UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE QUÍMICA
GLAUCO PILON DOS SANTOS
CONSTRUÇÃO E APLICAÇÃO DE DISPOSITIVOS ANALÍTICOS À BASE DE PAPEL NA DETECÇÃO DE BIOMARCADORES PARA DIAGNÓSTICO
CLÍNICO
CAMPINAS 2017
GLAUCO PILON DOS SANTOS
CONSTRUÇÃO E APLICAÇÃO DE DISPOSITIVOS ANALÍTICOS À BASE DE PAPEL NA DETECÇÃO DE BIOMARCADORES PARA DIAGNÓSTICO
CLÍNICO
Orientador: Prof. Dr. Lauro Tatsuo Kubota Coorientador: Prof. Dr. Scott T. Phillips
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELO ALUNO GLAUCO PILON DOS SANTOS, E ORIENTADO PELO PROF. DR. LAURO TATSUO KUBOTA
CAMPINAS 2017
Tese de Doutorado apresentada ao Instituto de Química da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutor em Ciências
“Um sonho que se sonha só, é só um sonho que se sonha só, mas um sonho que se sonha junto é realidade”
Raul Seixas
Aos meus pais Luis e Rosmary, minha irmã Glauce e a toda minha família, que sonharam junto comigo e hoje compartilham desta realidade, dedico este trabalho.
“Bom mesmo é ir à luta com determinação, abraçar a vida com paixão, perder com classe e vencer com ousadia, porque o mundo pertence a quem se atreve. E a vida é muito bela para
ser insignificante”
Charles Chaplin
“O valor das coisas não está no tempo em que elas duram, mas na intensidade com que acontecem. Por isso existem momentos inesquecíveis, coisas inexplicáveis e pessoas
incomparáveis”
AGRADECIMENTOS
À Deus, por conduzir meus passos e me dar força, saúde, além de estar presente em todos os momentos da minha vida.
Aos meus pais Luis e Rosmary, pelo amor incondicional, dedicação, incentivo e apoio em todas as etapas de minha formação pessoal e profissional, contribuindo para que eu pudesse alcançar meus objetivos.
À minha irmã Glauce, aos meus avós e a toda minha família por sempre acreditarem em meu potencial e por me incentivarem durante toda minha caminhada.
Ao Prof. Dr. Lauro Tatsuo Kubota, pela amizade, profissionalismo, atenção, apoio, incentivo, paciência, confiança, ensinamentos e orientação, me proporcionado as melhores oportunidades e estrutura de laboratório que um aluno poderia ter.
Aos amigos do Laboratório de Eletroquímica, Eletroanalítica e Desenvolvimento de Sensores (LEEDS): Cecília, Murilo, João Ricardo, Thiaguinho, Catia, Ronaldo, Camila Maroneze, Vitória, Viviane, Maiuí, Leandro, Alexandre, Thaís, Tatiana, Camila Erbereli, Lory, Juliana, Sérgio, Ana Carolina, Victor, Carlos, Rubia, Emilia e Gabriela pela amizade e pelos momentos de descontração e aprendizado.
Aos grandes amigos Dênio e José Tiago, que contribuíram para que os anos de pós-graduação fossem muito gratificantes em questão de amizade, companheirismo, convivência e aprendizado, estando sempre disponíveis para conversar, aconselhar e ajudar.
Ao Prof. Dr. Scott T. Phillips pela orientação, compromisso, paciência, motivação, conhecimentos transmitidos e dedicação nesta etapa tão importante de minha formação acadêmica, além da acolhida na The Pennsylvania State University e por proporcionar oportunidades que ficarão marcadas para sempre em minha memória. Gratidão por confiar tanto em mim e no meu trabalho!
fizeram por mim em State College. Vocês são pessoas muito importantes na minha vida! Obrigado por tudo!
Aos integrantes do grupo do Prof. Scott Phillips pela recepção, amizade e intensa colaboração durante a realização da pesquisa: Dustin, Hyungwoo, Greg, Saptarshi, Adam Brooks, Mike, Jihee, Songyi, Ina, Travis, Chris, Jie, Grace, Jiatao, Lu, Kelli, Xin-Xing e Anthony. Thank
you so much guys for everything!
Aos meus roommates John, Austin e Dinakaran, com quem tive a oportunidade de compartilhar essa experiência única nos EUA e que se tornaram os melhores amigos e companheiros que eu poderia ter em State College. Agradeço também aos amigos brasileiros pela grande companhia e ajuda nas dificuldades: Jocely, Carol, Fabrício, Patrick, Walter e Fellipe.
Ao Prof. Dr. Celso Aparecido Bertran e à Profª. Drª. Cassiana Carolina Montagner Raimundo, pelas valiosas sugestões e contribuições no exame de qualificação de área.
Ao Prof. Dr. Ivo Milton Raimundo Júnior, Prof. Dr. Marco Aurélio Zezzi Arruda e Prof. Dr. Pedro Luiz Onófrio Volpe, membros do exame de qualificação geral, que foram grandes incentivadores nesta etapa tão desafiadora.
Ao Prof. Dr. Carlos Emilio Levy, aos funcionários do Laboratório de Parasitologia do Hospital das Clínicas da UNICAMP (Célia e Kamila) e ao aluno de pós-graduação Tiago pelo profissionalismo, atenção, ensinamentos e por me receberem tão bem no laboratório.
Aos grandes amigos Marcos (Harry), Juliana, Jefferson, Marcelo e Miguel, que mesmo de longe sei que torceram pelas minhas vitórias, me incentivaram em todos os momentos e que estarão sempre ao meu lado.
Aos amigos de Araraquara, que tenho a satisfação de manter contato e que continuam proporcionando momentos de muitas conversas e diversão: Mari Bizari, Fabi, Jaqueline, João Pedro, Gabi, Elaine, Higor, Carol Rabal, Vinícius, Carol Rocha e Josiel.
À Secretaria de Pós-Graduação pela eficiência e por estarem sempre dispostas a ajudar e informar, em especial Isabel e Isabela.
A todos os funcionários do Instituto de Química, que de alguma forma contribuíram para a realização deste trabalho, em especial à Rubia pela amizade e por todo o apoio durante o doutorado e ao Humberto pelo apoio técnico no laboratório.
À Universidade Estadual de Campinas – UNICAMP, pela infra-estrutura e excelência na formação acadêmica e em pesquisa.
À The Pennsylvania State University, pela infra-estrutura e excelência em pesquisa, por acolher tão bem os alunos estrangeiros e por ter proporcionado alguns dos momentos mais felizes que já tive. We Are!
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pelo apoio financeiro em meus projetos científicos (Processo Fapesp nº 2013/09171-2 e 2014/18190-3).
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e ao INCT de Bioanalítica pelo apoio na realização dos projetos de pesquisa.
