UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
ANA CAROLINA ANDRADE VITOR KAYANO
DISTÚRBIO DA COAGULAÇÃO DA MALÁRIA CEREBRAL
EXPERIMENTAL
CAMPINAS 2016
DISTÚRBIO DA COAGULAÇÃO DA MALÁRIA CEREBRAL
EXPERIMENTAL
Tese apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do Título de Doutora em Genética e Biologia Molecular, na área de Imunologia.
ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA ANA CAROLINA ANDRADE VITOR KAYANOE ORIENTADA PELO PROF. DR. FABIO TRINDADE MARANHÃO COSTA
Orientador: FABIO TRINDADE MARANHÃO COSTA
CAMPINAS 2016
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. Fabio Trindade Maranhão Costa (Orientador)
Prof. Dr. Robson de Queiroz Monteiro
Prof. Dr. Claudio Romero Farias Marinho
Profa. Dra. Fernanda Loureiro de Andrade Orsi
Profa. Dra. Selma Giorgio
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que
se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
A Deus, meu guia e protetor. Aos meus queridos pais. Meus guerreiros que diariamente esboçam seu profundo amor pela família e pela vida. Meus exemplos de força e fé.
Ao Ricardo e à Alice, a melhor parte de mim.
Ao Prof. Dr. Fabio Trindade Maranhão Costa pela confiança, pelo comprometimento na realização deste projeto, por estar sempre aberto às novas ideias, por estimular a autonomia acreditando no potencial de cada um e pela sua compreensão e preocupação nos momentos difíceis que passei.
Aos colaboradores que ajudaram na realização desse projeto: João dos Santos, Marcele Bastos, Juliana Almeida Leite, Carla Judice, Natália Almeida, Letusa Albrecht, Ana Claudia Nery-Diez, Tallita Vassequi, Danielle Pereira, Ana Carolina Naime, Yzabella Nogueira, Claudio Werneck, Cristina Vicente, Julio Aliberti, Erich de Paula. Muito obrigada pelo aprendizado, disposição e dedicação. Vocês foram incríveis! Quero agradecer especialmente ao Jonnhy e à Marcele que foram meus parceiros fiéis de experimentos, à Carla e Juliana que foram essenciais para a finalização desse projeto e ao Dr. Erich e Dr. Julio Aliberti pelas sugestões e discussões.
Aos amigos e colegas que foram membros ou que ainda compõem o LIPEX. Ju, Ma, Yarinha, Ogrura, Suculenta, Letusita, Stef, Jonnhy, Naj, Tati, Catarina, Carla e Gustavo obrigada por terem feito do LIPEX um grupo muito agradável, unido e solícito em ajudar (inclusive nos cuidados com Alice). À querida Ana sempre tão eficiente e organizada. Obrigada por refrescar nossa memória e facilitar nosso trabalho.
Aos grandes amigos que ganhei durante esses anos de convívio no Instituto de biologia. Luci, Dani, Ana, Camis, Talittona, Tanuci, Bolinha, Neto e Érika obrigada pelas dicas, palavras de incentivo, troca de experiência e ajuda.
Ao Ricardo e Alice, meus grandes amores. Obrigada por simplesmente existirem em minha vida. Vocês tornaram essa jornada mais leve, empolgante e divertida.
Aos meus pais e minhas queridas irmãs, meus grandes incentivadores, pelas orações, pelo amor e apoio incondicional.
Ao programa de pós-graduação e à querida Lourdes pelas recomendações, paciência e esclarecimentos das normas e regras nos processos de qualificação, pré-banca e defesa.
Plasmodium falciparum, levando a óbito milhares de pessoas todos os anos. Apesar dos avanços
científicos para desvendar os fatores responsáveis pela MC, sua patogênese não é bem compreendida. MC é uma síndrome multifatorial envolvendo o sequestro de parasitos na microvasculatura e o aumento da expressão de citocinas pró-inflamatórias. Estes fatores, apesar de não estar claro como estão orquestrados, acarretam em disfunção endotelial e coagulopatia, contribuindo de maneira significativa no comprometimento clínico. Sendo assim, o entendimento dos mecanismos relacionados à coagulopatia na malária cerebral abre novas perspectivas para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas. Neste trabalho utilizamos o modelo de malária cerebral pela infecção de camundongos C57BL/6 por Plasmodium berghei ANKA (PbA). Com o intuito de assegurar se a malária cerebral experimental (MCE) estaria marcada por uma disfunção no processo de coagulação, similar às infecções em humanos, animais infectados com PbA foram submetidos à cirurgia para indução fotoquímica do trombo arterial e o tempo de formação do trombo foi determinado. Estes ensaios mostraram que na MCE existe um fenótipo pró-trombótico dependente de células imunocompetentes e cepa específica, uma vez que animais infectados por P. berghei NK65 (linhagem que não causa malária cerebral) não apresentaram disfunção equivalente.
Ainda, a presença do parasito parece ser fundamental no processo de coagulopatia, assim como de linfócitos T CD8+. A disfunção da hemostasia também foi demonstrada no cérebro desses animais através do aumento da expressão de icam1, tf e epcr e do elevado tempo de retenção das plaquetas nos vasos cerebrais. Além disso, o aumento do complexo trombina- antitrombina e do tempo de lise da euglobulina, juntamente com os níveis elevados do
inibidor do ativador do plasminogênio (PAI-1), indicam uma hipercoagulabilidade, com ativação da coagulação associada à diminuição da degradação de fibrina. Para determinar se este fenótipo estaria relacionado ao desenvolvimento da doença, os animais foram tratados com ácido tranexâmico (inibidor do sistema fibrinolítico) e posteriormente infectados por PbA. Os camundongos apresentaram uma morte prematura em relação aos não tratados, bem como um aumento da expressão de tnfa, ifng e prf1. Além disso, camundongos deficientes em
PAI-1 (PAI-/-) infectados por PbA não sucumbiram a MCE e essa proteção foi associada aos níveis baixos de moléculas inflamatórias e prevenção da ativação endotelial. Isso mostra que a MCE, assim como a disfunção endotelial, é dependente da presença de PAI-1. Coletivamente,
infection which leads to death thousands of people every year. Despite scientific advances to unveil the factors responsible for CM, its pathogenesis is not well understood. CM is a multifactorial syndrome involving parasite sequestration in the microvasculature and increased expression of proinflammatory cytokines. Although it is not clear how these factors are orchestrated, they result in endothelial dysfunction and coagulopathy that contribute significantly in clinical aggravation. Thus, the understanding of coagulopathy mechanims related to cerebral malaria opens new perspectives for the development of therapeutic strategies. In this work we use the cerebral malaria model: C57BL/6 mice infected by Plasmodium berghei ANKA (PbA). To ensure that experimental cerebral malaria (ECM) was characterized by a dysfunction in the coagulation process, similar to human infections, PbA- infected mice were submitted to surgery for induction of photochemically arterial thrombus and time for thrombus formation was determined. These tests showed that the ECM has a prothrombotic phenotype dependent of immuno-competent cells and strain specific, since animals infected with P.
berghei NK65 (non cerebral strain) showed no equivalent
dysfunction. Furthermore, the presence of the parasite appears to be critical in the coagulopathy process as well as CD8+ T lymphocytes. The dysfunction of hemostasis was also demonstrated in the brain of these animals through increased expression of icam1, tf and epcr and elevated retention time of platelets in the brain vessels. Furthermore, the increase in
thrombin-antithrombin and the euglobulin lysis time, together with high levels of inhibitor of plasminogen activator (PAI-1) indicate a hypercoagulability, with activation of coagulation associated with decreased fibrin degradation. To determine whether this phenotype could be related to the disease development, animals were treated with tranexamic acid (an inhibitor of the fibrinolytic system) and subsequently infected with PbA. The mice showed an early death compared to untreated group, as well as increased expression of tnfa, ifng and prf1. Furthermore, mice deficient in PAI-1 (PAI-1-/-) infected with PbA did not succumbed to ECM and protection was associated with low levels of inflammatory molecules and prevention of endothelial activation. These findings show that ECM, as well as endothelial dysfunction is dependent on the presence of PAI-1. Collectively, these findings open new perspectives for the understanding of the cerebral malaria pathophysiology and the design of new therapeutic approaches.
