FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA
PARTICIPAÇÃO DOS HORMÔNIOS TIREOIDEANOS NO
DESENVOLVIMENTO DE HIPERREATIVIDADE INDUZIDA
PELO DESAFIO ANTIGÊNICO COM OVALBUMINA EM
TRAQUÉIAS ISOLADAS DE RATOS SENSIBILIZADOS
Fernanda Carvalho Bezerra
UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA
PARTICIPAÇÃO DOS HORMÔNIOS TIREOIDEANOS NO
DESENVOLVIMENTO DE HIPERREATIVIDADE INDUZIDA
PELO DESAFIO ANTIGÊNICO COM OVALBUMINA EM
TRAQUÉIAS ISOLADAS DE RATOS SENSIBILIZADOS
Fernanda Carvalho Bezerra
Dissertação apresentada ao Departamento de Fisiologia e Farmacologia da
Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Ceará como
pré-requisito para obtenção do título de Mestre em Farmacologia.
B469p Bezerra, Fernanda Carvalho
Participação dos Hormônios tireoideanos no desenvolvimento de hiperreatividade induzida pelo desafio antigênico com ovalbumina em traquéias isoladas de ratos sensibilizados / Fernanda Carvalho Bezerra. – 2005.
14 f. : il.
Orientador: Prof. Dr. Pedro Jorge Caldas Magalhães Dissertação (Mestrado). Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem.
1.Hormônios Tireoideanos 2.Ovalbumina 3.Hiper-reatividade Brônquica I Magalhães, Pedro Jorge Caldas (orient.) II. Título.
PARTICIPAÇÃO DOS HORMÔNIOS TIREOIDEANOS NO
DESENVOLVIMENTO DE HIPERREATIVIDADE INDUZIDA PELO
DESAFIO ANTIGÊNICO COM OVALBUMINA EM TRAQUÉIAS ISOLADAS
DE RATOS SENSIBILIZADOS
FERNANDA CARVALHO BEZERRA
Dissertação defendida e aprovada em 05 de agosto de 2005.
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. Pedro Jorge Caldas Magalhães (Orientador)
Prof. Dr. Francisco Ruy Capaz (Orientador)
Prof. Dr. Nilberto Robson Falcão do Nascimento
AGRADECIMENTOS
Agradeço em primeiro lugar a Deus que sempre me deu saúde e forças para que eu atingisse os meus objetivos.
Ao Prof. Dr. Francisco Ruy Capaz, pela dedicação, apoio e ensinamentos sempre precisos e valiosos.
Ao Prof. Dr. Pedro Jorge Caldas Magalhães pelo incentivo e colaboração inestimável na realização deste trabalho.
Aos Professores do curso de Pós-graduação em Farmacologia, pelos ensinamentos científicos imprescindíveis a minha formação.
Ao colega de Pós-graduação do Laboratório de Farmacologia do Aparelho Respiratório (LAFAR), Carlos Tiago Martins Moura pela colaboração na realização deste trabalho. Aos estudantes de iniciação científica, Sany, Heloísa e Cristiana, pela amizade e disponibilidade em ajudar.
Aos colegas de Pós-graduação em Farmacologia em especial, Gardenia, Hemerson, Daniel, Alexandra, Daniela e Virgínia pela agradável convivência.
A Dra. Artemísia Portela, Febe Jemima e Castro Júnior, pela disponibilidade em atender as solicitações.
As secretárias da Pós-graduação em Farmacologia, Sílvia Azevedo e Aura Rhanes, pela dedicação no atendimento.
Aos funcionários do Departamento de Fisiologia e Farmacologia pela presteza em nos fornecer ajuda.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo apoio financeiro concedido.
Aos animais, pela vida em prol da pesquisa científica.
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RESUMO
Participação dos hormônios tireoideanos no desenvolvimento de hiperreatividade induzida pelo desafio antigênico com ovalbumina em traquéias isoladas de ratos sensibilizados. Fernanda Carvalho Bezerra, Dissertação de Mestrado em Farmacologia, Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, 2005.
Com o objetivo de verificar a influência dos hormônios tireoideanos no desenvolvimento de hiperreatividade traqueal, ratos machos (200 - 250 g) eutireóideos, hipotireóideos (propiltiouracil [PTU] - v.o. 0,05% p/v, durante 4 semanas) ou hipertireóideos (L- tiroxina [T4] - 0,5 mg/kg s.c., por 7 ou 9 dias) foram sensibilizados à ovalbumina (OVA) e, 14 dias depois, desafiados através da inalação de OVA (1 mg/ml, seguida de 5 mg/ml, 15 min cada). O sacrifício dos animais para a realização dos experimentos ocorreu 24 h após o desafio antigênico por anestesia com hidrato de cloral (400 mg/Kg). A traquéia isolada foi montada em cubas contendo 10 ml de Krebs-Henseleit modificado (37 oC, 5% de CO2 em O2). Foram obtidas curvas concentração-efeito (CCE) para cloreto de potássio (KCl), carbacol (CCh) ou serotonina (5-HT). Também foram realizadas CCE ao Ca2+ em preparações estimuladas por KCl, CCh ou 5-HT e mantidas em solução sem Ca2+. A reapresentação do antígeno promoveu significativo aumento (p < 0,05, two-way ANOVA) da resposta máxima (RM) das CCE ao KCl de 0,96 ± 0,10 gF para 1,53 ± 0,11 gF (n = 7), ao CCh de 1,98 ± 0,06 gF para 2,92 ± 0,07 gF (n = 7) e à 5-HT de 1,64 ± 0,14 gF para 2,41 ± 0,15 (n = 6) nos tecidos obtidos de animais sensibilizados ou desafiados, respectivamente. As traquéias também apresentaram aumento (p < 0,05, two-way ANOVA) da RM ao Ca2+ quando estimuladas com KCl de 0,54 ± 0,06 gF para 0,86 ± 0,07 gF (n = 6), com CCh de 1,20 ± 0,14 gF para 1,77 ± 0,14 gF (n = 6) ou com 5-HT de 0,59 ± 0,10 gF para 1,15 ± 0,05 gF (n = 6) nos tecidos obtidos de animais sensibilizados ou desafiados, respectivamente. O hipotireoidismo não alterou significativamente a RM induzida por KCl e CCh, enquanto que aquela induzida pela 5-HT foi reduzida de 1,64 ± 0,14 gF nos animais eutireóideos para 0,34 ± 0,07 gF nos animais hipotireóideos (p < 0,001, two-way ANOVA). Após desafio, a 5-HT produziu 0,56 ± 0,11 gF (n = 7) no tecido hipotireóideo (p < 0,001, two-way ANOVA). O hipotireoidismo aboliu o desenvolvimento de hiperreatividade para KCl e CCh. Ocorreu um aumento na CE50 nas CCE obtidas ao CCh de 0,49 x 10-6M para 4,65 x 10-6M (P < 0,05, two-way ANOVA ). O desafio reduziu a CE50 novamente para 1,53 x 10-6M (n = 6, p<0,05, two-way ANOVA). As traquéias de animais hipotireóideos desafiados apresentaram diminuição da RM ao Ca2+ quando estimuladas com KCl, CCh e 5-HT. Ocorreu aumento na CE50 nas CCE ao Ca2+ em traquéias desafiadas e estimuladas com CCh de 5,77 x 10-4 M para 22,50 x 10-4 M (n = 6, p<0,01 two-way ANOVA). O hipertireoidismo promoveu um significativo aumento na RM das CCE apenas ao KCl (0,96 ± 0,10 gF no controle versus 1,58 ± 0,15 no tecido hipertireóideo). Não houve desenvolvimento de hiperreatividade após o desafio antigênico (RM = 1,87 ± 0,14 gF). Ocorreu diminuição da CE50 ao CCh de 0,67 x 10-4 M no controle para 0,14 x 10-4 M após tratamento com T4. Os resultados mostram que há envolvimento dos hormônios tireoideanos no desenvolvimento de hiperreatividade em traquéia de rato, induzida após reapresentação do antígeno a animais previamente sensibilizados.
ABSTRACT
Putative involvement of the thyroid hormones in hyperreactivity development induced by antigenic challenge with ovalbumin on ovalbumin-sensitized rat isolated tracheae. Fernanda Carvalho Bezerra, Master’s Dissertation in Pharmacology,
School of Medicine, Federal University of Ceará, 2005.