A crescente demanda por dispositivos de diagnóstico rápidos, altamente sensíveis e de baixo custo tem estimulado esforços para a geração de sistemas analíticos simplificados, capazes de serem aplicados em campo. Este trabalho científico envolveu o estudo de diferentes abordagens para possibilitar a detecção qualitativa e quantitativa de biomarcadores para diagnóstico clínico em plataformas à base de papel. A primeira estratégia consistiu no entendimento dos princípios de funcionamento do dispositivo de imunoensaio em fluxo lateral, permitindo avaliar as etapas críticas e consequentemente proporcionar as condições experimentais mais adequadas para o diagnóstico precoce da malária causada por Plasmodium
falciparum, pela identificação do biomarcador HRP2. O melhor desempenho do dispositivo
foi atingido por meio da utilização de 0,05 µg (1 µL / 50 µg mL-1) do anticorpo de captura e incubação por 5 minutos para sua adsorção; bloqueio da nitrocelulose com BSA 1,5% (m/v) contendo 0,1% do surfactante Tween-20 (v/v) por imersão e incubação por 10 minutos; 0,04 µg (20 µL/ 2 µg mL-1) de anticorpo de detecção conjugado com a enzima peroxidase; lavagem com solução tampão Tris-HCl 0,01 mol L-1 pH 7,4 contendo 0,15 mol L-1 de NaCl e 0,1% de Tween 20 (v/v); adição de 5 µL do substrato cromogênico TMB e realização da leitura no intervalo de 5-20 minutos após esta adição. O sistema com detecção colorimétrica apresentou um limite de detecção visual de 5 ng mL-1 (135 pmol L-1), cujo valor deve ser suficiente para identificar a contaminação pela malária no primeiro dia do aparecimento dos sintomas. A plataforma desenvolvida foi então aplicada para amostras de sangue de pacientes infectados pela doença, demonstrando eficiência na discriminação qualitativa de um resultado positivo e negativo e a geração de resultados confiáveis. Em outro estudo, com o intuito de proporcionar uma segunda geração do dispositivo, foi construído um sistema de detecção em 3D à base de papel capaz de ser acoplado a uma plataforma de imunoensaio em fluxo lateral. Este sistema possibilita o diagnóstico de maneira quantitativa, automatizada e com amplificação de sinal por meio da incorporação de um novo material polimérico da classe dos poli(benzil éteres) que responde seletivamente a peróxido de hidrogênio, além de necessitar apenas da visualização de cor e de um cronômetro para a obtenção dos dados e posterior análise dos resultados. A delimitação das barreiras hidrofóbicas no papel foi realizada por meio de impressão à cera e foram avaliados os processos de orientação e tipo de papel a ser empregado na camada contendo o polímero. O processo de deposição do material na superfície do papel demonstrou uma maior repetibilidade quando realizada de forma automática por meio de um robô de manuseamento de líquidos. A condição de maior sensibilidade para o sistema de detecção em 3D foi atingida empregando uma concentração de polímero de 4,0 mg mL-1 com a obtenção de um limite de detecção de 0,02 mmol L-1 de peróxido de hidrogênio. Este sistema foi então acoplado a uma plataforma de imunoensaio em fluxo lateral e utilizado em estudos iniciais na detecção da isoenzima MB da creatina quinase, um dos biomarcadores indicado para o diagnóstico do infarto agudo do miocárdio.
ABSTRACT
The growing demand for rapid, highly sensitive and cost effective diagnostic devices has stimulated considerable efforts towards the generation of simplified analytical systems capable of being applied in the field. This scientific work involved different approaches for the qualitative and quantitative detection of biomarkers for clinical diagnosis on paper-based analytical platforms. The first strategy consisted of understanding the principles behind the lateral flow immunoassay, in order to evaluate the critical steps and consequently to provide the most adequate experimental conditions for the early diagnosis of Plasmodium falciparum malaria by the identification of the HRP2 biomarker. The best performance of the device was achieved by using 0.05 µg (1 µL / 50 µg mL-1) of capture antibody and incubating for 5 minutes in order for it to adsorb; blocking the nitrocellulose with 1.5% (w/v) BSA containing 0.1% (v/v) surfactant Tween 20 by immersion and incubation for 10 minutes; 0.04 µg (20 µL/ 2 µg mL-1) of detection antibody labeled with the peroxidase enzyme; washing with 0.01 mol L-1 Tris-HCl buffer solution pH 7.4 containing 0.15 mol L-1 NaCl and 0.1% (v/v) Tween 20; addition of 5 µL of the chromogenic substrate TMB followed by reading in the range of 5-20 minutes after this addition. The colorimetric detection system presented a visual limit of detection of 5 ng mL-1 (135 pmol L-1), a value that should be enough for identifying the contamination by malaria in the first day of the appearance of the symptoms. The developed platform was then applied to blood samples from patients infected by the disease, demonstrating efficient performance at qualitatively discriminating a positive and a negative result, thus producing reliable results. In another study, aiming to provide a second generation of the device, a 3D paper-based detection system capable of being coupled to a lateral flow immunoassay platform was constructed. This system enables the obtainment of a quantitative and automated diagnostic assay with signal amplification by employing a new polymeric material from the class of poly(benzyl ethers) that selectively responds to hydrogen peroxide, besides requiring only the color visualization and a timer to obtain the data for subsequent analysis of the results. The delimitation of the hydrophobic barriers on the paper was carried out by wax printing and the orientation and type of paper to be employed in the layer containing the polymer were evaluated. The process of depositing the material on the surface of the paper demonstrated great repeatability when performed automatically by using a liquid handling robot. The highest sensitivity condition for the 3D detection system was achieved by employing 4.0 mg mL-1 of polymer, which allowed obtaining a limit of detection of 0.02 mmol L-1 of hydrogen peroxide. This system was then coupled to a lateral flow platform and employed in initial studies for the detection of creatine kinase MB isoenzyme, one of the biomarkers indicated for the diagnosis of acute myocardial infarction.
Figura 1. A) Método de fabricação de dispositivos em 3D empregando padrões impressos à cera - Reproduced from Ref. 42 with permission from The Royal Society of Chemistry; B) Arquitetura do dispositivo construído por meio da criação de barreiras hidrofóbicas por impressão à cera - Reprinted from Ref. 41 with permission from Elsevier; C) Estruturas ocas geradas após o processo de impressão à laser, delimitando os canais hidrofílicos para percolação da amostra - Reproduced from Ref. 46 with permission from The Royal Society of
Chemistry.. ... 29
Figura 2. Exemplos de ensaios com detecção colorimétrica de modo qualitativo (A) -
Reproduced from Ref. 57 with permission from The Royal Society of Chemistry;
semi-quantitativo (B) - Reprinted from Ref. 59 with permission from Elsevier; semi-quantitativo (C) -
Reprinted from Ref. 67 by permission of John Wiley & Sons, Inc. Copyright 2012 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim.. ... 33
Figura 3. Configuração típica de um teste de imunoensaio em fluxo lateral. ... 35
Figura 4. A) Layout, estrutura do sistema para a realização dos testes de imunoensaio em fluxo lateral nas etapas de otimização e protótipo do dispositivo a ser utilizado pelo usuário final; B) Esquema da plataforma à base de papel para o diagnóstico da malária causada pelo
Plasmodium falciparum; C) Catálise do substrato TMB pela enzima peroxidase (Fonte: Adaptado do site da empresa Sigma-Aldrich: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/ t0565). ... 45
