Efeito do alimento contaminado com cobre sobre a reprodução e a produção secundária do cladócero Daphnia laevis
Giseli Swerts Rochaa,b*, Maria da Graça Gama Melão b, Ana Teresa Lombardic e Alessandra Emanuele Tonietto d
a Programa de Pós-Graduação em Ecologia e Recursos Naturais
b Departamento de Hidrobiologia, Centro de Ciências Biológicas e da Saúde (CCBS), Universidade Federal de São Carlos (UFSCar), Rodovia Washington Luis, Km 235, CEP 13565-905, São Carlos, SP, Brasil.
c Departamento de Botânica, CCBS, UFSCar d Departamento de Química, UFSCar
* Autor para correspondência: Tel. +55-16-33518757; Fax. +55-16-33518310; e-mail: [email protected]
Palavras chave: Pseudokirchneriella subcapitata; ecotoxicologia aquática; bioacumulação.
Título abreviado: Efeito do alimento contaminado no cladócero Daphnia laevis
ABSTRACT
The aim of this study was to evaluate changes in a zooplankton species, Daphnia laevis (Crustacea, Cladocera) fed with the green algae Pseudokirchneriella subcapitata previously exposed to five different concentrations of copper. The accumulation of metal was measured in both the algae and in the cladoceran. The results suggested that exposure to contaminated food directly influenced the reproduction of animals,
specially the total number of eggs and neonates produced over the animals’ life cycle. Also, the secondary production was affected. This work evidenced the importance of
dietary copper exposure to cladocerans, and demonstrates that the secondary production can be a good endpoint in ecotoxicological studies.
RESUMO
O objetivo do presente estudo foi avaliar as mudanças ocorridas em uma espécie zooplanctônica, Daphnia laevis (Crustacea, Cladocera), alimentada com algas verdes (Pseudokirchneriella subcapitata) previamente expostas a diferentes concentrações de cobre. O acúmulo de metal foi quantificado tanto na alga quanto no cladócero. Os resultados sugerem que a exposição ao alimento contaminado influenciou diretamente a reprodução e a produção secundária dos animais. Este trabalho evidencia a importância da captura do cobre via alimento e como a produção secundária pode ser um bom “endpoint” em estudos ecotoxicológicos.
INTRODUÇÃO
O cobre é um elemento fundamental para toda a biota em concentrações diminutas, tornando-se tóxico em altas concentrações. Concentrações sub-letais de metais traço, em longo prazo, podem causar mudanças no crescimento, ciclo de vida e reprodução de invertebrados de água doce (Timmermans, 1993). O cobre iônico livre, por ser biodisponível, é a forma mais tóxica do metal, tanto para o fitoplâncton (Lombardi et al., 2002) quanto para o zooplâncton (Nogueira et al., 2005; Santos et al., 2008). Estudos ecofisiológicos envolvendo indivíduos dos primeiros níveis tróficos (fito e zooplâncton), base das cadeias alimentares aquáticas, fornecem indicações sobre os efeitos desse agente estressor no ambiente, uma vez que atuam como via de entrada de metais tóxicos nas mesmas.
Esta pesquisa avaliou o efeito da microalga Pseudokirchneriella subcapitata
contaminada com cobre sobre parâmetros da história de vida e produção secundária do cladócero herbívoro Daphnia laevis durante todo o ciclo de vida do animal, a fim de investigar a importância da via alimentar na contaminação do zooplâncton.
METODOLOGIA
P. subcapitata foi cultivada em meio de cultura L.C. Oligo em 20 °C ± 2, sob
iluminação de 100 µE-1m-2 s-2 e fotoperíodo de 12/12 horas (APHA, 1995). Células algais foram expostas por 96 horas às concentrações de 5 x 10e-7 (T 1), 8 x 10e-7 (T 2), 1 x 10e-6 (T 3), 5 x 10e-6 (T 4) e 1 x 10e-5 (T 5) mol.L-1 de cobre.
D. laevis foi mantido em câmara incubadora (25 ± 1°C e 12/12 h luz/escuro). O meio de cultivo foi água reconstituída (pH 7,2; condutividade 160 µS cm-1; dureza 42 mg.L-1 de CaCO3) acrescida de algas de 10e5 cél.mL-1 (ABNT, 2004).Os animais foram
individualizados em béqueres de polipropileno (50 mL) e alimentados com as algas previamente expostas ao metal. No controle, os animais foram alimentados com algas livres de contaminação. As variáveis bionômicas foram observadas em intervalos de 24 horas, com auxílio de um estereomicroscópio (Leica MZ6).