E SIGLAS
ACT Terapia Combinada à base de Artemisinina ADP Adenosina Difosfato
Ang Angiopoietina
TTPA Tempo da Tromboplastina Parcial Ativada AT Antitrombina
EI Eritrócitos infectados
EPCR Receptor Endotelial da Proteína C FT Fator Tecidual
ICAM-1 Molécula de Adesão Intercelular-1 IFN Interferon
MC Malária cerebral
MCE Malária Cerebral Experimental NI Não Infectado
PAI-1 Inibidor do Ativador do Plasminogênio PAR Receptor Ativado por Protease
PbA Plasmodium berghei ANKA
PbNK Plasmodium berghei NK65
PC Proteína C
PT Tempo de Protrombina TAT Trombina-Antitrombina TAFI
TFPI TM
Inibidor da Fibrinólise Ativado pela Trombina Inibidor da via do Fator Tecidual
Trombomodulina
TNF tPA TXA uPA
Fator de Necrose Tumoral
Ativador do Plasminogênio do tipo Tecidual Ácido Tranexâmico
Ativador do Plasminogênio do tipo Uroquinase vWF Fator de Von Willebrand
JUSTIFICATIVA… ... 34 OBJETIVOS ... 35 METODOLOGIA… ... 36 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 42 CONCLUSÕES ... 64 REFERÊNCIAS… ... 65 ANEXOS ... 81
INTRODUÇÃO
Aspectos gerais da maláriaA malária é uma doença infecciosa amplamente distribuída que atinge regiões tropicais e subtropicais do globo (Figura 1) e expõe ao risco de infecção 3,3 bilhões de pessoas distribuídas em 97 países. No mundo, em 2015, foram reportados 214 milhões de casos e 438 mil mortes, principalmente de crianças e de mulheres grávidas (WHO, 2015). Os mais afetados são países de baixa renda. Cerca de 80% dos casos e 90% das mortes ocorrem na África, sendo 78% dessas mortes de crianças abaixo de 5 anos (WHO, 2014). De fato, no mundo, a malária está entre as cinco principais causas de morte em crianças abaixo de 5 anos (Kyu et al., 2016).
Figura 1. Áreas de transmissão de Malária no Mundo. Fonte: WHO, 2014 adaptado.
No Brasil, nos últimos 12 anos, uma média de 400 mil casos por ano foram notificados (Sampaio et al., 2015). A região Amazônica composta pelos estados do Acre, Amazonas, Amapá, Maranhão, Mato Grosso, Pará, Rondônia, Roraima e Tocantins é a mais afetada, sendo responsável por quase a totalidade dessas infecções no país (Figura 2). Em 2013, foram reportados aproximadamente 180 mil casos de malária e 41 mortes (WHO, 2014).
Figura 2. Mapa de Risco da Malária por município de infecção, Brasil, 2014.
Fonte: Sinan/SVS/MS e Sivep-Malária/SVS/MS (http://portalsaude.saude.gov.br).
O causador da malária é um protozoário pertencente ao filo Apicomplexa, ordem Coccidia, família Plasmodiidae e gênero Plasmodium. Apesar de existirem várias espécies de Plasmodium em diversos hospedeiros vertebrados, somente 5 parasitam o homem. São eles:
P. falciparum, P. vivax, P. malariae, P. ovale e P. knowlesi. Plasmodium falciparum, espécie
prevalente no continente africano, é a mais virulenta e responsável pela alta taxa de mortalidade. Em contraste, P. vivax é a espécie mais distribuída mundialmente e a que prevalece no Brasil, responsável por 82% das infeções. Apesar da baixa taxa de mortalidade devido às infecções por
P. vivax, houve um aumento no número de casos graves e isso tem sido motivo de preocupação
(Oliveira-Ferreira et al., 2010; Rahimi et al., 2014). P. knowlesi, anteriormente conhecido por ser um parasito em primatas, vem sendo reportado em infecções em humanos pela transmissão entre homem e símios com aumento no número de casos principalmente na Malásia (Müller and Schlagenhauf, 2014). P. knowlesi juntamente com P. malariae e P. ovale apresentam número reduzido de casos em comparação às duas outras espécies.
A transmissão da malária ocorre pela picada de um mosquito fêmea durante o repasto sanguíneo. Este mosquito pertence ao gênero Anopheles, ordem Diptera, família Culicidae. Existem mais de 400 espécies de Anopheles e, dessas, 70 são vetores da malária. No Brasil, as
espécies mais prevalentes são A. darlingi, A. aquasalis e An. albitarsis (Sinka et al., 2010) e no continente africano, é o An. gambiae.
O ciclo do Plasmodium spp. ocorre especificamente em dois tipos de hospedeiro, em um vertebrado e um invertebrado nos quais acontece a reprodução assexuada por esquizogonia (divisão citoplasmática precedida de divisão nuclear) e sexuada, respectivamente. A infecção se inicia no homem quando as formas esporozoíticas são inoculadas na pele desse hospedeiro pelo vetor durante a hematofagia (Figura 3). Essas formas na pele podem alcançar ativamente a corrente sanguínea (Gueirard et al., 2010) e ao atingirem o fígado atravessam as células do hospedeiro e invadem os hepatócitos (Tavares et al., 2013). Nos hepatócitos, o parasito se diferencia e se multiplica assexuadamente formando os merozoítos dentro de uma vesícula denominada merossomo. Os merozoítos, liberados a partir dos merossomos, alcançam a corrente sanguínea e invadem os eritrócitos dando início ao ciclo eritrocítico. Dentro das hemácias o parasito se reproduz por esquizogonia e assim se apresenta em diferentes formas, de trofozoíto a esquizonte, dependendo do estágio de desenvolvimento. O esquizonte, ao se romper, libera merozoítos que invadirão novos eritrócitos. O ciclo eritrocítico pode acontecer a cada 24, 48 ou 72 horas dependendo da espécie de Plasmodium e é responsável pela patogenia e manifestações clínicas da doença. Após algumas gerações de merozoítos, fatores ambientais e do hospedeiro determinam a diferenciação do parasito dando origem aos gametócitos (Guttery et al., 2015). Estes, ao serem ingeridos pelo inseto vetor, são ativados e se diferenciam em gametas e assim a fecundação acontece. O zigoto formado se desenvolve em uma forma com motilidade denominada oocineto que atravessa a parede do intestino. Ao final, novos esporozoítos, produzidos a partir do oocineto, são armazenados na glândula salivar do vetor e injetados em um próximo repasto sanguíneo (Aly et al., 2009).
Figura 3. Ciclo de vida do Plasmodium spp. Fonte: (Greenwood et al., 2008) adaptado.
O período de incubação é bastante variável (9-40 dias) e depende da espécie de plasmódio. Os primeiros sintomas da malária são inespecíficos e parecidos com uma infecção viral, com um quadro de dor de cabeça, fadiga, dor muscular normalmente acompanhada por febre, calafrios, vômitos e perda de peso. Em crianças, podem estar presentes letargia, tosse e falta de apetite. A doença pode evoluir para as formas graves dentro de poucas horas ou dias em que o paciente apresenta uma ou mais das seguintes manifestações clínicas: coma (malária cerebral-MC), acidose metabólica, anemia grave, hipoglicemia, insuficiência renal aguda e edema pulmonar (WHO, 2015). As infecções que evoluem para as formas graves são ocasionadas principalmente pelo P. falciparum (Wassmer et al., 2015). Os casos graves de malária por P. vivax são raros, mas se apresentam mais frequentemente como anemia grave e insuficiência respiratória. (Naing et al., 2014)
O controle da malária é baseado principalmente na quimioterapia e no combate ao mosquito. A quimioterapia visa à eliminação do parasito na sua fase sanguínea ou na sua fase hepática, sendo a maioria dos fármacos destinada ao ciclo eritrocítico. Existem vários medicamentos que compõem o tratamento da malária. Dentre eles estão o quinino, a cloroquina, a primaquina, a artemisinina e seus derivados, como o artesunato. A escolha do medicamento vai depender de inúmeros fatores, tais como a espécie do parasito, a gravidade do paciente, o grupo a que esse paciente pertence (adultos, crianças, grávidas e lactantes) e a presença de parasitos resistentes ao medicamento naquela região (WHO, 2015). Atualmente, a terapia combinada à base de artemisinina (ACT) está à frente no programa de erradicação dessa doença, ajudando na redução do número de casos e mortes (Enserink, 2007). A problemática no tratamento da malária está centrada na presença e disseminação de parasitos resistentes ao medicamento (Wongsrichanalai and Sibley, 2013). Isso aconteceu com a cloroquina e vem acontecendo com os derivados da artemisinina (Amaratunga et al., 2016; Phyo et al., 2012). Por isso a busca incessante de novos compostos com atividade antimalárica torna-se um grande desafio para a comunidade científica. Além do uso de ACT´s, algumas políticas para o controle da malária vêm sendo adotadas e têm mudado o panorama da malária em várias regiões. A quimioprevenção, o uso de mosqueteiro tratado com inseticida e o gerenciamento de casos (que inclui diagnóstico e tratamento) são algumas delas (WHO, 2015). Até o momento não existe uma vacina comercialmente disponível, porém 4 candidatos vacinais estão em teste, sendo que um deles, a RTS,S/AS01, está em fase mais avançada e obteve uma redução de 46% de incidência nos casos graves de malária em crianças (RTS, 2015). No entanto, a política para o seu uso ainda não foi determinada (WHO, 2015).
