1
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ
INSTITUTO SUPERIOR DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS
MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIAS FISIOLÓGIAS
ALINE COLARES CAMURÇA DOS SANTOS
RESPOSTA FUNCIONAL E TRANSCRICIONAL DO NERVO
ISQUIÁTICO DE RATOS SUBMETIDOS AO EXERCÍCIO
AERÓBICO DE BAIXA INTENSIDADE.
FORTALEZA-CEARA
2014
2 ALINE COLARES CAMURÇA DOS SANTOS
RESPOSTA FUNCIONAL E TRANSCRICIONAL DO NERVO ISQUIÁTICO
DE RATOS SUBMETIDOS AO EXERCÍCIO AERÓBICO DE BAIXA
INTENSIDADE.
Dissertação apresentada ao Curso de Pós-graduação em Ciências Fisiológicas do Instituto Superior em Ciências Biomédicas da Universidade Estadual do Ceará-UECE como requisito parcial para a obtenção do título de mestre em Ciências Fisiológicas.
Orientadora: Profª Dra. Vânia Marilande Ceccatto Co-Orientador: Prof. Dr. Alex Marreiros Ferraz
Fortaleza-CE 2014
3 Dados Internacionais de Catalogação na Publicação
Universidade Estadual do Ceará
Biblioteca Central Prof. Antônio Martins Filho
Bibliotecário(a) Responsável – Thelma Marylanda Silva de Melo CRB-3 / 623
Nome: SANTOS, Aline Colares Camurça dos
S237r Santos, Aline Colares Camurça dos
Resposta funcional e transcricional do nervo isquiático de ratos submetidos ao exercício aeróbico de baixa intensidade / Aline Colares Camurça dos Santos. — 2014.
CD-ROM. 70f :il. (algumas color.) ; 4 ¾ pol.
“CD-ROM contendo o arquivo no formato PDF do trabalho acadêmico, acondicionado em caixa de DVD Slin (19 x 14 cm x 7 mm)”.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Estadual do Ceará, Centro de Ciências da Saúde, Curso de Mestrado Acadêmico em Ciências Fisiológicas, Fortaleza, 2014.
Área de Concentração: Ciências Fisiológicas. Orientação: Profª. Dr ª. Vânia Marilande Ceccatto.
1. Sistema nervoso periférico. 2. Exercício físico. 3. Plasticidade neural .I. Título.
5 Às divindades, À minha mãe. Meu anjo da guarda.
6 AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Profª Dra. Vânia Marilande Ceccatto, por ter aberto as portas do seu laboratório, me dado o suporte para a realização desta dissertação e principalmente pelas orientações no momento e forma acertados.
Este estudo é fruto de todos os trabalhos anteriores envolvendo exercício físico experimental no laboratório de bioquímica e expressão gênica (LABIEX-UECE), assim sendo, agradeço aos atuais mestres e doutores que fizeram parte do LABIEX e contribuíram para o aprimoramento da metodologia envolvida no treinamento de roedores em esteira motorizada. Agradeço ao corpo docente do Mestrado Acadêmico em Ciências Fisiológicas UECE.
Agradeço imensamente as pessoas que me ajudaram na lida laboratorial deste estudo. Tenho consciência que os cuidados cotidianos com os animais, as análises sem hora pra acabar e a rotina impiedosa do aprendizado, foram essenciais para os resultados obtidos.
Aos amigos e amigas que acompanharam esta jornada cercada de sacrifícios e glórias, a minha mais sincera gratidão. Pois sem vocês não haveriam tantos risos e lágrimas embelezados pelos laços do companheirismo e da fraternidade.
Dedico um agradecimento muito especial ao colega de laboratório e amigo, Tanes Imamura de Lima que, com seu jeito calmo, incitou noites em claro, por trabalho ou por questionamentos, que resultaram num estudo muito mais engrandecedor do que seria sem ele. Por último e mais importante, agradeço àquelas e àqueles que formam minha família, seja esta de escolha ou de sangue, por terem ao seu modo, me dado forças e suavidade para enfrentar esta batalha.
Este trabalho teve o apoio financeiro da coordenação de aperfeiçoamento de pessoal de nível superior (CAPES) e do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPQ).
7 “Por que não nos ajudarmos no caminho?
Ficaria mais fácil, um pouco mais fácil... É um novo dia, um novo tempo e um novo sentimento!”
8 RESUMO
O sistema nervoso periférico (SNP) é a interface que liga o meio ambiente ao sistema nervoso central. O entendimento das alterações induzidas pelo exercício físico, em suas diversas modalidades, no SNP, é de grande relevância para a manutenção e otimização do desempenho deste sistema em diversas situações, assim como, para a prevenção e tratamento da neurodegeneração advinda de doenças ou até mesmo do envelhecimento. Este estudo teve como objetivo avaliar as respostas funcionais e transcricionais do exercício físico aeróbio a 50% da intensidade encontrada no teste de esforço máximo, no nervo isquiático (NI) de ratos wistar. Foram utilizados 16 animais, com 30 dias de vida, divididos nos grupos controle sedentário (CS) e controle treinado (CT). Para caracterizar a intensidade do treinamento foi traçado o perfil lipídico (triglicerídeos, colesterol total e HDL) e foram avaliados os estoques de glicogênio hepático e muscular dos animais. Para avaliar a sensibilidade mecânica e térmica, foram realizados, quinzenalmente, os testes de Von Frey e Tail Flick adaptado. O parâmetros eletrofisiológicos de excitabilidade e condução do impulso nervoso, foram aferidos pelo Potencial de Ação Composto e a expressão dos genes relacionados a sinalização redox, inflamação, estrutura e ativação nuclear foi avaliada pelo rt-qPCR. Os dados estão apresentados como CS e CT respectivamente. Os nossos resultados sugerem que o exercício físico utilizado influenciou o metabolismo lipídico como um exercício de baixa intensidade (Colesterol - 89,75 ± 13,19; 43,13 ± 2,3 P<0,01, Triglicerídeos – 157,23 ± 23,47; 62,59 ±7,44 P< 0,05, HDL – 0,378±0,06; 0,773 ± 0,07 P<0,01) e foi capaz de elevar os níveis de glicogênio estocados (Muscular – 0,14±0,03; 0,22±0,02 P<0,05, Hepático – 0,17±0,02; 0,65±0,06 P< 0,001) adaptando o organismo para a manutenção de exercícios agudos por um período de tempo maior. Além disso, o treinamento foi capaz de melhorar a resposta motora dos membros posteriores dos animais do grupo CT demonstrado pela retirada da pata traseira sob uma pressão diminuída no teste de Von Frey (27,72g ± 1,32; 23,03g ± 1,76 P<0,05) e pela retirada da cauda com redução do tempo de latência ao estímulo frio (14,72s ± 2,81; 7,57 ± 0,9 P<0,05) e quente (12,64s ± 2,3; 6,86 ± 0,67 P<0,05). Foi capaz também, de aumentar a expressão gênica de enzimas pró oxidantes e antioxidantes (NOX 2 P<0,001; NOX 4 P<0,01; eNOS P<0,05; CATALASE P<0,001; SOD 2 P<0,05; GPX1 P<0,001) de citocinas pró inflamatórias (TNFα P<0,05), de neurofilamentos (NFL e NFH P<0,001), de fatores nucleares (NFKβ P<0,01 e MAPK P38 P<0,001) e de fatores de crescimento (TGF e IGF1 P< 0,01). Ainda, reduziu a expressão de SOD1, nNOS P<0,001 e NGF P<0,05. Além disso, a bainha de mielina dos axônios do NI de ratos treinados se manteve preservada enquanto foram identificados pontos degenerativos nesta estrutura celular do grupo CS. A resposta transcricional e histológica dependente do protocolo utilizado, foi eficiente para alterar a velocidade de condução do impulso nervoso nas fibras motoras (90,06 m/s ± 3,4; 111,9 m/s ±12,07 P<0,) sem alterar os parâmetros de excitabilidade da célula (Reobase – 3,22v±0,06; 3,1v±0,1 P>0,05, Cronaxia 46µs±1,46; 48,33µs±2,4). Em conclusão, os resultados do presente estudo sugerem que o exercício físico d induz a regulação de inúmeros genes associados ao balanço redox, à inflamação e à plasticidade neural no nervo isquiático de ratos, influenciando na preservação do tecido neuronal e na melhoria da velocidade de condução do impulso nervoso das fibras motoras, culminando em uma resposta motora mais rápida quando necessário.
