DISSERTAÇÃO Estabilidade catalítica da peroxidase do nabo na forma livre e imobilizada em esferas de quitosana

Texto

(1)PRICILA MARIA BATISTA CHAGAS. ESTABILIDADE CATALÍTICA DA PEROXIDASE DO NABO NA FORMA LIVRE E IMOBILIZADA EM ESFERAS DE QUITOSANA. LAVRAS - MG 2014.

(2) PRICILA MARIA BATISTA CHAGAS. ESTABILIDADE CATALÍTICA DA PEROXIDASE DO NABO NA FORMA LIVRE E IMOBILIZADA EM ESFERAS DE QUITOSANA. Dissertação apresentada à Universidade Federal de Lavras, como parte das exigências do Programa de PósGraduação em Agroquímica, para a obtenção do título de Mestre.. Orientadora Dra. Angelita Duarte Corrêa. Dra. Maria Cristina Silva Dr. Custódio Donizete dos Santos Coorientadores. LAVRAS – MG 2014.

(3) Ficha Catalográfica Elaborada pela Coordenadoria de Produtos e Serviços da Biblioteca Universitária da UFLA Chagas, Pricila Maria Batista. Estabilidade catalítica da peroxidase do nabo na forma livre e imobilizada em esferas de quitosana / Pricila Maria Batista Chagas. – Lavras : UFLA, 2014. 91 p. : il. Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Lavras, 2014. Orientador: Angelita Duarte Corrêa. Bibliografia. 1. Enzima. 2. Glutaraldeído. 3. Remazol Brilliant Blue R. 4. Descoloração. 5. Enzima - Armazenamento. I. Universidade Federal de Lavras. II. Título. CDD – 547.23.

(4) PRICILA MARIA BATISTA CHAGAS. ESTABILIDADE CATALÍTICA DA PEROXIDASE DO NABO NA FORMA LIVRE E IMOBILIZADA EM ESFERAS DE QUITOSANA. Dissertação apresentada à Universidade Federal de Lavras, como parte das exigências do Programa de PósGraduação em Agroquímica, para a obtenção do título de Mestre.. APROVADA em 24 de fevereiro 2014. Dra. Denise Alvarenga Rocha. UFLA. Dr. Arnaldo César Pereira. UFSJ. Dra. Angelita Duarte Corrêa Orientadora. Dra. Maria Cristina Silva Dr. Custódio Donizete dos Santos Coorientadores. LAVRAS – MG 2014.

(5) “Quando amamos e acreditamos do fundo de nossa alma, em algo, nos sentimos mais fortes que o mundo, e somos tomados de uma serenidade que vem da certeza de que nada poderá vencer a nossa fé. Esta força estranha faz com que sempre tomemos a decisão certa, na hora exata e, quando atingimos nossos objetivos ficamos surpresos com nossa própria capacidade.” Paulo Coelho. DEDICO. Aos meus pais, Dorlinda e Clarindo, pela dedicação, por acreditar e acima de tudo pelo amor incondicional..

(6) AGRADECIMENTOS. A Deus, pela oportunidade da vida, pela força, coragem e sabedoria. À Profa. Dra. Angelita Duarte Corrêa pela oportunidade, orientação, confiança e incentivo durante todos os trabalhos, além dos ensinamentos proporcionados por eles. À Cris, por todo o aprendizado, pela amizade e incentivo durante todos os trabalhos realizados. Ao Prof. Custódio, pela grande colaboração e ensinamentos durante nossos trabalhos. A toda minha família, em especial aos meus irmãos André e Jorge, pela oportunidade e carinho. Aos amigos do laboratório, Mariana, Adnéia, Anderson, Mariene, Ana Paula, Luciana, Lucas, Estela, Valquíria, Denise, Vinícius, Rafaela, Tamara, Rodrigo, Fabíola em especial minha bic junior. Juliana Arriel pela nossa. cumplicidade, por todo nosso aprendizado durante todos os trabalhos que realizamos juntas, pela paciência e persistência que tivemos, e acima de tudo pela nossa fé e amizade. À Xulita, pela colaboração e pela amizade conquistada no Laboratório de Bioquímica. A todos os meus grandes amigos Mariana, Lucas e Deise que sempre estiveram presentes em todos os momentos deste aprendizado. À Karina e à Geovanna minhas irmãs de coração, as vezes são filhas, pelo incentivo e ensinamentos de todos os dias. Ao programa. de. Pós-graduação em Agroquímica/UFLA,. oportunidade. Á Capes, pela concessão da bolsa de estudos.. pela.

(7) RESUMO As peroxidases são enzimas que têm aplicações em diversos campos como a medicina, a síntese química, na análise de alimentos, em novas aplicações ambientais como desintoxicação e remoção de diversos poluentes orgânicos como fenóis, aminas aromáticas e corantes de água residuais. Algumas limitações na utilização de enzimas livres, como a estabilidade e a capacidade catalítica, diminuem com a complexidade dos efluentes. Algumas destas limitações são superadas pelo uso de enzimas na forma imobilizada, as quais podem ser utilizadas como catalisadores com tempo de vida longo, sendo um meio eficaz para efetuar a reutilização da enzima e para melhorar a sua estabilidade. Para que enzimas apresentem uma maior durabilidade, baixo custo e altamente ativas, vários suportes têm sido utilizados nos processos de imobilização, como a quitosana. Os experimentos foram conduzidos tendo como objetivo a preparação das esferas de quitosana utilizando como agente reticulante o glutaraldeído para a imobilização da enzima peroxidase de nabo por um processo de baixo custo. Foram determinadas as características do suporte e o efeito de imobilização na atividade da enzima. Após a determinação das melhores condições de imobilização da enzima, algumas propriedades do sistema imobilizado foram comparadas com a enzima livre, incluindo o pH ótimo e a temperatura, a estabilidade de armazenamento, a aplicação na remoção de corante têxtil e reutilização. A peroxidase foi caracterizada e imobilizada com sucesso nas esferas de quitosana reticuladas. O pH ótimo 7,0 foi o mesmo para ambas as peroxidases livre e imobilizada, entretanto a imobilização resultou na estabilização da enzima em uma ampla variação de pH, e ambas foram ativas na faixa de temperatura de 30 oC a 50 oC, o que favorece o uso de processos industriais. Verificou-se que a enzima imobilizada apresentou-se mais estável em relação ao armazenamento quando comparada à enzima livre. Ambas foram utilizadas na remoção do corante Remazol Brilliant Blue R. Nos experimentos de descoloração com peroxidase imobilizada, dois fenômenos foram observados, descoloração devido à adsorção sobre o suporte (60,45%) e degradação do corante devido à ação da enzima (27,50%). A enzima livre proporcionou 62,86% de remoção da cor. A imobilização da enzima proporcionou um aumento na estabilidade da enzima frente alguns parâmetros, além de possibilitar a recuperação e sua reutilização. A enzima imobilizada apresentou um potencial na remoção de cor do corante de 61,17% após 6 ciclos consecutivos e uma atividade residual de 55,25% após 5 ciclos consecutivos de seu reuso. Estes resultados são significativos com possibilidade de aplicação de enzimas imobilizadas em setores industriais levando a uma redução do custo operacional. Palavras-chave: Enzima. Glutaraldeído. Descoloração. Armazenamento.. Remazol.. Brilliant.. Blue. R..