Malária Cerebral (MC)
Cerca de 1-2% das infecções por Plasmodium pode evoluir para as formas graves e quase a totalidade desses casos é atribuída à infecção por P. falciparum. As manifestações clínicas da malária falciparum grave diferem entre crianças e adultos, porém, a malária cerebral está presente nas duas faixas etárias. Nos adultos, os órgãos mais afetados são cérebro (MC), pulmões (síndrome respiratória aguda-ARDS), fígado (icterícia) e rins (insuficiência renal aguda). Em crianças, por outro lado, a malária cerebral, anemia grave e acidose são as complicações mais comuns (Wassmer et al., 2015).
A malária cerebral é uma síndrome neurológica e é a principal causa de morte nos casos de malária. A taxa de mortalidade atinge 18% das crianças da África e 30% dos adultos
do sudeste da Ásia mesmo que seja administrado o antimalárico apropriado (Dondorp et al., 2005; Dondorp et al., 2010). E, de aproximadamente 10% das crianças que sobrevivem, 25% apresentam déficit neurológico (Boivin et al., 2007; Kariuki et al., 2014). Dentre as sequelas que a malária cerebral pode causar estão a paralisia, perda de função cognitiva, epilepsia e distúrbio de comportamento (Christensen and Eslick, 2015). A malária cerebral é definida pela presença de formas assexuadas de P. falciparum em pacientes com coma persistindo por mais de 30 minutos após convulsão e sem nenhuma outra causa de encefalopatia (WHO, 2015). São características dessa síndrome: alteração nos níveis de consciência, confusão mental, episódios de convulsões, alterações cognitivas e comportamentais. Há também um aumento na pressão intracraniana (Newton et al., 1997), edema cerebral (Seydel et al., 2015), quebra da barreira hemato encefálica (Brown et al., 1999a), hipóxia e isquemia (Beare et al., 2009).
Os mecanismos de patogênese da malária cerebral ainda não foram completamente elucidados e, na literatura, não há um consenso sobre o principal fator desencadeante. Acredita-se que três componentes são fundamentais para o deAcredita-senvolvimento dessa síndrome: o Acredita-sequestro parasitário, a disfunção endotelial e a inflamação (Figura 4). A hipótese mais aceita é a de que estes processos não acontecem isoladamente, estando estritamente interligados e contribuindo para a patogênese dessa doença (Cunnington et al., 2013).
Figura 4. Patofisiologia da malária cerebral. Fonte: (Cunnington et al., 2013) adaptado.
O sequestro parasitário, que consiste na retirada de formas maduras da circulação periférica, é um fenômeno comum na malária cerebral. Esse sequestro acontece na microvasculatura de alguns órgãos pela adesão do eritrócito infectado ao endotélio. O parasito, dentro da hemácia, exporta uma proteína para a membrana dessa célula denominada PfEMP-1 (do inglês, Plasmodium falciparum erythrocyte membrane protein-1), que é altamente polimórfica, sendo codificada pela família de genes var. A PfEMP-1 liga-se a diferentes receptores presentes nas células do hospedeiro, conferindo ao parasito propriedades adesivas. Essa adesão pode ocorrer pela interação com alguns receptores como ICAM-1 (do inglês,
intercelular adhesion molecule 1), CD36 (receptor da trombopoetina), CSA (do inglês, chondroitin sulfate A) e EPCR (do inglês, endotelial protein C receptor). O parasito pode aderir
também a eritrócitos não infectados, formando as rosetas, e a eritrócitos infectados, fenômeno denominado aglutinação. Essa propriedade citoadesiva permite que o parasito
complete seu ciclo celular, multiplicando e invadindo novas hemácias sem ser removido pelo baço (Adams et al., 2014).
Os achados histopatológicos evidenciam a presença do parasito nos vasos cerebrais acompanhada ou não de hemorragias, trombo e monócitos (Dorovini-Zis et al., 2011; Grau et al., 2003). A explicação seria de que essa adesão de eritrócitos infectados (EI) e também de leucócitos mediada pelos receptores de adesão como ICAM-1 e VCAM, por exemplo, poderiam levar à congestão e oclusão mecânica dos vasos cerebrais com diminuição do fluxo sanguíneo resultando em isquemia, hipóxia tecidual (Marsh et al., 1996), dano endotelial e quebra da barreira hemato-encefálica (Medana and Turner, 2006). No entanto, o sequestro parasitário como único responsável pela malária cerebral ainda é questionável por não ser um fenômeno restrito ao cérebro. A presença do parasito foi reportada no coração, pulmões, rins, pele e intestino em pacientes com malária cerebral e malária não cerebral, porém, em maior proporção no primeiro grupo (Milner et al., 2013; Pongponratn et al., 1991; Seydel et al., 2006).
Além disso, na malária cerebral o endotélio perde suas propriedades anticoagulante, anti-inflamatória e vasodilatadora. Essa disfunção endotelial é caracterizada pelos marcadores de ativação como o vWF (do inglês, von Willebrand factor) (Hollestelle et al., 2006), Ang-1 e 2 (angiopoietina 1 e 2) (Conroy et al., 2009), ICAM-1 (Conroy et al., 2010), V-CAM e E- selectina (Armah et al., 2005b; Page and Liles, 2013).
vWF é uma glicoproteína sintetizada por células endoteliais e megacariócitos que promove a adesão das plaquetas ao colágeno exposto no endotélio danificado e age como carreador do fator VIII da coagulação (Bryckaert et al., 2015). vWF sintetizado pelas células endoteliais é constitutivamente secretado no plasma ou armazenado nos grânulos intracelulares denominados corpos de Weibel-Palade (WP), na forma de multímeros de alto peso molecular que podem ser secretados após ativação endotelial (Page and Liles, 2013). O aumento do vWF de alto peso molecular no plasma de pacientes infectados por P. falciparum foi reportado (de Mast et al., 2009) e está associado à mortalidade (Graham et al., 2016). Tem sido proposto que o vWF poderia facilitar a adesão do EI, leucócitos e monócitos ao endotélio e também regular o extravasamento leucocitário (O'Sullivan et al., 2016).
O Ang-1 e Ang-2 são dois marcadores de ativação endotelial em doenças infecciosas (Page and Liles, 2013). Ang-1 é produzido constitutivamente por células musculares lisas, ao passo que Ang2 é produzido pelas células endoteliais, armazenado nos corpos de WP e liberado após estímulo nocivo ou inflamatório. Ambos são regulados pelo óxido nítrico (NO) que é produzido pelo endotélio e tem função de manter o tônus vascular (Alfieri et al., 2014;
Ju et al., 2014). A diminuição de NO tem sido reportada nos casos graves de malária (Anstey et al., 1996; Yeo et al., 2008) e na malária cerebral experimental (MCE) (Gramaglia et al., 2006), comprometendo a função endotelial e a perfusão vascular. De fato, a administração de NO diminui a permeabilidade vascular e a expressão de moléculas pelo endotélio ativado, reduzindo assim, a adesão de leucócitos, plaquetas e parasitos (Kayano et al., 2016).
O ICAM-1, além de ser um ligante para o P. falciparum, pode também se ligar aos receptores de leucócitos como o LFA-1 ou macrófagos (Mac-1). A co-localização de ICAM-1 e parasitos foi encontrada no tecido post mortem de pacientes com malária cerebral (Turner et al., 1994); e o aumentado de ICAM-1 foi verificado também em pacientes com malária grave (Turner et al., 1998). Esses achados, associado ao fato de que parasitos isolados de pacientes com malária cerebral são capazes de se ligar mais fortemente a esse receptor, suportam a ideia do seu envolvimento com a malária cerebral. Essa adesão do EI pode induzir apoptose in vitro, além de diminuir a expressão de proteínas relacionadas a junções intercelulares, como a ZO-1 (do latim, Zonula Occludens), vinculina e endotelina, que mantém a barreira hemato encefálica (BBB, do inglês, blood brain barrier).