Figura 5. Layout do dispositivo construído para os testes em fluxo lateral contendo a zona de detecção e a zona controle para validação do imunoensaio. ... 48
Figura 6. Imagens da zona de detecção do dispositivo e respectivos histogramas de intensidade de coloração, variando a concentração do anticorpo de captura (0,5250 µg mL-1) (A) e tempo de incubação (560 min) (B) na detecção de 500 ng mL-1 da proteína HRP2. ... 51
Figura 7. Imagens do dispositivo na detecção da proteína HRP2 na ausência de bloqueio com BSA (A) e bloqueando a membrana de nitroceluose com 1,5% (m/v) de albumina de soro bovino (B). ... 52
Figura 8. Imagens da zona de detecção do dispositivo e respectivos histogramas de intensidade de coloração, variando a concentração de BSA (0,54,5% (m/v)) (A) e o tempo de incubação (060 min) (B) na detecção de 500 ng mL-1 da proteína HRP2. ... 54 Figura 9. Imagens obtidas por FEG-MEV da membrana de nitrocelulose: antes e após o bloqueio da superfície com 1,5% (m/v) de BSA e após a adição do substrato TMB. ... 55
Figura 10. Imagens da zona de detecção do dispositivo e respectivo histograma de intensidade de coloração, em função da presença/ausência do surfactante Tween 20 na solução de bloqueio, utilizados na detecção de 500 ng mL-1 da proteína HRP2. ... 56
Figura 11. Imagens da zona de detecção do dispositivo e respectivo histograma de intensidade de coloração, em função da concentração de Tween 20 na faixa de 0,010,1% (v/v), (Neg): ausência da proteína HRP2 e (Pos): presença de 500 ng mL-1 da proteína HRP2. ... 57
Figura 12. Gráfico de intensidade de coloração em função do volume de TMB e respectivas imagens da zona de detecção na ausência (Neg) e presença (Pos) de 500 ng mL-1 da proteína HRP2 após a adição de 5 µL do substrato cromogênico. ... 58
Figura 13. Imagens da zona de detecção do dispositivo (A), curva analítica (B) para diferentes concentrações da proteína HRP2 (5-500 ng mL-1) e (C) região linear da curva analítica (5-60 ng mL-1). Todas as medidas foram realizadas em triplicata. ... 60
Figura 14. Imagens da zona de detecção do dispositivo monitorados em diferentes tempos após a adição do TMB na detecção de 500 ng mL-1 da proteína HRP2 e a respectiva representação na forma de gráfico.. ... 61
Figura 16. Imagem dos dispositivos utilizando a membrana de separação LF1 (A e C) e Fusion 5 (B e D) para diferentes volumes de amostra: 5 µL (A e B) e 10 µL (C e D). ... 64
Figura 17. Imagem dos dispositivos utilizando a membrana de separação LF1 para diferentes volumes de amostra: 5 µL (A) e 10 µL (B e C), após a realização do imunoensaio e da adição do revelador TMB na ausência (A e B) e presença (C) da proteína HRP2. ... 65
Figura 18. Imagem dos dispositivos utilizando a membrana de separação LF1 após a realização do imunoensaio e da adição do revelador TMB na ausência (A e C) e presença (B e D) da proteína HRP2. Volume de amostra do Paciente 2 (A e B) e do Paciente 3 (C e D), ambos negativos para a malária causada pelo Plasmodium falciparum: 10 µL.. ... 66
Figura 19. Imagem da zona de detecção dos dispositivos de imunoensaio em fluxo lateral para 11 pacientes (P1-P11) diagnosticados positivos para a malária causada pelo Plasmodium
falciparum com diferentes graus de parasitemia: P1: incontáveis; P2: incontáveis; P3:
incontáveis; P4: incontáveis; P5: 72000; P6: 30000; P7: 5400; P8: 1260; P9: 480; P10: 420; P11: 120 parasitas/µL. ... 67
Figura 20. Protótipo do dispositivo de imunoensaio em fluxo lateral para o diagnóstico da malária causada pelo Plasmodium falciparum. ... 68
Figura 21. Imagens da zona de detecção do dispositivo e respectivos histogramas de intensidade de coloração, variando a concentração do anti-anticorpo (0,5250 µg mL-1) (A) e tempo de incubação (560 min) (B) na ausência da proteína HRP2 e na presença de 2 µg mL-1 do anticorpo marcado com a enzima peroxidase. ... 70
Figura 22. Imagem do dispositivo construído para os testes em fluxo lateral contendo a zona de detecção e a zona controle para validação do imunoensaio, na ausência da proteína HRP2. ... 71
Figura 23. Imagem do dispositivo construído para os testes em fluxo lateral contendo a zona de detecção e a zona controle. ... 72
Figura 24. Imagem do dispositivo construído para os testes em fluxo lateral contendo a zona de detecção e a zona controle para validação do imunoensaio, na ausência da proteína HRP2 e empregando diferentes concentrações de surfactante na solução de lavagem (0,1-1,0%). ... 73
Figura 25. Imagem do dispositivo construído para os testes em fluxo lateral contendo a zona de detecção e a zona controle para validação do imunoensaio, na ausência da proteína HRP2, após a adição de 5 µL do substrato TMB para membranas. ... 73
Figura 26. Imagem do dispositivo construído para os testes em fluxo lateral contendo a zona de detecção e a zona controle para validação do imunoensaio, na ausência da proteína HRP2, após a adição de 5 µL do substrato TMB para membranas. ... 74
Figura 27. (A) Reação do monômero com peróxido de hidrogênio após a desprotonação do analito pela base. (B) Polímero e seus produtos de despolimerização após a reação do peróxido de hidrogênio com um monômero aleatório ao longo da cadeia polimérica [119]. .. 82
Figura 28. Layout utilizado na construção dos dispositivos à base de papel. ... 83
Figura 29. Layout do sistema em 3D utilizado para quantificação de peróxido de hidrogênio. A região em preto são as áreas hidrofóbicas enquanto as regiões em branca, cinza, amarela e verde são hidrofílicas. A amostra é adicionada na camada 1 e elui verticalmente até a camada 5 do dispositivo. As camadas 1 (superior) e 5 (inferior) não possuem nenhum reagente impregnado no papel. ... 84
Figura 30. Layout do sistema de imunoensaio em fluxo lateral. ... 86
Figura 31. Efeito da orientação do papel no tempo necessário para a eluição da amostra pelo dispositivo empregando como amostra água ultrapura () e peróxido de hidrogênio 1 mmol L-1 (). A) Orientação 1 e B) Orientação 2. A concentração do polímero utilizada na
Figura 32. Efeito do tipo de papel na sensibilidade e reprodutibilidade das medidas empregando como amostra água ultrapura () e peróxido de hidrogênio 1 mmol L-1 (). A concentração do polímero utilizada na obtenção destes dados foi de 5 mg mL-1, 7,5 mg mL-1 e 5 mg mL-1 para o papel de impressão Aspen 30, papel Whatman nº 1 e papel Whatman nº 4, respectivamente. ... 90
Figura 33. A) Efeito da concentração do polímero empregando como amostra água ultrapura () e peróxido de hidrogênio 1 mmol L-1 (). B) Tempo necessário para a eluição da amostra pelo dispositivo em função da concentração de peróxido de hidrogênio. C) Curva analítica para H2O2 obtida na região linear do gráfico B. ... 92
Figura 34. Layout do dispositivo à base de papel para a quantificação de glicose a partir da geração de peróxido de hidrogênio pela enzima glicose oxidase. ... 93
Figura 35. A) Tempo para eluição da amostra em função da [GOx]; B) Tempo para a eluição da amostra em função da [glicose]. A concentração do polímero foi fixada em 5 mg mL-1.... 94
Figura 36. Equipamento Mantis® e chips compatíveis com soluções aquosas (silicone) e alguns solventes orgânicos (PFE) utilizados na deposição dos reagentes no substrato de papel. Fonte: www.formulatrix.com/liquid-handling/products/mantis/index.html. ... 95
Figura 37. Visão lateral do chip utilizado para a deposição do polímero no papel. ... 96
Figura 38. Câmara de luz utilizada para o alinhamento do papel na superfície da microplaca de 384 poços. ... 97
Figura 39. Encaixe da microplaca no equipamento Mantis® e visualização do papel após a deposição do corante verde... 97
Figura 40. Efeito dos diferentes métodos de deposição do polímero (manual vs automática) no tempo necessário para eluição da amostra pelo dispositivo nas medidas empregando como amostra água ultrapura () e peróxido de hidrogênio 1 mmol L-1 () e [polímero] = 5,5 mg mL-1. ... 98