Palavras chave: Sistema Nervoso Periférico, Exercício Físico, Plasticidade neural, Nervo Isquiático
9 ABSTRACT
The peripheral nervous system (SNP) is the interface that connects the environment to the central nervous system. The understanding of SNP changes induced by physical exercise, in its several ways, is of great importance for maintaining and optimizing the performance of this system in various situations, as well as for the prevention and treatment of diseases of neurodegeneration arising or even of aging. This study aimed to evaluate the functional and transcriptional responses of aerobic exercise at 50 % of the intensity found in the maximal exercise test , the sciatic nerve ( NI ) of Wistar rats . 16 animals were used , with 30 days of life , divided into sedentary control groups ( CS ) and trained control (TC ) . To characterize the intensity of training was traced lipid profile (triglycerides, total cholesterol and HDL ) and inventories of liver glycogen and muscle of animals were evaluated . To evaluate the mechanical and thermal sensitivity were fortnightly, conducted tests Tail Flick and Von Frey adapted . The electrophysiological parameters of excitability and conduction of nerve impulses , were measured by Compound Action Potential and the expression of genes related to redox signaling , inflammation , nuclear structure and activation was assessed by RT - qPCR . Data are presented as CS and CT respectively. Our results suggest that exercise influence lipid metabolism used as a low-intensity exercise ( Cholesterol - 89.75 ± 13.19 , 43.13 ± 2.3, P < 0.01 , Triglycerides - 157.23 ± 23 , 47, 62.59 ± 7.44 P < 0.05 , HDL - 0.378 ± 0.06, 0.773 ± 0.07 P < 0.01 ) and was able to raise levels of stored glycogen ( muscular - 0 , 14 ± 0.03 , 0.22 ± 0.02 P <0.05 Liver - 0.17 ± 0.02 , 0.65 ± 0.06 P < 0.001) adapted to maintain the body exercises by acute a period of time. Furthermore, the training was able to improve the motor response of the hind limbs of the animals of group CT demonstrated by withdrawal of the hind paw under the reduced Von Frey ( 27.72 g ± 1.32 test pressure; 23.03 g ± 1 76 P < 0.05 ) and with reduced tail flick latency time to cold stimulation ( 14.72 ± 2.81 s , 7.57 ± 0.9 P < 0.05 ) and hot ( 12.64 s ± 2.3 , 6.86 ± 0.67 P < 0.05). Was also capable of increasing the gene expression of pro oxidant and antioxidant enzymes ( NOX 2 P < 0.001 ; NOX 4 P < 0.01 ; eNOS P < 0.05 ; CATALASE P < 0.001 ; SOD 2 P < 0.05 ; GPx1 P < 0.001) pro- inflammatory cytokines ( TNF P <0.05) , neurofilament ( NFL and NFH P < 0.001) , nuclear factors ( NFKβ P <0.01 MAPK and P38 P < 0.001) and on factors (TGF IGF1 and P < 0.01). Furthermore, reduced the expression of SOD1 nNOS P <0.001 and NGF P <0.05. Additionally, the myelin sheath of the axon NI trained rats was preserved as degenerative spots were identified in this cellular structure of the CS group. The dependent transcriptional and histological response protocol used was efficient to change the speed of nerve impulse conduction in motor fibers ( 90.06 m / s ± 3.4, 111.9 m / s ± 12.07 P < 0 , ) without changing the parameters of the cell excitability ( rheobase - v 3.22 ± 0.06, 3.1 ± 0.1 v P > 0.05 , Chronaxy 46µs ± 1.46 , 48.33 ± 2.4 mS ) . In conclusion , the results of this study suggest that physical exercise d induces the regulation of numerous genes associated with redox balance , inflammation and neural plasticity in the sciatic nerve of rats , influencing the preservation of neuronal tissue and improve conduction velocity motor fibers of the nervous impulse , resulting in a faster motor response when needed .
10 LISTA DE FIGURAS
Fig. 1 – A) Eixo somatossensorial e B) Eixo neural motor esquelético do sistema nervoso -19
Fig. 2 – Estrutura de um neurônio. ---20
Fig. 3 – A) Características dos canais regulados por voltagem com sucessivas ativações e inativações. B) Alteração da condutância dos canais de Na+ e K+ durante o curso do potencial de ação.--- 21
Fig. 4 - Anatomia fisiológica da sinapse --- 22
Fig. 5- A) Revestimento das células de Schwann em torno de um axônio para formar a bainha de mielina. B) Condução saltatória de um neurônio mielinizado..--- 23
Fig. 6- Potencial de Ação Composto --- 24
Fig. 7 – Mitocôndria. --- 25
Fig 8 – Desenho dos complexos da CTE. --- 26
Fig. 9 – Adaptação dos roedores à esteira elétrica motorizada --- 30
Fig. 10 – Teste de Von Frey e Teste de Tail flick adaptado --- 32
Fig. 11 – Protocolo do Teste de Esforço Máximo (TEM) e do treinamento--- 33
Fig. 12 –Aferição da glicemia sérica e aferição da massa corporal.--- 33
Fig. 13 – A) Nervo Isquiático de ratos wistar disposto na câmara de Harvard. B) interface eletrônica de registro eletrofisiológico. C) Setup de eletrofisiologia extra celular.--- 35
Fig. 14 - Avaliação da integridade do RNA através da visualização das bandas de RNA ribossomal 28s, 18s e 5s. Eletroforese em gel de agarose de 1µg do RNA extraído do NI dos grupos controle e treinado.---37
Fig. 15 - Curva de amplificação de expressão gênica rt-qPCR---38
Fig. 16- curva de melting em rt-qPCR --- 38
Fig. 17 –A) Avaliação quinzenal da massa corpórea, durante oito semanas de experimento. B) Avaliação quinzenal da glicemia sérica. C) Intensidade máxima alcançada nos testes exaustivos realizados.--- 40
11
Fig. 18- Avaliação quinzenal da sensibilidade das extremidades corporais. --- 42
Fig. 19 –Avaliação do Potencial de Ação Composto (PAC) --- 43
Fig. 20 – Gráfico Avaliação da expressão gênica por rt-qPCR. --- 44
12 LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Classificação das fibras nervosas (adaptada de Berne e Levy). --- 23 Tabela 2 – Primers utilizados --- 39 Tabela 3 – Perfil metabólico dos animais ao final do período experimental. --- 41
13 LISTA DE ABREVIATURAS
% GC – Percentual de Guanina e Citosina ATP – Trifosfato de Adenosina
BLAST – Basic Local Alignment Search Tool
CAPES – Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior cDNA – DNA Complementar
CEUA – Comitê de Ética Para o Uso de Animais CFMV – Conselho Federal de Medicina Veterinária Ct – Limiar de Quantificação
DNA – Ácido Desoxirribonucléico eNOs – Óxido Nítrico Sintase endotelial ERO – Espécies Reativas de Oxigênio GPX - Glutiationa peroxidase GPX 1 – Glutiationa Peroxidase 1 GSH – Glutiationa Reduzida H2O – Água H2O2 – Peróxido de Hidrogênio HPRT – Hipoxantina-guanina fosfo-ribosil-transferase IGF- fator de crescimento parecido com a insulina IDT – Integrated DNA Technologies
MAPKp38 – Proteína Mitogênica Ativada subunidade p38
NADPH oxidase - dinucleótido de nicotinamida e adenina oxidase NF-κβ – Fator Nuclear kappa Beta
NFL- Neurofilamento de cadeia leve NFH- Neurofilamento de cadeia pesada nNO – Oxido Nítrico Sintase Neuronal NO – Óxido Nítrico
NOS – Oxido Nítrico Sintase NOX 2 –NADPH oxidase 2 NOX 4 –NADPH oxidase 4 O2 – Oxigênio
O2 – Superóxido ONOO – peroxinitrito
PAC- Potencial de ação composto
PGC-1α – Coativador do Receptor Ativado do Proliferador de Peroxisoma Gama Rt-qPCR – PCR Quantitativo em tempo real
RNA – Ácido Ribonucléico
SOD 1 – Superóxido dismutase citosólica SOD 2 – Superóxido dismutase mtocondrial Tm – Temperatura de Melting
TGF- Fator de transformação e crescimento / fator de crescimento tumoral TNFα – Fator de necrose tumoral α
14 SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ---15
2. OBJETIVOS ---17
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ---18
3.1 Morfologia e Organização do Sistema Nervoso ---18
3.2 Percepção do estímulo e Condução do sinal nervoso --- 20
3.3 Metabolismo neuronal ---24
3.4 Exercício Físico e Sistema Nervoso --- 28
4. MATERIAIS E MÉTODOS --- 30
4.1 Animais--- 30
4.2 Grupos Experimentais --- 30
4.3 Familiarização dos animais ao ambiente de treino--- 30
4.4 Avaliação da sensibilidade térmica e mecânica ---30
4.5 Protocolo de treinamento físico ---31
4.6 Acompanhamento de massa e glicemia--- 33
4.7 Sacrifício--- 33
4.8 Armazenamento dos tecidos--- 33
4.9 Glicogênio muscular e hepático--- 33
4.10 Ensaios bioquímicos no plasma--- 34
4.11 Registro eletrofisiológico extracelular--- 34
4.12 Procedimento Histológico--- 35
4.13 Análise da Expressão Gênica--- 36
4.14 Analise estatística--- 39
5. RESULTADOS --- 40
5.1 Caracterização do modelo experimental--- 40
5.2 Parâmetros sensoriais in vivo --- 41
5.3 Análise histopatologico--- 48
5.4 Parâmetros eletrofisiológicos --- 48
5.5 Avaliação da expressão gênica--- 49
6. DISCUSSÃO --- 45
7. CONCLUSÕES --- 57
15 1. INTRODUÇÃO
O Sistema Nervoso (SN), em sua globalidade, é responsável pela maioria das nossas necessidades enquanto seres vivos, incluindo o controle motor, a aquisição e o armazenamento de informações, a regulação dos órgãos e dos sistemas internos, além de influenciar nos aspectos emocionais intrínsecos à existência humana. Assim, compreende uma rede interligada de percepção de estímulos e promoção de respostas adequadas, ambas mediadas pelo Sistema Nervoso Periférico (SNP).