Para o cálculo da produção secundária, a biomassa individual foi calculada através de uma relação peso/comprimento (Y = 0,1175.X + 0,0281; Re2 = 0,9601). A
produtividade secundária foi estimada pelo método descrito por Edmondson & Winberg (1971).
A extração do cobre acumulado nos organimos foi feita através de digestão (48 h a 65° C) em ácido nítrico ultra-puro em frascos de teflon. A determinação de cobre total foi feita em polarógrafo EG&G PAR utilizando voltametria de redissolução anódica com
pulso diferencial (DPASV) através de adições de padrão de cobre. A determinação do metal livre nos meios de cultivo foi realizada com um eletrodo seletivo ao íon cobre. Os resultados foram submetidos a análises estatísticas de normalidade e de
homogeneidade e, em seguida, ao Teste de Tukey.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Na Figura 1, são apresentadas curvas do número médio de ovos e neonatos acumulados por fêmea de D. laevis, ao longo de todo o ciclo de vida dos animais, para o controle e para os tratamentos experimentais T1, T2, T3, T4 e T5.
10 15 20 25 30 35 0 10 20 30 40 50 60 70 N ú m e ro m é d io d e n e o n a to s a c u m u la d o s /f ê m e a Dias Controle T1 T2 T3 T4 T5
Figura 1: Número médio de ovos e de neonatos acumulados/fêmea de Daphnia laevis, cultivada em laboratório a 25° C com fotoperíodo de 12/12 h luz/escuro, alimentada com Pseudokirchneriella subcapitata (10e5 cél.mL-1), nos tratamentos Controle, T1, T2, T3, T4 e T5.
Na Tabela 1, são apresentados os valores médios para alguns parâmetros bionômicos avaliados em D. laevis no controle e nos tratamentos experimentais.
Na Figura 2 são apresentados os valores de metal acumulado pela alga e pelo cladócero.
5 10 15 20 25 30 0 10 20 30 40 50 60 70 80 N ú m e ro m é d io d e o v o s a c u m u la d o s /f ê m e a Dias Controle T1 T2 T3 T4 T5
Controle T1 T2 T3 T4 T5 -2.00E-016 0.00E+000 2.00E-016 4.00E-016 6.00E-016 8.00E-016 1.00E-015 1.20E-015 1.40E-015 1.60E-015 1.80E-015 2.00E-015 2.20E-015 2.40E-015 2.60E-015 2.80E-015 3.00E-015 3.20E-015 C o b re a c u m u la d o ( g )/ c é lu la Tratamentos Controle T1 T2 T3 T4 T5 0.00E+000 5.00E-010 1.00E-009 1.50E-009 2.00E-009 2.50E-009 3.00E-009 3.50E-009 4.00E-009 C o b re a c u m u la d o ( g )/ a n im a l Tratamentos
Figura 2: Valores médios de acúmulo de cobre (g) por célula de P. subcapitata e por indivíduo de Daphnia laevis exposta aos tratamentos Controle, T1, T2, T3, T4 e T5. As barras indicam o desvio-padrão.
Valores diários acumulados de produção individual para crescimento (Pc), para
reprodução (Pr) e de produção total (P = Pc + Pr), para os tratamentos controle, T1, T2, T3, T4 e T5, estão apresentados na Figura 3. Os resultados mostram que, tanto no controle quanto nos tratamentos experimentais, os animais têm um investimento
energético em reprodução bem superior ao crescimento. Os animais dos tratamentos T3 (p<0,05), T4 e T5 (p<0,001) apresentaram diferença estatisticamente significante quanto ao investimento em crescimento, quando comparados ao controle. Já para os tratamentos T1 e T2, não houve diferença estatisticamente significante em relação ao controle. 0 5 1 0 1 5 20 2 5 3 0 -0 .0 1 0 .0 0 0 .0 1 0 .0 2 0 .0 3 0 .0 4 0 .0 5 0 .0 6 0 .0 7 0 .0 8 0 .0 9 0 .1 0 0 .1 1 0 .1 2 0 .1 3 0 .1 4 0 .1 5 P c ( m g P S /i n d /d ia ) D ias C o ntrole T 1 T 2 T 3 T 4 T 5 5 1 0 15 20 2 5 30 0 .0 0 .5 1 .0 1 .5 2 .0 2 .5 3 .0 P r (m g P S ) in d /d ia D ia s C o n tro le T 1 T 2 T 3 T 4 T 5
0 5 10 15 20 25 30 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 P ( m g ) in d /d ia D ias C ontrole T1 T 2 T3 T 4 T5
Figura 3: Produção individual diária média acumulada de Daphnia laevis para
Crescimento (Pc), Reprodução (Pr) e Total (P = Pc + Pr) para o Controle, T1, T2, T3, T4 e T5.