Figura 41. Efeito do processo de filtragem das soluções do poli(benzil éter) de mesma concentração (5,0 mg mL-1) preparadas em dias consecutivos.. ... 99
Figura 42. Frascos contendo quantidades iguais de material polimérico obtidas após o processo de preparação da solução estoque e posterior evaporação do solvente. ... 100
Figura 43. A-L) Gráficos relacionando tempo necessário para a eluição da amostra pelo dispositivo em função da concentração de peróxido de hidrogênio e respectivas curvas analíticas para H2O2 obtida na região linear. M) Efeito da concentração do polímero
empregando como amostra água ultrapura () e peróxido de hidrogênio 1 mmol L-1 (). .... 103 Figura 44. Layout do dispositivo para a realização do imunoensaio em fluxo lateral de forma automatizada e com amplificação de sinal e esquema do imunoensaio sanduíche utilizando os três anticorpos. ... 105
Figura 45. Tempo necessário para a eluição da amostra para o imunoensaio em três condições diferentes: Condição 1) Ausência de glicose (substrato) e da proteína CK-MB; Condição 2) Presença de glicose 1 mol L-1 e ausência da proteína CK-MB; Condição 3) Presença de glicose 1 mol L-1 e 1 µg mL-1 da proteína CK-MB. ... 106
Tabela 1. Faixa linear, limite de detecção e coeficiente angular obtido por meio da curva analítica para peróxido de hidrogênio em diferentes concentrações de reagente hidrofóbico.. ... 103
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
2D duas dimensões 3D três dimensões
µL microlitros
µPAD dispositivos analíticos à base de papel µTAS microssistemas de análise total
ALT alanina aminotransferase BSA albumina de soro bovino
CAAE Certificado de Apresentação para Apreciação Ética CAGR taxa composta anual de crescimento
CEP Comitê de Ética em Pesquisa CK-MB isoenzima MB da creatina quinase CO2 dióxido de carbono
DAB 3,3’-Diaminobenzidina DNA ácido desoxirribonucleico DCM diclorometano
GOx glicose oxidase
H2O2 peróxido de hidrogênio HC Hospital de Clínicas
hCG gonadotrofina coriônica humana HCl ácido clorídrico
HEPES 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-ácido etanosulfônico HIV Vírus da Imunodeficiência Humana
HRP2 proteína-2 rica em histidina IAM infarto agudo do miocárdio IgG imunoglobulina G
IgM imunoglobulina M K2CO3 carbonato de potássio
L litro
LD limite de detecção LDH lactato desidrogenase
MEV-FEG Microscopia Eletrônica de Varredura com Emissão de Campo
mg miligrama
min minutos
mL mililitro
mm milímetro
NaCl cloreto de sódio
ng nanograma
NPs nanopartículas
OMS Organização Mundial da Saúde PCR reação em cadeia da polimerase PDI índice de polidispersão
Pf Plasmodium falciparum
PFE perfluorelastômero pH potencial hidrogeniônico pmol picomol
POC point-of-care
RNA ácido ribonucleico
TMB 3,3’,5,5’ tetrametilbenzidina
Tris 2-amino-2-(hidroximetil)-1,3-propanodiol
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 24
1.1 Da miniaturização analítica ao desenvolvimento de testes point-of-care ... 24
1.2 Propriedades da celulose e a utilização do papel na construção de dispositivos analíticos (µPADs) ... 26
1.2.1 Métodos de fabricação dos µPADs com foco nos procedimentos de impressão à cera e corte à laser ... 27
1.2.2 A simplicidade da detecção colorimétrica em µPADs para ensaios qualitativos e quantitativos direcionados ao diagnóstico clínico ... 30
1.3 Imunossensores: importância no diagnóstico clínico ... 34
1.3.1 Imunoensaio em fluxo lateral (LFIA) ... 34
2 MOTIVAÇÃO PARA O DESENVOLVIMENTO DA TESE ... 37
3 OBJETIVOS ... 38
4 Desenvolvimento de dispositivo de imunoensaio em fluxo lateral para o
diagnóstico precoce da malária causada pelo Plasmodium falciparum ... 40
4.1 Motivação para a realização deste estudo ... 40
4.2 PARTE EXPERIMENTAL ... 42
4.2.1 Materiais, reagentes e soluções ... 42
4.2.2 Instrumentação ... 42
4.2.3 Layout do dispositivo e esquema do imunoensaio para o sistema em fluxo lateral ... 43
4.2.4 Otimização das condições experimentais e construção da curva analítica para a proteína HRP2 ... 46
4.2.5 Análise de imagens pelo software ImageJ ... 46
4.2.6 Aplicação do dispositivo LFIA para amostras de sangue periférico humano ... 47
4.2.7 Zona Controle: validação do ensaio e estabilidade do dispositivo ... 48
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 50
5.1 Efeito da concentração e do tempo de incubação do anticorpo de captura ... 50
5.2 Efeito do bloqueio da nitrocelulose com BSA ... 51
5.3 Efeito da concentração e do tempo de incubação com BSA ... 52
5.6 Incerteza das medidas obtidas a uma intensidade máxima de coloração nas etapas de otimização ... 57 5.7 Efeito da quantidade de substrato TMB na intensidade do sinal colorimétrico ... 58 5.8 Curva analítica para a detecção da proteína HRP2, biomarcador da malária ... 59 5.9 Estabilidade do produto insolúvel colorido e efeito do tempo de leitura na intensidade de resposta ... 61 5.10 Aplicação do dispositivo LFIA para amostras de sangue periférico humano ... 62 5.11 Estimativa de custo do dispositivo ... 68 5.12 Inclusão da zona controle: possibilidade de validação do imunoensaio para avaliação sistemática do funcionamento do dispositivo ... 68 5.12.1 Efeito da concentração e do tempo de incubação com o anti-IgG ... 69 5.12.2 Avaliação de nova metodologia para bloqueio da nitrocelulose ... 71 5.12.3 Otimização das condições de lavagem para o novo layout contendo a zona controle ... 72
6 CONCLUSÕES PARCIAIS ... 75
7 Plataforma analítica point-of-care para a realização de imunoensaios
quantitativos de forma simplificada, automatizada e com amplificação de
sinal ... 77
7.1 Motivação para a realização deste estudo ... 77
8 PARTE EXPERIMENTAL ... 79
8.1 Materiais, reagentes e soluções ... 79 8.2 Instrumentação ... 80 8.3 Mecanismo da reação de despolimerização do poli(benzil éter) na presença de peróxido de hidrogênio ... 81 8.4 Construção e princípio de funcionamento dos dispositivos em 3D contendo o reagente hidrofóbico ... 82 8.5 Aplicação da plataforma em 3D como sistema de detecção em dispositivo de imunoensaio em fluxo lateral ... 85
9 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 87
9.1 Efeito da orientação do papel no tempo necessário para a eluição da amostra pelo dispositivo ... 87
9.2 Efeito do tipo de papel empregado para deposição do material polimérico na sensibilidade e repetibilidade das medidas analíticas ... 89 9.3 Efeito da concentração do polímero no tempo de eluição da amostra e curva analítica para peróxido de hidrogênio ... 90 9.4 Aplicabilidade analítica da plataforma utilizando reagente hidrofóbico como estratégia de detecção ... 92 9.5 Deposição dos reagentes pelo robô de manuseamento de líquidos (Mantis®) ... 94 9.6 Construção da curva analítica para peróxido de hidrogênio em diferentes concentrações do polímero ... 100 9.7 Aplicação da plataforma em 3D como sistema de detecção em dispositivo LFIA para a quantificação da isoenzima MB da creatina quinase (CK-MB) ... 104
10 CONCLUSÕES PARCIAIS ... 108
11 CONSIDERAÇÕES FINAIS E PERSPECTIVAS FUTURAS ... 109
REFERÊNCIAS ... 110
ANEXO I: PARECER CONSUBSTANCIADO DO COMITÊ DE ÉTICA
EM PESQUISA DA UNICAMP ... 124
1 INTRODUÇÃO
1.1 Da miniaturização analítica ao desenvolvimento de testes point-of-care
A tecnologia moderna tem sido marcada por grandes avanços na área de sistemas analíticos miniaturizados [1-3]. Esta mudança de escala de tamanho proporciona uma redução na quantidade de reagentes e amostras a ser utilizado nas análises, possibilita uma minimização do consumo de energia e material na produção, o que consequentemente reflete também em um baixo custo por dispositivo, contribui na geração de plataformas mais simples tanto com relação à operação quanto na construção, além da portabilidade, redução no tempo de análise e no desenvolvimento de sistemas minimamente invasivos [4, 5].