Para atuar desta forma, o SN se constrói durante o desenvolvimento do indivíduo, diferenciando células a medida da necessidade exata, distribuindo-as nas áreas adequadas do seu campo tecidual, coordenando as inervações, funções e momentos de ativação de cada via de sinalização.
Continuamente, este sistema é submetido a situações fisiológicas diversas, incluindo o sono, o estado de alerta, as doenças, o estresse patológico ou fisiológico como é o caso do exercício físico. Nestas situações o SN reage de maneira distinta se remodelando e proporcionando um fenótipo eficiente na adaptação aos requisitos cotidianos.
Os benefícios do exercício físico no SNP têm sido demonstrados principalmente acerca da redução dos prejuízos advindos de lesões; da prevenção e tratamento dos efeitos deletérios causados por doenças neurodegenerativas e ainda pela eficiência no atraso do declínio funcional proveniente do envelhecimento. O foco do exercício físico no SNP deriva, em parte, da habilidade que o exercício tem em elevar a produção de defesas antioxidantes, fatores de crescimento neuronais, regular elementos do citoesqueleto, estimular fatores nucleares e algumas citocinas pró inflamatórias que atuam como sinalizadores da neuroplasticidade. Contudo, é sabido que os múltiplos tipos e intensidades de exercício físico interferem de forma diferente em cada aspecto genotípico e funcional do SNP.
Pela sua complexidade, a indução à plasticidade neuronal, quais os mecanismos de ação dependentes do exercício físico são ativados no SNP e como o exercício físico aeróbico de baixa intensidade influencia na resposta motora dos ratos wistar, não estão totalmente compreendidos.
16 Este estudo, almeja identificar as alterações moleculares induzidas pelo exercício físico aeróbico de baixa intensidade e como estas interferências modificam a sensibilidade e consequente resposta motora dos membros posteriores de ratos wistar.
17 2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Avaliar a resposta funcional e transcricional do treinamento aeróbico de baixa intensidade no Nervo Isquiático de ratos Wistar
2.2 Objetivos Específicos
Avaliar parâmetros sensório-motores e composição bioquímica sérica relacionados ao treinamento/sedentarismo
Avaliar a estrutura histológica do Nervo Isquiático
Medir os parâmetros eletrofisiológicos de reobase, cronaxia, duração e velocidade de propagação do impulso nervoso no Nervo Isquiático
Avaliar a expressão gênica de genes relacionados a estrutura, sinalização redox, inflamação e fatores de ativação nucleares do Nervo Isquiático
18 3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 Morfologia e Organização do Sistema Nervoso
O Sistema Nervoso (SN) representa uma rede de comunicações e controle que recebe, a cada minuto, milhões de informações provenientes de órgãos e nervos sensoriais integrados, com o intuito de determinar respostas a serem executadas pelo corpo. É responsável pelo controle consciente de ações motoras, percepções sensoriais, aprendizado e armazenamento de informações, além da regulação autonômicas de ações vitais do organismo (MARTINS, 2012).
Para que essa relação estímulo/resposta possa ocorrer de forma apropriada, o SN abrange três componentes básicos: os componentes sensoriais, formados por receptores capazes de transformar estímulos externos ou internos (nível de oxigênio no sangue, Pressão Arterial, níveis de substratos, etc) em sinais neuronais (informações aferentes); os componentes integrativos, responsáveis pelo processamento e armazenamento das informações e ainda, por fazerem a integração entre as respostas mentais; e motoras coordenadas pelo terceiro componente, os componentes motores.
Anatomicamente, o SN pode ser dividido em Sistema Nervoso Central (SNC) e Sistema Nervoso Periférico (SNP). O SNC é a parte responsável pela integração das atividades corpóreas, armazenamento de experiências, controle do ambiente interno e controle de movimentos voluntários (LENT, 2004), O SNP representa a interface entre os ambientes externo e internos e o SNC. É formado por receptores sensoriais, gânglios nervosos e nervos periféricos constituídos, em sua maioria, por fibras motoras e sensoriais.
Duas vias possibilitam essa interface: A via eferente e a via aferente. Na via eferente o impulso nervoso, iniciado por uma alteração elétrica, é transmitido ao longo do axônio até o órgão efetor. Na via aferente o impulso é gerado pelos receptores e transmitido ao SNC (Fig.1) (BARROS, 2002).
19 Alterações crônicas na estrutura e metabolismo celular deste tecido, como situações de exercício físico, podem desencadear vias de sinalização específicas capazes de gerar um remodelamento funcional induzindo alterações no mecanismo interativo entre estímulo e resposta (SUTOO, 2003).
O SN é composto por células do tecido conjuntivo e por vasos sanguíneos, tendo na neuroglia e nos neurônios dois dos seu principais tipos celulares. A neuroglia é encarregada da sustentação, suporte metabólico e imunológico dos neurônios, como também de isolá-los e protege-los contra variações extremas. O neurônio, por sua vez, é uma célula extremamente excitável que se comunica com outros neurônios ou com células de órgãos efetores.
Um neurônio típico é constituído por quatro partes: um corpo celular ou soma, pelos dendritos e pelo axônio e suas terminações (Fig. 2A). O soma é o centro metabólico da célula, onde se encontram o núcleo, inúmeras mitocôndrias e os elementos do citoesqueleto. Os dendritos são responsáveis pela recepção e modulação dos sinais advindos de outros neurônios, enquanto o axônio é responsável pela propagação do Potencial de Ação (PA) em direção à próxima célula (LENT, 2004). A atividade neuronal de transmissão do sinal é geralmente codificada por sequências de PA’s propagados ao longo dos axônios nos circuitos neuronais.
Ainda, o citoplasma dos neurônios contêm feixes de filamento frouxamente empacotados, dispostos paralelamente ao axônio da célula nervosa, chamados filamentos intermediários ou neurofilamentos. Eles capacitam a célula para suportar a tensão mecânica do transporte axônico e podem ser classificados de acordo com os tipos de proteínas que os
Fig. 1 – A) Via aferente do sistema nervoso B) Via eferente (GUYTON, 2006)
20 constitui, incluindo os neurofilamentos de cadeia pesada (NFH) e o neurofilamentos de cadeia leve (NFL) (Fig 2B).
3.2 Percepção do estímulo e Condução do sinal nervoso
Os PA’s neuronais são ondas de descargas elétricas de apenas alguns milissegundos
(ms) de duração, que percorrem a membrana de uma célula excitável. É uma resposta do tipo tudo-ou-nada, ou seja, o estímulo pode ser capaz de atingir o limiar e dispara-lo ou não.
O PA é gerado principalmente no local de união do soma com axônio (segmento inicial), região de menor limiar (zona de gatilho), conhecido como cone axonal. Para isso, é necessário uma alteração brusca e rápida da diferença do potencial de repouso (GUYTON, 2006). Essa alteração se dá quase sempre pelo aumento do fluxo transiente de íons Na+ e K+ nos seus canais específicos, promovendo a inversão da polaridade do potencial de membrana o que gera uma resposta ampla, propagável por toda a extensão da fibra nervosa sem se alterar (Fig. 3) (HODGKIN, 1952; RANDALL, 2000).
Fig. 2 A) – Estrutura de um neurônio B) Neurofilamentos (GUYTON, 2006)
21 Em algumas situações há alterações desse limiar, podendo se tornar mais negativo, o que dificulta a despolarização da célula, ou seja, faz necessário um estímulo maior para ter uma mesma resposta. Ou ainda, pode acontecer o oposto, o meio interno da célula neuronal se torna mais positivo, assim, esta se encontra hiperexcitável, por exemplo no caso da diabetes e da constrição ciática respectivamente (FERREIRA da SILVA, 2012; ALVES, 2006).
Após a descarga elétrica desencadeada pelo PA, a comunicação celular continua através da liberação de moléculas sinalizadoras em junções celulares especializadas, dependentes de ATP, chamadas sinapses. Nestas sinapses a transmissão do sinal é mediada por moléculas sinalizadoras incluindo proteínas, peptídeos e gases como o Oxido Nítrico (NO). Chamadas de neurotransmissores, são rapidamente secretadas no neurônio pre sináptico em direção ao neurônio pós sináptico em resposta a um potencial de ação prévio (Fig. 4) (BURNS, 1995).