Em testes crônicos, o sucesso reprodutivo é uma importante medida de toxicidade da substância para se verificar os efeitos ecológicos em populações e comunidades. Os efeitos dos tóxicos na reprodução podem ser diretos, como a probabilidade de sobrevivência dos ovos em desenvolvimento, ou indiretos, como os resultados de decréscimo da taxa de assimilação alimentar ou aumento dos custos energéticos para crescimento ou manutenção (De Schamphelaere, 2003).
A fecundidade média foi um parâmetro reprodutivo afetado. Comparando os valores do controle com os demais tratamentos, observa-se a diminuição dos valores médios (3,71 – controle até 2,03 – T5). Este decréscimo condiz com os resultados obtidos por Sobral et al. (2001) e Hook & Fisher (2001), que observaram efeitos deletérios na reprodução de cladóceros alimentados com algas verdes expostas à contaminação por cobre e prata, respectivamente. Rodgher et al (2008) relatam que algumas variáveis bionômicas e reprodutivas de Ceriodaphnia silvestrii foram afetadas quando expostas à alimentação diária com algas contaminadas com concentrações sub-letais de cobre.
O tratamento T4 apresenta um valor de fecundidade superior quando comparado aos de T2 e T3, e bem próximo de T1. De Schamphelaere et al (2004) demonstraram um
aumento na reprodução em D. magna alimentada com células de P. subcapitata exposta ao cobre, enquanto Gusso (2004) obteve resultados semelhantes com C. cornuta. No entanto, um melhor resultado na reprodução não implica, necessariamente, em animais mais saudáveis.
Os estudos abordando as contaminações crônicas, especialmente envolvendo todo o ciclo de vida, ainda são escassos e a complexidade dos processos envolvendo a toxicidade crônica é provavelmente maior para os elementos essenciais (De Schamphelaere, 2003).
Os animais do controle tiveram maior número de ovos acumulados por fêmea (73,8), semelhantes aos valores médios (68,6) obtidos por Rocha & Matsumura-Tundisi (1990). T1 apresentou um valor médio ligeiramente inferior ao do controle (67,5). Para T2 e T3, esta diferença foi maior (50,9 e 39,8, respectivamente). T4 apresentou um valor médio de 63,55 ovos/fêmea, o que poderia ser considerado como um efeito benéfico da exposição ao cobre. Este resultado mais elevado também poderia ser conseqüência de uma mudança na estratégia de vida, investindo em reprodução quando o ambiente se encontra desfavorável. Em T5 foi observado o menor valor médio de ovos/fêmea. Estes dados diferem dos de Rodgher et al (2009), onde o número de ovos de C. silvestrii foi inversamente proporcional ao aumento da concentração de cobre.
D. laevis apresentou diferentes valores de produção secundária nos tratamentos experimentais, com diferente partição da energia entre os processos de crescimento somático e reprodução. Em todos os tratamentos, a produção secundária foi determinada principalmente pela produção relativa à reprodução (Pr), ou seja, a utilização da maior parte da energia alimentar na produção de biomassa de ovos em detrimento do
importante para podermos avaliar qual o impacto causado nas taxas reprodutivas de uma população, e como a introdução de agentes contaminantes e estressores podem
desencadear um comportamento diferenciado, que irá influenciar diretamente na composição da população. Apenas os animais de T5 apresentaram a maior parcela destinada ao crescimento corpóreo (p<0,01), além de menor número de ovos e neonatos acumulados por fêmea (p<0,001). Como conseqüência, a produção total de T5 foi a menor observada.
Dados relativos ao efeito de tóxicos na produção secundária contribuem para uma melhor compreensão da forma que a contaminação via alimento interfere nas
características das populações dentro dos ecossistemas. No entanto, há uma carência de literatura com esse enfoque. De Schamphelaere et al (2004) já haviam relatado respostas positivas do estímulo da reprodução e crescimento de D. magna alimentada com P. subcapitata exposta a diferentes concentrações de cobre, interferindo diretamente no resultado de produção desta espécie, porém não são apresentados os valores de produção secundária.
Bossuyt & Janssen (2005) reportaram variações na sensibilidade de zooplâncton de água doce ao cobre, em virtude de diferentes capacidades de aclimatação ao metal. O presente estudo demonstra a sensibilidade de D. laevis a diferentes concentrações subletais de cobre, obtidas através do alimento. Essas concentrações promoveram a acumulação de cobre nesses organismos tornando-os um importante elo de transferência do metal nas cadeias tróficas de ambientes aquáticos naturais. Enquanto que o aumento na concentração de cobre nas algas foi diretamente proporcional à concentração do metal nos diferentes tratamentos, o cladócero acumulou uma certa quantidade
capacidade de regulação do metal em cladóceros também foi observada por outros autores (Nogueira et al., 2005; Santos et al., 2008).