O processo inflamatório está presente nos casos graves de malária, inclusive na malária cerebral. Estudos mostram o aumento de TNF- nos casos graves de malária (Sahu et al., 2013) e expressão aumentada de TNF- e IFN-γ associadas à malária cerebral (Armah et al., 2005a; Armah et al., 2005b; Brown et al., 1999b; Porta et al., 1993). É sugerido que essas citocinas pró-inflamatórias aumentem a expressão de moléculas de adesão como o ICAM-1, propiciando assim a adesão de parasitos e leucócitos. No entanto, marcadores da inflamação sistêmica estão também aumentados nos casos graves de malária por P. vivax e parece estar associado à biomassa parasitária (Barber et al., 2015). Isso mostra que a inflamação pode estar relacionada à malária grave, porém por si só não parece ser suficiente para causar malária cerebral. Sendo assim, acredita-se que não só a presença de citocinas pró-inflamatórias como
também a resposta imune mediada por células T são importantes para o desenvolvimento dessa síndrome neurológica. Uma maior ativação dos linfócitos T CD4+ e células de memória foram encontrados em crianças com malária cerebral do que em malária grave por anemia (Mandala et al., 2015). Além disso, a quimiocina CXCL10, cuja função é recrutar células T CD8+ e CD4+ para sítios da inflamação, estava estatisticamente aumentada em pacientes com malária cerebral em relação àqueles com malária grave por anemia (Armah et al., 2007). E os níveis elevados de CXCL10 estão associados a um maior risco de morte em pacientes com malária cerebral (Jain et al., 2008; Wilson et al., 2011). Assim, a ativação de linfócitos, o
aumento de algumas quimiocinas envolvidas na migração de leucócitos (Armah et al., 2007; Ochiel et al., 2005) junto com a presença dessas células no tecido cerebral fortalecem a hipótese de que a inflamação mediada por citocinas, quimiocinas e células T tem papel preponderante na malária cerebral.
Neste cenário inflamatório as plaquetas também aparecem como possíveis integrantes desse processo. Em células endoteliais de microvasculatura cerebral de humanos (HBEC), as plaquetas induziram a expressão de genes relacionados à apoptose e inflamação (Barbier et al., 2011). No plasma de pacientes com malária cerebral, o aumento de uma quimiocina denominada PF4 (do inglês, platelet factor 4) derivada das plaquetas foi reportado (Wilson et al., 2011). Foi mostrado que o PF4 contribui para migração de leucócitos para o tecido cerebral (Srivastava et al., 2010). As plaquetas ativadas podem liberar moléculas inflamatórias, formar trombos e assim conduzir a uma maior inflamação do endotélio. E essa ativação é em parte desencadeada pela interação do PfEMP-1 do EI com o CD36 dessas células (Srivastava et al., 2008). Além disso, por possuir a capacidade de destruir o EI (McMorran et al., 2012) e maquinaria necessária para apresentação de antígeno, podendo participar da resposta imune frente ao parasito (Chapman et al., 2012), mostra que as plaquetas podem desempenhar inúmeras funções. No entanto, seu papel na patogênese da malária cerebral permanece incerto.
Malária Cerebral Experimental (MCE)
Como discutido anteriormente, a malária cerebral é resultado da sequência de complexos e inúmeros eventos, iniciado provavelmente pela adesão do EI ao endotélio cerebral, cujos mecanismos são pouco compreendidos e esclarecidos. Em humanos, a investigação na tentativa de elucidar esses mecanismos é baseada principalmente nos achados histopatológicos que são puramente descritivos e correlativos. Para definir causa-efeito e as vias que permeiam cada processo diante da complexidade dessa síndrome neurológica são necessários estudos com intervenção direta. Dessa forma, os modelos em animais se tornam valiosos instrumentos para o entendimento da patofisiologia dessa doença que em humanos seria difícil de ser deduzido (Lou et al., 2001).
Os modelos animais que existem para o estudo da malária cerebral são realizados em primatas e roedores. No modelo em primatas, a infecção por P. knowlesi e P. coatneyi em Rhesus macacos e P. falciparum em macacos-esquilo, permite a investigação de alguns aspectos da malária cerebral, mas esbarram no custo e no reduzido número de animais que podem ser utilizados (de Souza et al., 2010). Por isso, o modelo em roedores é o mais
difundido. Apesar de existirem várias espécies de Plasmodium que infectam roedores, somente
Plasmodium berghei e Plasmodium yoelii têm sido utilizados mais frequentemente nos estudos
da malária cerebral. Infecções por Plasmodium berghei ANKA (PbA) apresentam características em comum com a doença em humanos, como os aspectos imunológicos e histopatológicos, e por isso é o modelo mais utilizado (Lou et al., 2001). Camundongos CBA ou C57BL/6 infectados por PbA apresentam uma síndrome neurológica caracterizada por paralisia total ou parcial dos membros, desvio da cabeça, convulsões e coma que acontece entre os dias 5 a 10 pós-infecção, levando a óbito cerca de 90% dos animais infectados. Mais tardiamente, por volta do dia 10-12 pós-infecção, os outros 10% sucumbem por hiperparasitemia ou anemia profunda sem sinais neurológicos (Lou et al., 2001; Rest, 1982).
Embora este modelo não reproduza todas as características clínicas observadas na malária cerebral humana, algumas similaridades entre as vias de resposta imune em camundongos e em humanos, principalmente as mediadas por citocinas pró-inflamatórias, justificam o uso do modelo na pesquisa da malária cerebral. Vários estudos foram capazes de mostrar a presença de EI de PbA, leucócitos e plaquetas nos capilares cerebrais (Hearn et al., 2000; Neill and Hunt, 1992) e de elevados níveis de expressão de TNF-, LT (Linfotoxina) e IFN- (Hunt and Grau, 2003). Na MCE, além dessa exacerbação da reposta inflamatória, há também uma disfunção endotelial. O bloqueio desse processo resulta em diminuição de ICAM-1, TNF-, IFN e assim inviabiliza o desenvolvimento dessa síndrome neurológica (He
et al., 2014). Assim como na malária cerebral humana, os linfócitos estão intimamente ligados a MCE, tanto os T CD4+ quanto os T CD8+ são cruciais para o desenvolvimento dessa síndrome (Belnoue et al., 2002; Villegas-Mendez et al., 2012). As células T CD8+ induzem apoptose em células endoteliais e quebram as junções intercelulares por meio da secreção de
perforina e granzimas, resposta essa modulada por linfócitos T CD4+ via IFNγ (Howland et al., 2015). Como citado, a presença das plaquetas na microvasculatura cerebral foi visualizada na malária cerebral em humanos (Dorovini-Zis et al., 2011; Grau et al., 2003) e também no modelo experimental (Ampawong et al., 2014). Neste modelo, as plaquetas amplificam a resposta de células T pela interação entre moléculas co-estimulatórias e células T. Na fase aguda da MCE, as plaquetas são importantes no controle do parasito, mas sua ativação em longo prazo contribui no quadro inflamatório (Aggrey et al., 2013).
A principal diferença entre a malária cerebral em humanos e no modelo murino concerne à adesão. No primeiro, a adesão é parasitária enquanto no segundo, há uma adesão maciça de leucócitos. Esse é um dos principais fatores que colocam o uso do modelo em
questão gerando alguns debates no meio científico (Carvalho, 2010; de Souza et al., 2010; Hunt et al., 2010; White et al., 2010). Independente do tipo celular encontrado na microvasculatura na malária cerebral humana e na MCE, acredita-se que essa adesão seja responsável pela obstrução e hipóxia, fenômenos comuns e importantes para a malária cerebral (Nacer et al., 2014). Além disso, outras alterações clínicas, como a disfunção da barreira hemato-encefálica, destruição neuronal e hemorragia cerebral, são características comuns entre a malária cerebral em humanos e no modelo experimental, e que ratificam a importância do uso do modelo para a investigação dessa doença que acomete milhares de pessoas anualmente.
Aspectos Gerais da Coagulação
O sistema de hemostasia é composto por mecanismos complexos que envolvem proteínas pró-coagulantes e anticoagulantes naturais, plaquetas e leucócitos com o objetivo de manter a integridade vascular, permitindo assim que o sangue flua dentro do vaso. O desequilíbrio desse sistema pode resultar em hemorragia ou trombose, com perda de sangue e oclusão do vaso, respectivamente. Neste sistema estão presentes a ativação e controle da coagulação, assim como a degradação da fibrina, figura 5.
Figura 5. Processos que compõem a hemostasia e seus respectivos fatores.
Para manter a hemostasia, após injúria vascular, as plaquetas aderem ao tecido danificado e agregam por meio de interações dos seus receptores com ligantes extracelulares e proteínas solúveis. Além disso, a exposição do fator tecidual (FT), glicoproteína transmembrânica presente em condições fisiológicas nas camadas subendoteliais de vasos sanguíneos e de tecidos perivasculares, ativa a coagulação gerando pequenas quantidades de trombina. Esta, por sua vez, tem efeito sobre vários fatores da coagulação e também sobre as plaquetas. Por essa via de retroalimentação positiva grandes quantidades de trombina são formadas. Assim, a trombina converte o fibrinogênio em fibrina e o trombo plaquetário é estabilizado (Versteeg et al., 2013).