Independente da natureza do sinal, a célula alvo responde através de um receptor específico que, quando se liga a uma molécula sinalizadora, torna-se ativada e gera uma cascata de sinais intracelulares, modificando o comportamento da célula. De acordo com os estímulos a que estas estruturas são submetidas, pode ocorrer um aprimoramento desta comunicação.
Tem sido sugerido que o exercício físico pode influenciar no aumento da síntese de neurotrofinas e fatores de crescimento que aperfeiçoam a comunicação entre as células nervosas, prevenindo ou atrasando a perda de função cognitiva proveniente do envelhecimento ou de doenças neurodegenerativas (AHLSKOG, 2011).
Fig. 3 – A) Características dos canais regulados por voltagem com sucessivas ativações e inativações. B) Alteração da condutância dos canais de Na+ e K+ durante o curso do potencial de ação. (GUYTON, 2006)
22 Para que o SN processe uma informação térmica ou tátil, este deve ser primeiramente estimulado pela ativação de receptores sensoriais, cada tipo de receptor está habilitado para informar o SNP apenas sobre determinados aspectos ou dimensões do meio ambiente, funcionando como um filtro sensorial altamente sensível ao estímulo que lhe é adequado. Os receptores chamados exteroceptivos, como por exemplo os mecanoceptivos, os nocioceptivos e os térmicos, são responsáveis pelos elementos da interação da pele com o meio ambiente externo ao corpo.
Após a detecção do estímulo pelos receptores, os sinais nervosos são então transmitidos ao SNC pelas fibras nervosas que, por sua vez, apresentam diâmetros variáveis (0,5 a 20µm) e quanto maior o diâmetro, maior a velocidade de condução do impulso. De uma forma geral, as fibras nervosas estão classificadas em A (α, β, γ e δ) e C, mielinizadas e não mielinizadas (Tabela 1) (HUANG, 2001; SILVERTHORN, 2003).
A função primordial da mielina é o aumento na velocidade de condução do impulso nervoso. Isto se dá pela disposição da mielina em intervalos regulares, alternados com nódulos de Ranvier, transmitindo o impulso entre os nódulos de maneira saltatória (Fig. 5), com recriação do potencial de ação em cada nódulo (CARLOS, 2011). Em ratos de meia idade submetidos ao treinamento físico moderado, o exercício físico pode manter ou otimizar a mielinização destas fibras (PIANCA, 2006).
23 As informações sobre a percepção tátil são transmitidas pelas fibras Aα e Aβ. Os axônios que transportam sinais sobre dor e temperatura, em geral estão agrupados, pois os conjuntos de receptores que medeiam seus sinais se sobrepõem na membrana e são transportados pelas mesmas fibras, tipos Aδ e C, configurando assim uma falta de especialidade morfológica para o transporte destas informações. Então, para que o indivíduo seja capaz de perceber distintamente as sensações de dor ou temperatura, os receptores específicos de cada sensação apresentam um limiar de excitação diferente.
Todos estes estímulos podem levar a uma reação imediata, incluindo a contração muscular que culmina na retirada de uma extremidade corpórea do contato com um estímulo externo. As fibras aferentes de sensibilidade térmica são classificadas como responsivas ao aumento da temperatura, calor nocivo, diminuição da temperatura e frio nocivo. Enquanto que as fibras responsivas a pressão se enquadram às sensações de tato fino e com mecanorreceptores de baixo limiar.
Tipo de fibra sensorial Diâmetro da fibra (mm) Receptor inervado Velocidade de condução do impulso Aα 0,13-20 Fusos musculares primarios,órgão tendíneo de Golgi
Aβ 0,16-12 Fusos musculares secundários, mecanorreceptores cutâneos Aδ 0,11-51 Mecanorreceptores cutâneos, termorreceptores, nociorreceptores
C 0,2-1,5 Mecanorreceptores cutâneos, termorreceptores, nociorreceptores Tipo de fibra
motora
Aα 0,12-20 Fibras musculares esqueléticas extrafusais Aγ 0,12-8,2 Fibras musculares intrafusais
B 0,21-33 Fibras autonômicas pré-ganglionares C 0,2-2 Fibras autonômicas pós-ganglionares
Tabela 1 – Classificação das fibras nervosas (adaptada de Berne e Levy).
Fig. 5- A) Revestimento das células de Schwann em torno de um axônio para formar a bainha de mielina. B) Condução saltatória de um neurônio mielinizado.
A)
24 Em mamíferos, grandes nervos periféricos como o nervo isquiático (NI) contêm tipicamente milhares de feixes de axônios individuais, sensoriais e motores, agrupados em uma bainha de tecido conectivo frouxo chamado epineuro. Este tecido é de grande importância experimental como modelo no estudo do comportamento de SNP. Para tanto, o Potencial de ação composto (PAC) é utilizado para aferir, ao mesmo tempo, parâmetros de excitabilidade e condutibilidade do impulso nervoso em neurônios com características morfológicas e funcionais distintas. Mesmo não acontecendo naturalmente, pode ser induzido experimentalmente ou clinicamente por meio de eletrodos de estímulo e de registro, que medem a resposta elétrica de todos os axônios excitados, auxiliando assim o entendimento sobre as vias de condução do impulso nervoso. A diferença entre a velocidade de condução e amplitude do sinal demonstrada na Figura 6 acontece por causa da diferença de limiar de excitação dos distintos axônios (MENDES,2012).
3.2 Metabolismo neuronal
O neurônio é a célula que possui o maior metabolismo do organismo, paradoxalmente não possui reservas energéticas expressivas e caso a oferta de glicose seja interrompida por um período importante de tempo, a atividade neuronal pode cessar (ILLANES,____).
Um indivíduo em condições de repouso porém acordado, o metabolismo neuronal é cerca de 7,5 vezes maior que o de tecidos não neurais. A maior necessidade metabólica deste tecido é para bombear íons através de suas membranas, para isso o aporte de glicose capaz de suprir a demanda energética da célula nervosa é proveniente exclusivamente do metabolismo aeróbico.
25 Neste tipo de metabolismo, as principais substancias das quais a célula extrai energia são os nutrientes que reagem quimicamente com o oxigênio sob a influência de enzimas para gerar ATP (Trifosfato de Adenina). O ATP, moeda de energia da célula, é um composto necessário para o transporte ativo das moléculas através das membranas, assim como para a contração dos músculos, reações sintéticas, condução de impulsos nervosos, divisão celular e crescimento. Cerca de 95% do ATP formado na célula é proveniente da mitocôndria. (GUYTON, 2006)
As mitocôndrias são organelas móveis e plásticas, frequentemente associadas aos microtúbulos, presentes em todas as células eucarióticas. Formadas pelas membranas externa e interna, e pela matriz mitocondrial, convertem a energia em formas que possam ser utilizada para direcionar as reações celulares (Fig. 7).
A energia obtida pela oxidação dos alimentos promove a transferência de elétrons de um composto para outro, aciona as chamadas bombas de prótons (H+) ligadas às membranas para, no momento necessário, transferir H+ de um lado para outro da membrana. A enzima de membrana, ATP sintase, utiliza o gradiente de pH e de voltagem (eletroquímico) gerado pelo fluxo de H+, para sintetizar ATP a partir de ADP (Difosfato de Adenosina) e Pi (Fosfato livre).
Os elétrons são deslocados por moléculas carreadoras, principalmente uma molécula chamada NAD+, responsável por transportar elétrons do sítio onde os macronutrientes são degradados para o primeiro de uma série de carreadores de elétrons embebidos na membrana mitocondrial. Todo este complexo é chamado de Cadeia Respiratória ou Cadeia Transportadora de Elétrons (CTE) (ALBERTS, 1997).
26 A cadeia respiratória possui quatro grandes complexos enzimáticos transferidores de elétrons constituídos por subunidades proteicas associadas a grupos prostéticos diferentes, que parecem existir como estruturas independentes (Fig. 8). O fluxo de elétrons só segue do primeiro complexo para o seguinte porque cada complexo da sequência tem afinidade maior por elétrons (potencial redox) do que o seu antecessor, ou seja organizados de forma crescente com relação ao seu potencial redox:
1. O complexo I - NADH – ubiquinona - oxido - redutase, que aceita elétrons do NADH e os passa à ubiquitina, a qual transfere seus elétrons para o segundo complexo. NAD+ oxida os álcoois, aldeídos ou cetonas;
2. O complexo II- Succinato desidrogenase – contém FAD (dinucleotídio de flavina e adenina) que é o aceitador de elétrons da reação. Oxida os alcanos e alcenos enquanto produzindo FAD e FADH2;
3. O complexo III- citocromo b-c1 o qual aceita elétrons da ubiquitina e os repassa para o complexo citocromo-oxidase;
4. Complexo IV- citocromo oxidase que finalmente repassa os elétrons ao oxigênio.
Todavia, no decorrer desta cadeia algumas moléculas que, na sua órbita externa, possuem um oxigênio com elétron desemparelhado, altamente instáveis e com elevada capacidade de reação, são produzidos. As Espécies Reativas de Oxigênio (EROs) ou radicais livres como também são chamados, tendem sempre a ligar seu elétron não pareado com estruturas próximas, doando (redutores) ou recebendo elétrons (oxidantes) (VALKO, 2006).