In other to verify the influence of thyroid hormones on the tracheal hyperreactivity development, euthyroid, hypothyroid (propiltiouracil [PTU] - p.o. 0.05% w/v, 4 weeks) or hyperthyroid (L-tiroxine [T4] – 0.5 mg/kg s.c.,7 or 9 days) male rats (200 - 250 g) were sensitized to ovalbumine (OVA) and, 14 days later, challenged with OVA inhalation, (1 mg/ml, followed by 5 mg/ml, 15 min each). Animals sacrifice was carried out 24 later by means of anaesthesia with chloral hydrate (400 mg/Kg). Isolated trachea was mounted in 10 ml bath chamber filled with modified Krebs-Henseleit (37 oC, 5% de CO2 em O2). Concentration-effect curves (CEC) were carried out for potassium chloride (KCl), carbachol (CCh) or serotonin (5-HT). CEC to Ca2+ added in tissues maintained in Ca2+-free medium stimulated with KCl, CCh or 5-HT also were carried out. Antigenic challenge produced significant increase (p < 0.05, two-way ANOVA) of the maximal response (Emax) of the CCE for KCl from 0.96 ± 0.10 gF to 1.53 ± 0.11 gF (n = 7), for CCh from 1.98 ± 0.06 gF to 2.92 ± 0.07 gF (n = 7) and for 5-HT from 1.64 ± 0.14 gF to 2.41 ± 0.15 (n = 6) in tissues obtained from sensitized or challenged animals, respectively. Tracheae also showed increase on the Emax to Ca2+ (p < 0.05, two-way ANOVA) when stimulated with KCl from 0.54 ± 0.06 gF to 0.86 ± 0.07 gF (n = 6), with CCh from 1.20 ± 0.14 gF to 1.77 ± 0.14 gF (n = 6) or with 5-HT from 0.59 ± 0.10 gF to 1.15 ± 0.05 gF (n = 6) on sensitized or challenged tissues, respectively. The hypothyroidism did not modify significantly the KCl- or CCh-induced Emax, while the 5-HT-induced contractile effect was reduced from 1.64 ± 0.14 gF in euthyroid tissues to 0.34 ± 0.07 gF in hypothyroid tissues (p < 0.001, two-way ANOVA). After challenge, 5-HT produced in hypothyroid tissues a contraction corresponding to 0.56 ± 0.11 gF (n = 7, p < 0.001, two-way ANOVA). Hypothyroidism prevented hyperreactivity development for KCl and CCh. It was observed an increased EC50 value in CCE for CCh from 0.49 x 10-6M to 4.65 x 10-6 M (p < 0,05, two-way ANOVA). After challenge, CE50 value was reduced to 1.53 x 10-6 M (n = 6, p < 0,05, two-way ANOVA). Tracheae from challenged hypothyroid animals showed decreased Emax to Ca2+ when they were stimulated with KCl, CCh and 5-HT. It was observed an increased EC50 value in CCE to Ca2+ in challenged tissues stimulated with CCh from 5.77 x 10-4 M to 22.50 x 10-4 M (n = 6, p < 0.01, two-way ANOVA). Hyperthyroidism significantly increased Emax of the KCl-induced CCE (0.96 ± 0,10 gF in control versus 1.58 ± 0.15 on hyperthyroid tissue). Hyperreactivity was not showed after antigenic challenge (Emax = 1.87 ± 0.14 gF). It was observed a reduction of the EC50 value to CCh from 0.67 x 10-4 M in control to 0.14 x 10-4 M after T4 treatment. Our results show that there is a putative thyroid hormones involvement in hyperreactivity development on rat trachea, after an antigenic challenge.
LISTA DE ABREVIATURAS
5-HT Serotonina
CCh Carbacol
Ca2+ Cálcio
CCE Curva concentração-efeito
CONT Controle
EDTA Ácido etilenodiaminotetracético
ET-1 Endotelina 1
gF Grama força
IgE Imunoglobulina E
IgG Imunoglobulina G
IL-4 Interleucina 4
IL-13 Interleucina 13
KCl Cloreto de potássio
LTs Leucotrienos
LTB4 Leucotrieno B4
LTC4 Leucotrieno C4
MLCK Miosina quinase de cadeia leve
n Número de experimentos
(NO) Óxido nítrico
(ROC) Canal de cálcio operado por receptor
SD24 Animal sensibilizado e desafiado 24h antes
da realização dos experimentos
SENS Animal sensibilizado
TNF-α Fator de necrose tumoral alfa
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Representação esquemática do tratamento com PTU, sensibilização e desafio antigênico com ovalbumina...050
Figura 2. (a) Efeito da sensibilização e desafio antigênico com ovalbumina (OVA) na resposta contrátil induzida pelo potássio em traquéias isoladas de ratos...079
(b) Efeito do hipotireoidismo na resposta induzida pelo potássio (KCl) em traquéias isoladas de ratos sensibilizados ou sensibilizados e desafiados à OVA...079
Figura 3. (a) Efeito da sensibilização e desafio antigênico com ovalbumina (OVA) na resposta contrátil ao cálcio que teve sua entrada induzida pelo KCl em traquéias isoladas de ratos...082
(b) Efeito do hipotireoidismo na resposta contrátil ao cálcio que teve sua entrada induzida pelo KCl em traquéias isoladas de ratos sensibilizados ou sensibilizados e desafiados à OVA...082
Figura 5. (a) Efeito da sensibilização e desafio antigênico com ovalbumina (OVA) na resposta contrátil ao cálcio que teve sua entrada induzida pelo carbacol em traquéias isoladas de ratos...088
(b) Efeito do hipotireoidismo na resposta contrátil ao cálcio que teve sua entrada induzida pelo carbacol em traquéias isoladas de ratos sensibilizados ou sensibilizados e desafiados à OVA...088
Figura 6. (a) Efeito da sensibilização e desafio antigênico com ovalbumina (OVA) na resposta induzida pela serotonina em traquéias isoladas de ratos...091
(b) Efeito do hipotireoidismo na resposta contrátil induzida pela serotonina em traquéias isoladas de ratos sensibilizados ou sensibilizados e desafiados à OVA...091
Figura 7. (a) Efeito da sensibilização e desafio antigênico com ovalbumina (OVA) na resposta contrátil ao cálcio que teve sua entrada induzida pela serotonina em traquéias isoladas de ratos...094
Figura 8. Efeito da adição de propiltiouracil (0,01 mg/ml), 1 minuto antes da obtenção das curvas concentração efeito, na resposta induzida pelo potássio (KCl) em traquéias isoladas de ratos sensibilizados ou sensibilizados e desafiados à OVA...097
Figura 9. Efeito da adição de propiltiouracil (0,01 mg/ml), 1 minuto antes da obtenção das curvas concentração efeito, na resposta induzida pelo carbacol em traquéias isoladas de ratos sensibilizados ou sensibilizados e desafiados à OVA...099
Figura 10. Efeito da adição de propiltiouracil (0,01 mg/ml), 1 minuto antes da obtenção das curvas concentração efeito, na resposta induzida pela serotonina em traquéias isoladas de ratos sensibilizados ou sensibilizados e desafiados à OVA...101
Figura 11. (a) Efeito do hipertireoidismo na resposta induzida pelo potássio (KCl) em traquéias isoladas de ratos sensibilizados ou sensibilizados e desafiados à OVA...103 (b) Efeito do hipertireoidismo na resposta induzida pelo potássio (KCl) em traquéias isoladas de ratos sensibilizados ou sensibilizados e desafiados à OVA...103
(b) Efeito do hipertireoidismo na resposta induzida pelo carbacol em traquéias isoladas de ratos sensibilizados ou sensibilizados e desafiados à OVA...106
Figura 13. (a) Efeito do hipertireoidismo na resposta induzida pela serotonina em traquéias isoladas de ratos sensibilizados ou sensibilizados e desafiados à OVA...109 (b) Efeito do hipertireoidismo na resposta induzida pela serotonina em traquéias isoladas de ratos sensibilizados ou sensibilizados e desafiados à OVA...109
Figura 14. Efeito do hipotireoidismo na hiperreatividade avaliada pela resposta contrátil induzida pelo antígeno, em traquéias isoladas de ratos sensibilizados ou sensibilizados e desafiados à OVA...112
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Efeito do estado da tireóide em parâmetros biológicos de ratos tratados com PTU (0,05%) durante 28 dias ou com T4 (5mg/mL) durante 7 ou 9 dias...078