Estudos de longo prazo são importantes para o entendimento dos caminhos do metal no metabolismo dos animais. Bossuyt & Janssen (2005) acompanharam várias gerações de D. magna expostas ao alimento contaminado com uma concentração constante de metal, e concluíram que o organismo se aclimatava e adaptava com o tempo, apresentando mudanças comportamentais a partir da sexta geração e redução na concentração interna do metal a partir da nona.
O impacto do alimento contaminado com cobre na história de vida de D. laevis, observado no presente estudo, como redução no número médio de ovos e de
descendentes produzidos, sugere consequências negativas na dinâmica de populações naturais que estejam submetidas às concentrações subletais semelhantes.
Hook & Fisher (2001) observaram, em experimentos de curta duração, onde copépodos marinhos eram alimentadas com diatomáceas expostas a diferentes metais (Hg, Cd, Hg, Mn e Zn), uma redução inicial na capacidade reprodutiva dos animais. Porém, após uma semana de exposição, a produção de ovos foi normalizada. Os autores sugeriram que na exposição de curto prazo, não houve tempo suficiente para acionar os mecanismos de detoxificação dos animais.
Segundo os protocolos ecotoxicológicos (APHA,1995), os testes de toxicidade crônica utilizando espécies do gênero Daphnia sugerem o acompanhamento por 21 dias. É importante ressaltar que as espécies citadas nos protocolos (D. magna e D. similis) não ocorrem naturalmente no Brasil e possuem um ciclo de vida maior que a espécie do presente estudo. Com os dados obtidos no presente estudo, sugerimos que devam ser realizados ensaios crônicos que avaliem todo o ciclo de vida do animal, uma vez que
CONCLUSÕES
Houve acúmulo de cobre tanto na alga quanto no cladócero. No entanto, enquanto na alga as concentrações de metal tiveram um crescimento diretamente proporcional à contaminação, nos cladóceros o acúmulo foi constante em todos os tratamentos. Os animais apresentaram, portanto, mecanismos de regulação do metal, acumulando até um certo nível e excretando o metal excedente. O alimento contaminado afetou tanto a reprodução quanto a produção secundária dos animais, sugerindo a importância da via alimentar na contaminação das cadeias alimentares aquáticas pelo cobre.
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AGRADECIMENTOS
Agradecemos à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pelo apoio financeiro (processo no 2007/02073-4 ) e pela bolsa de mestrado concedida à primeira autora (processo no 2007/02680-8).
Tabela 1: Valores médios (± DP) de desenvolvimento de Daphnia laevis (Cladocera, Daphniidae) alimentadas com alga P. subcapitata nos tratamentos Controle, T1, T2, T3, T4 e T5. Característica Controle T1 T2 T3 T4 T5 Tamanho médio de neonato (mm) 0,6138 ± 0,013 0,6386 ± 0,029 0,6262 ± 0,024 0,6386 ± 0,029 0,6386 ± 0,033 0,6045 ± 0,026 Tamanho médio da primípara (mm) 1,286 ± 0,147 1,41 ± 0,157 1,248 ± 0,119 1,271 ± 0,102 1,326 ± 0,094 1,221 ± 0,1361
Idade primípara (dias) 10,2 ± 3,01 8,9 ± 2,96 9,25 ± 3,73 11,75 ± 3,2 9,78 ± 2,17 9,2 ± 1,3
Tempo de desenv. embrionário médio (dias) 2 2 2 2 2 2 Fecundidade média (ovos/fêmea/ninhada) 3,71 ± 1,55 3,56 ± 1,61 2,46 ± 1,11 2,29 ± 1,00 3,35 ± 1,12 2,03 ± 0,64
Número médio de ovos em todo o ciclo de vida
15,56 ± 12,63 17,11 ± 9,57 13,25 ± 9,38 11,25 ± 6,43 20,33 ± 12,06 10,2 ± 7,12 Tamanho máximo do adulto (mm) 1,86 2,015 1,86 1,86 1,86 1,55 Longevidade média (dias) 22 ± 3,97 15,6 ± 4,25 18,9 ± 4,93 18,8 ± 2,97 17,7 ± 3,96 18,4 ± 5,29 Longevidade máxima (dias) 28 31 31 29 29 24 Tamanho mínimo da primípara (mm) 1,085 1,24 1,085 1,24 1,24 1,085