(8) ABSTRACT Peroxidases are enzymes that have applications in many fields such as medicine, chemical synthesis, food analysis, and new environmental applications, like detoxification and removal of various organic pollutants such as phenols, aromatic amines and wastewater dyes. Some limitations on the use of free enzymes, like stability and catalytic ability, decrease with effluent complexity. Some of these limitations are overcome by the use of immobilized enzymes, which can be used as long-life catalysts and are effective means to reuse the enzyme and to improve its stability. In order for enzymes to present higher durability, low cost and high activity, various supports, such as chitosan, have been used in immobilization processes. The experiments were conducted with the objective to prepare chitosan beads, using glutaraldehyde as a crosslinking agent, for the immobilization of turnip peroxidase through a low-cost process. The support characteristics and the effect of immobilization on enzyme activity were determined. After the determination of the best conditions for enzyme immobilization, some properties of the immobilized system were compared with the free enzyme, including optimum pH and temperature, storage stability, application in the removal and reuse of the textile dye. Peroxidase was successfully characterized and immobilized on the cross-linked chitosan beads. The optimum pH (7.0) was the same for both free and immobilized peroxidases; however, immobilization resulted in the stabilization of the enzyme through a wide pH range, and both were active in the temperature range between 30 ºC and 50 ºC, which favors the use of industrial processes. It was found that the immobilized enzyme was more stable, when compared to the free enzyme, regarding storage. Both were used in the removal of the dye Remazol Brilliant Blue R. In discoloration experiments with immobilized peroxidase, two phenomena were observed: discoloration, due to adsorption on the support (60.45%) and dye degradation, due to the action of the enzyme (27.50%). The free enzyme removed 62.86% of the color. Enzyme immobilization resulted in an increase in enzyme stability regarding certain parameters, besides enabling its recovery and reuse. The immobilized enzyme showed a potential of 61.17% for the removal of the dye color after 6 consecutive cycles and a residual activity of 55.25% after 5 consecutive cycles of its reuse. These results are significant, with the possibility of application of immobilized enzymes in industrial sectors, leading to a reduction in operating costs. Keywords: Enzyme. Glutaraldehyde. Remazol Brilliant. Blue R. Discoloration. Storage..

(9) SUMÁRIO. 1 2 3. 1 2 3 4. PRIMEIRA PARTE ............................................................................9 INTRODUÇÃO .................................................................................10 REFERENCIAL TEÓRICO .............................................................14 CONSIDERAÇÕES FINAIS.............................................................41 REFERÊNCIAS ................................................................................43 SEGUNDA PARTE - ARTIGO.........................................................51 ARTIGO 1 Catalytic stability of turnip peroxidase in free and immobilized form on chitosan beads.................................................51 INTRODUCTION .............................................................................53 MATERIAL AND METHODS .........................................................56 RESULTS AND DISCUSSION.........................................................64 CONCLUSION ..................................................................................84 REFERENCES ..................................................................................85.

(10) 9. PRIMEIRA PARTE. APRESENTAÇÃO. Os resultados que fazem parte desta dissertação estão apresentados sob a forma de artigo, o qual se encontra no item artigo. As referências bibliográficas referem-se somente as citações que aparecem na introdução e no referencial teórico..

(11) 10. 1 INTRODUÇÃO. As enzimas apresentam várias propriedades (atividade, seletividade, especificidade). que. as. tornam. atrativas. como. catalisadores. para. biotransformações. Um grande número de enzimas, provenientes de uma variedade de vegetais e microrganismos, vem sendo apresentadas como capazes de desempenhar importantes papéis em diferentes aplicações nas indústrias química, alimentícia, têxtil, de papel e na agricultura, resultando em significativas reduções de custos. A tecnologia de enzimas é um campo multidisciplinar, e reconhecido pela Organização para a Cooperação Econômica e Desenvolvimento (OCED) como importante componente do desenvolvimento industrial sustentável. Esse desenvolvimento tem estimulado as indústrias química e farmacêutica a utilizarem a tecnologia de enzimas com interesse concentrado nas áreas da saúde, de energia e do meio ambiente (CARDOSO; MORAES; CASS, 2009). Entre as enzimas estudadas destacam-se as peroxidases que são empregadas na indústria devido às suas propriedades catalítica e à versatilidade de reconhecer diversos substratos. Apresentam aplicações na área de síntese orgânica, remoção de compostos fenólicos em resíduos industriais, construção e aplicação de biossensores, imunoensaios enzimáticos e diminuição de resíduos poluentes de indústria de tecidos, que utilizam estas enzimas em processos de descoloração. Estas enzimas catalisam a redução do peróxido de hidrogênio, enquanto um doador de elétrons é oxidado, e podem ser utilizadas na remoção de compostos fenólicos e aminas aromáticas em soluções aquosas. Além disso, alguns autores mostram que a oxidação de compostos coloridos é estimulada significativamente por meio da utilização de enzimas oxidativas..

(12) 11. Devido à ampla utilização das peroxidases, principalmente como biocatalisador ambiental, há um interesse crescente por novas fontes desta enzima e por processos de obtenção de baixo custo. Nosso grupo de pesquisa concluiu, dentre vários vegetais estudados, que a raiz do nabo é uma ótima fonte de peroxidase, e pode ser obtida por um processo de baixo custo. A enzima bruta foi investigada, quanto à remoção de uma série de corantes da indústria têxtil com resultados bastante promissores (SILVA et al., 2012). Entretanto, as peroxidases, assim como quaisquer enzimas, estão sujeitas a inativação por diversos fatores químicos, físicos e biológicos, podendo estes ocorrer quando estocadas ou durante o uso.. Portanto, estudar formas de. armazenamento da enzima é relevante no sentido de encontrar uma condição que resulte na manutenção da sua atividade catalítica. Além disso, para que a catálise seja eficiente em um determinado processo, há necessidade de proteger a enzima de interagir com o meio no qual é realizada a reação, pois o mesmo poderia provocar a sua inativação, impossibilitando a catálise da reação. A estabilidade e capacidade catalítica de enzimas diminuem com a complexidade dos efluentes. Considerando isso, há a necessidade de estabilizar a enzima e protegê-la contra essa inativação podendo utilizá-la nas suas várias aplicações. Faz-se então, necessário, o emprego de um método para que a mesma não perca sua atividade catalítica e sua seletividade. Frente a este problema, várias técnicas vem sendo desenvolvidas para fornecer estabilidade as enzimas e facilitar sua recuperação e utilização. A imobilização de enzimas tem se mostrado, nos últimos tempos, uma ferramenta para melhorar as propriedades enzimáticas, como a alta atividade e seletividade, representando uma alternativa para a condução de bioprocessos uma vez que, teoricamente, os biocatalisadores imobilizados ficam retidos para serem várias vezes, o que acarreta economia significativa no custo global do processo. A fixação ou encerramento das enzimas em suportes sólidos.

(13) 12. proporciona diversas vantagens sobre as enzimas livres, tais como: maior estabilidade operacional e aumento da vida útil da enzima, facilidade de separação do produto do catalisador em processos analíticos e em reatores de fluxo contínuo. Vários tipos de suportes sólidos vêm sendo estudados para a imobilização de enzimas. Entre estes destaca-se a quitosana, que possuiu várias propriedades físicas, químicas e biológicas que a tornam. muito versátil. quimicamente. É um polissacarídeo amino, derivado do processo de desacetilação da quitina, um produto natural, de baixo custo, renovável e biodegradável, de grande importância econômica e ambiental e foi o suporte testado neste trabalho na imobilização da peroxidase do nabo.. 1.1 Objetivo geral Armazenamento e imobilização da enzima peroxidase extraída da raiz do nabo em esferas de quitosana da enzima peroxidase, avaliando seu potencial de aplicação na biodegradação do corante Remazol Brilliant Blue R.. 1.2 Objetivos específicos. a) extrair a peroxidase da raiz do nabo; b) otimizar os parâmetros de imobilização da enzima peroxidase da raiz do nabo, avaliando o tempo de contato da enzima com o suporte e a relação da concentração da enzima com o suporte; c) estudar a estabilidade da enzima livre e imobilizada; d) armazenar a enzima livre e imobilizada sob várias condições; e) avaliar o potencial de reutilização do complexo enzima-suporte..

(14) 13. f) avaliar a capacidade de degradação do corante Remazol Brilliant Blue R (RBBR) catalisada pela peroxidase da raiz do nabo na sua forma imobilizada e livre..