Tabela 2a. CE50 e Resposta Máxima obtidas de curvas concentração-efeito ao potássio (KCl) realizadas com traquéias isoladas de ratos naive,
sensibilizados (SENS) e sensibilizados e desafiados (SD24)...080 Tabela 2b. CE50 e Resposta Máxima obtidas de curvas concentração-efeito ao
potássio (KCl) realizadas com traquéias isoladas de ratos sensibilizados (SENS), hipotireoideos sensibilizados (HIPO+SENS) e hipotireoideos sensibilizados e desafiados (HIPO + SD24)...081
Tabela 3a. CE50 e Resposta Máxima obtidas de curvas concentração-efeito ao cálcio (CaCl2) na presença de cloreto de potássio (KCl) e atropina, realizadas com traquéias isoladas de ratos naive, sensibilizados (SENS) e
Tabela 4a. CE50 e Resposta Máxima obtidas de curvas concentração-efeito ao carbacol (CCh) realizadas com traquéias isoladas de ratos naive,
sensibilizados (SENS) e sensibilizados e desafiados (SD24)...086 Tabela 4b. CE50 e Resposta Máxima obtidas de curvas concentração-efeito ao
carbacol (CCh) realizadas com traquéias isoladas de ratos sensibilizados (SENS), hipotireoideos sensibilizados (HIPO+SENS) e hipotireoideos sensibilizados e desafiados (HIPO +SD24)...087
Tabela 5a. CE50 e Resposta Máxima obtidas de curvas concentração-efeito ao cálcio (CaCl2) na presença de carbacol e nifedipina, realizadas com traquéias isoladas de ratos naive, sensibilizados (SENS) e sensibilizados e
desafiados (SD24)...089 Tabela 5b. CE50 e Resposta Máxima obtidas de curvas concentração-efeito ao cálcio (CaCl2) na presença de carbacol e nifedipina, realizadas com traquéias isoladas de ratos sensibilizados (SENS), hipotireoideos sensibilizados (HIPO+SENS) e hipotireoideos sensibilizados e desafiados (HIPO +SD24)...090
Tabela 6a. CE50 e Resposta Máxima obtidas de curvas concentração-efeito à serotonina (5-HT) realizadas com traquéias isoladas de ratos naive,
Tabela 7a. CE50 e Resposta Máxima obtidas de curvas concentração-efeito ao cálcio (CaCl2) na presença de serotonina, realizadas com traquéias isoladas de ratos naive, sensibilizados (SENS) e sensibilizados e desafiados
(SD24)...095 Tabela 7b. CE50 e Resposta Máxima obtidas de curvas concentração-efeito ao cálcio (CaCl2) na presença de serotonina, realizadas com traquéias isoladas de ratos sensibilizados (SENS), hipotireoideos sensibilizados (HIPO+SENS) e hipotireoideos sensibilizados e desafiados (HIPO +SD24)...096
Tabela 8. CE50 e Resposta Máxima obtidas de curvas concentração-efeito ao potássio (KCl) realizadas com traquéias isoladas de ratos sensibilizados (SENS), sensibilizados + propiltiouracil (SENS+PTU) e sensibilizados e desafiados + propiltiouracil (SD24 + PTU)...098
Tabela 9. CE50 e Resposta Máxima obtidas de curvas concentração-efeito ao carbacol (CCh) realizadas com traquéias isoladas de ratos sensibilizados (SENS), sensibilizados + propiltiouracil (SENS+PTU) e sensibilizados e desafiados + propiltiouracil (SD24+PTU)...100
Tabela 11a. CE50 e Resposta Máxima obtidas de curvas concentração-efeito ao potássio (KCl) realizadas com traquéias isoladas de ratos sensibilizados (SENS), hipertireoideos sensibilizados (HIPER7D+SENS) e hipertireoideos sensibilizados e desafiados (HIPER7D + SD24)...104 Tabela 11b. CE50 e Resposta Máxima obtidas de curvas concentração-efeito ao potássio (KCl) realizadas com traquéias isoladas de ratos sensibilizados (SENS), hipertireoideos sensibilizados (HIPER9D+SENS) e hipertireoideos sensibilizados e desafiados (HIPER9D+SD24)...105 Tabela 12a. CE50 e Resposta Máxima obtidas de curvas concentração-efeito ao carbacol (CCh) realizadas com traquéias isoladas de ratos sensibilizados (SENS), hipertireoideos sensibilizados (HIPER7D+SENS) e hipertireoideos sensibilizados e desafiados (HIPER7D+SD24)...107 Tabela 12b. CE50 e Resposta Máxima obtidas de curvas concentração-efeito ao carbacol (CCh) realizadas com traquéias isoladas de ratos sensibilizados (SENS), hipertireoideos sensibilizados (HIPER9D+SENS) e hipertireoideos sensibilizados e desafiados (HIPER9D+SD24)...108 Tabela 13a. CE50 e Resposta Máxima obtidas de curvas concentração-efeito à
serotonina (5-HT) realizadas com traquéias isoladas de ratos sensibilizados (SENS), hipertireoideos sensibilizados (HIPER7D+SENS) e hipertireoideos sensibilizados e desafiados (HIPER7D + SD24)...110 Tabela 13b. CE50 e Resposta Máxima obtidas de curvas concentração-efeito à
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO...024
1.1Anatomofisiologia das vias aéreas...027
1.2 O processo asmático...027
1.2.1 Definição e desenvolvimento...027
1.2.2 Base inflamatória da asma...028
1.2.3 Resposta asmática precoce...030
1.2.4 Resposta asmática tardia...031
1.2.5 Modelos animais de asma...034
1.3Glândula tireóide...037
1.3.1Biossíntese e secreção dos hormônios tireoideanos...038
1.4 Hormônios tireoideanos e asma...040
2 OBJETIVOS...043
2.1 Objetivo Geral...044
2.2 Objetivos Específicos...044
3 MATERIAIS E MÉTODOS...045
3.1 MATERIAIS...046
3.1.1 Animais...046
3.1.2 Drogas e soluções...046
3.2 MÉTODOS...048
3.2.1 Indução do Hipotireoidismo...048
3.2.2 Indução do Hipertireoidismo...048
3.2.3 Sensibilização e bronco-provocação antigênica...048
3.2.4 Avaliação da contratilidade da musculatura traqueal...051
3.2.5 Curvas concentração-efeito para o carbacol, serotonina e potássio...052
3.2.6 Curvas concentração-efeito para o cálcio...053
3.2.7 Resposta contrátil ao antígeno...053
3.3 ANÁLISE ESTATÍSTICA...054
4 RESULTADOS...055
4.1 Efeito do tratamento com propiltiouracil (PTU) ou com L-Tiroxina (T4) em parâmetros biológicos monitorados em ratos ...056
4.2 Hiperreatividade em traquéia isolada de rato para a resposta contrátil induzida por altas concentrações de potássio após sensibilização e desafio antigênico com OVA...056
4.3 Efeito do hipotireoidismo no desenvolvimento de hiperreatividade em traquéia isolada de ratos sensibilizados e desafiados à OVA na resposta contrátil induzida por altas concentrações de potássio. ...057
4.5 Efeito do hipotireoidismo no desenvolvimento de hiperreatividade em traquéia isolada de ratos sensibilizados e desafiados à OVA na resposta contrátil induzida pela adição de Ca2+ em preparações mantidas em solução despolarizante zero Ca2+...059
4.6 Hiperreatividade da traquéia isolada de rato para a resposta contrátil induzida por carbacol após sensibilização e desafio antigênico com OVA...060
4.7 Efeito do hipotireoidismo no desenvolvimento de hiperreatividade em traquéia isolada de ratos sensibilizados e desafiados à OVA na resposta contrátil induzida pelo carbacol...060
4.8 Hiperreatividade da traquéia isolada de rato para a resposta contrátil induzida pela adição de Ca2+ em preparações mantidas em solução zero Ca2+ na presença de carbacol após sensibilização e desafio antigênico com OVA...061
4.9 Efeito do hipotireoidismo no desenvolvimento de hiperreatividade em traquéia isolada de ratos sensibilizados e desafiados à OVA na resposta contrátil induzida pela adição de Ca2+ em preparações mantidas em solução zero Ca2+ na presença de carbacol...062
4.10 Hiperreatividade da traquéia isolada de rato para a resposta contrátil induzida por serotonina após sensibilização e desafio antigênico com OVA...063
4.11 Efeito do hipotireoidismo no desenvolvimento de hiperreatividade em traquéia isolada de ratos sensibilizados e desafiados à OVA na resposta contrátil induzida pela serotonina...064