27 No início da década de 50 um estudo pioneiro abordou a possibilidade que altos níveis de oxigênio nos organismos pudessem promover algum grau de toxicidade (BOGHDADY, 2012). Conquanto o oxigênio seja essencial à vida, esta molécula também pode ser tóxica pelo excesso na formação de suas espécies reativas. O estresse oxidativo ou desequilíbrio redox, como também é conhecido, acontece quando há um aumento da relação entre a produção de espécies reativas e a produção endógena de defesas antioxidantes (TANIYAMA,2003).
As EROs são um grupo heterogêneo de moléculas que têm um papel importante na regulação da sinalização celular, estimulação enzimática e de receptores e exercem influência no controle da expressão gênica (JACKSON,1999; SMITH, 2006), também têm sido relacionadas à regulação da plasticidade sináptica via canais de cálcio e potássio (HUDLESTON, 2008; ANGELOVA, 2006), assim como pela regulação da proteína kinase reguladora de sinal extra celular (ERK) também conhecida como MAPK (KEMMERLING, 2007).
Estas espécies reativas são geradas principalmente por três mecanismos: na respiração mitocondrial, pela ativação de várias oxidases incluindo as NADPH oxidase (NOX), as Xantina Oxidase (XO), e pelas sintases de oxido Nitrico (NO) (MCCORD,1969; MASSAAD, 2011). Alguns estudos apontam que 1-3% do total de elétrons vaza da cadeia transportadora de elétrons e se ligam ao oxigênio prematuramente, gerando o radical superóxido (O2-). Ainda, a principal forma de EROS produzida pelas NADPH oxidases também é o superóxido.
Em resposta a produção de radicais livres, a célula desenvolve uma satisfatória quantidade de defesas antioxidantes, formadas por um grupo de componentes que são oxidados em detrimento a outras moléculas, de forma enzimática ou não. As defesas antioxidantes e mecanismos de retirada de EROs de forma enzimática acontecem através das enzimas catalase e Super Oxido Desmutase (SOD) e pela redução dos radicais livres através da doação de elétrons mediada pela Gluatationa reduzida(GSH) (LIMÓN-PACHECO, 2009).
Estes mecanismos de defesas também interferem positivamente no sinal de transdução e regulação da proliferação da resposta imune. Enquanto as EROS foram associadas ao câncer e a complicações diabéticas, as defesas antioxidantes têm sido apresentadas como terapia de prevenção e tratamento de ambas as doenças (MATOUGH, 2011).
A exposição a estressores ambientais, inatividade física e algumas patologias podem levar ao quadro de superprodução de EROs e a ineficiência orgânica na remoção destas moléculas culminando em degeneração celular, dano no aparato molecular e até apoptose celular (FRANCO, 2009).
28 3.3 Exercício Físico e Sistema Nervoso
A prática regular de atividade física é amplamente conhecida por promover muitos benefícios à saúde, incluindo a diminuição da mortalidade por todas as causas, juntamente com uma redução do risco de doenças cardiovasculares, câncer e diabetes (CRESPO, 2002). “Mente sã em um corpo são” é um proverbio amplamente difundido, mas pouco entendido biologicamente (KEMPERMANN,2010), considerando que ainda são recentes as descobertas dos mecanismos de atuação do exercício no remodelamento celular para a prevenção e reparação de danos no sistema nervoso.
Sabe-se que o exercício físico induz uma série de efeitos positivos no SNC tais como, eficiência no aprendizado, melhoria na memória, plasticidade sináptica, ativação neuronal e aumento da neurogênese (GARCIA, 2012). Atualmente, evidências científicas também suportam a noção de que as perturbações na homeostase celular diminuíram em indivíduos fisicamente ativos quando comparados à indivíduos sedentários, devido à seleção natural da expressão gênica (BOOTH,2002).
O exercício físico tem a habilidade de aumentar tanto a demanda energética de ATP como a necessidade de consumo de oxigênio pelo organismo. Isso leva a um aumento da atividade mitocondrial, possivelmente à biogênese mitocondrial, aumento na produção de catecolaminas e nas vias metabólicas durante a sua pratica. Têm sido sugerido que o exercício físico representa uma causa provável de geração excedente de EROs (COFFEY, 2007; SILVA, 2010; SERVAIS,2003; POWERS, 2008). Contudo, este fenômeno atua como sinalizador adaptativo, provocando a diminuição do estresse oxidativo induzido por diversas doenças (PINHO, 2007; AGUIAR, 2008; MARTÍN-SÁNCHEZ, 2011). A oxirredução ocasionada pela contração muscular tem um papel fisiológico na adaptação ao exercício, que resulta num aumento de poderosas enzimas antioxidantes (GOMEZ-CABRERA, 2006).
No final da década de 1970, um estudo publicado por Dillard (1978) sugere um aumento na peroxidação lipídica durante o exercício em ratos e humanos. A partir deste período o interesse pela influência do exercício físico na adaptação celular, principalmente mediada pela sinalização redox cresceu espantosamente. Porém, passados 40 anos, os estudos concentraram-se principalmente no tecido muscular esquelético (POWERS, 2008) e ainda há uma discussão restrita acerca da relação entre o exercício físico e a produção de EROs no SNP.
29 As interferências da prática regular de atividade física no sistema nervoso se concentram prioritariamente na prevenção e tratamento de doenças, assim como na tentativa de reduzir os efeitos deletérios dos processos naturais do envelhecimento no SNC. Estudos sobre alterações no metabolismo, estrutura e funcionalidade do SNP induzidas pelo exercício físico, de baixa a elevada intensidade, com vias energéticas, requisitos motores e períodos de duração distintos são incomuns, ao mesmo tempo que importantes pois trata-se de influencias no sistema intermediário entre a percepção de estímulos e a execução de respostas apropriadas.
Atualmente, inúmeros estudos tem apresentado indícios de modificações nos neurotransmissores, alterações na expressão de genes relacionados as vias de sinalização estruturais e funcionais dos neurônios e participação de proteínas sinápticas nas mudanças plásticas induzidas pelos exercícios (VAN MEETEREN,1997; TILLERSON, 2003; ILHA, 2008). Contudo, a adaptação fenotípica do organismo ao exercício é resultante de uma cadeia sinalizadora intrínseca e complexa iniciada pela regulação da expressão gênica. Grande variedade de fatores moleculares como o NFKβ, TGF, NGF, dentre outros, participa na diferenciação, no crescimento, na migração, no direcionamento dos neurônios para os locais apropriados e na manutenção das conexões sinápticas (MASSAAD,2011).
Desta forma, identificar as influências funcionais e transcricionais do exercício físico aeróbico de baixa intensidade no SNP de ratos wistar pode aprofundar os conhecimentos sobre a rede de conexões envolvidas nas respostas motoras e desta forma direcionar prescrições de treino cada vez mais específicas para cada objetivo e necessidade.
30 4. MATERIAIS E MÉTODOS
O trabalho foi desenvolvido nas dependências do Instituto Superior de Ciências Biomédicas da Universidades Estadual do Ceará-UECE no período entre 03.2012 e 01.2014. Trata-se de uma pesquisa experimental aprovada pelo Comitê de Ética para o uso de animais da UECE-CEUA sob o número: 127837060.
Animais: O experimento foi iniciado com 16 ratos machos albinos da linhagem Wistar com 30 dias de vida e peso médio de 94,74g±20g. Os animais foram mantidos em ciclo claro/escuro (12h/12h), em ambiente com temperatura controlada entre 22 a 25°C, tendo acesso ad libitum à água e à ração.
Grupos Experimentais: O estudo foi composto por dois grupos experimentais: Grupo Controle Sedentário CS (n=8) e Grupo Controle Treinado CT (n=8),
Familiarização dos animais ao ambiente de treino: Logo após o desmame (21 dias), os animais foram adaptados à esteira ergométrica (Atletic speed 2, Atletic, Brasil), ajustada por Ferraz (2007), objetivando a minimização do estresse a ser gerado pelo exercício forçado durante o experimento (KREGEL et al, 2006) e a exclusão de animais que ofereceram recusa à caminhada. Neste período, que foi chamado de pré experimento, os ratos foram dispostos na esteira durante duas semanas, submetidos à caminhada inicial de cinco minutos com acréscimo de dois minutos ao dia até alcançar e permanecer a dez minutos ao dia, de segunda a sexta, a uma velocidade constante de 0,3km/h (MALYSZ, 2010), no período noturno para respeitar o ciclo circadiano dos roedores.