Neste processo de hemostasia, a coagulação tem como objetivo a formação de trombina e no modelo baseado em superfícies celulares pode ser dividido em três fases: iniciação, amplificação e propagação (Monroe and Hoffman, 2006). Na fase de iniciação o FT, principal fator desencadeador da cascata de coagulação, é exposto ao espaço intravascular por injúria tecidual ou pela expressão nas células endoteliais, monócitos ou micropartículas (Morrissey, 2001). A ligação do FT com o fator VIIa forma um complexo proteolítico que cliva os fatores IX e X (Hoffman, 2003). Como consequência, os fatores IXa e Xa são gerados, e dessa forma, a trombina é formada (Figura 6). O fator Xa associado com seu cofator Va formam um complexo denominado protrombinase na célula que expressa FT. O fator V pode ser ativado pelo fator Xa ou por proteases não coagulantes resultando em fator Va necessário para a formação do complexo protrombinase. Este gera pequenas quantidades de trombina insuficientes para formação do coágulo, mas essenciais para a fase de amplificação da coagulação (Hoffman, 2003). Na fase de amplificação, essa pequena quantidade de trombina gerada é capaz de ativar plaquetas e de converter os fatores V e VIII em Va e VIIIa, respectivamente. O fator VIIIa age como cofator para o fator IXa na conversão do fator X em Xa. Além disso, a trombina converte o fator XI em XIa (Figura 6). A fase de propagação ocorre em superfícies procoagulantes como as plaquetas ativadas. O fator IXa se associa com o fator VIIIa e esse complexo fator IXa/fator VIIIa (tenase) catalisa a conversão do fator X para Xa. Então, o complexo Xa/Va (protrombinase) é formado e grandes quantidades de trombina são geradas (Figura 6). Essa converte o fibrinogênio em fibrina, e assim o coágulo é estabilizado (Versteeg et al., 2013). Neste modelo celular da coagulação há também a via do fator XII-XI desencadeada pelos polifosfatos de plaquetas (PolyP), colágeno e NETs (do inglês neutrophil
XII, levando a uma subsequente ativação da calicreína plasmática e fator IX (Figura 6). Essa via serve como uma amplificação da via do FT, mas não é essencial para a hemostase já que animais deficientes em fator XII não tem tendência ao sangramento. Embora seja dispensável para hemostase, ela participa dos eventos trombóticos (Morrissey et al., 2012).
Figura 6. Cascata de coagulação. O fator tecidual (FT) presente nas células da camada
subendotelial é exposto por dano endotelial e forma um complexo com o fator VIIa que leva a formação dos fatores Xa e IXa. O fator Xa catalisa a reação para geração de trombina (IIa). Esta converte os fatores VIII, V e XI em VIIIa, Va e XIa, respectivamente. O fatores VIIIa e Va agem como cofatores para a geração de Xa e IIa, respectivamente. Assim, grande quantidade de trombina é formada que leva à deposição de fibrina. Paralelamente, polifosfatos (PolyP) liberados pelas plaquetas podem estimular a ativação dos fatores XII, V e
XI. Fonte: (Versteeg et al., 2013) adaptado.
As plaquetas são cruciais nessa hemostasia. Em condições normais elas circulam sem aderir ao endotélio vascular (Vieira-de-Abreu et al., 2012). No entanto, quando há dano endotelial as proteínas da matriz extracelular (colágeno, fibronectina, laminina, etc.) interagem com seus os receptores como GPVI (receptor do colágeno) e GPIb (receptor do vWF). Essa interação induz mudanças conformacionais das plaquetas e ativação da integrina αIIbβ3 (GPIIb/IIIa), promovendo assim sua ativação e sua adesão ao endotélio. Assim, as plaquetas ativadas secretam alguns mediadores como ADP (adenosina difosfato), serotonina e tromboxano A2 que recrutam outras plaquetas consolidando o tampão hemostático e
impedindo o extravasamento de sangue (Varga-Szabo et al., 2008). No entanto, em condições patológicas, o endotélio ativado pode expressar proteínas de adesão das plaquetas e FT. Este gera trombina, que além de catalisar a reação para formação de fibrina, age também sobre as plaquetas, ativando-as. A trombina é um importante agonista das plaquetas via PAR (do inglês, “protease activated receptor”) presente na membrana dessas células (Coughlin, 2000). Em humanos, 4 subtipos foram relatados: PAR1, PAR2, PAR3 e PAR4. Esses são diferentemente expressos em vários tipos celulares além das plaquetas como: células endoteliais, leucócitos e células musculares lisas (Esmon, 2014). As plaquetas ativadas expressam receptores de alta afinidade com as proteases e seus cofatores promovendo uma superfície para a amplificação da geração de trombina e liberação de fatores de coagulação, contribuindo assim com a cascata de coagulação (Walsh, 2004). Apesar de participarem do processo de coagulação, estudos recentes sugerem que a geração de trombina pode ser formada na ausência de grande acúmulo de plaquetas e que o dano ou ativação endotelial podem suportar a geração de trombina por formar uma superfície procoagulante (Atkinson et al., 2010; Ivanciu and Stalker, 2015).
Esse processo de ativação da coagulação e geração de fibrina é regulado para que não haja formação de fibrina em excesso e oclusão do vaso. Dessa forma, a trombina desencadeia a secreção de alguns inibidores como TFPI (do inglês, tissue fator pathway inhibitor), antitrombina (AT) e proteína C (PC). TFPI é importante inibidor fisiológico na fase inicial da coagulação (Esmon, 2014) que inibe a coagulação se ligando diretamente ao fator Xa e ao complexo FT-VIIa-Xa (Figura 7). A antitrombina, por sua vez, é o anticoagulante mais abundante no plasma, que além de inibir diretamente a trombina, formando o complexo trombina-antitrombina (TAT), tem efeito sobre inúmeras enzimas da coagulação (Figura 7). A proteína C quando ligada a seu receptor, o EPCR (receptor endotelial da proteína C), e a trombina ligada ao receptor trombomodulina (TM), formam um complexo que levam à ativação da PC em PCA (proteína C ativada). Esta inativa os fatores Va e VIIIa, processo esse potencializado pela proteína S, diminuindo assim a formação dos complexos protrombinase e tenase (Figura 7). Além disso, a trombina ligada à TM é mais sensível à ação da antitrombina do que a trombina circulante (Licari and Kovacic, 2009)
Figura 7. Controle da cascata de coagulação. TPFI se liga ao fator Xa e ao complexo
FT-VIIa-Xa, inibindo assim a formação de trombina. A antitrombina inibe a trombina e os fatores IXa e Xa. A proteína C na sua forma ativada (PCA) inibe os fatores Va e VIIIa. A PCA é gerada pela ligação da trombina à trombomodulina e a PC a seu receptor, o EPCR. Fonte: (Versteeg et al., 2013) adaptado.
Na hemostase, a degradação de fibrina tem grande importância para reconstituir funcionalidade ao vaso sanguíneo. Neste processo, a plasmina, responsável por degradar a fibrina e ativar as metaloproteinases, é gerada a partir do plasminogênio na presença de seus ativadores: o ativador do plasminogênio do tipo tecidual (tPA), sintetizado e secretado pelas células endoteliais, e o ativador do plasminogênio do tipo uroquinase (uPA), produzido por monócitos e macrófagos, figura 8 (Chapin and Hajjar, 2015). tPA e uPA são regulados pelo inibidor da ativação do plasminogênio (PAI) liberados na circulação pelas plaquetas, pelas células endoteliais, entre outros. Outra proteína que inibe a ação da plasmina é a α2- antiplasmina. Esta serpina protease exerce função inibitória sobre o sistema fibrinolítico por se complexar à plasmina (Figura 8). O TAFI (do inglês, thrombin-activatable fibrinolysis
inhibitor) é ativado pela trombina associada à trombomodulina e diminui o número de sítios de
ligação do plasminogênio na fibrina (Cesarman-Maus and Hajjar, 2005). Dessa forma, o TAFI diminui a formação de plasmina e, consequentemente, a degradação de fibrina (Figura 8).
Figura 8. Sistema Fibrinolítico. A formação de fibrina é controlada pelo sistema
fibrinolítico, no qual a plasmina é responsável por degradar a fibrina e gerar produtos de degradação de fibrina. A plasmina é sintetizada a partir do plasminogênio na presença de seus ativadores (tPA e uPA) que são neutralizados pelo inibidor do ativador do plasminogênio (PAI). A α2-antiplasmina se liga à plasmina e bloqueia sua ação. O TAFI (do inglês,
thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor) inibe a formação de plasmina por impedir a ligação do
plasminogênio na fibrina.
Coagulação e Inflamação
A ativação da coagulação e a inflamação são processos vinculados que permeiam as doenças vasculares. Vários estudos mostram que citocinas pró-inflamatórias podem interferir nos mecanismos de coagulação, assim como algumas proteases ativadas na coagulação podem modular a inflamação (Levi and van der Poll, 2005).