4.13 Efeito do hipotireoidismo no desenvolvimento de hiperreatividade em traquéia isolada de ratos sensibilizados e desafiados à OVA na resposta contrátil induzida pela adição de Ca2+ em preparações mantidas em solução zero Ca2+ na presença de serotonina...066
4.14 Efeito do propiltiouracil (PTU, 0,01mg/ml), adicionado ao líquido de incubação, na resposta contrátil induzida por altas concentrações de potássio em traquéia isolada de ratos sensibilizados (SENS) e sensibilizados e desafiados (SD24) à OVA... 067
4.15 Efeito do propiltiouracil (PTU, 0,01mg/ml), adicionado ao líquido de incubação, na resposta contrátil induzida pelo carbacol em traquéia isolada de ratos sensibilizados ou sensibilizados e desafiados à OVA...068
4.16 Efeito do propiltiouracil (PTU, 0,01mg/ml), adicionado ao líquido de incubação, na resposta contrátil induzida pela serotonina em traquéia isolada de ratos sensibilizados ou sensibilizados e desafiados à OVA...069
4.17 Efeito do hipertireoidismo (T4, 0,5 mg/kg, durante 7 dias) no desenvolvimento de hiperreatividade em traquéias isoladas de ratos sensibilizados e desafiados à OVA na resposta contrátil induzida por altas concentrações de potássio...070
4.18 Efeito do hipertireoidismo (T4, 0,5 mg/kg, durante 9 dias) no desenvolvimento de hiperreatividade em traquéia isolada de ratos sensibilizados e desafiados à OVA na resposta contrátil induzida por altas concentrações de potássio...071
4.20 Efeito do hipertireoidismo (T4, 0,5 mg/kg, durante 9 dias) no desenvolvimento de hiperreatividade em traquéia isolada de ratos sensibilizados e desafiados à OVA na resposta contrátil induzida pelo carbacol...073
4.21 Efeito do hipertireoidismo (T4, 0,5 mg/kg, durante 7 dias) no desenvolvimento de hiperreatividade em traquéia isolada de ratos sensibilizados e desafiados à OVA na resposta contrátil induzida pela serotonina... 074
4.22 Efeito do hipertireoidismo (T4, 0,5 mg/kg, durante 9 dias) no desenvolvimento de hiperreatividade em traquéia isolada de ratos sensibilizados e desafiados à OVA na resposta contrátil induzida pela serotonina... 075
4.23 Efeito do hipotireoidismo na resposta contrátil induzida pela apresentação do antígeno OVA em traquéia isolada de ratos apenas sensibilizados ou sensibilizados e desafiados à OVA ...076
1.1 ANATOMOFISIOLOGIA DAS VIAS AÉREAS
Podemos classificar as vias aéreas quanto a sua localização em superiores e inferiores. As primeiras iniciam-se nas fossas nasais prolongando-se até a laringe e porção superior da traquéia, e as inferiores compreendem a porção inferior da traquéia e suas ramificações, brônquios, bronquíolos indo até os alvéolos.
A traquéia inicia-se logo abaixo da laringe, possuindo entre outras funções aquela de tubo condutor de ar aos pulmões. Apresenta duas porções uma cervical e outra torácica apresentando como característica um número variável de anéis (16 a 20) ou semi-anéis cartilaginosos sobrepostos e em forma de C ligados pela membrana cricotraqueal. A região posterior da traquéia caracteriza-se por ser composta basicamente de músculo liso, o músculo liso traqueal, que tensiona as bordas da cartilagem e evita que elas se separem, uma vez que os semi-anéis cartilaginosos não se fecham nesta região. Isso promove uma certa motilidade da porção posterior. A membrana cricotraqueal reveste externamente toda a traquéia e vai unindo os anéis até a carina, local onde a traquéia se divide em brônquio principal direito e esquerdo
(STEPHENS, 2002).
As vias aéreas vão assim se subdividindo em vários ramos, tornando-se cada vez mais curtas, com menor diâmetro e maior número à medida que penetram no pulmão. A traquéia é denominada de via respiratória de primeira geração, e os dois brônquios principais direito e esquerdo de segunda geração e assim sucessivamente. Existem cerca de 20 a 25 gerações até que o sistema tubular das vias aéreas alcance os alvéolos.
uma lâmina própria), uma camada submucosa, uma camada de músculo liso com peças cartilaginosas e uma camada adventícia. Existem três tipos comuns de células no epitélio traqueobrônquico: ciliadas, caliciformes e basais (ROSS et al., 1993).
As células ciliadas são encontradas em todo trato respiratório até os bronquíolos respiratórios e promovem o batimento ciliar que visa eliminar a secreção e materiais estranhos à árvore brônquica. As células caliciformes estão localizadas entre as células ciliadas e têm a função de produzir muco, que vem a se somar com aquele produzido por glândulas submucosas das vias de condução. Por fim as células basais que funcionam como fonte de novas células, estando localizadas sobre a lâmina basal.
A cada ramificação, os brônquios vão perdendo gradativamente componentes de sua parede, com isso observa-se a ausência de cartilagens e de glândulas submucosas nos bronquíolos da zona de condução. Nestes bronquíolos o epitélio e a musculatura são os principais constituintes. Já os bronquíolos respiratórios pertencentes à zona de respiração são formados por epitélio cilíndrico e cúbico. Na porção da traquéia e dos brônquios não ocupadas por lâminas de cartilagem, as paredes são predominantemente formadas por músculo liso, com exceção dos bronquíolos respiratórios que apresentam apenas algumas fibras musculares lisas. O saco alveolar formado por um conjunto de alvéolos, localiza-se na extremidade distal das vias aéreas da zona respiratória e é responsável pelas trocas gasosas. As paredes dos álveolos são delgadas e compostas por três tipos de células: pneumócitos tipo I, pneumócitos tipo II e células em escova.
inferiores até a zona de condução. A traquéia é revestida por uma camada mucosa especial chamada mucosa respiratória que possui epitélio estratificado ciliado.
1.2 O PROCESSO ASMÁTICO
1.2.1 Definição e desenvolvimento
A asma é uma patologia determinada pela interação de fatores genéticos e ambientais levando a um processo de inflamação crônica e complexa das vias aéreas caracterizada por obstrução variável e reversível espontânea ou farmacologicamente, (embora não completamente em todos os pacientes). A asma também desencadeia hiperreatividade, definida como resposta exacerbada das vias aéreas a estímulos não alérgicos, que envolve a ativação de diversas células inflamatórias e a liberação de diversos mediadores inflamatórios (BARNES et al., 1998).
A British Toracic Society define asma como sendo uma doença inflamatória
1.2.2 Base inflamatória da asma
A limitação do fluxo aéreo, que corresponde ao principal componente da asma brônquica, apresenta como principais características fisiopatológicas: hipertrofia e contração do músculo liso, vasodilatação, hipersecreção e remodelamento brônquico. O edema é resultado da vasodilatação e congestão da microvascularização brônquica que promove o aumento na exsudação de plasma e macromoléculas para o interstício e luz das vias aéreas. Ocorre ainda infiltração de células inflamatórias nos brônquios, principalmente por eosinófilos, linfócitos, mastócitos e macrófagos com descamação do epitélio brônquico e espessamento da membrana basal reticular. A hipersecreção mucosa caracteriza-se por hipertrofia das glândulas mucosas, aumento das células caliciformes, com aumento de secreção intraluminal, e obstrução das vias aéreas por muco. Devido ao aumento da massa muscular que envolve as vias aéreas, por hipertrofia e hiperplasia muscular, temos o conseqüente encurtamento da musculatura lisa, facilitando o processo contrátil.