Avaliação da sensibilidade térmica e mecânica: Após a adaptação à esteira, os animais que não apresentaram resistência à atividade física permaneceram no estudo. Ao completarem trinta dias, os animais foram submetidos ao teste de retirada da cauda (tail flick adaptado) e ao de teste Von Frey para avaliar a sensibilidade aos estímulos externos durante todo o experimento. Os testes foram aplicados quinzenalmente, sendo executados sempre nas
31 semanas que não havia teste de esforço máximo, no mesmo horário e local, em dias alternados (segunda - Vonfrey, quarta – tail flick quente/muito quente, sexta tail flick frio/gelado) visando estabelecer padrões iniciais e avaliar em curso temporal a sensibilidade térmica e mecânica do animal.
Teste de retirada da cauda (tail flick adaptado):
Utilizando um equipamento de controle térmico da água, a temperatura da mesma era ajustada de acordo com o objetivo e monitorada com um termômetro de mercúrio. Em seguida a ponta da cauda do animal era imersa em água fria e gelada (10°C e 4°C) ou quente e muito quente (42°C e 46°C) sendo quantificado o tempo de latência até o animal retirar a cauda em contato com a água. (Authier et. al 2003). O movimento de retirada foi padronizado pela contração dos músculos do tronco e patas traseiras para a diminuição do erro por subjetividade.Teste de Von Frey (sensibilidade mecânica):
consistiu na colocação dos animais em caixas de acrílico, com uma abertura circular na parte superior, cujo assoalho é uma rede de malha igual a 5 mm2 constituída de arame não maleável de 1 mm de espessura. Os experimentos foram realizados com um anestesiômetro eletrônico (Modelo 1601C, Life Sciences Instruments, Califórnia, EUA), que consiste em um transdutor de pressão conectado a um contador digital de força expressa em gramas (g). O aparelho é calibrado para registrar uma força máxima de 150 g, mantendo a precisão de 0,1 g. O contato do transdutor de pressão com a pata dos animais é realizado por meio de uma ponteira de polipropileno com 0,5 mm de diâmetro. Durante 30 minutos os animais permaneceram nas caixas a fim de adapta-los ao ambiente do teste. A partir deste tempo o avaliador tocou a pata traseira do animal com o capilar específico e a pressão com a qual o animal retira a pata é apresentada no visor estabelecendo seu limiar. Os estímulos foram repetidos por até seis vezes, em geral até o animal apresentar três medidas similares com uma clara resposta de “flinch” (sacudida) após a retirada da pata (ANDREWS, 1993).A medição destes parâmetros foi feita por dois pesquisadores sendo um anotador, que sabia a posição dos animais de cada grupo e um avaliador que não sabia que animal de cada grupo estava sendo avaliado. Este padrão foi adotado no intuito de diminuir a interferência subjetiva no resultado dos testes
32 Protocolo de treinamento físico: O protocolo de exercício físico consistiu em Testes de Esforço Máximo (TEM) antes do início do período de treinos com o intuito de estabelecer a capacidade física inicial dos animais e a cada duas semanas de treino com o intuito de reajustar a carga da sessão de treinamento, além de averiguar a adaptação dos roedores ao mesmo. Neste teste os animais foram colocados na esteira com velocidade inicial de 0,3km/h e a cada três minutos esta velocidade foi acrescida em 0,2 km/h até a exaustão de cada animal (RÊGO MONTEIRO, 2011) (Figura 11 A). A exaustão foi caracterizada quando, durante a corrida, há um afastamento lateral acentuado nas patas traseiras do animal, posteriormente o rato apresenta diminuição da capacidade coordenativa nas passadas e ao ser retirado da esteira, o animal permanece com a mobilidade reduzida.
O programa de treinamento foi composto por cinco sessões semanais (segunda a sexta) de corrida em esteira, com velocidade de 50% do TEM (MALYSZ,2011), com duração da sessão de treino de 10 minutos no primeiro dia após o teste e respeitando o princípio de sobrecarga do treinamento desportivo (GOMES, 2010), foi acrescido 10 minutos a cada dia até chegar a sessenta minutos diários.
Minutos
Fig. 10 – A) Teste de Von Frey B) Teste de Tail flick adaptado
A) B)
33 Acompanhamento de peso e glicemia: Os animais foram acompanhados semanalmente através da aferição do peso corporal e da glicemia sanguínea. Para tais avaliações foi utilizada uma balança digital com precisão em miligramas (KERN882) e um glicosimetro (ACCUCHECK Active, Ireland).
Sacrifício: Trinta e seis horas após o fim do período de treinamento, os animais foram anestesiados com CO2 durante 4 minutos, para posterior sacrifício por decapitação, de acordo com a resolução do Conselho Federal de Medicina Veterinária – CFMV/CRMVs – N° 714, 20/06/2002. Amostras do músculo esquelético gastrocnêmio, do fígado, do nervo isquiático e do sangue foram coletadas e acondicionados para análises bioquímicas, histológicas e moleculares. As carcaças foram acondicionadas em sacolas plásticas específicas para material biológico e congeladas para serem coletadas pela empresa responsável pelo descarte de material biológico da Universidade Estadual do Ceará.
Armazenamento dos tecidos: Tecidos foram acondicionados de acordo com as análises especificadas abaixo.
Segunda Terça Quarta Quinta Sexta
Semanas Intensidade Duração Intensidade Duração Intensidade Duração Intensidade Duração Intensidade Duração (Km/h) (Min) (Km/h) (Min) (Km/h) (Min) (Km/h) (Min) (Km/h) (Min)
1ª 0,6 10 0,6 20 0,6 30 0,6 40 0,6 50 2ª 0,6 60 0,6 60 0,6 60 0,6 60 0,6 60 3ª 0,9 10 0,9 20 0,9 30 0,9 40 0,9 50 4ª 0,9 60 0,9 60 0,9 60 0,9 60 0,9 60 5ª 0,9 10 0,9 20 0,9 30 0,9 40 0,9 50 6ª 0,9 60 0,9 60 0,9 60 0,9 60 0,9 60 7ª 0,9 60 0,9 60 0,9 60 0,9 60 0,9 60
Fig. 11 – A) Esquema de aumento de velocidade durante o Teste de Esforço Máximo (TEM). B) Protocolo de treinamento durante o experimento.
Fig. 12 – A) Aferição da glicemia sérica. B) Aferição da massa corporal. B)
34 Glicogênio muscular e hepático: Afim de avaliar a influência do exercício nos estoques de glicogênio, esta substância foi extraída do tecido muscular (100mg), gastrocnêmio, e do tecido hepático (200mg). Primeiramente foi feita a curva de glicose com a solução inicial a 1,5g de glicose para 15 mL de deionizada posteriormente houve a diluição desta solução a 90,80,70,60,50,40,30 e 10µg/mL em seguida 1ml de cada concentração foi colocado em tubos de ensaio, posteriormente adicionado 1ml de fenol 5%, adicionado 950 µl de dh2O (para fígado) e 100 µl com 900 µl de dh2O (para músculo) e 5ml de H2SO4 em cada tubo. A amostra ficou incubada 30minutos na geladeira para em seguida realizar a leitura no espectrofotômetro. Para extração do glicogênio do tecido, o processo é muito parecido. Há a inclusão da fervura do total tecido submerso em KOH30%, adição de 1ml de Na2SO4 homogeneização da solução no vórtex, incubação por 5 minutos, 2mLde etanol 95% para precipitar o glicogênio da digestão alcalina, mais uma vez o ensaio foi levado ao vórtex e à geladeira por 30 minutos. Posteriormente a solução foi centrifugada a 550G por 30 minutos (ou 25000 rpm), o sobrenadante foi desprezado e no pellet foi adicionado 1ml de dh2O e homogeneizado no vórtex. Em seguida foi adicionado 1ml de fenol, extraído 100µL da solução e adicionado 900 µL de dH2O (para músculo) e 50µL com 950 µL de dH2O (para fígado) finalmente foi adicionado 5ml de ácido sulfúrico incubado na geladeira por 30 minutos até a leitura no espectrofotômetro calibrado com comprimento de onda a 490nm.
Ensaios bioquímicos no plasma: O sangue foi coletado no momento do sacrifício e mantido de 2 a 8°C. As análises foram realizadas em até 7 dias a partir do armazenamento do material coletado, através de kits de ensaios bioquímicos (Labtest, Brasil), para dosagem dos níveis séricos de Triglicérides, colesterol liquiform, colesterol HDL, proteínas totais e albumina, no intuito de avaliar as alterações metabólicas e caracterizar a intensidade do treinamento físico. Todos os kits foram utilizados de acordo com as especificações do fabricante.