A trombina e o fator Xa além de participarem da geração de fibrina têm efeito deletério, em parte associado à ativação do receptor PAR (Esmon, 2014). Estudos mostram que o fator Xa tem capacidade de induzir in vitro a secreção de citocinas pró- inflamatórias e quimiocinas atrativas de leucócitos em células endoteliais (Busch et al., 2005). O estímulo da trombina em células endoteliais induz, via NF-kB, a expressão de interleucinas como Il-6, Il- 8, citocina quimioatrativa de leucócitos (MCP-1), moléculas adesivas como o ICAM-1 e P- selectina. A ativação de PAR-4 nas plaquetas pela trombina resulta no recrutamento de leucócitos, contribuindo assim com a inflamação (Kaplan et al., 2015). O TNF-α, por exemplo, aumenta a expressão de FT nos monócitos, iniciando assim a cascata de coagulação.
E, no modelo experimental de sepse, o bloqueio dessa proteína inibe a inflamação (Chen et al., 2004a).
A ativação da coagulação e formação de trombina ativa mecanismos anticoagulantes gerando a PCA, via EPCR e TM. A importância desse sistema é bem ilustrada em complicações pró-trombóticas e pró-inflamatórias associadas à deficiência de PC, como no modelo animal de isquemia, doenças inflamatórias, aterosclerose e doenças vasculares. Em pacientes sépticos, a diminuição de proteína C e dos níveis de PCA/PC está associada a um aumento de risco de morte em decorrência de inflamação sistêmica e de coagulação intravascular disseminada (Fisher and Yan, 2000; Liaw et al., 2004). A administração de PCA recombinante tem mostrado benefício em modelo animal de várias doenças como a infecção aguda (Kerschen et al., 2010), inflamação estéril (Scaldaferri et al., 2007), neurodegeneração (Zhong et al., 2009) e acidente vascular isquêmico (Cheng et al., 2003). Esse efeito pode ser atribuído à sua função anti-inflamatória e anti-apoptótica (Feistritzer and Riewald, 2005). A diminuição de citocinas pró-inflamatórias foi encontrada após administração de PCA no modelo de endotoxemia (Okajima, 2001). Além disso, PCA inibe a produção de TNF-α induzida por LPS pelo bloqueio do NF-kB (Yuksel et al., 2002). A sinalização de PCA via PAR-1 resultou em aumento de Il-10 em monócitos estimulados por LPS (Toltl et al., 2008) e nas células endoteliais inflamadas, a PCA reduziu a expressão de MCP-1 e ICAM-1 (Franscini et al., 2004).
Citocinas inflamatórias, como TNF-α e IL1b, induzem a secreção dos ativadores do plasminogênio, mas também dos seus inibidores como PAI-1, levando a uma remoção inadequada de fibrina (Hamaguchi et al., 2003; van Hinsbergh et al., 1990). Animais deficientes geneticamente para plasminogênio PG(-/-) têm recrutamento de leucócitos e monócitos diminuídos no modelo de peritonite induzido por tioglicolato (Zeng et al., 2002). A plasmina, gerada a partir do plasminogênio, estimula a expressão de citocinas como TNF-α, IL-6, Il-1, quimiocinas e FT em monócitos (Syrovets et al., 2001). Por outro lado, IFN-α aumenta a expressão do receptor de plasminogênio na membrana de monócitos com consequente aumento na geração de plasmina (Gyetko et al., 1992).
Por muito tempo foi sugerido que durante as infecções a ativação da coagulação e inflamação era como um círculo vicioso, por ativar excessivamente as células do sistema imune e levar à formação intravascular de trombo, com consequências nocivas para o tecido. Por outro lado, alguns acreditam que a ativação da coagulação frente à infecção é um mecanismo da reposta imune inata do hospedeiro com intuito de barrar o agente infeccioso (Engelmann and Massberg, 2013; Fiusa et al., 2015). Essa reposta de formação de fibrina e
migração de leucócitos com objetivo de conter o patógeno por formar uma barreira física facilita o reconhecimento e destruição desse agente, impedindo sua sobrevivência e disseminação. No entanto, a desregulação desse mecanismo é um evento chave no desenvolvimento de desordens trombóticas (Engelmann and Massberg, 2013)
Malária Grave e Coagulação
Inúmeros estudos indicam alterações no sistema de coagulação nas infecções maláricas. Os pacientes infectados por P. falciparum apresentam tempo de sangramento prolongado, há a presença de trombina (Riedl et al., 2016), os níveis de anticoagulantes naturais estão baixos (Moxon et al., 2015), assim como a contagem de plaquetas (Moxon et al., 2009). No entanto, os sinais clínicos de coagulopatia são raros, sem evidências de sangramento espontâneo e trombose (Moxon et al., 2015). Apesar dessa coagulopatia não ser evidente clinicamente ela ocorre nos micro vasos dos pacientes com MC. A presença de hemorragias em microvasos oculares de crianças com MC e de microtrombos e hemorragias nos microvasos do cérebro de crianças que sucumbiram à essa doença foram demonstrados (Dorovini-Zis et al., 2011; Taylor and Molyneux, 2015; White, 2011). Esses eventos trombóticos têm sido descritos post mortem no cérebro e também nos pulmões, como tromboembolismo. Na malária gestacional, uma das formas graves de malária, a deposição de fibrina foi reportada no tecido placentário assim como a presença de marcadores de ativação da coagulação e de inibição do sistema fibrinolítico a partir do sangue do cordão umbilical de pacientes (Avery et al., 2012). Isso indica que as infecções por P. falciparum podem desencadear um distúrbio de coagulação e que esse processo tem um papel importante na patogênese da malária.
Acredita-se que o FT, receptor transmembrânico constitutivamente expresso na maioria dos vasos em células sob a camada endotelial, seja responsável pela ativação da cascata de coagulação na malária (Francischetti et al., 2008). Foi mostrado que EI por P. falciparum induzem a expressão de FT em células endoteliais, permitindo reações de coagulação em cascata e que FT seria responsável pela ligação entre o processo inflamatório na MC e a cascata de coagulação (Francischetti et al., 2008; Francischetti et al., 2007). Na malária gestacional, por exemplo, a presença do processo inflamatório e depósito de fibrina na placenta estão associados à expressão aumentada de FT nos monócitos infiltrados (Imamura et al., 2002). A expressão de FT e a amplificação da cascata de coagulação por EI e plaquetas ativadas são cruciais na formação do trombo. De fato, EI obtidos de pacientes com MC têm efeito ex-vivo pró-coagulante (Francischetti et al., 2007) e acúmulo de plaquetas também já
foi observado no cérebro de pacientes que morreram de MC (Dorovini-Zis et al., 2011; Grau et al., 2003).
Acredita-se que tanto o componente desencadeador da coagulação quanto as moléculas regulatórias da coagulação estejam envolvidos no processo patogênico da malária cerebral. A TM e o EPCR, proteínas com atividade anticoagulante por controlar a geração de trombina, estão diminuídos no cérebro de pacientes com malária que vieram a óbito (Moxon et al., 2013). A ausência desses receptores estava associada à presença de fibrina nos vasos desses pacientes que se apresentavam solúveis no sangue e no líquido cefalorraquidiano. Além disso, o EPCR é um receptor de adesão do parasito (Turner et al., 2013). A inibição da atividade do EPCR, pela ligação do parasito a esse receptor ou pelo seu desprendimento ocasionado por citocinas pró-inflamatórias, diminui a geração da proteína C ativada. Com isso, há diminuição do efeito anticoagulante e anti-inflamatório desencadeado pela proteína C ativada (Aird et al., 2014).
Outras proteínas que agem no processo de regulação da coagulação e de dissolução do trombo estão alteradas na malária grave. Há uma diminuição na atividade fibrinolítica em grávidas e crianças infectadas por P. falciparum (Avery et al., 2012; Omoigberale et al., 2005). O uPA , um ativador da geração de plasmina, está aumentado em infecções por P. falciparum assim como o PAI-1 (Mohanty et al., 1997; Perch et al., 2004). Além disso, estudos in vitro mostraram que P. falciparum é capaz de internalizar e processar o plasminogênio, gerando fragmentos de angiostatina, inibidor endógeno da angiogênese, os quais foram observados no cérebro post mortem de pacientes com malária cerebral (Melo et al., 2014). De fato, no plasma de animais infectados por P. chabaudi, e que apresentam alta parasitemia, o plasminogênio está significativamente diminuído (Melo et al., 2014).