A característica macroscópica mais importante é a hiperinsuflação pulmonar com áreas focais de atelectasias decorrentes de obstrução causada pela oclusão de brônquios e bronquíolos por muco espesso gelatinoso. A presença de muco indica deficiência crônica no sistema secretor de muco ou no clearance mucociliar, ou em
A maioria dos pacientes com asma apresenta um comprometimento mais acentuado nas pequenas vias aéreas, entre 2 e 6 mm de diâmetro. Os brônquios apresentam com freqüência hiperplasia de células caliciformes, metaplasia e hipertrofia de glândulas mucosas, ectasia de ductos glandulares e desnudamento das células ciliadas resultando em perda da função ciliar, favorecendo a presença de muco intraluminal. Dados das últimas três décadas apresentam evidências de que o pulmão distal que inclui as pequenas vias aéreas menores de 2mm de diâmetro e o parênquima pulmonar, contribui também para a patogênese da asma (Sanerkin, Evans et al., 1965).
De acordo com a definição de asma, os sintomas estão associados a uma variável limitação ao fluxo aéreo, que pode ser revertida espontaneamente ou sob efeito do tratamento. Todavia, é por demais conhecido que a asma determina uma inflamação crônica das vias aéreas, com remodelamento estrutural na parede das vias aéreas que pode ser irreversível mesmo com o tratamento, resultando em obstrução fixa irreversível.
1.2.3 Resposta asmática precoce
Como já é conhecida na asma alérgica, a provocação bronquial com inalação de antígenos resulta em rápida broncoconstrição com resposta máxima em 15 a 30 minutos após o desafio e resolvida em 1 a 3 horas (PEPYS et al., 1975). O time-course da
resposta asmática precoce lembra uma reação de hipersensibilidade imediata como a que ocorre em outros locais. Além disso, o grau de participação dos mastócitos torna evidente o aumento de ativação destas células, caracterizando-o como sendo o principal evento da asma precoce tal como ocorre na hipersensibilidade imediata (HOLGATE et al., 1986).
Imediatamente após a inalação do alérgeno, os mastócitos localizados nos pulmões e na mucosa nasal sensibilizados previamente pela IgE, são ativados pela ligação cruzada do antígeno aos receptores IgE da superfície de sua membrana celular, resultando na liberação de grânulos por difusão passiva. Para a espécie humana, e outros mamíferos o mediador mais conhecido liberado pelos mastócitos é a histamina, que se encontra presente e participa na reação alérgica imediata, desenvolvendo vasodilatação com aumento da permeabilidade vascular, contração da musculatura lisa brônquica e intestinal, e aumento da secreção de muco, por atuar no receptor H1 (ROSENTHAL et
al., 1977). Sua ação é curta, pois a histamina é rapidamente metabolizada em 1 a 2
minutos, sendo 70% metabolizada pela histamina-N-metiltransferase e 30% pela diamino-oxidase (histaminase). O pré-tratamento de pacientes asmáticos com antagonistas anti-H1, altamente potentes e seletivos, atenua a fase precoce da asma (Howarth & Holgate, 1985; Rafferty et al., 1986).
armazenadas nos grânulos (histamina e fatores quimiotáxicos para eosinófilos); moléculas formadas durante o processo de desgranulação (superóxidos, leucotrienos, prostaglandinas, adenosina); proteínas recentemente sintetizadas, transcritas horas após a iniciação da desgranulação (interleucinas, fatores de crescimentos de colônias de macrófagos); material macromolecular derivado dos “grânulos matrix” que podem ter seus efeitos perpetuados por um período prolongado, após a desgranulação (triptase, heparina, quimase, catepsina G, carboxipeptidase, peroxidase e fatores inflamatórios) (Kaliner, M.A et al., 1999).
A resposta dos mediadores liberados como conseqüência do desafio antigênico pode ser inibida pelo pré-tratamento com drogas antialérgicas, cromoglicato de sódio e agonistas adrenérgicos beta-2 como salbutamol (Church, 1982; Howarth et al., 1985).
Outras células também podem participar na resposta asmática precoce como os macrófagos (Joseph et al., 1981), eosinófilos (Capron et al., 1981) e plaquetas (Joseph et al., 1983).
1.2.4 Resposta asmática tardia
As primeiras descrições da resposta asmática tardia datam de 1873 quando o pesquisador Blackley em uma exposição acidental de pólen no laboratório observou que os sintomas da asma podem ocorrer horas após a inalação do antígeno podendo persistir por alguns dias. Em 1970, Altounyan observou que, após a inalação do alérgeno, ocorria gradual aumento da resposta bronquial para histamina. Posteriormente, Cockcroft et al.,
Em geral, os fatores que promovem a reação alérgica podem diminuir após uma resposta imediata ou avançar para uma resposta asmática tardia não clara. Estas evidências sugerem que os níveis de anticorpos circulantes principalmente de IgE podem ser importantes, pois a resposta tardia ocorre mais provavelmente em indivíduos com alto grau de sensibilização ao alérgeno (Robertson et al., 1974). A magnitude da
resposta precoce e portanto o nível de reatividade das vias aéreas, parece também ser importante no desenvolvimento subseqüente da resposta tardia (Hargreave et al., 1974;
Cockcroft et al., 1974). Pacientes asmáticos com alta reatividade nas vias aéreas tem
mais probabilidade de desenvolver a resposta asmática tardia.
Na fase de inflamação crônica da mucosa das vias aéreas, característica da reposta tardia, temos uma confluência de linfócitos T, mastócitos, eosinófilos e basófilos, associados a um estado de hiperreatividade brônquica. Esse processo de asma alérgica crônica consta com a contínua ativação de mastócitos na mucosa brônquica, como demonstrado pela presença de triptase e histamina no líquido do lavado broncoalveolar; pelas características de desgranulação quando vistas pela microscopia eletrônica; e pelas evidências de síntese contínua de IL-4 e IL-5. Secretam um grande número de mediadores, capazes de explicar não só os sintomas de asma, mas todas as características patológicas presentes na parede brônquica.
Um achado típico de pacientes com asma é o recrutamento, ativação e infiltração de eosinófilos nas paredes edemaciadas dos microvasos e tecidos perivasculares,
determinando a liberação de proteínas pró-inflamatórias tóxicas. Este intenso recrutamento de células inflamatórias está associado a mudanças estruturais vasculares mais intensas. Protrusões musculares intra-arteriolas presumivelmente regulam o fluxo sanguíneo na rede capilar e/ou sinusóides. Esta função pode sofrer alterações quando ocorre o aparecimento do processo de remodelamento da asma (Salvato et al., 2001).
Ocorre infiltrado inflamatório no epitélio, lâmina própria e submucosa, por eosinófilos, células plasmáticas, fibroblastos (células-chave no processo de reparo tecidual), predominando os eosinófilos que respondem por 5 a 50% do infiltrado celular. Mastócitos em número considerável são encontrados na submucosa, no epitélio e mesmo na luz brônquica, onde interagem com alérgenos inalados antes mesmo de penetrarem no epitélio. Além disso, a asma está associada a uma baixa taxa de apoptose, a qual está em parte relacionada ao aumento da expressão do GM-CSF (fator de estimulação de colônias de macrófagos e granulócitos) que parece ter um importante papel regulador na apoptose celular (Vrugt B.,Wilson S. et al., 2000).
O dano estrutural do epitélio brônquico é uma das características mais descritas em estudos post-mortem de pacientes com asma grave. As células do epitélio colunar
Assim, o processo inflamatório parece ser fundamental para o desenvolvimento do processo em seres humanos, estando evidente que existe uma grande variedade de tipos celulares e mediadores que contribuem de forma importante para o desenvolvimento da resposta asmática tardia. Elas são responsáveis pela broncoconstrição e pelo desenvolvimento de uma hiperreatividade inespecífica cuja associação com a reposta asmática tardia ainda não está bem esclarecida (Hutson, 1989).
1.2.5 Modelos animais de asma
Os estudos da fisiopatologia e mecanismos envolvidos no desenvolvimento da asma foram realizados em sua maioria a partir de modelos experimentais. É grande a diversidade de modelos animais, que são utilizados visando mimetizar as alterações observadas durante o processo asmático. A imunização a um dado antígeno e sua reapresentação constituem a base da maioria dos modelos (Jancar et al., 1997). Assim,
podemos estudar tanto in vivo como in vitro a resposta das vias aéreas à reapresentação
ao antígeno. Em modelos animais a sensibilização a um alérgeno específico acarreta o desenvolvimento de processo inflamatório similar ao encontrado em pulmões de pacientes asmáticos.