(15) 14. 2 REFERENCIAL TEÓRICO 2.1 Enzimas como biocatalisadores e suas aplicações. As enzimas são substâncias naturais envolvidas em todos os processos bioquímicos que ocorrem nas células vivas. São macromoléculas geralmente proteicas, imprescindíveis a qualquer ser vivo, pois aceleram as reações químicas que mantém e regulam os processos vitais. Caracterizam-se pela alta especificidade e eficiência, e se fazem necessárias em baixas concentrações. Em muitos processos as enzimas podem substituir substâncias químicas sintéticas e contribuir para processos de produção ou gerar benefícios para o meio ambiente, por meio da biodegradabilidade e pelo menor consumo de energia (LEHNINGER; NELSON; COX, 2011). As enzimas apresentam várias propriedades que as tornam atrativas como catalisadores para biotransformações. São catalisadores versáteis, existindo um processo enzimático equivalente para cada tipo de reação orgânica. A aplicação de biocatalisadores na indústria é objeto de muitas investigações, devido à alta atividade catalítica em comparação com os catalisadores convencionais, e pelo fato de atuarem com alta eficiência em condições reacionais bastante suaves (DALLA-VECCHIA; NASCIMENTO; SOLDI, 2004). Essas propriedades têm estimulado as indústrias química e farmacêutica a utilizarem a tecnologia de enzimas com interesse concentrado nas áreas da saúde, de energia e do meio ambiente (CARDOSO; MORAES; CASS, 2009). A tecnologia enzimática despontou como área de investigação no início de 1960, com a imobilização de enzimas para utilização em processos químicos (KRAJEWSKA, 2004). Desde então esses biocatalisadores têm sido empregados em diversos segmentos, incluindo a síntese de compostos bioativos e de novos.

(16) 15. biopolímeros, metodologias analíticas por meio de construção de biossensores, terapia enzimática e processos em indústrias tradicionais como óleos e gorduras, curtumes, papel e celulose, têxtil e cosméticos (SIMÕES et al., 2011). Com o avanço da tecnologia enzimática, a seleção de novas enzimas, a produção de enzimas por tecnologia do DNA recombinante e a engenharia de proteínas permitiram a modificação das propriedades cinéticas e da estabilidade que contribuíram para o desenvolvimento de novas soluções na tecnologia de reatores enzimáticos e nas técnicas de imobilização (GUISAN, 2006). As pressões governamentais, a regulamentação severa, as novas tecnologias e as descobertas científicas, no entanto, condicionam o crescimento do mercado das enzimas. O desenvolvimento de tecnologias com base enzimática tem direta correlação com a procura de novos produtos para diferentes segmentos do mercado. De acordo com Industry Market Research for Business Leaders, Strategists, Decision Makers (2012), o mercado global de enzimas industriais foi de 5,1 bilhões de dólares em 2008 e a projeção é de que o crescimento anual foi de aproximadamente 6,3%, com estimativa de movimentação de 7,0 bilhões de dólares para 2013. O mercado mundial das enzimas divide-se em três segmentos: enzimas empregadas na indústria de alimentos, enzimas técnicas e enzimas empregadas na produção de ração animal. Destes três grupos, destacam-se as enzimas destinadas aos setores de alimentos, que são empregadas basicamente na produção de xarope de açúcar invertido e de compostos aromatizantes, e as enzimas técnicas, que são utilizadas na formulação de detergentes, produção de papel e celulose, manufatura de couros e produção de fármacos. Este é o principal mercado consumidor de enzimas, detendo aproximadamente 50% do total das enzimas comercializadas. Outras empresas desenvolvem sistemas industriais de conversão de biomassa para transformação enzimática de resíduos agrícolas em etanol. Verifica-se também a introdução de enzimas na produção.

(17) 16. de plásticos derivados de matérias-primas não originadas do petróleo, na produção de fontes alternativas de energia, como os biocombustíveis, ou outros materiais relacionados (GUISAN, 2006; MENDES et al., 2011; SÁ-PEREIRA et al., 2008). Muitas vezes, para um determinado processo biocatalítico, a enzima nativa não atende aos requisitos para aplicação em grande escala, e as suas propriedades, portanto, necessitam ser otimizadas ou moduladas. O papel de engenharia de proteínas é o de ultrapassar as limitações de enzimas naturais como biocatalisadores, otimizando quimiosseletividade, regiosseletividade e principalmente, estereosseletividade do biocatalisador, aspectos relacionados a processos como estabilidade a longo prazo em determinadas temperaturas e valores de pH e a atividade na presença de concentrações elevadas de substrato para atingir a produtividade máxima. Desta forma, técnicas de imobilização têm sido empregadas com o objetivo de reutilizar as enzimas (SINGH et al., 2013). O uso de biocatalisadores imobilizados (enzimas e células) é uma estratégia e importante ferramenta para estabilizar e reduzir a inativação por distorção da sua estrutura nativa por influência da temperatura, pH e de solventes orgânicos, o que pode ser atrativo para a aplicação de enzimas no setor industrial, a ser utilizada para a condução de bioprocessos em várias situações. Aliada à engenharia, bioquímica, microbiologia e genética, esta tecnologia pode ser utilizada como uma ferramenta para aumentar a eficiência de processos biotecnológicos e, consequentemente, reduzir custos de produção (CARVALHO et al., 2005; SHELDON, 2007). 2.2 Enzima peroxidase e suas aplicações As peroxidases (E.C. 1.11.1.7, doador H2O2 oxidorredutase) são enzimas que catalisam a redução do peróxido de hidrogênio (H2O2) ou outro peróxido.

(18) 17. orgânico, enquanto um doador de elétrons (AH2) é oxidado. A reação ocorre em várias etapas, como mostrado a seguir: Peroxidase + H 2 O 2 → CompostoI + H 2 O CompostoI. CompostoII. + AH. → CompostoII. 2. + AH. 2. + AH. → Peroxidase + AH. (1). •. •. (2) + H 2O. (3). No primeiro estágio do processo catalítico ocorre a reação do sítio ativo com o peróxido de hidrogênio. O peróxido de hidrogênio é reduzido produzindo água e a enzima é oxidada formando o composto I, uma forma intermediária reativa que apresenta um estado de oxidação mais alto em comparação com a enzima nativa. No segundo estágio da reação, o composto I oxida uma molécula de substrato (AH2), gerando um substrato radicalar e o composto II. Finalmente, o composto II é reduzido por uma segunda molécula de substrato, fazendo com que a enzima retorne a sua forma inicial (HINER et al., 2001). Os radicais livres formados durante o ciclo (AH●) difundem-se do sítio ativo da enzima para o meio da solução. Estes radicais livres são reativos e tendem a iniciar uma reação espontânea, em cadeia, em que as moléculas aromáticas são ligadas formando um produto poliaromático com solubilidade reduzida 2 AH● → A2H2(S) ↓ (NICELL, 1994). A maioria das moléculas poliaromáticas solúveis produzidas apresenta características de substrato da enzima, sendo novamente oxidadas pela reação. Consequentemente, a demanda de H2O2 para a reação global de um substrato aromático é sempre maior do que o previsto pela estequiometria da reação. O resultado subsequente desta oxidação é a formação de cadeias ainda maiores com solubilidade reduzida (NICELL et al., 1992). As enzimas peroxidases possuem especificidade por uma ampla variedade de substratos aromáticos, como fenóis, polifenóis, aminas aromáticas.