JUSTIFICATIVA
Estudos clínicos sugerem que na malária cerebral há um distúrbio de coagulação. No entanto, pouco se sabe sobre os mecanismos envolvidos neste processo e se essa alteração, de fato, contribui para o desenvolvimento da doença ou se é somente uma consequência da ativação endotelial e inflamação desencadeada pela presença do parasito sem maiores efeitos. Até o momento as investigações acerca desse processo foram baseadas principalmente em estudos post mortem que caracterizam os aspectos histopatológicos da malária cerebral humana, porém apresentam limitações metodológicas e éticas. Assim, a malária cerebral experimental, por apresentar similaridades com a malária cerebral humana, se torna uma ferramenta importante para obter informações detalhadas sobre patofisiologia da malária cerebral que em estudos com humanos não poderiam ser deduzidos. Portanto, a avaliação da hemostasia na malária cerebral experimental é necessária, tanto para a compreensão do papel da coagulação no processo patogênico, quanto para desvendar os mecanismos e fatores envolvidos na ativação e controle da coagulação que possibilitem a busca por novos alvos terapêuticos.
OBJETIVOS
Objetivo Geral:
Avaliar a hemostasia sistêmica na malária cerebral experimental. Objetivos Específicos:
1. Determinar o tempo de formação do trombo arterial induzido fotoquimicamente na malária cerebral experimental
2. Avaliar o número e funcionalidade das plaquetas na malária cerebral experimental 3. Verificar a formação de TAT e a integridade dos fatores de coagulação na malária
cerebral experimental
4. Avaliar a atividade fibrinolítica na malária cerebral experimental
5. Verificar a interferência da hipercoagubilidade no desenvolvimento da malária cerebral experimental
6. Determinar a expressão de moléculas inflamatórias na malária cerebral experimental após indução da hipercoagulabilidade
7. Avaliar o desenvolvimento da doença, a ativação endotelial e a expressão de moléculas inflamatórias em animais deficientes em PAI-1 infectados por PbA.
METODOLOGIA
Animais e parasitosNeste projeto foram utilizados camundongos C57BL/6 de 7-10 semanas de idade fornecidos pelo Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica (CEMIB) da Universidade Estadual de Campinas (Unicamp) e mantidos em nosso biotério livre de patógenos específicos. Os procedimentos envolvendo os animais foram aprovados pelo Comitê de Ética na Experimentação Animal (CEUA) da mesma instituição (protocolo 3134-1 e 3833-1). Basicamente, foram utilizados 3 linhagens de parasita murino: Plasmodium berghei ANKA (PbA), linhagem que causa malária cerebral, P. berghei NK65 (PbNK), que não causa malária cerebral, e Plasmodium yoelli YM (PyYM) que leva a altas taxas de parasitemias (80-90%). PbA e PbNK65, linhagens GFP (do inglês, Green Fluorescent Protein), foram gentilmente cedidas pelo prof. Dr. Claudio Marinho da Universidade Estadual
de São Paulo. Para a infecção, uma solução contendo 106 eritrócitos infectados (EI) de PbA ou PbNK foi preparada e injetada nos animais pela via intraperitoneal. Para PyYM, quantidades diferentes da solução estoque foram injetadas diretamente nos animais via intraperitoneal.
Cirurgia para indução fotoquímica da trombo arterial
Os animais C57BL/6 infectados por PbA e PbNK, no dia 5 pós- infecção, foram submetidos à cirurgia de indução fotoquímica do trombo arterial, segundo o protocolo descrito He et al., 2002. Para isso, os animais foram anestesiados, via intramuscular com ketamina (10% - 100mg/kg de peso) e xilazina (2% - 16mg/kg de peso), e colocados em posição supina. Para o isolamento da artéria carótida, foi feita uma incisão média na cervical do lado direito. Desta forma, a sonda (Transonic Flow probe MAO SPSB) foi posicionada para o monitoramento do fluxo sanguíneo. Após, a solução de rosa de Bengala (Sigma Aldrich, St. Louis-USA), na concentração de 50mg/kg, foi injetada na veia lateral caudal do animal. Um laser verde a 1.5mW com 540nm (Melles Griot 25LGR), a uma distância de 6cm da incisão, foi aplicado. Na figura 9, as imagens mostram bem as etapas desse procedimento. O laser permaneceu ligado até a formação do trombo. O processo de trombose após a injeção de rosa de Bengala está relacionado com a formação de espécies reativas de oxigênio a partir da estimulação do corante pela luz do laser que levam à lesão do endotélio.
Figura 9. Ilustração da cirurgia para indução fotoquímica do trombo arterial. A carótida é isolada, a sonda é posicionada e o feixe de luz a 540nm incidido sobre a artéria.
Depleção de linfócitos T
A depleção dos linfócitos T CD4+ e CD8+ foram feitas de acordo com o protocolo descrito (Claser et al., 2011). Os hibridomas GK1.5 e o GK53.6.7 foram utilizados para a produção de anticorpos in vitro de anti-CD4 e in vivo de anti-CD8, respectivamente, gentilmente disponibilizados pelo grupo do prof. Dr. Maurício Martins Rodrigues (Universidade Federal de São Paulo, São Paulo, Brasil). 0,5 mg de anti-CD4 diluído em PBS (no dia 2 pós-infecção) e 0,05mL do produto de ascite contendo anti-CD8 foram injetados, pela via intraperitoneal, nos animais infectados no D2 e D4 pós- infecção. No D5, os animais depletados foram submetidos à cirurgia de indução da trombose arterial. A eficácia da depleção foi avaliada em um experimento anterior. Resumidamente, os baços dos animais depletados e não depletados (controle) foram coletados, macerados e peneirados. As amostras foram colocadas em um tubo contendo um tampão de lise. Esses tubos foram centrifugados a 1500 rpm por 5 minutos. O pellet obtido foi ressuspendido em PBS e anticorpos CD4 e anti-CD8a foram adicionados à solução na proporção de 1:100. Depois de 10 minutos de incubação as amostras foram levadas para o citômetro FACScalibur (BD) e a porcentagem de depleção analisada pelo software FlowJo.
Tratamento com artesunato
Um esquema de tratamento para eliminar o parasito da corrente circulatória dos animais infectados foi realizado conforme Clemmer et al., (2011). Para isso, o artesunato (Sigma Aldrich), preparado em NaCl 0,9% com 5% de bicarbonato de sódio, foi injetado via intraperitoneal na dose de 64mg/kg, nos dias D5-D7 pós-infecção. O tempo de formação de trombo desses animais foi determinado após a indução fotoquímica de formação de trombo, como descrito anteriormente. Os valores obtidos foram comparados com os valores dos animais infectados não tratados no D5 pós-infecção.
A partir do sangue total dos animais NI e dos infectados, no D5 pós- infecção, o número de plaquetas foi determinado utilizando um analisador hematológico veterinário BC- 2800Vet (Mindray, Hamburgo, Germany), dentro de 15 minutos após a coleta de sangue.
Tempo de Sangramento
O tempo de sangramento na veia da cauda foi analisado conforme (Werneck et al., 2008) com pequenas modificações. Os animais NI e infectados por PbA foram anestesiados como descrito anteriormente e fixados na posição vertical. Uma incisão transversal de 0,5cm foi feita na lateral da cauda onde o diâmetro media 5mm. Após incisão, a cauda foi imersa em um tubo de ensaio contendo PBS a 37°C. O tempo de sangramento foi definido como o intervalo da transecção até a interrupção do sangramento.
Agregação das plaquetas
O sangue dos animais NI e infectados por PbA, anestesiados, foi coletado por punção cardíaca com seringa contendo anticoagulante ACD-C (citrato ácido dextrose), centrifugado a 2200g durante 10 segundos por mililitro de sangue para a obtenção do plasma rico em plaquetas (PRP). Após, o PRP foi coletado e centrifugado a 2300g por 4 minutos para obtenção das plaquetas. Estas foram ressuspendidas em solução Krebs-Ringer e um ajuste de
1,2 x108 plaquetas/mL foi feito após contagem em câmara de Neubauer. 400uL dessa solução foi adicionada à cubeta e a solução de ADP (25uM) foi acrescentada para indução da agregação. Esta foi medida no agregômetro de dois canais (Chrono-log Lumi-Aggregometer model 560-Ca, Havertown, PA, EUA) a 37°C.
Criatomia e microscopia intravital das plaquetas
Os animais NI e infectados no D5 pós-infecção, foram anestesiados com ketamina 10% - 100mg/kg de peso e xilazina 2% - 16mg/kg de peso e submetidos à criatomia para exposição dos vasos sanguíneos do cérebro. Para isso, com a ajuda de uma lupa e uma broca cirúrgica (Beltec, Brazil), desgastou-se o crânio, no lobo esquerdo parietal, com abertura da janela de observação medindo entre 3-4mm. As plaquetas foram marcadas com fluorescência injetando na veia caudal do animal 3ug de anticorpo anti-CD41-PE, dissolvido em salina 0,9%. A interação das plaquetas com o endotélio foi observada pelo microscópio Carl Zeiss ImagerA2 acoplado a uma câmera (AxioCam) que gravou as imagens de um quadro por segundo. No total, 15 plaquetas em cada video foram analisadas com ajuda do software ImageJ.