Do ponto de vista analítico, as análises químicas convencionais normalmente são compostas por inúmeras etapas que exigem a utilização de laboratórios centrais, com profissionais qualificados para sua realização e interpretação dos dados, além de instrumentação especializada [6]. Com o propósito da miniaturização, os sistemas mais simplificados surgem como uma estratégia relevante na descentralização das análises e no desenvolvimento de dispositivos capazes de realizar desde a amostragem e reações químicas até processos de separação e detecção de forma integrada, conhecidos como Lab-on-a-Chip ou microssistemas de análise total (µTAS) [7, 8].
Neste contexto, a microfluídica se destaca como uma área emergente aplicada na construção de microdispositivos analíticos, e consiste de um campo de pesquisa relacionado à manipulação de pequenas quantidades de fluidos em canais de dimensões reduzidas [9]. Estas plataformas microfluídicas têm sido aplicadas em diversas áreas com finalidades (bio)analíticas tais como diagnóstico clínico [10], análises forenses [11], imunoensaios [12], análise e separação de DNA/RNA [13], análise de proteínas [14], análise ambiental [15], reação em cadeia da polimerase (PCR) [16], sequenciamento de DNA [17], dentre outros, o que tem impulsionado a evolução destes sistemas.
Um dos grandes fatores de impacto que indica os investimentos no setor de dispositivos microfluídicos é evidenciado pela expectativa de mercado, que deve aumentar de 3,65 bilhões de dólares em 2016 para 8,78 bilhões de dólares em 2021, representado uma taxa de crescimento anual (CAGR) de 19,2%, segundo informações divulgadas pela Markets and Markets [18]. Atualmente, aproximadamente 274 empresas no mundo tem direcionado seu
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foco no desenvolvimento de dispositivos microfluídicos e/ou componentes microfluídicos [19].
Como reflexo das mudanças econômicas e a necessidade de limitação dos gastos principalmente com os custos na área de saúde [20], a implementação desta tecnologia tem sido destaque no desenvolvimento de sistemas simplificados para aplicação em diagnósticos clínicos e favorece a obtenção de dispositivos de baixo custo, sensíveis, portáteis e automatizados, que podem ser utilizados em locais de pouca infraestrutura e que são facilmente transportáveis, possibilitando a realização das medidas em campo, onde o termo
point-of-care (POC) é empregado. Além disso, permite que as análises sejam executadas de
forma rápida e mais próximas ao paciente [21].
Por meio dos testes POC, análises biológicas complexas envolvendo amostras sem qualquer pré-tratamento como sangue total, saliva e urina podem ser realizadas em um hospital ou serviço de emergência, no consultório médico e até mesmo por um profissional não qualificado ou pelo paciente em sua própria casa, o que pode diminuir o número de visitas clínicas e os custos com o tratamento [6, 22]. Os principais desafios destes sistemas é o de garantir as propriedades para um teste ideal, conforme estabelecido pela Organização Mundial da Saúde (OMS): acessível, sensível, específico, de fácil utilização, robusto e rápido, sem a necessidade de equipamentos especiais para a realização das medidas e facilmente transportável até o paciente [23].
Os dispositivos do tipo POC têm sido amplamente empregados em diagnósticos associados às doenças infecciosas, tais como a malária, HIV e tuberculose; na detecção de proteínas como marcadores para diagnóstico do câncer; no monitoramento contínuo das taxas de glicose no sangue por meio de sistemas minimamente invasivos; na detecção de marcadores cardíacos, como por exemplo para o diagnóstico do infarto agudo do miocárdio, dentre outros [24, 25]. Estes testes rápidos podem ser aplicados tanto na prevenção e no diagnóstico precoce quanto no controle e monitoramento da evolução da doença, o que permite que seja realizado um tratamento imediato e consequentemente mais efetivo [26].
Uma das principais tendências das novas gerações de dispositivos POC e que refletem na evolução das plataformas está no acoplamento dos sensores portáteis com celulares do tipo
smartphone, onde no caso de detecção óptica, a câmera é empregada como detector e por
meio de aplicativos e análise de imagens é possível obter medidas de forma precisa no monitoramento de um alvo específico para o diagnóstico [26, 27]. Já no caso da detecção eletroquímica/eletroquimioluminescência, a conexão de saída de áudio tem sido empregada na aplicação de potencial para iniciar uma reação eletroquímica [28].
Dentre os diferentes materiais utilizados na construção de dispositivos microfluídicos tais como silício, vidro, polímeros elastômeros e termoplásticos [29], o papel tem se destacado como uma das plataformas de baixo custo mais interessantes para ensaios de diagnóstico e de grande aplicabilidade no desenvolvimento de testes do tipo point-of-care com potencial de comercialização [30].
1.2 Propriedades da celulose e a utilização do papel na construção de dispositivos analíticos (µPADs)
A celulose, biopolímero natural e principal constituinte utilizado na produção do papel, é um produto de origem renovável e que representa cerca de um terço da composição dos tecidos vegetais [31]. O polissacarídeo é formado por unidades repetidas de D-glicose, cujas moléculas de -D-glicopiranose estão covalentemente ligadas por meio de ligações glicosídicas (-1,4). Este homopolímero linear é caracterizado por possuir propriedades hidrofílicas, por ser biodegradável, de estrutura fibrosa, de fácil modificação química, além de ser insolúvel em água e na maioria dos solventes orgânicos [32].
Uma aplicação emergente e bastante relevante da celulose nos últimos anos consiste na utilização do papel como substrato para a construção de dispositivos microfluídicos devido a um conjunto de propriedades inerentes e atrativas deste material: biocompatível, ideal para aplicação em análises que envolvem moléculas biológicas; é um material de baixo custo; estrutura porosa, o que permite o armazenamento e imobilização dos reagentes necessários para a realização de um ensaio específico; de aquisição acessível em diferentes partes do mundo e nas mais diversas propriedades (tamanho de poro, espessura, cargas na superfície) e flexibilidade mecânica, que permite a geração de estruturas em 2D e 3D [33, 34].
Adicionalmente, em plataformas à base de papel, não é necessária a utilização de válvulas, bombas e/ou energia externa, uma vez que o escoamento do fluido é controlado pela ação da capilaridade. A possibilidade de utilização de baixas quantidades de amostra e de gerar dispositivos que são descartáveis também reforçam as vantagens, a versatilidade e a menor complexidade no emprego deste tipo de substrato para aplicações analíticas [35]. O crescimento significativo desta área de pesquisa se deu a partir do trabalho de Martinez et al. [36], que reportou a criação de barreiras hidrofóbicas para o controle do fluxo no papel a partir de um fotoresiste e demonstrou a possibilidade de detectar de forma simultânea glicose e proteína albumina de soro bovino (BSA) em amostra de urina por meio de ensaio
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colorimétrico. Desde então, as mais diversas estratégias têm sido desenvolvidas e contribuído para o avanço dos estudos na geração de plataformas portáteis, simplificadas e de baixo custo para aplicações em point-of-care, assim como diferentes métodos de fabricação e detecção [37].
1.2.1 Métodos de fabricação dos µPADs com foco nos procedimentos de impressão à cera e corte à laser
Uma variedade de métodos para a fabricação de dispositivos à base de papel tem sido reportada na literatura tais como por corte (manual, impressora com lâmina de corte ou à laser); impressão (à cera, jato de tinta); estampagem; desenho à mão (canetas com tintas hidrofóbicas, giz de cera); fotolitografia, entre outros. Cada procedimento possui suas vantagens e desvantagens e a escolha dependerá da resolução requerida, do tipo de aplicação e da compatibilidade dos materiais empregados na formação das barreiras hidrofóbicas e consequentemente dos canais microfluídicos com os reagentes que serão empregados em cada análise [38, 39].