(19) 18. primárias e poliaminas aromáticas primárias. Essas enzimas podem ser encontradas em microrganismos, plantas e também em mamíferos. A função biológica das peroxidases envolve síntese de várias biomoléculas e também a detoxificação por meio da destruição de H2O2. (VAN DE VELDE; VAN RANTWIJK; SHELDON, 2001). As peroxidases podem ser classificadas em três superfamílias: planta peroxidase, animal peroxidase e catalase peroxidase. A superfamília planta peroxidase está ainda dividida em três classes, de acordo com sua origem: classe I, peroxidases intracelulares que incluem a citocromo C peroxidase de levedura, a ascorbato peroxidase e a catalase-peroxidase bacteriana (PASSARDI et al., 2007); a classe II, que consiste em peroxidases fúngicas extracelulares: ligninases, ou lignina peroxidase. e manganês peroxidase, glicoproteínas. monoméricas que estão envolvidas na degradação da lignina e são comumente estudadas na descoloração de corantes e a classe III, que compreende as classes vegetais, sendo a isoenzima C da horsehadish peroxidase o exemplo mais estudado (DUNFORD, 1999; HUSSAIN, 2009). Peroxidases de plantas têm sido amplamente investigadas quanto à sua aplicação em poluentes orgânicos e outras áreas. Fatibello Filho e Vieira (2002) avaliaram o uso de extratos brutos vegetais ricos em peroxidase para a determinação. de. vários. analitos. de. interesse. alimentício,. ambiental,. farmacêutico, industrial e tecnológico. Silva et al. (2012) estudaram os seguintes vegetais para a obtenção da peroxidase: nabo (Brassica campestre ssp. Rapifera), rabanete (Raphanus sativus), abobrinha (Curcubita pepo), jiló (Solanum gilo Raddi) e batata-doce (Ipomoea batatas (L.) Lam.), entre estes, a raiz do nabo apresentou a mais alta atividade enzimática. No trabalho também foram avaliadas condições que melhorassem a obtenção da enzima peroxidase da raiz do nabo durante o processo de extração, constatando que a solução extratora contendo NaCl 0,2.

(20) 19. mol L-1 acarreta maior atividade enzimática (extrato bruto enzimático). Essa enzima apresentou atividade máxima em pH 7,0 e é ativa na faixa de temperatura de 30 ºC a 50 ºC, o que favorece a sua utilização em processos industriais. Na purificação parcial da peroxidase, o agente precipitante mais eficiente foi a acetona. Enzimas tais como lignina peroxidase e manganês peroxidase, ambas associadas com a degradação de lignina, podem ser utilizadas com sucesso para o biobranqueamento na indústria do papel, e podem produzir quebra oxidativa de corantes sintéticos azo. A horsehadish peroxidase (HPR) bem como as peroxidases de soja e nabo estão sendo aplicadas para a biorremediação de efluentes contaminados com fenóis, cresóis e fenóis clorados (MAYER; STAPLES, 2002; REGALADO; GÁRCIA-ALMENDÁREZ; VÁZQUEZ, 2004). As peroxidases também são utilizadas em sistemas analíticos em biossensores para a determinação de peróxido de hidrogênio e hidroperóxidos orgânicos, glicose, álcoois, glutamato e colina; em kits de diagnóstico, tais como a quantificação de ácido úrico, colesterol, lactose, e entre outros. Testes imunoenzimáticos como o teste de ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) que permitem a detecção de anticorpos específicos no plasma sanguíneo utilizam-se de enzimas na qual as peroxidases tem sido mais comuns utilizadas. A evolução destes métodos parece ser uma alternativa para projetar novas formas catalíticas de peroxidases de plantas de fontes diferentes para superar os problemas de estabilidade e aumentar a resistência térmica (HAMID; KHALIL, 2009; REGALADO; GÁRCIA-ALMENDÁREZ; VÁZQUEZ, 2004). As principais classes de enzimas que apresentam potencial no tratamento de uma variedade de compostos coloridos são as oxirredutases, como lacases e peroxidases (AKHTAR et al., 2006; BHUNIA; DURANI; WANGIKAR, 2001; YANG et al., 2003) e seu uso pode ser uma prática.

(21) 20. interessante para a descoloração de corantes sintéticos. Peroxidases podem catalisar a transformação/degradação de corantes aromáticos, tanto por precipitação como pela ruptura do anel aromático (HAMID; KHALIL, 2009; HUSSAIN, 2009). Vários estudos foram realizados utilizando peroxidases de plantas na descoloração de corantes. Várias são as dificuldades da utilização de peroxidases livres na descoloração e degradação de corantes. Uma nova abordagem baseada na aplicação de enzimas imobilizadas para o tratamento de compostos aromáticos tem aumentado a demanda devido ao seu menor impacto sobre os ecossistemas. Além de maior estabilidade, as enzimas quando imobilizadas podem adquirir propriedades adicionais vantajosas; enzimas imobilizadas podem ser usadas repetidamente ou continuamente em uma variedade de reatores, pode ser facilmente separadas dos produtos de reação solúveis e substrato não tratado o que envolvem a redução do custo operacional, e a remoção contínua de metabólitos tóxicos, simplificando o trabalho e atendendo aos processos industriais (MATTO; HUSAIN, 2009). Vários esforços têm sido feitos para desenvolver os procedimentos para a imobilização de peroxidases de várias fontes, mas a maioria das preparações de enzimas imobilizadas utilizam as enzimas comercialmente disponível ou suportes caros que aumentam os custos dos processos.. 2.3 Imobilização de enzimas. A imobilização pode ser definida como o movimento não independente das células ou enzimas na parte aquosa do sistema, por estarem alojadas dentro ou na superfície do agente imobilizador (TAMPION; TAMPION, 1988). A imobilização também é definida como a fixação de enzimas ou células vivas em um ambiente, de maneira que sua atividade catalítica não seja afetada.

(22) 21. negativamente e que possam ser usadas repetidamente e continuamente (GUISAN, 2006). A utilização de formas enzimáticas imobilizadas é de fundamental importância para aumentar a potencialidade dos sistemas enzimáticos no tratamento de resíduos industriais. Consequentemente, muitos suportes tem sido utilizados para a imobilização de enzimas de interesse. De maneira geral, a utilização de enzimas suportadas tem-se mostrado bastante conveniente, principalmente em função do aumento da sua estabilidade química e térmica. As enzimas são moléculas solúveis em água e o seu uso repetido, o qual é importante para viabilizar um processo econômico, é problemático devido ao fato de que elas são difíceis de serem recuperadas deste meio além da separação dos substratos e produtos. Muitas enzimas não são suficientemente estáveis dentro das condições operacionais, e elas podem perder a atividade catalítica devido as altas temperaturas, auto-oxidação, auto-digestão e/ou desnaturação pelo solvente e solutos ou devido a danos físicos. A produtividade de processos industriais, medidas de rendimento em função do tempo, é frequentemente baixa devido ao limite tolerado pela enzima para altas concentrações de substrato(s) e produto(s). Estes problemas podem ser solucionados pela imobilização de enzimas e biocatalizadores (CASTILLO et al., 1997; SATAR; HUNSAI, 2011). Para a obtenção da diminuição no custo global de processos que utilizam enzimas imobilizadas, o procedimento de imobilização deve atender a alguns requisitos, como baixo custo, boa recuperação da atividade enzimática e que a meia-vida operacional da enzima imobilizada seja suficientemente longa. (CASTRO et al., 2008; DALLA-VECCHIA; NASCIMENTO; SOLDI, 2004). Deve-se sempre considerar que a atividade da enzima seja mantida após a imobilização, ou seja, não deverão ocorrer alterações estruturais que levam a mudanças em seu sítio ativo (MENDES et al., 2011)..

(23) 22. Processos de imobilização e aplicações industriais têm sido relatados na literatura, incluindo a síntese de compostos bioativos e de novos biopolímeros, metodologias analíticas por meio de construção de biossensores, terapia enzimática e processos em indústrias tradicionais como óleos e gorduras, curtumes, papel e celulose, têxtil e cosméticos (MENDES et al., 2011; RASERA, 2006).. 2.3.1 Métodos de imobilização. Na literatura, inúmeros métodos de imobilização de enzimas têm sido descritos e utilizados para contornar os possíveis problemas de instabilidade e otimizar as várias aplicações. Em reações químicas e bioquímicas, o uso de enzimas puras pode ser dispendioso e seu descarte após o uso é economicamente inviável. Além disso, a recuperação do meio reacional pode ser difícil. Os métodos de imobilização variam da simples ligação por adsorção física em suportes diversos até a encapsulação em matrizes de sol-gel e granulação. Várias técnicas podem ser aplicadas para imobilizar ou confinar as enzimas em suportes sólidos, estando baseadas em mecanismos físicos e químicos. Entre os métodos de imobilização química estão: ligação da enzima no suporte por ligações iônicas; ligação da enzima no suporte por ligações covalentes; ligação cruzada entre a enzima e o suporte; ligação da enzima no suporte promovida por reagentes multifuncionais (ALFAYA; KUBOTA, 2002; KHAN; AKHTAR; HUSAIN, 2005; SHELDON, 2007). Os métodos físicos envolvem o confinamento das moléculas de enzima dentro dos poros de uma matriz polimérica, micelas reversas, microcápsulas ou entre membranas macroscópicas. (DURAN. et. al.,. 2002).. Na. Figura. 1. é. mostrada,. esquematicamente, a classificação dos métodos utilizados para a imobilização de enzimas..