Com o intuito de avaliar a eficiência da via intrínseca da cascata de coagulação, o tempo de formação do coágulo do plasma com citrato (3,2%) dos animais infectados por PbA no dia 5 pós-infecção e dos NI foi determinado. Para isso, o sangue desses animais foi coletado da veia cava e centrifugado a 3000 rpm por 15 minutos a 25°C. Em seguida, uma alíquota de 50 µl de plasma foi pré-aquecida a 37°C por 2 minutos e depois foi adicionado 50
µl de reagente TTPA CLOT e incubado a 37°C por 2 minutos. Finalmente, a reação foi disparada assim que foi adicionado 50 µl de cloreto de cálcio. Esta análise foi realizada em duplicata, por meio do Kit TTPA CLOT da BIOS diagnóstico (Brasil).
Tempo de Protrombina (TP)
Com o intuito de avaliar a eficiência da via extrínseca da cascata de coagulação, o tempo de formação do coágulo do plasma com citrato (3,2%) dos animais infectados por PbA no dia 5 pós-infecção e dos NI foi determinado. O sangue desses animais foi coletado da veia cava e centrifugado a 3000 rpm por 15 minutos a 25°C. Logo, uma alíquota de 50 µl de plasma foi pré aquecida a 37°C por 2 minutos e, em seguida, em um tubo limpo, foi acrescentado 100 µl do reagente TP CLOT e foi incubado por 4 minutos a 37°C. Para finalizar, foi adicionado 50 µl de plasma, disparando a reação. Tal experimento foi realizado em duplicata, por meio do Kit TP CLOT da BIOS diagnóstico.
Isolamento de RNA, síntese de cDNA e quantificação de mRNA
No D5 pós-infecção, os cérebros dos animais NI e infectados por PbA foram coletados e macerados em nitrogênio líquido. A extração de RNA foi feita em colunas do kit RNeasy micro kitTM (Quiagen) e o total de 1ug de RNA foi utilizado para a produção de cDNA. Essa reação foi feita utilizando o kit High capacity cDNA reverse transcription kitTM (4368813- Applied biosystems) conforme as instruções do fabricante. Após, a PCR quantitativa em tempo real foi realizada na presença do iTaq™ Universal SYBR® Green Supermix (BioRad) no sistema de detecção CFX96 Real-Time PCR Detection System (BioRad). Os ciclos foram de 95°C por 1 minuto, 35 ciclos de 95°C por 15 segundos e 60°C por 1 minuto seguido da curva de dissociação. Os oligonucleotídeos utilizados estão descritos na tabela abaixo. A expressão gênica dos genes alvo foi representada como o número de cópias relativas, utilizando-se o método 2-DDCT, que foram normalizadas pela expressão do mRNA do hprt. As
amostras dos animais NI foram usadas como amostras de referência.
Tabela 1. Genes de interesse e as sequências dos oligonucleotídeos utilizados para a quantificação de mRNA.
Gene ID_NCBI oligo forward (5´-3´) oligo reverse (5´-3´) HPRT NM_01355 6.2 CTTTGCTGACCTGCTG GATT TATGTCCCCCGTTGACTG AT IFN-γ NM_00833 7.3 CAGCAACAGCAAGGC GAAA GCTGGATTCCGGCAACAG TNF-α NM_00127 8601.1 ACGGCATGGATCTCAA AGAC AGATAGCAAATCGGCTGA CG IL-10 NM_01054 8.2 GGTTGCCAAGCCTTAT CGGA ACCTGCTCCACTGCCTTG CT Perforina NM_01107 3.3 GAGAAGACCTATCAGG ACCA AGCCTGTGGTAAGCATG ICAM-1 NM_01049 3.2 CGAAGGTGGTTCTTCT GAGC GTCTGCTGAGACCCCTCT TG EPCR NM_01117 1.2 CATCGGAGTTACAAAG GGCG CCCAGAACTCCAGGATGT TGA FT NM_01017 1.3 CCACCATCTTTATCATC CTCCT AGCCTTTCCTCTATGCCA AGC 18S rRNA (Plasmodium) gb|M19712 .1 GGAGATTGGTTTTGAC GTTTATGTG AAGCATTAAATAAAGCG AATACATCCTTAC
Citometria de fluxo das células endoteliais e macrófagos/micróglia
Os cérebros dos animais não-infectados e infectados foram coletados no D6 pós- infecção e digeridos com colagenase I durante 30 minutos a 37ºC. As células (1-5 milhões) foram incubadas com FcBlock juntamente com anticorpo anti-F4/80 ou anti-CD11b (violeta brilhante 510), IgG1 de rato isotipo controle ou anti-CD31 (PerCP-C5,5), anti-CD54, anti- CD141, anti-CD142 (FITC), anti-EPCR (PE), durante 30 minutos a 4ºC no tampão do citômetro. As células foram então lavadas, ressuspendidas no tampão e adquiridas utilizando o citômetro Fortessa LSR BD (500.000 eventos/amostra). Os perfis de expressão CD11b (ou F4/80)+ CD31+ (macrófagos / microglia) e CD11b-CD31+ (células endoteliais) para CD54, CD141, CD142, CD36 EPCR foram analisados usando o software FlowJo.
Quantificação do complexo Trombina-Antitrombina (TAT) e do inibidor do ativador do plasminogênio (PAI-1)
Os animais NI e infectados por PbA, sob anestesia (ketamina 10% - 100mg/kg de peso e xilazina 2% - 16mg/kg de peso), tiveram o sangue coletado pela veia cava. Esse sangue foi centrifugado para obtenção do plasma, que por sua vez, foi congelado a -80°C. Os ensaios imunoturbidométricos para a quantificação de TAT (ab137994) e PAI-1 (ab197752) do plasma dos animais foram realizados seguindo as instruções do fabricante (abcam).
Tempo de Lise da Euglobulina
Os animais NI e infectados por PbA, sob anestesia (ketamina 10% - 100mg/kg de peso e xilazina 2% - 16mg/kg de peso), tiveram o sangue coletado pela veia cava que foi centrifugado a 1500rpm durante 5 minutos para a separação do plasma. Este foi centrifugado a 3000 rpm por 10 minutos a 4°C para a precipitação da euglobulina. O pellet foi ressuspendido em tampão Tris-Tween e a trombina (10U/mL) foi então adicionada para a formação do coágulo. O tempo de lise foi determinado quando foi observada a dissolução completa do coágulo.
Tratamento com ácido tranexâmico
O fenótipo de hipercoagulabilidade foi induzido nos animais C57BL/6 com ácido tranexâmico (TXA -Transamin, Zydus Nikkho, Brasil), inibidor competitivo da ativação do plasminogênio. O tratamento com TXA foi realizado dois dias antes e durante a infecção com doses de 100mg/kg injetadas, pela via intraperitoneal, a cada 12 horas. A sobrevivência, os sintomas e as parasitemias foram analisados. A expressão de genes relacionados com a resposta inflamatória nos grupos tratados, no D4 pós-infecção, foi verificada por real time PCR de acordo com a metodologia descrita anteriormente, utilizando alguns oligos mostrados na tabela 1.
Análises Estatísticas
As análises estatísticas foram realizadas utilizando o teste Kruskal wallis e, para dados normais, foram aplicados ANOVA ou teste t. As análises de expressão gênica foram realizadas pelo próprio software da BioRad e as análises de sobrevivência foram feitas pelo teste Log Rank. As diferenças foram consideradas significativas quando p<0,05.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Neste projeto foram utilizados dois modelos de malária em camundongos: a malária cerebral experimental e a malária que não causa a síndrome neurológica. Para a MCE, animais C57BL/6 jovens (entre 7-9 semanas) foram infectados por PbA. Neste modelo, os animais infectados desenvolvem uma síndrome neurológica entre os dias 5 e 6 e sucumbem entre os dias 6 e 7 pós-infecção (figura 10A). A parasitemia periférica no início da infecção é baixa e atinge patamares mais elevados nos dias 5 e 6 pós-infecção, mas não ultrapassa 20% (figura 10B). Por outro lado, os camundongos C57BL/6 infectados por PbNK não apresentam síndrome neurológica. Os animais sucumbem entre os dias 20-25 pós-infecção por uma hiperparasitemia associada a uma anemia profunda (figura 10A). A parasitemia, em alguns casos, pode passar 40% (figura 10B). Apesar de não causar MCE, a infecção por PbNK acarreta encefalite, apresentando características histopatológicas típicas de MCE (Lacerda- Queiroz et al., 2011; Nacer et al., 2012).