Primariamente, a resposta asmática tardia foi descrita e estudada em um modelo desenvolvido em coelhos por Shampain et al. em 1982. Os coelhos eram, inicialmente,
sensibilizados através de injeções intraperitoniais de soluções contendo proteínas isoladas de Alternaria tenius, em dois grupos de animais. No primeiro grupo a aplicação
aplicação era efetuada 7 dias após o nascimento, levando a produção de IgE e IgG. Com a broncoprovocação dos dois grupos através da inalação do antígeno, foi observado que os coelhos que produziram preferencialmente apenas IgE desenvolveram obstrução precoce e tardia das vias aéreas. Os resultados obtidos sugeriram que imunoglobulinas IgE antígeno-específicas são necessárias para iniciar o processo de desenvolvimento da asma tardia induzida pelo antígeno e que, contrariamente, a IgG antígeno-especifica não estava associada ao processo asmático tardio (Behrens et al., 1984).
Outro estudo foi realizado para se analisar a resposta asmática tardia. Ratos Brow-Norway foram ativamente sensibilizados através de injeção subcutânea de ovoalbumina e, subseqüentemente, submetidos ao desafio antigênico por inalações. Os sintomas detectados foram, em alguns aspectos, semelhantes àqueles observados para pacientes humanos. Assim, no modelo utilizado, a resposta broncoconstritora tardia ocorreu mesmo na ausência da reação de resposta anafilática imediata. Contudo, o desenvolvimento da resposta tardia não estava associada a alterações na reatividade das vias aéreas (Eidelman et al., 1988). Ratos Wistar ativamente sensibilizados com
ovoalbumina também constituem um modelo animal utilizado na investigação do processo asmático (Bellofiore & Marin, 1988; Watanabe & Mishima, 1990). A provocação das vias aéreas com ovoalbumina, nesta situação, leva claramente ao aparecimento das duas fases aguda e tardia (Lissen et al., 1991; Martin et al., 1993;
Vianna & Garcia-Leme, 1995).
Um modelo animal que vem sendo utilizado há alguns anos pelo seu mimetismo da asma humana, é o desenvolvido em cobaias (Cavia porcellus, também conhecido
como ‘porquinho da índia’), principalmente devido à semelhança existente entre as cobaias e os seres humanos no que tange às respostas contráteis e relaxantes a várias substâncias, ao desenvolvimento de mediadores químicos similares em respostas induzidas por antígenos (Collier & James, 1967) e as alterações histopatólogicas observadas ao nível dos pulmões após o desafio antigênico (Kallos & Kallos, 1984). O modelo de indução imunológica das vias aéreas pela administração do alérgeno é freqüentemente utilizado em cobaias (Capaz et al., 1993). Cobaias ativamente
sensibilizadas apresentam reação anafilática que pode ser letal quando desafiadas com o antígeno específico. Esta reação foi descrita pela primeira vez em 1910 por Auer e Lewis e estava associada a uma grave broncoconstrição (Hutson, 1989).
No modelo com cobaias descrito por Wieslander et al. (1985), a resposta
asmática tardia foi relativamente pequena quando comparada com a magnitude da resposta asmática precoce. Neste modelo os animais foram sistematicamente sensibilizados com ovalbumina para produzirem anticorpos dos tipos IgE e IgG, e desafiados com instilação de ovalbumina associada a grânulos de sefarose. O lavado bronco-alveolar dos animais revelou aumento no número de neutrófilos e eosinófilos. Utilizando o mesmo procedimento Anderson et al., (1988), revelaram importante
pode exercer papel importante no desenvolvimento da resposta asmática tardia e que tal fato pode ocorrer como resultado da ativação de células inflamatórias.
Em outro modelo descrito, cobaias foram sensibilizadas com uma mistura de extrato de Ascaris suum e hidróxido de alumínio, e posteriormente desafiados através da
inalação deste extrato (Lijima et al., 1987). Os resultados demonstraram que a
quantidade de IgE antígeno-específico foi significativamente maior em animais que desenvolveram resposta tardia quando comparada à resposta obtida para os animais que exibiram somente a resposta imediata. Nos animais que apresentaram a resposta tardia também foi observada infiltração acentuada de eosinófilos na parede das vias aéreas. Entretanto, a desvantagem desse modelo consiste no fato de a resposta asmática tardia ocorrer apenas em menos da metade dos animais estudados.
1.3 GLÂNDULA TIREÓIDE
A Tireóide foi a primeira estrutura a ser reconhecida como glândula endócrina. A correlação entre a ausência ou o aumento de tamanho da glândula tireóide e a ocorrência de alterações biológicas em sítios distantes do organismo permitiu inferir que a glândula produzia substâncias que poderiam afetar alvos distantes. Assim, o hormônio tireoideano regularia os processos metabólicos na maioria dos órgãos e seria essencial para o desenvolvimento normal do sistema nervoso.
1.3.1 Biossíntese e secreção dos hormônios tireoideanos
Os hormônios tireoideanos são peculiares no sentido de que incorporam um elemento inorgânico, o iodo, numa estrutura orgânica formada por duas moléculas do aminoácido tirosina. Os produtos da glândula tireóide são conhecidos como iodotironinas. O principal produto é a 3,5,3',5'-tetraiodotironina, conhecida como tiroxina, muitas vezes designada por T4. Essa molécula funciona, em grande parte, como pró-hormônio circulante. A 3,5,3'-triiodotironina conhecida simplesmente como triiodotironina e designada por T3, é secretada em quantidades muito menores. Entretanto, esta é responsável por praticamente toda a atividade de hormônio tireóideo nas células alvo sendo, na realidade, produzida em sua maior parte nos tecidos periféricos a partir do pró-hormônio T4.
Existem três etapas principais envolvidas na síntese dos hormônios tireoideanos: (1) captação e concentração do iodeto no interior da glândula, (2) oxidação e incorporação do iodeto no anel fenol da tirosina, e (3) acoplamento de duas moléculas de tirosina iodadas para formar T4 ou T3. De interesse particular é o fato de que nem a iodetação nem o acoplamento ocorrem com tirosina livre em solução. Com efeito, as moléculas de tirosina devem ser inicialmente incorporadas por ligações peptídicas típicas na proteína conhecida como tireoglobulina. A tireoglobulina que é realmente iodada sobre tirosinas específicas.
NIEPOMNISZCZE, 1977). Este é o provável mecanismo pelo qual a tireóide extrai iodeto mesmo quando as concentrações plasmáticas são baixas.
A tireoglobulina é uma grande glicoproteína sintetizada sob forma de duas unidades peptídicas separadas, que se combinam e, a seguir, sofrem glicolização durante sua migração para o aparelho de Golgi. A proteína completa, incorporada em pequenas vesículas, dirige-se para a membrana apical e daí, para o lúmen adjacente do folículo.
No interior do lúmem folicular, o iodeto é incorporado à tireoglobulina. Um complexo enzimático, conhecido como tireóide peroxidase, liga-se à membrana apical. Essa enzima catalisa simultaneamente a oxidação do iodeto e sua incorporação no anel de benzeno da tirosina no lugar de um hidrogênio. A iodetação resulta na formação de monoiodotirosina (MIT) ou diiodotirosina (DIT).
A etapa de acoplamento também é realizada pela peroxidase ao justapor uma molécula de DIT com outra molécula de DIT no interior da tireoglobulina, para formar T4, ou com uma molécula de MIT, para formar T3.
1.4 Hormônios tireoideanos e asma
Existem várias evidências, na literatura, de que o hipertireoidismo, presente ou induzido pelo tratamento de reposição com hormônios tireoideanos, leva ao recrudescimento do estado asmático. Assim, está mais ou menos bem estabelecido que o hipertireoidismo é um fator agravante e está intimamente associado com o estado asmático. (ZACHARISEN & FINK, 2000). LUONG & NGUYEN (2000) relataram uma situação em que pacientes hipertireóideos, alguns meses após terem apresentado problemas como conseqüência do hipertireoidismo, começaram a desenvolver crises asmáticas. Relataram ainda que a condição dos pacientes, no que tange as crises asmáticas, melhorava quando o estado eutireóideo era atingido após o tratamento medicamentoso.