(24) 23. Ambos os métodos físicos e químicos possuem suas vantagens e desvantagens que dependem de vários fatores. A adsorção física é o método mais simples e o mais empregado para imobilização de enzimas. Nesse caso, o biocatalisador é estabilizado por interações com o suporte como forças de van der Waals, ligações de hidrogênio e ligações iônicas. As principais vantagens deste processo de imobilização são a facilidade e a simplicidade do processo, a estrutura conformacional da enzima é pouco alterada e além de ser um processo de menor custo. A grande desvantagem é a dessorção da enzima devido às variações de temperatura, pH e força iônica (DURAN et al., 2002; MENDES et al., 2011). Em geral, os métodos de imobilização química tendem a reduzir a atividade da enzima. A imobilização por ligação covalente baseia-se na ativação de suportes com a inserção de grupos reativos que reagem com os grupos nucleofílicos da enzima. Esta técnica não é comum como o método de adsorção física, mas apresenta a vantagem de evitar o fenômeno de dessorção..

(25) 24. Figura 1 Métodos mais comuns utilizados para a imobilização de enzimas Fonte: DALLA-VECCHIA; NASCIMENTO; SOLDI (2004). A seleção das condições para a imobilização por ligação covalente é mais difícil que em outros métodos de ligação em suportes. É necessário conhecer a densidade dos grupos ativos por unidade de área do suporte e a sua geometria para reduzir a formação do complexo enzima-suporte inativo. Este método pode também afetar a estrutura ativa da enzima, devido à alteração do centro ativo, contudo se a ligação covalente não inviabilizar o sítio ativo, podese obter uma maior eficiência catalítica. Suas principais vantagens são a maior resistência do biocatalisador quanto à variação de pH, temperatura e influência de solventes orgânicos; os derivados preparados podem ser empregados em diversas conformações de reatores, como fluxo contínuo, empacotado, tanque agitado e leito fluidizado e, a carga de enzima permanece constante após a etapa.

(26) 25. de imobilização (CANO; MINGUILLON; PALET, 2006; CASTRO et al., 2008; HANEFELD; GARDOSSI; MAGNER, 2009). O procedimento de imobilização por oclusão em géis ou membranas orgânicas corresponde ao confinamento do material biológico em uma matriz polimérica ou em uma membrana semipermeável, sendo o sistema revestido por uma membrana polimérica permeável, para reduzir a lixiviação do material biológico. Este tipo de imobilização apresenta a grande vantagem de se poder utilizar qualquer tipo de enzima. No entanto, exibe a desvantagem de lixiviação do material enzimático, devido aos diferentes tamanhos de poros nos polímeros, como também problemas de tempo de resposta, pela dificuldade de difusão das espécies envolvidas através das membranas (ALFAYA; KUBOTA, 2002). O processo mais amplamente utilizado baseia-se na formação de ligações cruzadas entre os grupos amino do suporte com os grupos amino da enzima, ou da formação de ligações cruzadas intermoleculares com a formação de partículas insolúveis macroscópicas, pela utilização de reagentes bi- ou multifuncionais. O reagente multifuncional é geralmente uma molécula que possui a capacidade de ligar a enzima ao suporte. Vários reagentes multifuncionais podem ser utilizados, envolvendo diferentes tipos de aminoácidos das enzimas e grupos funcionais do suporte. Entre os agentes multifuncionais mais utilizados pode-se destacar o glutaraldeído, carbodiimida e γ-aminopropiltrietoxissilano (FRANCA et al., 2008; MOHAMED et al., 2013; VILLELA , 2006). As principais vantagens deste método são a simplicidade de execução e a forte interação da enzima com o suporte. Entretanto, também apresenta grandes desvantagens, como a dificuldade do controle da reação, o uso de grandes quantidades de enzima, baixa atividade enzimática (ALFAYA; KUBOTA, 2002; SHELDON, 2007). Dessa forma, a escolha entre os métodos físicos e químicos depende de vários fatores. Usualmente, é preferível obter uma enzima com menor atividade,.

(27) 26. mas com maior estabilidade do que uma enzima com uma alta atividade, mas que possua uma pequena estabilidade (DURAN et al., 2002). Em algumas situações, quando se deseja obter enzimas imobilizadas com maior atividade, ou aumentar a resistência mecânica dos suportes, é recomendável a utilização de uma combinação de métodos para a imobilização de enzimas. Por exemplo, pode-se melhorar a estabilidade da enzima imobilizada por adsorção promovendo-se uma ligação cruzada entre as moléculas da enzima com o glutaraldeído (CASTRO et al., 2008). A utilização de enzimas imobilizadas pode ultrapassar algumas destas limitações e fornecer catalisadores estáveis com longos tempos de vida. Em particular, imobilização de peroxidases por ligações covalentes retém alta atividade da enzima e é eficaz na remoção de compostos fenólicos e cor numa ampla faixa de pH e temperatura ( ZILLE, 2003). Apesar da grande diversidade de métodos desenvolvidos e aplicados na imobilização de enzimas, não há um método aplicável para todas as enzimas (MENDES et al., 2011). A escolha do método de imobilização a ser utilizado para imobilização de uma determinada enzima passa, necessariamente, por análise da aplicação a que se destina o sistema contendo a enzima imobilizada. Uma vez definida a aplicação e condições operacionais onde a enzima deverá atuar, pode-se então avaliar, entre as técnicas disponíveis, aquela que melhor se adeque às necessidades exigidas. É importante avaliar o tempo e os custos necessários para viabilizar o método de imobilização escolhido, uma vez que tais parâmetros irão refletir no processo, portanto, nos custos do produto final (CASTRO et al., 2008; SILVA, 2000). Na Tabela 1 estão apresentados de modo resumido as principais vantagens e desvantagens dos cinco métodos básicos de imobilização..

(28) Tabela 1 Vantagens e desvantagens dos cinco métodos básicos de imobilização Adsorção. Característica natural Ligações fracas. • •. Ligação covalente. Ligação química entre os grupos funcionais da enzima e do suporte. • • • •. Confinament o. Incorporação da enzima dentro de um gel ou um polímero. •. •. Ligação entre enzima e agente • de reticulação (Ex.glutaraldeído)/ molécula inerte (Ex., BSA) Afinidade Ligação por afinidade entre um • grupo funcional em um suporte (Ex., avidina) e afinidade em uma sequência de proteína (Ex., Biotina) Fonte: SASSOLAS; BLUM; LECA-BOUVIER (2012) Ligaçãocruzada. Vantagens Facilidade operacional Perda limitada da atividade enzimática Nenhuma barreira de difusão Estável Curto tempo de resposta Alta atividade enzimática. • •. Desvantagens Dessorção Adsorção não específica. • •. Matriz não regenerável Produto tóxico com o acoplamento. A atividade catalítica não é influenciada por interações químicas entre o monômero e a enzima Vários tipos de enzimas podem ser imobilizadas dentro de um mesmo polímero Simples. • • •. Barreira de difusão Vazamento de enzima Altas concentrações de monômero e necessidade de enzima por electropolimerização. •. Perda da atividade enzimática. Imobilização orientada. •. Necessidade da presença de grupos específicos na enzima (Ex., His, Biotina). controlada. e. 27.