Registro eletrofisiológico extracelular: Após a dissecação do nervo isquiático os tecidos foram nutridos com solução de Locke modificada com a seguinte composição (mM): NaCl (140); KCl (5,6); MgCl2 (1,2) CaCl2 (2,2); tris-hidroximetil-aminometano (TRIS) (10); glicose (10). A solução teve pH de 7,4 ± 0,01 ajustado por adição de NaOH ou HCl, à temperatura ambiente. Este nervo foi então disposto transversalmente sobre eletrodos de platina em uma câmara de Harvard com uma alça de 15-20 mm imersa em solução de Locke para sua nutrição. A câmara foi hermeticamente fechada para evitar a desidratação da
35 preparação. Na extremidade distal do nervo foram dispostos dois eletrodos que estimularam o nervo com um pulso de amplitude de tensão 40 V, duração de 0,1 ms e frequência de 0,2 Hz através de uma unidade isoladora de estímulo (modelo SIU 4678, Grass Instruments Co., Quincy, MA, USA) que está conectada à um estimulador (modelo S-48, Grass Instruments). Um eletrodo de registro foi disposto na extremidade proximal do nervo a fim de registrar os potenciais de ação evocados. Este eletrodo esteve acoplado a um amplificador especialmente configurado para satisfazer as necessidades da pesquisa (AM 01/UECE), que por sua vez esteve acoplado à um osciloscópio (Model 547, Tektronix, Inc., Portland, OR, USA) e a uma placa de interface análogo-digital (Digidata 1200, Axon Instruments, Inc., Foster City, CA, USA) (Figura 6F). A placa converteu os dados analógicos para digitais e os enviou à um computador, que utilizando o programa AxoScope 8 (Axon Instruments) permitiu a visualização e armazenamento dos registros para análise.
O protocolo foi composto de duas horas de estabilização, a fim de se obter uma amplitude pico-a-pico estável. A velocidade de condução e a duração das componentes foram analisadas aos 120 minutos de estabilização. Após este período se iniciou a coleta de medidas de excitabilidade nervosa através da reobase e cronaxia. A reobase é definida como a tensão limiar de estímulo para uma resposta ativa das fibras nervosas com pulso de longa duração (1 ms) e a cronaxia é o tempo limite para uma resposta ativa com um estímulo duas vezes o encontrado na reobase.
Procedimento Histológico: Após o registro eletrofisiológico, almejando a visualização da estrutura celular do nervo isquiático, este foi acondicionado em recipiente apropriado, submerso em paraformaldeido a 10% para posterior processamento em solução
Fig. 13 – A) Nervo Isquiático de ratos wistar disposto na câmara de Harvard. B) interface eletrônica de registro eletrofisiológico. C) Setup de eletrofisiologia extra celular.
36 formalina neutra, álcool absoluto e xilol. O tecido então, foi incluso em parafina histológica a 65ºC. Em seguida foram realizados cortes histológicos com três micras de espessura, depois as pescarias dos mesmos com lâminas fosca. As lâminas foram levadas à estufa a 65º C para melhor adesão dos fragmentos e para desparafiná-las. A bateria de coloração foi composta por: Xilol, Xilol, Xilol, Álcool Absoluto, Álcool a 90%, Álcool a 80%, banho em H2O, Hematoxilina, banho em H2O, Eosina, Álcool a 80%, Álcool a 90%, Álcool Absoluto, Xilol, Xilol, Xilol. A lâmina e lamínula foram montadas com Balsamo do Canadá (resina sintética). Aparelhos utilizados no procedimento: Processador de Tecido Automático Lupetec, central de Inclusão Leica EG1150H, Micrótomo Leica RM 2235 Microsystems, Estufa de Esterilização e Secagem 60º a 65ºc, Bateria de Coloração EASYPATY. O Procedimento foi realizado pelo técnico do laboratório de Patologia/Histologia – UFC.
As lâminas foram analisadas ao microscópio ótico do Instituto de Ciências Biomédicas da UECE em parceria com o laboratório HISTOVESP.
Análise da Expressão Gênica:
Busca e avaliação das sequências de primers
:
Inicialmente foi feito uma busca de artigos científicos no periódicos CAPES e NCBI usando as palavras chave: real time PCR, wistar rats e os genes de interesse. foram selecionados 03 trabalhos que utilizaram o método de rt-qPCR usando SYBR Green Master Mix (Life Technologies USA) e quantificação singleplex, para cada gene. Ambas as sequências forward e reverse dos primers selecionados foram posteriormente analisadas pela ferramenta de busca BLAST usando como referência o genoma de rato e selecionando RefSeq RNA no campo da base de dados. Apenas as sequências que obtiveram afinidade superior a 90% para o gene alvo e predição menor que 70% para outros genes foram selecionadas. Em seguida, as sequências obtidas foram analisadas no aplicativo online Primer Blast sendo averiguados os seguintes parâmetros: temperatura de melting (Tm), percentual de CG (%CG), e tamanho do produto (Tp). As mesmas sequências foram também analisadas no aplicativo online IDT Oligo Analyser onde foi verificado a Tm, %CG, Tm de produção de grampo, energia livre de homo-dimerização e energia livre de hetero-dimerização. No aplicativo IDT Oligo Analyser, os valores das concentrações de Mg e dNTPs foram reajustadas respectivamente para 2.5 e 0.8 mM e da concentração do primer para 0.3 µM para determinação dos parâmetros descritos.Extração de RNA: O RNA total foi extraído utilizando o reagente Trizol® de acordo com as especificações do fabricante. As amostras de nervo isquiático foram homogeneizadas
37 com o auxílio do homogeneizador Polytron® PTM2100 (Kinematica AG, Switzerland) neste reagente até sua completa diluição. Após homogeneização, a amostra foi centrifugada a 12000 x G (RCF) por 10 minutos a 4 °C. No sobrenadante continha RNA e este foi transferido para outro tubo que foi incubado por 5 min a temperatura ambiente para permitir a completa dissociação do complexo núcleo-proteína. Após esse tempo foi adicionado 200µl de clorofórmio por tubo misturado vigorosamente e incubado por três minutos em temperatura ambiente. Em seguida houve uma nova centrifugação a 12000 x g por 15 minutos à 4°C. Novamente o pellet contém o RNA. Para a precipitação do RNA foi adicionado 500µl de isopropanol (100%); incubado por dez minutos a temperatura ambiente e centrifugado a 12000 x G por 10 minutos a 4°C. O sobrenadante foi descartado e foi adicionado ao pellet 1 ml de etanol 75% (gelado). Mais uma centrifugação a 7500 x g por 5 minutos a 4 °C e então deixar o pellet secar. O pellet foi re-suspendido em 30µl de água ou solução de SDS a 0,5% (20 - 50 µl), depois encubado no termociclador a 55ºC por doze minutos. A integridade da amostra de RNA extraída dos tecidos foi avaliada pela eletroforese em gel de agarose (Fig. 14). Este gel é constituído por tampão TAE (80ml) e agarose (1,2g) homogeneizando e aquecendo a mistura até ficar translucido, então foi adicionado 2 µl de Brometo de Etídio e homogeneizado. As amostras foram preparadas com 1 l de frente de corrida,1 g de RNA e aproximadamente 3 l de H2O ultra pura. A presença das bandas 5s, 18s e 28s foi usada como indicativo de qualidade do RNA.
Síntese de cDNA: Realizada através do kit ImProm-II Reverse Transcription System (Promega, USA) de acordo com as especificações do fabricante. Um micrograma de cada amostra de RNA total foi submetido a reação de transcrição reversa com primers OligodT. Para isto, foi adicionado a cada amostra tampão da enzima (50 mM de Tris-HCl pH 8,3, 75 mM de KCl, 3 mM de MgCl2), DTT (10 mM), mistura de dNTPs (0,5mM cada), OligodT primers (150ng), inibidor de RNAse (40U) e a enzima ImProm-II™ Reverse Transcriptase (Promega, EUA), em volume final de 20 µl. As reações foram incubadas no termociclador (Techne TC-412, UK) por 5 min à 70oC, depois resfriadas por 5 minuntos no
Fig. 14 –Avaliação da integridade do RNA através da visualização das bandas de RNA ribossomal 28s, 18s e 5s. Eletroforese em gel de agarose de 1µg do RNA extraído do NI dos grupos controle e treinado.
38 gelo seguida de 5 min à 25oC, com aquecimento para 42ºC por 60 min. As amostras de cDNA foram diluídas na proporção 1/10 e armazenadas à -20ºC.
Análise quantitativa da expressão gênica: Realizada através da técnica de PCR em tempo real utilizando o sistema Biorad CFX 96 (Biorad, CA, EUA). Os ensaios foram realizados em duplicata, utilizando o cDNA sintetizado previamente (2 µL por amostra), adicionado à mistura da reação contendo 10 µL de Power SYBR Green (Lifetechnologies, Foster City, CA, EUA), 6,8 µL de água ultra-pura (Lifetechnologies, Foster City, CA, EUA) e 0,6 µL (300 nM) de cada primer forward e reverse.
A amplificação da expressão gênica (Fig. 15) consistiu de uma etapa inicial de ativação da enzima de 95 °C por 10 minutos; 40 ciclos promovendo a desnaturação (95 °C) por 15 segundos; o anelamento e a extensão dos primers (60 °C) por 1 minuto (temperatura ótima para todos os pares de primers usados), e 1 ciclo para análise do melting que consiste aumento gradativo da temperatura de 55 °C para 95 °C para obtenção das curvas de melting (Fig.16).
