valores de a* aumentaram de -10,37 para +29,25 como consequência da redução de clorofila e síntese de licopeno, representando a mudança de cor de verde para vermelho. O valor de L* diminuiu, indicando que a fruta ficou mais escura com o amadurecimento. O valor de b* aumentou, refletindo a síntese do -caroteno, o segundo carotenoide