(29) 28. 2.3.2 Tipos de suportes. As propriedades das preparações de enzimas imobilizadas são influenciadas pelas propriedades da enzima e do material do suporte. A interação entre esses dois componentes proporciona um derivado imobilizado com propriedades químicas, bioquímicas, mecânicas e cinéticas específicas. Há uma imensa variedade de suportes que tem sido utilizados para a imobilização de enzimas e, de modo geral, pode-se classificá-los de acordo com sua natureza química, em suportes orgânicos ou inorgânicos, sendo possível apontar uma série de vantagens e desvantagens associadas a cada um desses tipos de suportes (CASTRO et al., 2008). Muitos suportes orgânicos, sejam naturais ou sintéticos, têm sido propostos para imobilização de enzimas e a predominância do uso desses sobre os inorgânicos deve-se, principalmente, à versatilidade que esses materiais têm de participarem de um grande número de diferentes reações, o que favorece sua ativação. Por outro lado, sua aplicação em muitas áreas é limitada por uma baixa estabilidade, bem como a dificuldade de recuperação do catalisador do meio reacional por métodos simples (KENNEDY; WHITE, 1985; SHELDON, 2007). Outro inconveniente associado aos suportes orgânicos, particularmente os naturais e seus derivados, é susceptibilidade ao ataque de microorganismos. Na Tabela 2 são apresentados alguns exemplos de suportes orgânicos e inorgânicos utilizados em processos de imobilização..

(30) 29. Tabela 2 Exemplos de suportes insolúveis para imobilização de enzimas Orgânicos naturais Ágar/agarose Carbono ativado Celulose Colágeno Dextranas Gelatinas Quitina/quitosana Seda Fonte: CASTRO et al. (2008). Orgânicos sintéticos Copolímeros de acrilato/metacrilato Poli(amida) Poli(anilina) Poli(estireno) Poli(pirrol) Poli(vinilálcool) Poli(vinilcloreto) Polímeros de acrilamida. Inorgânicos Alumina Celite Hidroxiapatita Óxidos metálicos Sílica Titânia Vidro poroso Zircônia. A maior contribuição para o bom desempenho da enzima imobilizada é dada pelo suporte. Se de um lado um suporte criteriosamente selecionado pode aumentar o tempo de meia-vida da enzima imobilizada, de outro uma escolha imprudente pode afetar adversamente não só a estabilidade térmica, mas o desempenho global do sistema (CASTRO et al., 2008; MENDES et al., 2011). A escolha do suporte é tão importante quanto a escolha do método de imobilização a ser utilizado em um determinado sistema. Alguns cuidados devem ser tomados nessa escolha, uma vez que, após a imobilização, o suporte será o principal constituinte do microambiente em que a enzima estará imobilizada. Neste sentido, é necessário que sejam avaliadas algumas características do sistema. Os requisitos básicos para um material ser considerado um suporte adequado são: as características físicas do suporte devem ser adequadas para uso no reator selecionado; manter a estabilidade química e mecânica sob as condições operacionais; conter grupos químicos capazes de se ligarem ao biocatalisador; o material constituinte do suporte deve permitir a obtenção de partículas com dimensões variadas, a fim de que se possa alcançar um ponto de equilíbrio entre a redução de efeitos difusionais e a operacionalidade do reator,.

(31) 30. sobretudo quando este for do tipo leito fixo; porosidade compatível com as dimensões do biocatalisador a ser imobilizado; resistência aos microrganismos; estabilidade térmica; permitir a regeneração; um longo período de vida útil; alta capacidade de retenção de enzima (CASTRO et al., 2008; SILVA, 2000). Polímeros naturais vêm sendo utilizados como materiais de suporte na tecnologia de imobilização, tais como alginato, carragenina, agarose, quitina, quitosana, e apresentam vantagens de ser atóxico, biocompatível e biodegradável.. 2.3.2.1 Quitina/Quitosana. A quitina, denominação usual para o polímero β (1-4) 2-acetamino-2deoxi-D-glicose (N-acetilglicosamina), possuindo, assim, estrutura semelhante a fibra vegetal denominada celulose (Figura 2 ). A diferença estrutural entre as duas fibras deve-se aos grupos hidroxilas localizados na posição 2, que na quitina foram substituídos por grupos acetoamino, é o segundo polissacarídeo natural mais abundante encontrado na natureza e está presente em uma variedade de animais marinhos (caranguejo, camarão, lagosta), insetos, fungos e leveduras. A quitosana, β (1-4)-2-amino-2-deoxi-D-glicose (Figura 2), é o principal derivado da quitina, obtida a partir da desacetilação por processo de hidrólise básica . A transformação da quitina em quitosana modifica suas propriedades, de modo que a quitosana insolúvel em água, torna-se solúvel na maioria dos ácidos orgânicos, como acido acético, acido fórmico e ácidos inorgânicos, incluindo o ácido clorídrico. A quitosana é um produto natural, de baixo custo, renovável e biodegradável, de grande importância econômica e ambiental. As carapaças de crustáceos são resíduos abundantes e rejeitados pela indústria pesqueira, que em muitos casos as consideram poluentes. Sua utilização reduz o impacto ambiental.

(32) 31. causado pelo acúmulo nos locais onde é gerado ou estocado (KRAJEWSKA, 2004; OLIVEIRA; VIEIRA, 2006).. Quitina. Quitosana. Celulose. Figura 2 Estruturas da quitina, quitosana e celulose Fonte: KRAJEWSKA (2004). A presença de grupos amino livres na quitosana e sua consequente solubilidade em soluções aquosas de certos ácidos, seu caráter de polieletrólito e suas propriedades físicas, químicas e biológicas, tornam este polímero mais versátil quimicamente quando comparado com seu análogo, a quitina. Dessa forma, a quitosana torna-se uma atraente alternativa para muitas aplicações, sendo considerada um suporte ideal para imobilização de enzimas, devido as propriedades já citadas, e, principalmente, em função de sua matéria prima ser.

(33) 32. de baixo custo, pois se trata, principalmente, de resíduos da indústria pesqueira (AMORIM et al., 2003; KRAJEWSKA, 2004; OLIVEIRA; VIEIRA, 2006). Os biocatalisadores preparados por imobilização em quitosana têm sido empregados na biotransformação de proteínas, modificação de óleos e gorduras e materiais lignocelulósicos, remoção de contaminantes em águas residuárias, síntese de compostos de alto valor agregado empregados nas indústrias farmacêutica e alimentícia e geração de energia, purificação de enzimas, preparação de sofisticados biossensores para medições in situ em águas residuárias e quantificação de metabólitos produzidos pelo organismo humano no controle de enfermidades. Além disso, é economicamente viável, e bastante empregada na medicina, em produtos farmacêuticos, na agricultura, em biotecnologia, na indústria de cosméticos e de alimentos e, também, como adsorvente na remoção de corantes e no tratamento de efluentes industriais (OLIVEIRA; VIEIRA, 2006; MENDES et al., 2011). Quitosana e quitina são materiais suportes para imobilização de enzimas, os quais podem ser utilizados sob a forma de pós, flocos e géis e em diferentes configurações geométricas. A preparação do gel de quitosana é favorecida pelo fato de que o quitosana se dissolve facilmente em soluções diluídas da maioria dos ácidos orgânicos, incluindo ácido fórmico, acético, tartárico e ácido cítrico, de modo a formar soluções viscosas que precipitam sobre um aumento de pH e por formação de complexos ionotrópicos com polieletrólitos aniônicos insolúveis em água. Desta forma géis de quitosana podem ser transformados em esferas, membranas, revestimentos, cápsulas, fibras, fibras ocas e esponjas (KRAJEWSKA, 2004). A preparação de esferas é uma estratégia para incrementar a capacidade de adsorção da quitosana, uma vez que as esferas possuem uma área superficial cerca de 100 vezes maior do que a quitosana em flocos. Além disso, as esferas apresentam cinéticas de adsorção mais rápidas e maior facilidade de manuseio e.