O método por impressão à cera domina este cenário pela simplicidade de utilização da técnica, que consiste basicamente na impressão de um padrão gerado a partir de um software computacional, seguido de um tratamento térmico em um forno ou sobre uma chapa de aquecimento, para que ocorra a fusão da cera e sua penetração nos poros do papel, levando à formação das barreiras hidrofóbicas. O custo deste procedimento é bastante baixo, permite a fabricação de muitos dispositivos a partir de uma única impressão, e consiste de um método rápido e eficiente na construção de plataformas à base de papel [40].
Bhakta et al. [41] desenvolveram um dispositivo à base de papel fabricado por meio de impressão à cera, baseado na formação das barreiras hidrofóbicas após tratamento térmico, para detecção colorimétrica de nitrito em amostra de saliva. A arquitetura do dispositivo consistiu de quatro zonas teste, todas aplicadas para análise do mesmo analito, com possibilidade de detecção simultânea de outros compostos (Figura 1B). O método de fabricação se mostrou efetivo na criação dos canais hidrofílicos e no direcionamento da amostra pelos canais microfluídicos pela ação da capilaridade.
Lewis et al. [42] reportaram que também é possível construir dispositivos em 3D de forma simplificada empregando padrões impressos por meio de impressão à cera (Figura 1A). Nesta metodologia, as folhas foram unidas por meio de adesivo em spray após a
formação das barreiras hidrofóbicas, com alinhamento realizado a partir das arestas do papel. Em experimentos realizados com corantes, os autores demonstraram que estes percolaram por canais separados e não houve vazamento da amostra entre as camadas do dispositivo, comprovando a eficácia na adesão das folhas e do alinhamento dos canais microfluídicos bem como das barreiras hidrofóbicas.
Entretanto, para ensaios que envolvem em alguma etapa a utilização de compostos incompatíveis com a cera tais como solventes orgânicos e surfactantes [37], a barreira hidrofóbica pode ser comprometida e consequentemente interferir no resultado da análise. Neste contexto, o corte a laser consiste em uma alternativa viável na formação de estruturas em alta resolução, inclusive em microescala, com baixo custo relativo e possibilita que as próprias bordas ou estruturas ocas geradas pela ação do laser atuem como barreiras hidrofóbicas e delimitem os canais microfluídicos [43].
Adicionalmente, para dispositivos formados a partir da associação de diferentes tipos de materiais tais como os sistemas de imunoensaio em fluxo lateral, que utilizam uma variedade de substratos (celulose, membrana de fibra de vidro, nitrocelulose) de diferentes propriedades (espessura, composição), além da base (geralmente polimérica) utilizada como suporte para a montagem do dispositivo, a técnica demonstra ser bastante versátil pela possibilidade de ajuste dos parâmetros requeridos no corte de cada material [44]. Cabe ressaltar que a maior parte destes testes biológicos empregam soluções contendo surfactante na composição [45] (para evitar interações não específicas e lavagem), o que inviabilizaria o uso da utilização da cera na fabricação dos dispositivos.
Nie et. al. [46] demonstraram por meio da técnica de impressão à laser, a criação de um padrão com estruturas ocas em plataforma à base de papel, que foram utilizadas na delimitação dos canais hidrofílicos para percolação da amostra (Figura 1C). Por meio de um ensaio colorimétrico, foi possível determinar simultaneamente glicose e BSA em amostra artificial de urina, de modo qualitativo e semi-quantitativo, além de comprovar a eficácia do método de fabricação dos µPADs em uma única etapa. Segundo os autores, o procedimento é extremamente rápido, de baixo custo e de grande potencial na produção de dispositivos em larga escala.
Fu et al. [47] utilizaram o método de fabricação de µPAD por corte à laser na geração de uma estrutura contendo três entradas para a aplicação em sistema de imunoensaio em fluxo lateral para a detecção da proteína-2 rica em histidina, cujas múltiplas etapas do ensaio, inclusive a amplificação do sinal, foram realizadas de forma automatizada. Os autores ainda reportaram que todos os papéis empregados na confecção do dispositivo para estocagem dos
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reagentes e na realização do ensaio, além da estrutura de plástico para construção do invólucro foram obtidos pelo mesmo método de corte. Cabe ressaltar que em uma das etapas do procedimento que corresponde à lavagem, foi utilizada uma solução tampão contendo um surfactante (Tween 20).
Figura 1. A) Método de fabricação de dispositivos em 3D empregando padrões impressos à cera - Reproduced from Ref. 42 with permission from The Royal Society of Chemistry; B) Arquitetura do dispositivo construído por meio da criação de barreiras hidrofóbicas por impressão à cera - Reprinted from Ref. 41 with permission from Elsevier; C) Estruturas ocas geradas após o processo de impressão à laser, delimitando os canais hidrofílicos para percolação da amostra - Reproduced from Ref. 46 with permission from The Royal Society of Chemistry.
Após a escolha do método de fabricação mais adequado para cada tipo de aplicação, a definição da estratégia de detecção é essencial para promover uma sensibilidade adequada na determinação do analito.
1.2.2 A simplicidade da detecção colorimétrica em µPADs para ensaios qualitativos e quantitativos direcionados ao diagnóstico clínico
No desenvolvimento de dispositivos analíticos à base de papel, as detecções colorimétrica, eletroquímica, por eletroquimioluminescência e luminescência são os métodos mais comumente empregados para este tipo de plataforma [48]. Devido à maior simplicidade, rapidez e a possibilidade de obtenção de respostas qualitativas (sim/não), semi-quantitativas e quantitativas, a detecção colorimétrica constitui de uma ferramenta de grande versatilidade, de baixo custo relativo e a mais almejada para aplicação em sistemas que visam à realização de medidas em campo e locais com pouca infraestrutura, sem a necessidade de instrumentação sofisticada [38, 49].
Nestes sistemas, diferentes abordagens podem ser empregadas para a geração de cor. As nanopartículas (NPs) (ouro, prata, látex) são um dos principais materiais utilizados para esta finalidade, sendo a de ouro a mais popular. Sua propriedade óptica aliada à biocompatibilidade permite sua conjugação com material genético, antígenos e anticorpos e possibilita a atuação como marcador em bioensaios [50, 51]. No entanto, estas NPs podem apresentar limitações quando uma alta sensibilidade é requerida, como por exemplo, no diagnóstico precoce de doenças, devido a sua baixa intensidade de coloração [52]. Além disso, o controle das condições para a imobilização de anticorpos de forma orientada em sua superfície é um fator crítico na eficácia do reconhecimento biológico [53].
Por outro lado, os métodos baseados em reações enzimáticas, com destaque para as enzimas oxidases, são muito explorados, uma vez que as suas propriedades catalíticas permitem a formação de uma quantidade bastante significativa do produto detectável a partir de um substrato que apresenta alteração na cor pela mudança do seu estado de oxidação [51], o que contribui para um aumento de sensibilidade e consequentemente na diminuição dos limites de detecção em ensaios de diagnóstico. Já no caso dos imunoensaios em plataformas de papel, a enzima peroxidase é uma das mais empregadas como marcador do anticorpo de detecção, além da fosfatase alcalina (hidrolase) [54].
Neste contexto, para aplicações em que a identificação da presença ou ausência de um analito na amostra já é suficiente como resposta, ensaios qualitativos podem ser realizados e os resultados obtidos por meio de observação a olho nu (Figura 2A). São os casos de muitos testes rápidos imunocromatográficos para diagnóstico clínico como o de gravidez e testes para a identificação de biomarcadores específicos para doenças infecciosas como a dengue,
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Chikungunya, malária, leishmaniose, dentre outras patologias. Cabe ressaltar que estes dispositivos são ideais para serem empregados principalmente em situações em que o tempo para obtenção do diagnóstico é crítico para o estado de saúde do paciente [35, 55-57].