Não é raro, o hipertireoidismo recrudescer o estado do paciente que apresenta crises asmáticas, tanto assim que normalmente é recomendado a pacientes asmáticos, onde existe um curso de doença problemático e desfavorável, realização de exames visando verificar a atividade e o funcionamento da glândula tireóide (JEREZ et al., 1998).
que quando estas células eram tratadas só com o alérgeno específico ou só com (T4). Foi sugerido então, em função destes resultados, que este incremento na produção de ânion superóxido induzido por (T4), poderia ser um fator importante no mecanismo da exacerbação da asma freqüentemente encontrada em pacientes hipertireoideos.
Manzzolli et al. (1999) trabalhando com um modelo animal de hipotireoidismo em ratos, estudaram os efeitos da tireoidectomia cirúrgica na migração celular desencadeada pelo desafio antigênico, que consiste na inalação de ovalbumina. Estes autores verificaram que animais desafiados à ovalbumina 50 dias após o procedimento cirúrgico, apresentavam uma diminuição significativa na migração celular associada a uma redução nos níveis séricos de IgE, sendo estes efeitos revertidos pela reposição hormonal, o que os levou a sugerir o envolvimento dos hormônios tireoideanos na regulação da produção de IgE.
O presente trabalho foi elaborado visando detectar se além do envolvimento dos hormônios tireoideanos com o processo de migração celular descrito acima, também o hipotireoidismo poderia interferir na resposta contrátil da musculatura lisa das vias aéreas. Uma vez que na crise asmática, a broncoconstrição é o fenômeno mais evidente e característico.
2.1 Objetivo Geral
• Avaliar a possível participação dos hormônios tireoideanos na hiperreatividade induzida pela resposta anafilática em traquéias isoladas de ratos.
2.2 Objetivos Específicos
• Descrever os efeitos dos hormônios tireoideanos na hiperreatividade induzida pela sensibilização e desafio antigênico com ovalbumina na resposta contrátil ao potássio, carbacol ou serotonina em traquéias isoladas de ratos.
3.1 Materiais
3.1.1 Animais
Em todos os experimentos realizados foram utilizados ratos (Rattus novergicus)
machos da variedade Wistar, pesando entre 200 e 250 g, provenientes do Biotério Central bem como do Biotério Setorial do Departamento de Fisiologia e Farmacologia da Faculdade de Medicina, ambos da Universidade Federal do Ceará. Os animais foram mantidos em gaiolas, em grupos de 6, durante uma semana no Biotério do Laboratório de Farmacologia do Aparelho Respiratório, em períodos de claro/escuro de 12 horas, para ambientação e aclimatação. Aos animais foram fornecidas água e ração ad libitum.
3.1.2 Drogas e Soluções
Foram utilizadas as seguintes drogas e reagentes químicos: carbamilcolina (carbacol), ovalbumina (OVA, chicken egg albumin, grade IV), 5-hidroxitriptamina
(5-HT; serotonina), adquiridos da companhia Sigma Chemical Co. (St Louis, MO, EUA). Cloreto de cálcio, cloreto de potássio, hidrato de cloral, hidróxido de alumínio, Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), hidróxido de sódio, L-tiroxina (free acid), foram
todos de pureza analítica, provenientes das empresas Quimibras, Merck, Cromato Produtos Químicos e Sanofi Winthorp. O propiltiouracil (PTU) foi gentilmente cedido pela empresa Biolab Sanus Farmacêutica (São Paulo, Brasil).
foi preparada pela simples omissão do CaCl2 no momento de sua preparação e incremento da concentração de NaCl para manter a osmolaridade da solução. Logo a composição (em mmol/L) foi NaCl 122,4; KCl 4,7; KH2PO4 1,2; MgSO4.7H2O 1,2; NaHCO3 25,0; Glicose 11,0. Adicionou-se também 10-5 M de EDTA.
3.1.3 Equipamentos
3.2 MÉTODOS
3.2.1 Indução do Hipotireoidismo
Para inibir a atividade da glândula tireóide, propiltiouracil (PTU) foi administrado por via oral, dissolvido na água de bebida dos animais durante um período de 4 semanas (28 dias). A concentração de PTU na água de bebida foi 0,05% (PANTOS et al., 2003). A solução foi preparada no momento da administração aos animais. O controle deste grupo constituiu-se de animais que ingeriram água isenta de PTU (Figura 1).
3.2.2 Indução do Hipertireoidismo
Hipertireoidismo foi induzido por meio de injeções subcutâneas de L - tiroxina (T4) diluída em solução salina (0,001N NaOH em NaCl 0,9%) 0,5 mg/kg de peso corpóreo às 09:00 horas, diariamente durante 7 ou 9 dias. Os experimentos foram realizados 24 h após a última injeção (Figura 1). Ratos controle foram injetados com solução salina alcalina nos mesmos períodos (HONDA ET AL, 2003).
3.2.3 Sensibilização e bronco-provocação antigênica
Alguns animais sensibilizados foram submetidos, imediatamente após o término do período de sensibilização, a bronco-provocação antigênica 24 horas antes dos experimentos. Para tal, os animais foram colocados em uma caixa acrílica medindo 20 x 30 x 21 cm, acoplada a um nebulizador ultrassônico e expostos a nebulização de OVA durante 30 minutos. Este período de 30 minutos foi dividido em duas sessões seqüenciais de 15 minutos cada. Na primeira sessão foi utilizada OVA na concentração de 1 mg/ml e na segunda sessão de 5 mg/ml,.este grupo de animais recebeu a denominação de desafiado. (Figura 1).
Os animais controle receberam no momento da sensibilização injeções intraperitoneais de solução salina, e aqueles que serviram de controle para os grupos desafiados, além de injeções de solução salina no momento da sensibilização, foram submetidos também 14 dias após, a duas inalações sucessivas de solução salina de 15 minutos cada, totalizando 30 minutos. Este grupo de animais recebeu a denominação de
Figura 1 -Representação esquemática do tratamento com PTU ou com L- tiroxina
3.2.4 Avaliação da contratilidade da musculatura traqueal
No dia da realização dos experimentos, os animais foram inicialmente anestesiados pela administração intraperitoneal de hidrato de cloral (400 mg/Kg) e a seguir, foram colocados na posição de decúbito dorsal para a excisão da traquéia. Após o sacrifício dos animais por exsanguinação, através da secção da artéria aorta abdominal, a região cérvico-toráxica anterior foi aberta cirurgicamente e a traquéia foi então, removida cuidadosamente e levada a uma placa de petri contendo solução de Krebs-Henseleit aerada com mistura carbogênica (95% O2/5% CO2). Após sua remoção, a traquéia foi cortada em segmentos com aproximadamente 0,5 cm de comprimento. Após limpeza e remoção de tecidos adjacentes, a traquéia foi cortada sob a forma de anéis com aproximadamente 0,5 mg de comprimento e os segmentos traqueais foram montados em cubas para tecidos isolados com capacidade de 10 ml contendo solução de Krebs-Henseleit aerada com mistura carbogênica sendo mantidos à temperatura de 36,5 ± 0,2 °C. A tensão inicial aplicada foi de 1 gF e mantida neste nível por um período de 50 minutos para que se atingisse o equilíbrio do sistema. Neste período, a tensão era ajustada a 1 gF, a cada 15 minutos, sendo também o líquido nutritivo trocado.
Contrações isométricas foram registradas por intermédio de um transdutor de força, acoplado a uma placa de aquisição de dados analógico-digital. Os dados provenientes do transdutor eram transferidos e registrados em um microcomputador, que permitia a obtenção, em gramas de tensão, da força gerada na contração desenvolvida pela preparação. O registro das contrações musculares foi realizado através de programa específico inteiramente desenvolvido em nosso laboratório.
montados para o ensaio farmacológico era alternada em cada sessão, ou seja, caso na sessão anterior houvesse sido montada inicialmente uma traquéia controle e uma experimental, nesta sessão a ordem era invertida, a traquéia do grupo experimental era montada primeiro. Este procedimento proporcionava também alternância dos sistemas utilizados para registro das contrações (cuba para órgão isolado + transdutor + canal do “software” utilizado), pois sempre se iniciava a montagem pelo sistema e canal A e a seguir pelo B. Assim, se em uma sessão o sistema “A” registrasse o grupo experimental e o “B” o controle, na sessão seguinte ocorria à inversão registrando o “B” o experimental e “A” o controle. A intenção destes procedimentos era fazer com que as condições experimentais (líquido de incubação, solução dos agonistas e antagonista utilizadas etc.) fossem as mesmas para os dois grupos. A alternância dos sistemas prevenia, eventuais diferenças entre os dois sistemas de registro, apesar de a calibração mostrar perfeita equivalência entre os dois canais.