(34) 33. operação. A versatilidade deste polímero permite a preparação de esferas de diferentes formas e tamanhos, envolvendo diversos produtos e derivados. O uso de quitosana porosa em partículas apresenta inúmeras vantagens no processo de imobilização de enzimas: o fato de a quitosana ser um material de origem natural (biopolímero), sendo desta maneira seguro para o uso e biocompatível; quando comparada com outras resinas sintéticas, sua grande quantidade de poros se apresenta de maneira uniforme desde a superfície até seu interior, provendo desta maneira uma grande difusão do substrato; a presença abundante de grupos amina altamente reativos disponíveis para imobilizar enzimas via ligação covalente e pelo fato de que a quitosana, por si mesma, possui uma grande afinidade com enzimas, permitindo, desta maneira, que uma grande quantidade de enzimas possa ser imobilizada (AZEVEDO et al., 2007; DENKBAS et al., 2002). No intuito de aumentar a estabilidade química e física da quitosana e seus derivados (complexos polieletrolíticos e matrizes híbridas), têm sido empregadas alternativas como a modificação química, também denominada de reticulação, empregando diferentes agentes de ativação. As reações envolvidas na reticulação por agentes bifuncionais ocorrem entre os grupos amino e hidroxilas da quitosana. Esta modificação pode ser realizada com diferentes agentes. químicos. como. glicidol,. epicloridrina,. glutaraldeído,. glioxal,. formaldeído e genipina, formando estruturas complexas, amplamente reportadas na literatura especializada (MENDES et al., 2011). Na reação da quitosana com glutaraldeído, ocorre ataque nucleofílico dos grupos amino da quitosana aos grupos carbonilas do glutaraldeído, também observado quando se utiliza glioxal e formaldeído. A ligação covalente entre os grupos amino do biopolímero e aldeído terminal do glutaraldeído é irreversível e resiste a valores extremos de pH e temperatura. Diferentes mecanismos são propostos para explicar a reação de glutaraldeído com quitosana..

(35) 34. Monteiro e Airoldi (1999) propuseram o mecanismo como sendo uma interação dos grupos amino livres da quitosana com o grupo aldeído do glutaraldeído formando uma base de Schiff (ligação imina). Para interpretar este comportamento, três hipóteses são consideradas: (i) formação de uma base de Schiff entre o grupo aldeído com o grupo amino da quitosana, o outro grupo aldeído livre seria utilizado para uma determinada reação de interesse; (ii) a reticulação é formada entre uma molécula de glutaraldeído e duas unidades de grupo amino, resultando na formação de duas bases de Schiff e (iii) a reticulação é formada também por mais de uma molécula de glutaraldeído, devido à sua polimerização em determinadas condições, por exemplo, em altos valores de pH. O glutaraldeído reage com os grupos NH2 da quitosana formando uma rede polimérica, na qual a enzima peroxidase está aprisionada entre os interstícios formados. Além disso, existe a possibilidade da enzima encontrar-se ligada em uma das extremidades do glutaraldeído (Figura 3) (AYBASTIER et al., 2011; OLIVEIRA; VIEIRA, 2006)..

(36) 35. Quitosana glutaraldeído. Quitosana. Peroxidase. Quitosana. Peroxidase. Figura 3 Esquema da enzima peroxidase imobilizada em uma matriz de quitosana modificada com glutaraldeído Fonte: AYBASTIER et al. (2011), com modificações. 2.4 Tratamento de corantes têxteis. Do total de água doce disponível para consumo mundial, cerca de 88% são utilizadas na agricultura. A indústria é responsável por apenas 7%, ficando os restantes 5% para uso doméstico. Somente o setor têxtil é responsável pelo consumo de 15% da água destinada ao setor industrial, devolvendo-a, depois dos processos, extremamente contaminada (HUNSAIN, 2006). Os corantes são substratos utilizados para impressão de papel, fotografia a cores, tingimento têxtil e como um aditivo em produtos de petróleo, apresentando uma origem sintética e estrutura aromática molecular complexa (HAMID; KHALIL, 2009; HUNSAIN, 2006). A indústria têxtil contribui significativamente para a poluição dos rios em algumas regiões do Brasil ao transformar fibras naturais e sintéticas em tecidos e outros produtos. Em algum ponto do processo de fabricação de tecidos,.

(37) 36. operações de processamento químico úmido são necessárias para preparar, purificar, colorir ou acabar adequadamente o produto. Isso resulta na geração de efluentes cuja carga de poluentes provém não somente da remoção de impurezas das próprias matérias-primas como também dos reagentes químicos residuais usados no processamento (CAMMAROTA; COELHO, 2001). Estima-se que aproximadamente 20% da carga de corantes seja perdida nos resíduos de tingimento durante o processamento têxtil, enquanto, para os corantes reativos, até 50% da concentração inicial do corante é descarregada no banho de tingimento (AZMI; BANERJEE, 2001). A legislação ambiental de países desenvolvidos, e mesmo a de países em desenvolvimento, vem exigindo melhor qualidade dos efluentes industriais, estimulando assim o desenvolvimento de pesquisas que conduzam a tratamentos mais eficientes. Segundo Guaratini e Zanoni (2000), os corantes são classificados de acordo com sua estrutura química ou de acordo com o método pelo qual ele é fixado na fibra têxtil. Baseado na estrutura química ou cromóforo, cerca de 20 a 30 diferentes grupos de corantes podem ser identificados. Corantes azo (monoazo, diazo, triazo, poliazo), antraquinona, ftalocianina e triarilmetano são quantitativamente os grupos cromóforos principais (ZILLE, 2005), e representam o grupo de corantes maior e mais versátil, representando 70% de todo o material corante consumido (SATAR; HUSAIN, 2011). Os corantes azo reativos são a maior classe de corantes sintéticos solúveis em água, com a maior variedade de cores e estruturas e são geralmente resistentes à biodegradação aeróbica. Durante o processo de tingimento a maior parte dos corantes é hidrolisado e depois lançado nos cursos de água. No entanto, a maioria destes corantes não apresenta toxicidade por si, mas após o lançamento em ambientes aquáticos podem ser convertidos em aminas com.

(38) 37. potenciais carcinogênicas e isto apresenta um impacto sob o ecossistema (HUSAIN, 2006). Corantes antraquinonas constituem a segunda mais importante classe de corantes têxteis, depois de corantes azo (BAUGHMAN; WEBER, 1994). Eles têm uma vasta gama de cores em quase todo o espectro visível, sendo violeta, azul e verde as cores mais comuns utilizadas (FONTENOT et al., 2002). Entre eles, Remazol Brilliant Blue R (RBBR) é um corante importante industrialmente que é frequentemente usado como um material de partida na produção de corantes poliméricos. RBBR é um derivado de antraceno e representa uma importante classe de organopoluentes tóxicos e recalcitrantes (OSMA; TOCAHERRERA; RODRIGUEZ-COUTO, 2010). O RBBR tem sido utilizado como uma substância modelo em diversos estudos sobre a degradação de corantes e diferentes tipos de processos físicos, químicos e biológicos foram testados para a sua remoção. Na Tabela 3 estão listados alguns métodos utilizados na remoção RBBR. Apesar das metodologias citadas se apresentarem como eficazes, as desvantagens de cada processo devem ser consideradas, tais como: geração de lodo (adsorção e oxidação de Fenton), meia-vida curta (ozonização) e alto custo da energia elétrica (eletroquímica)..

(39) 38. Tabela 3 Os métodos químicos e físicos estudados para remoção de corante Remazol Brilliant Blue R (RBBR) pH. Tempo de reação (min). Descoloração (%). 20. 1,5. 300. 97,5. 50-300. 20. 8. 5. 98. Oxidação Fenton. 100. 20. 3. 60. 99. Ozonização. 800. 25. 3-10. 45. 100. Hidrolise. 100. 120. 4. 120. 74,39. Eletroquímica. 400. 25. 80. 100. O ultrasom assistido processo eletroquímico Biossorção em Candida sp.. 50. -. 8. 120. 90. 203. 25. 2. 5760. 69. Metodologia. Concentração (RBBR) (mg L−1). Temperatura (◦C). 50. Adsorção em material de resíduos agroindustrial (farelo de trigo) Adsorção em nanopartículas (MgO). Fonte: SILVA et al. (2013). No que diz respeito ao tratamento de efluentes coloridos, a diversidade estrutural dos corantes proporciona uma grande variedade de cores, dificultando, entretanto, a utilização de um único método no tratamento desses efluentes (LEITÃO, 2000). Atualmente, vários métodos podem ser utilizados na remoção de corantes em efluentes industriais. Estes métodos podem ser distribuídos em três categorias, que são químicos, físicos e biológicos. O uso de processos biológicos baseados na utilização de fungos e bactérias, ou diretamente na utilização de enzimas, tem surgido como umas das alternativas de grande potencial. A crescente utilização de enzimas, nos tratamentos de poluentes específicos, e recentes avanços biotecnológicos têm.