Em análises semi-quantitativas, a interpretação visual correspondente à coloração obtida para o ensaio é comparada com um padrão de cor empregado como referência, que permite estimar a concentração do analito na amostra. Jain et al. [58] reportaram um estudo de avaliação do desempenho de um dispositivo à base de papel para detecção colorimétrica da proteína alanina aminotransferase (ALT), utilizado na identificação de doenças do fígado, cuja comparação visual dos resultados com uma escala de cores possibilitou estimar sua concentração e também classificar em que faixa de valor a amostra se localizava acima do limite superior.
Wang et al. [59] desenvolveram um dispositivo à base de papel para detecção colorimétrica semi-quantitativa de BSA baseado em sua interação com o azul de bromofenol. A plataforma foi construída no formato de uma árvore contendo sete ramificações, sendo que nas ramificações de 1-6 foram adicionados spots de concentrações crescentes e conhecidas de BSA e a sétima consistiu do spot de uma amostra artificial de urina contendo uma quantidade específica do analito (Figura 2B). A comparação visual dos resultados permitiu estimar a concentração de BSA nesta amostra utilizando a própria calibração do dispositivo, sendo a comparação realizada pela faixa de concentração relativa à intensidade de coloração.
Uma das grandes limitações dos testes semi-quantitativos é que muitas vezes a sensibilidade requerida para análises clínicas não atende aos requisitos necessários para o diagnóstico. Adicionalmente, o resultado do ensaio pode sofrer influência das diferentes percepções visuais de cada observador e consequentemente aumenta a possibilidade de gerar conclusões errôneas, o que tem influenciado o desenvolvimento de diferentes estratégias para a obtenção de medidas quantitativas a partir de ensaios colorimétricos de forma mais precisa, mantendo o foco em sistemas simplificados para aplicação em point-of-care [60, 61].
Com o objetivo de promover a maior precisão em medidas quantitativas, os métodos mais comuns são os realizados por análise de imagem obtidas por meio de scanner [62, 63] ou pela câmera digital dos smartphones [26], cuja quantificação pode ser obtida também de forma direta por aplicativos específicos [64]. Em geral, as imagens são convertidas em uma escala de cores e intensidade é medida por meio de software computacional, sendo esta proporcional à concentração do analito [65].
Uma abordagem simplificada em plataforma à base de papel para a detecção colorimétrica quantitativa de cocaína em urina foi reportada por Wei et al. [66] por meio de
observação visual e medidas baseadas em distância, sem a necessidade de nenhum equipamento para a obtenção do resultado. O procedimento consistiu na utilização de um hidrogel, contendo enzima glicoamilase oclusa, formado a partir de um aptâmero. Ao reconhecer o analito, o hidrogel se desfaz e libera a glicoamilase e consequentemente glicose, que ao percolar pelo papel inicia uma reação enzimática em cascata. Na presença de glicose oxidase, há geração de peróxido de hidrogênio e na presença de peroxidase e do substrato cromogênico 3,3’-Diaminobenzidina (DAB), um produto insolúvel colorido se forma, cuja distância percorrida é proporcional à concentração do analito na amostra.
Outra vertente que se apresenta como destaque no desenvolvimento de dispositivos colorimétricos à base de papel fundamenta-se no emprego de reagentes hidrofóbicos (de baixo peso molecular ou polímeros) que respondem seletivamente a um analito, levando a formação de produtos menores e mais hidrofílicos que o composto inicial, permitindo a percolação da amostra por canais microfluídicos. Nesta estratégia, o monitoramento da concentração do analito é obtido pelo por meio de medidas baseadas na observação de cor e medidas de tempo através de um cronômetro [67-70].
Lewis et al. [67] empregaram um reagente hidrofóbico (monômero) que responde seletivamente para peróxido de hidrogênio no desenvolvimento de uma estratégia de detecção em plataforma em 3D à base de papel, sem a necessidade de utilizar equipamentos eletrônicos externos para a realização das medidas quantitativas do analito. Baseados nas mudanças da propriedade físico-química do papel modificado de hidrofóbico para hidrofílico na presença do analito, a concentração de peróxido de hidrogênio foi relacionada com o tempo necessário para a eluição da amostra, que ao percolar pelo dispositivo, redissolve um corante alimentício e possibilita a visualização da cor, seguido da leitura (Figura 2C). O limite de detecção obtido para o peróxido de hidrogênio neste ensaio foi de 0,7 mmol L-1.
Em outro estudo reportado por Lewis et al. [69] foi demonstrado o emprego de um oligômero como reagente hidrofóbico ao invés de um monômero. A quantificação do analito foi baseada em medidas no tempo para a eluição da amostra pelos canais microfluídicos, como resultado de uma despolimerização do oligômero pela presença do analito, que leva à mudanças nas propriedades físico-químicas de hidrofóbica para hidrofílica. Além disso, por meio de uma reação de despolimerização em cascata, há uma amplificação de sinal em função do emprego deste composto. Neste estudo, foi possível quantificar enzimas ativas (fosfatase alcalina e -galactosidase) de forma indireta, atingindo um limite de detecção da ordem de pmol L-1 na detecção da fosfatase alcalina em amostra complexa (soro).
INTRODUÇÃO 33
Cabe ressaltar que este tipo de estratégia é muito interessante no desenvolvimento de plataformas simplificadas para aplicação em point-of-care. No caso dos compostos seletivos para a detecção de peróxido de hidrogênio, sistemas enzimáticos que gerem este produto (o caso de muitas enzimas oxidases), podem ser configurados em dispositivos de papel de modo a atuar na geração de plataformas para a realização de bioensaios. Há inclusive a possibilidade de acoplar estas plataformas em 3D em testes de imunoensaio em fluxo lateral, conforme será demonstrado em um dos trabalhos desenvolvidos nesta tese e que representa uma grande perspectiva na obtenção de plataformas altamente sensíveis.
Figura 2. Exemplos de ensaios com detecção colorimétrica de modo qualitativo (A) - Reproduced from Ref. 57 with permission from The Royal Society of Chemistry; semi-quantitativo (B) - Reprinted from Ref. 59 with permission from Elsevier; quantitativo (C) - Reprinted from Ref. 67 by permission of John Wiley & Sons, Inc. Copyright 2012 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim.
1.3 Imunossensores: importância no diagnóstico clínico
Um dos principais requisitos para análises de diagnóstico clínico é a exigência de que o método utilizado seja de extrema confiabilidade para a detecção de um analito nas concentrações adequadas/requeridas, uma vez que o resultado obtido é decisivo na identificação de uma patologia e do estabelecimento de procedimentos para o tratamento. Neste contexto, destacam-se os imunossensores, que são caracterizados por serem métodos de alta sensibilidade e seletividade, atribuído à grande especificidade entre o antígeno e o anticorpo, sendo estas as razões predominantes que justificam sua aplicação em muitos ensaios [71, 72].
No cenário atual, caracterizado pela crescente demanda no desenvolvimento de dispositivos point-of-care, os sistemas de imunoensaio em fluxo lateral cada vez mais se destacam pela simplicidade, baixo custo, alta sensibilidade e rapidez na obtenção dos resultados, o que tem impulsionado os estudos nesta área de pesquisa [73]
1.3.1 Imunoensaio em fluxo lateral (LFIA)
Os sistemas de imunoensaio em fluxo lateral, também conhecidos como testes imunocromatográficos, representam uma forma de diagnóstico à base de papel amplamente utilizada e adequada para aplicação em campo. Uma das grandes vantagens destes testes rápidos é o fato da análise ser realizada sem qualquer pré-tratamento da amostra, além de não necessitar de usuários treinados para sua manipulação e obtenção dos resultados. Estes testes em sua maioria são qualitativos ou semi-quantitativos e bastante indicados em processos de triagem. Uma das plataformas mais conhecidas disponível comercialmente é o teste de gravidez, cuja análise é realizada pelo monitoramento da glicoproteína hormonal gonadotrofina coriônica humana (hCG) [74, 75].