Fig. 16- curva de melting em rt-qPCR
39 O limiar de quantificação (Ct) de cada amostra foi determinado automaticamente pelo software CFX manager versão 1.6 (Biorad, CA, EUA) para comparação e determinação da expressão gênica segundo o método do 2-∆∆Ct segundo Livak (Livak & Schimittgen, 2001) usando a média geométrica do gene HPRT para normalização dos dados. As curvas de melting realizadas após o protocolo de amplificação serviram para avaliar possíveis formações de estruturas secundárias decorrentes de contaminação de DNA genômico ou dimerização de primers.
Tabela 2 – Primers utilizados
Forward primer (5′ to 3′) Reverse primer (5′ to 3′) BLAST Amplicon Pro oxidantes
NOX2 TCATCACATCCTCCACCAAA TCCACGTACAATTCGCTCAG 100% 125
NOX4 ACTGCCTCCATCAAGCCAAGA CTTCCAAATGGGCCATCAATGTA 100% 90
XO AAGATCCGAAACGCCTGTGTG GGAATCCTGGTGCGGTACAAAC 100% 132
Anti oxidantes
CATALASE ATTGCCGTCCGATTCTCC CCAGTTACCATCTTCAGTGTAG 100% 105
SOD1 TGTGTCCATTGAAGATCGTGTG CTTCCAGCATTTCCAGTCTTTG 100% 185
SOD2 TGGACAAACCTGAGCCCTAA GACCCAAAGTCACGCTTGATA 100% 77
GPX1 CGACATCGAACCCGATATAGA ATGCCTTAGGGGTTGCTAGG 100% 60
Constitutivos
eNOS TCCTAACTTGCCTTGCATCC GGCAGCCAAACACCAAAGTC 100% 134
nNOS GTGGAGGTGCTGGAGGAGTT ACTCCAAAGATGTCCTCGTGGTA 100% 72
NFL CCATGCAGGACACAATCAAC CTGCAAGCCACTGTAAGCAG 100% 248 NFH ACCTATACCCGAATGCCTTCTT AGAAGCACTTGGTTTTATTGCAC 100% 177 PGC-1α ACCCACAGGATCAGAACAAACC GACAAATGCTCTTTGCTTTATTGC 100% 76 Fatores de crescimento NGF GGACGCAGCTTTCTATCCTGG CCCTCTGGGACATTGCTATCTG 100% 129 TGF GCTAATGGTGGACCGCAACAAC CACTGCTTCCCGAATGTCTGAC 100% 100
IGF1 ACTCTGCTTGCTCACCTTTACC TCATCCACAATGCCCGTC 100% 174
Ativadores nucleares e sinalizadores de inflamação
TNFα AACTTCGGGGTGATCGGTCC CAAATCGGCTGACGGTGTGGG 100% 331
NFkB1 CCCATGTAGACAGCACCACCTATGAT ACAGAGGCTCAAAGTTCTCCACCA 100% 132
COX 2 AGTATCAG AACCGCATTGCC TAAGGTTTCAGGGAGAAGCG 100% 310
MAPK p38 TGAACTTCGCAAATGTATTTATTGGT ATCTGAGTCCAAAACGAGCATCT 100% 80
Analise estatística:
Para uniformizar a coleta, organização, descrição e análise de dados foi utilizada a estatística descritiva de análise univariada, não paramétrica, de escala de medida intervalar e de razão; empregando o teste T para amostras independentes. Considerando significativos os resultados com P< 0.05. (NORMANDO, 2010, BARROS, 2012)
40 5. RESULTADOS:
5.1 Caracterização do modelo experimental:
Fig. 17 – A) Avaliação quinzenal da massa corpórea, durante oito semanas de experimento. B) Avaliação quinzenal da glicemia sérica. C) Intensidade máxima alcançada nos testes exaustivos realizados. (*) P<0,05 e (δ)
P<0,001.
O exercício físico aeróbico de baixa intensidade não alterou a massa corporal ou a glicemia dos animais treinados quando comparado aos sedentários. No entanto, foi eficiente em influenciar positivamente a capacidade física máxima dos animais submetidos a este protocolo de treino.
A)
C)
41 Tabela 3 – Perfil metabólico dos animais ao final do período experimental. (*) P<0,05; (α) P<0,01 e (δ) P<0,001. ANÁLISES GRUPOS CS CT Colesterol total (mg/dL) 89,75 ± 13,19 43,13 ± 2,34 α Colesterol HDL (mg/dL) 0,38 ± 0,06 0,77 ± 0,07 α Triglicerídeos (mg/dL) 157,0 ± 23,47 62,59 ± 7,44 * Proteínas totais (mg/dL) 6,95 ± 0,21 6,76 ± 0,35 Albumina (mg/dL) 0,38 ± 0,02 0,40 ± 0,02 Glicogênio Hepático (mg/dL) 0,17 ± 0,029 0,65 ± 0,06 δ Glicogênio Muscular (mg/dL) 0,14 ± 0,03 0,22 ± 0,02 *
Os animais treinados apresentaram alterações positivas no metabolismo lipídico, estas alterações correspondem as modificações encontradas em organismos submetidos ao treinamento de baixa intensidade. Além disso, os estoques de glicogênio hepático e muscular estavam aumentados nos animais submetidos ao protocolo de treinamento. Contudo este programa de treino não foi eficiente em alterar os parâmetros proteicos avaliados.
Parâmetros sensoriais in vivo:
42
Fig. 18 - Avaliação quinzenal da sensibilidade das extremidades corporais. A) Ao frio extremo, 4ºC. B) À temperatura fria, 10ºC. (*) P<0,05, (α) P<0,01. C) Ao calor extremo. D) À temperatura quente, 42ºC (*) P<0,05. E) Avaliação da sensibilidade mecânica da pata traseira. (δ) P<0,001 e (*) P<0,05
O protocolo de treinamento utilizado não alterou em nenhum momento do experimento o limiar térmico das temperaturas extremas, porém foi capaz de diminuir o tempo de latência para retirada da cauda em temperaturas consideradas não nocivas. Ainda, o treinamento utilizado neste estudo proporcionou a redução do limiar de pressão nas patas posteriores, a partir da sexta semana, dos animais submetidos ao treinamento.
Análise Histopatológica:
Os tecidos de NI de quase todos os animais apresentaram degeneração vacuolar discreta – o que pode ser visto até no processo de retirada do tecido. Devemos observar, entretanto, aqueles que exibiam fendas (controle sedentário) que na verdade são câmaras de digestão da mielina (em processo de degeneração). Não foram encontradas outras alterações significantes nas lâminas analisadas.
D) C)
43 Parâmetros eletrofisiológicos:
Fig. 19 – Avaliação do Potencial de Ação Composto (PAC) das fibras motoras e sensoriais no final do experimento. A) e B) Limiar de excitabilidade, Reobase e Cronaxia respectivamente. C) Duração das
componentes. D) Velocidade das componentes (*) P<0,05.
O protocolo de treinamento utilizado, mesmo sendo capaz de reduzir a reobase em alguns experimentos isolados do grupo CT, não promoveu diferença estatística entre o grupo de animais sedentários e o grupo submetido ao treinamento aeróbico de baixa intensidade. A cronaxia também não teve seus valores estatísticos diferentes entre os grupos. Assim como a duração das componentes. Todavia, o protocolo utilizado foi eficiente em melhorar a velocidade de condução do impulso nervoso da primeira componente do PAC, referente as fibras motoras.
C) D)
B) A)
44 Expressão Gênica (rt-qPCR):
O protocolo de treinamento utilizado se mostrou eficiente em elevar os níveis da expressão de genes pro oxidantes como das NADPH Oxidases 2 e 4, sem interferir na expressão de Xantina Oxidase. Ao mesmo tempo, elevou a expressão de genes anti oxidantes como a CATALASE, a Super Oxido Desmutase 2 e a Glutationa Peroxidase. No entanto, o
Gráfico 20 – Avaliação da expressão gênica por rt-qPCR. (*) P<0,05, (α) P<0,01 e (δ) p<0,001.
A) B)
D) E)
45 treinamento aeróbico de baixa intensidade promoveu uma redução da expressão do gene codificador da Super Oxido Desmutase 1.
O treinamento físico utilizado, foi capaz de elevar a expressão de genes codificadores da Oxido Nítrico endotelial, Neurofilamentos de cadeia leve e pesada, ao passo que reduziu a expressão da Oxido Nitrico neuronal e não influenciou na expressão de PGC1 α. Ainda, este mesmo protocolo influenciou positivamente na expressão do Fator de Crescimento Tumoral (TGF), do Fator de Crescimento Parecido com a Insulina (IGF) e reduziu a expressão de Fator de Crescimento Neuronal. Além disso, elevou a expressão dos genes NFKβ, MAPK p38 e TNFα, mas não exerceu influencia na expressão do gene codificador da COX 2.