(40) 39. possibilitado a produção de enzimas mais baratas e facilmente disponíveis utilizando de melhores procedimentos de isolamento e purificação. As potenciais vantagens do tratamento enzimático quando comparadas a tratamentos convencionais incluem: aplicação em materiais recalcitrantes, atuação em concentrações altas e baixas dos contaminantes, atuação num amplo espectro de pH, temperatura e salinidade, necessidade de aclimatização de biomassa e o fácil processo de controle, entre outros (DURÁN; ESPOSITO, 2000). Entre os processos biotecnológicos de tratamento de efluentes têxteis, com o emprego de enzimas, podem-se citar as enzimas lignolíticas como as lacases, lignina peroxidase e manganês peroxidase. Estas enzimas têm demonstrado sua capacidade de descolorir os corantes têxteis, mediante a polimerização ou degradação desses corantes (BHUNIA; WANGIKAR, 2001; GÜBITZ, 2003). A enzima peroxidase é conhecida por sua capacidade de remoção de compostos fenólicos e aminas aromáticas de soluções aquosas e também a descoloração de efluentes da indústria têxtil. O tratamento com peroxidase resulta na remoção de grupamentos fenólicos tóxicos dos efluentes industriais, usando peróxido de hidrogênio no processo (WILBERG; ASSENHAIMER; RUBIO, 2002). Silva et al. (2012), trabalhando com a peroxidase de nabo em solução (Brassica campestre ssp. Rapifera), obtiveram uma remoção de 66% da cor do corante RBBR em solução aquosa após 40 minutos de reação. Enquanto a descoloração obtida pela peroxidase das cascas de soja foi de 86%, em um tempo de reação de 13 minutos (SILVA et al., 2013). Apesar desses resultados promissores, várias limitações impedem a utilização de oxidoredutases livres na descoloração e degradação de corantes. O uso de enzimas livres mostram algumas desvantagens como instabilidade térmica, suscetibilidade ao ataque por proteases e alguns agentes desnaturantes,.

(41) 40. inibição da atividade e dificuldade de separação e reuso da enzima ao final da reação (KHAN; AKHTAR; HUSAIN, 2005)..

(42) 41. 3 CONSIDERAÇÕES FINAIS. As enzimas peroxidases possuem especificidade por uma ampla variedade de substratos aromáticos, e devido a esta especificidade estas enzimas têm sido aplicadas no tratamento de águas residuais, biotransformações, monitoramento ambiental, bem como construções de biossensores, na remediação de vários poluentes aromáticos tais como fenóis, aminas aromáticas e corantes. Devido ao uso generalizado de peroxidases, principalmente como biocatalisador ambiental, existe um interesse crescente em novas fontes desta enzima. Silva et al. (2012) investigaram vários vegetais como fonte de peroxidase. Neste estudo, observou-se que a raiz de nabo é uma fonte rica em peroxidase, e apresentou uma alternativa de baixo custo na remoção de corantes têxteis, sem purificação. Várias são as dificuldades da utilização de peroxidases livres na descoloração e degradação de corantes, como sua separação para posterior aplicação, a contaminação do produto desejado e sua inativação aumenta com a complexidade dos efluentes.. Enzimas imobilizadas podem melhorar a. termoestabilidade, estabilidade operacional, recuperação, reutilização, alta pureza e rendimentos elevados de produtos em suas aplicações industriais. Vários estudos têm sido realizados com o intuito de tornar os procedimentos para a imobilização de peroxidases viáveis do ponto de vista prático e econômico. Entretanto, a maioria das preparações de enzimas imobilizadas requer utilização de enzimas comercialmente disponíveis ou suportes caros que aumentam o custo dos processos. Neste estudo objetivou-se a obtenção da enzima e sua imobilização por um processo de baixo custo. A peroxidase extraída do nabo foi caracterizada e imobilizada nas esferas de quitosana, as quais foram reticuladas com.

(43) 42. glutaraldeído com sucesso. Foram determinadas as características do suporte e o efeito da imobilização na atividade da enzima. Definiram-se as melhores condições de imobilização da enzima e algumas propriedades do sistema imobilizado foram comparadas com a enzima livre. Em relação ao pH, ambas as enzimas livre e imobilizada, apresentaram melhor performance em pH 7,0. A imobilização melhorou a estabilidade da peroxidase de nabo, em valores menores de pH (região ácida), o que proporciona maior flexibilidade quanto à aplicação da enzima em meios diversos. No que se refere à temperatura, ambas foram ativas na faixa de 30 oC a 50 oC, o que favorece sua aplicação em processos industriais. A peroxidade imobilizada apresentou maior estabilidade em relação ao tempo de armazenamento, quando comparada a enzima livre, o que pode ser atribuído ao fato de que a enzima imobilizada sofre menor influência de agentes externos. As enzimas livre e imobilizada em esferas de quitosana, foram investigadas quanto ao seu potencial na remoção do Remazol Brilliant Blue R em solução aquosa. A remoção do corante obtida para a enzima imobilizada foi de 87,95%, enquanto que para a enzima livre foi de 62,86%. Em relação à enzima imobilizada, dois mecanismos distintos foram responsáveis pela remoção da cor, adsorção do corante no biopolímero e degradação enzimática. A imobilização da enzima proporcionou um aumento na estabilidade da enzima frente a alguns parâmetros, além de possibilitar a recuperação da enzima do meio reacional e a sua reutilização..

(44) 43. REFERÊNCIAS AKHTAR, S. H. Potential applications of immobilized bitter gourd (Momordica charantia) peroxidase in the removal of phenols from polluted water. Chemosphere, Oxford, v. 65, n. 7, p. 1228-1235, Nov. 2006.. ALFAYA, A. A. S.; KUBOTA, L. T. A utilização de materiais obtidos pelo processo de sol-gel na construção de biossensores. Química Nova, São Paulo v. 25, n. 5, p. 835-841, set. 2002.. AMORIM, R. V. S. et al. Chitosan from Syncephalastrum racemosum used as a film support for lipase immobilization. Bioresource Technology, New York, v. 89, n. 1, p. 35-39, Aug. 2003.. AYBASTIER, O. et al. Determination of total phenolic content in Prunella L. by horseradish peroxidase immobilized onto chitosan beads. Analytical Methods, New York, v. 3, n. 10, p. 2289-2297, Oct 2011.. AZEVEDO V. V. C. et al. Quitina e quitosana: aplicações como biomateriais. Revista Eletrônica de Materiais e Processos, Campina Grande, v. 2, n. 3, p. 27-34, dez. 2007.. AZMI, W.; BANERJEE, U. Biological decolorization of crystal violet by a newly isolated Bacillus sp. and microbial assessment of toxicity of untreated and treated dye. Scientia Iranica, Tehran, v. 8, n. 3, p. 171-178, July 2001.. BAUGHMAN, G. L.; WEBER, E. J. Transformation of dyes and relatedcompounds in anoxic sediment - kinetics and products. Environmental Science & Technology, Easton, v. 28, n. 2, p. 267-276, Feb. 1994.. BHUNIA, A.; DURANI, S.; WANGIKAR, P. Horseradish peroxidase catalyzed degradation of industrially important dyes. Biotechnology and Bioengineering, New York, v. 72, n. 5, p. 562-567, Mar. 2001..