O formato tradicional dos testes de imunoensaio em fluxo lateral (Figura 3) consiste da associação de diferentes tipos de papel que apresentam funções específicas [76, 77], conforme descrito a seguir:
1) Membrana para a adição da amostra: normalmente constituídas de celulose ou membrana de fibra de vidro, sua principal função é receber a amostra, filtrar e reter contaminantes ou as células vermelhas do sangue quando for o caso, além de promover uma
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liberação eficiente do analito e consequentemente promover a distribuição da amostra para a membrana do conjugado.
2) Membrana do conjugado: usualmente de composição de fibra de vidro, esta membrana atua na estocagem dos anticorpos de detecção, que estão conjugados com algum tipo de marcador, e que irão interagir com o antígeno, sendo responsável por mantê-los estáveis e liberá-los de forma eficiente para a membrana de reação.
3) Membrana de reação: composto por nitrocelulose, que possibilita a imobilização dos anticorpos de captura de forma direta por uma contribuição tanto de interações hidrofóbicas quanto eletrostáticas, esta membrana representa o local de ocorrência da reação de reconhecimento biológico antígeno-anticorpo e também onde a detecção será realizada. Na linha teste, são imobilizados anticorpos que são responsáveis pelo reconhecimento do antígeno, enquanto a linha controle contém anti-anticorpos, que reconhecem de forma específica os anticorpos de detecção.
4) Membrana absorvente: constituída de celulose, esta membrana é utilizada como um reservatório do líquido que está sendo conduzido pela membrana pela ação da capilaridade e responsável por manter o fluxo da amostra pelo dispositivo.
Assim, o princípio de funcionamento do dispositivo está baseado inicialmente na adição na adição da amostra em uma membrana, onde o líquido é filtrado e os compostos indesejáveis ficam retidos. Após, o analito é submetido a uma migração, impulsionado pela ação da capilaridade, até a membrana do conjugado, local em que se liga seletivamente com os anticorpos de detecção que estão conjugados com algum marcador para possibilitar a geração do sinal colorimétrico. A interação do analito com moléculas de captura específicas é realizada na membrana de reação, possibilitando a leitura do resultado do diagnóstico [6].
Figura 3. Configuração típica de um teste de imunoensaio em fluxo lateral. Adaptado de B. O’Farrell (2009) [76].
Para imunoensaios direcionados à detecção de biomarcadores, que são moléculas biológicas que estão associadas à identificação e monitoramento de uma patologia ou relacionados à desordem de alguma função no organismo [78], o ensaio do tipo sanduíche é o mais empregado e consiste na utilização de dois tipos de anticorpos (captura e detecção), direcionados a diferentes epítopos do antígeno [79]. O anticorpo de detecção, conjugado com algum tipo de marcador tais como nanopartículas e enzimas, conforme descrito na seção 1.2.2, será responsável pela geração do sinal colorimétrico na zona de detecção do dispositivo. Em face dos desafios para atingir os requisitos da OMS na geração dos dispositivos do tipo point-of-care, algumas das novas tendências no desenvolvimento de sistemas LFIA incluem estratégias para aumentar a sensibilidade na detecção colorimétrica pela utilização de métodos de amplificação de sinal em sistemas envolvendo enzimas e nanopartículas [45, 80], sistemas integrados e automatizados [81], mudanças na arquitetura do dispositivo [82], detecção multiplexada de diferentes biomarcadores [57], além de perspectivas de acoplar sistemas LFIA com estratégias de detecção quantitativa de forma simplificada e sem o uso de equipamentos externos [69, 70, 83].
MOTIVAÇÃO 37
2 MOTIVAÇÃO PARA O DESENVOLVIMENTO DA TESE
Diante de toda a problemática exposta, fica evidente a importância e a necessidade de se desenvolver sistemas cada vez mais simplificados, de baixo custo e altamente sensíveis para diagnóstico clínico, de modo a aumentar a acessibilidade dos testes rápidos principalmente em locais de pouca infraestrutura e desta maneira contribuir com a sociedade auxiliando no controle dos problemas de saúde pública ocasionados por uma série de doenças graves. Além disso, para o diagnóstico precoce, ou em situações de emergência, onde o tempo é crítico para o estado de saúde do paciente, por meio da identificação do problema é possível iniciar um tratamento imediato e possibilitar um aumento nos índices de sobrevivência.
Este trabalho científico envolveu o estudo de diferentes abordagens na detecção colorimétrica qualitativa e quantitativa de biomarcadores para diagnóstico clínico em plataformas à base de papel. A primeira estratégia consistiu no entendimento dos princípios de funcionamento do dispositivo de imunoensaio em fluxo lateral, que permitiu avaliar as etapas críticas e consequentemente proporcionar as melhores condições experimentais para atingir a sensibilidade desejada na detecção de baixas concentrações da proteína HRP2, biomarcador da malária causada pelo Plasmodium falciparum, com a finalidade de possibilitar um diagnóstico precoce da doença. Ao final dos estudos, o sistema foi aplicado para amostras de sangue de pacientes infectados pela doença.
Em outro estudo, com o intuito de proporcionar uma segunda geração do dispositivo, foi construída uma plataforma em 3D capaz de realizar imunoensaios de forma quantitativa, automatizada e com amplificação de sinal por meio da utilização de um novo material polimérico que responde seletivamente para peróxido de hidrogênio, necessitando apenas de um cronômetro na obtenção dos dados para posterior análise dos resultados e quantificação do analito. O sistema foi aplicado em estudos inicias para a deteção da proteína creatina quinase (CK-MB), um dos biomarcadores indicado para o diagnóstico do infarto agudo do miocárdio.
Cabe ressaltar que esta é a primeira tese com o tema de imunoensaio em fluxo lateral que foi desenvolvida no Laboratório de Eletroquímica, Eletroanalítica e Desenvolvimento de Sensores (LEEDS) da Unicamp/Brasil, sob coordenação do Prof. Dr. Lauro Tatsuo Kubota, sendo complementada pelo trabalho desenvolvido durante o estágio realizado na The
Pennsylvania State University/USA sob orientação do Prof. Dr. Scott T. Phillips. Espera-se
desta maneira que este trabalho contribua para a consolidação desta linha de pesquisa no grupo, abrindo novas perspectivas para a evolução destas plataformas.
3 OBJETIVOS
O objetivo geral deste trabalho consiste na construção e aplicação de dispositivos analíticos à base de papel na detecção colorimétrica de biomarcadores para diagnóstico clínico de modo qualitativo e quantitativo empregando sistema de imunoensaio em fluxo lateral.
Objetivos específicos:
Entendimento do funcionamento do sistema de imunoensaio em fluxo lateral (LFIA)
Avaliação das condições experimentais para a detecção da proteína-2 rica em histidina (HRP2), biomarcador da malária causada pelo Plasmodium falciparum
Construção da curva analítica para a proteína HRP2 e obtenção do limite de detecção para o ensaio
Aplicação do dispositivo para amostras de sangue periférico humano de pacientes infectados pela malária
Inclusão de uma zona controle no dispositivo para validação do imunoensaio e avaliação sistemática do funcionamento da plataforma
Construção de um sistema de detecção em 3D á base de papel contendo um novo polímero da classe dos poli(benzil éteres) que responde seletivamente para peróxido de hidrogênio
Avaliação das melhores condições para deposição do polímero pelo método manual por meio de microcapilar ou automático empregando um robô de manuseamento de líquidos
Construção de curvas analíticas para peróxido de hidrogênio para diferentes concentrações do polímero e obtenção dos limites de detecção e quantificação
Acoplamento da plataforma em 3D como sistema de detecção em dispositivo de imunoensaio em fluxo lateral para a quantificação da isoenzima MB da creatina quinase (CK-MB), um dos biomarcadores para o diagnóstico do infarto agudo do miocárdio.