3.2.5 Curvas concentração-efeito para o carbacol, serotonina e potássio
logarítmica). Todas as traquéias isoladas foram utilizadas em apenas uma sessão experimental.
3.2.6 Curvas concentração-efeito para o cálcio
Após o período de equilíbrio de 50 minutos, em solução de Krebs-Henseleit tal como descrito acima, o líquido nutritivo foi trocado por solução de Krebs-Henseleit modificada sem cálcio e com EDTA (10-5 M), nifedipina (10-6 M) e atropina (10-6 M). Cinco minutos após a troca do líquido de incubação, foi obtida a resposta contrátil inicial induzida pelo carbacol (10-5 M), pela serotonina (10-5 M) ou pelo KCl (60 mM). Após a estabilização da resposta com a formação do “plateau” foi adicionado CaCl2 em concentrações crescentes (acrescidas de um fator 3, concentrações dentro do intervalo de 10-6 a 10-2 M) obtendo-se assim a CCE ao cálcio. Experimentos nos quais KCl ou serotonina foram os agonistas utilizados para a resposta contráctil inicial, nifedipina não foi usada. Por sua vez, quando carbacol foi o agonista utilizado para a resposta contrátil inicial, a atropina não foi utilizada.
3.2.7 Resposta contrátil ao antígeno
efeito dos hormônios tireoideanos na reação de Schultz-Dale, em traquéias isoladas, após o período de equilíbrio de 50 minutos, no qual a traquéia foi submetida, a cada 15 minutos, a trocas sucessivas do líquido de incubação e ajuste de tensão a 1gF (SABAN et al., 1987) foi adicionado 0,05mg de ovalbumina à preparação.
3.3 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os testes estatísticos foram realizados com o auxílio dos softwares Microcal
4.1 Efeito do tratamento com propiltiouracil (PTU) ou com L-Tiroxina (T4) em
parâmetros biológicos monitorados em ratos
O efeito do tratamento com PTU ou com T4 nos parâmetros monitorados, taxa de crescimento (ganho de peso corpóreo) e peso da tireóide são apresentados na tabela 01. Podemos observar que houve uma redução significativa de peso nos ratos tratados com PTU em relação aos animais do grupo controle. Entretanto a observação mais proeminente do tratamento com propiltiouracil foi o peso da tireóide o qual foi significativamente aumentado em relação ao grupo controle.
Observamos ainda que houve redução significativa na taxa de crescimento nos animais tratados com T4,(0,5 mg/kg, s.c) durante 7 dias ou 9 dias em relação ao grupo controle. Entretanto, houve aumento significativo no peso da tireóide nos animais tratados com T4 durante 7 dias e diminuição significativa quando o período de tratamento foi de 9 dias.
4.2 Hiperreatividade em traquéia isolada de rato para a resposta contrátil
induzida por altas concentrações de potássio após sensibilização e desafio
antigênico com OVA.
As curvas concentração-efeito (CCE), obtidas para o potássio, 24 horas após o desafio antigênico, em traquéias isoladas de ratos naive, sensibilizados (SENS) ou
houve aumento significativo (p < 0,05, ANOVA, BONFERRONI) de 47,11% na RM obtida em traquéias de animais SD24, em relação à RM das CCE obtidas com traquéias do grupo naive, mas não houve alteração significativa entre os valores de CE50. Podemos observar ainda que não houve alteração significativa nem na RM nem na CE50 obtidas em traquéias do grupo sensibilizado em relação às traquéias do grupo naive.
4.3 Efeito do hipotireoidismo no desenvolvimento de hiperreatividade em traquéia
isolada de ratos sensibilizados e desafiados à OVA na resposta contrátil induzida
por altas concentrações de potássio.
4.4 Hiperreatividade da traquéia isolada de rato para a resposta contrátil induzida
pela adição de Ca2+ em preparações mantidas em solução despolarizante zero Ca2+
após sensibilização e desafio antigênico com OVA.
As CCE, obtidas pela adição de cálcio (10-6 a 10-2 M), após contração induzida por KCl (60 mM), 24 horas após o desafio antigênico, em traquéia isolada de ratos
naive, sensibilizados (SENS) ou sensibilizados e desafiados com OVA (SD24) são
apresentadas na figura 3a. A tabela 03a apresenta os valores das CE50 e RM. A adição de Ca2+, na solução extracelular sem cálcio e com EDTA, na presença de 60 mM de potássio e atropina (10-6 M), de maneira dependente de concentração (p < 0,001, ANOVA), produziu contrações cuja RM foi atingida na concentração de 10 mM. Podemos observar que houve aumento significativo (p<0,05, ANOVA, BONFERRONI) de 50,88% na RM obtida em traquéia de animais sensibilizados e desafiados, em relação à RM obtida com traquéia do grupo naive. Nota-se ainda que não ocorreu alteração
4.5 Efeito do hipotireoidismo no desenvolvimento de hiperreatividade em traquéia
isolada de ratos sensibilizados e desafiados à OVA na resposta contrátil induzida
pela adição de Ca2+ em preparações mantidas em solução despolarizante zero Ca2+
4.6. Hiperreatividade da traquéia isolada de rato para a resposta contrátil
induzida por carbacol após sensibilização e desafio antigênico com OVA.
As CCE, obtidas para o carbacol, 24 horas após o desafio antigênico, em traquéias isoladas de ratos naive, apenas sensibilizados ou sensibilizados e desafiados
com OVA (SD24), são apresentadas na figura 4a. A tabela 04a apresenta os respectivos valores das CE50 e RM. A aplicação cumulativa de carbacol (10-8 a 3x10-5 M) produziu, de maneira dependente de concentração (p < 0,001, ANOVA), desenvolvimento de força contrátil cuja força máxima foi atingida com 10 µM de carbacol. Podemos observar que houve aumento significativo (p < 0,001, ANOVA, BONFERRONI) de 64,97% na RM obtida em traquéias de animais SD24, em relação à RM das CCE obtidas com traquéias do grupo naive. Nota-se que não ocorreu alteração significativa
na comparação entre os valores de CE50. Podemos observar ainda que não houve alteração significativa nem na RM nem na CE50 obtidas em traquéias do grupo sensibilizado em relação às traquéias do grupo naive.
4.7. Efeito do hipotireoidismo no desenvolvimento de hiperreatividade em traquéia
isolada de ratos sensibilizados e desafiados à OVA na resposta contrátil induzida
pelo carbacol
desenvolvimento de força contrátil cuja resposta máxima foi atingida na concentração de 10 µM. Podemos observar que não houve alteração na RM obtida em traquéias de animais hipotireóideos sensibilizados e hipotireóideos sensibilizados e desafiados, em relação à RM obtida no grupo sensibilizado, entretanto houve deslocamento significativo da curva para a direita como pode ser evidenciado pelo aumento do valor da CE50 dos animais hipotireóideos sensibilizados em relação ao grupo apenas sensibilizado (p<0,05, ANOVA, BONFERRONI).
4.8 Hiperreatividade da traquéia isolada de rato para a resposta contrátil induzida
pela adição de Ca2+ em preparações mantidas em solução zero Ca2+ na presença de
carbacol após sensibilização e desafio antigênico com OVA.
As CCE médias obtidas, 24 horas após o desafio antigênico, pela adição de cálcio (10-6 a 10-2 M) à solução zero Ca2+ com nifedipina (10-6 M), após pequena contração induzida por carbacol (10-5 M),em traquéias isoladas de ratos naive, apenas
sensibilizados ou sensibilizados e desafiados com OVA (SD24) são apresentadas na figura 5a. A tabela 05a apresenta os valores das CE50 e RM. A adição cumulativa de Ca2+, de maneira dependente de concentração (p < 0,001, ANOVA), produziu contrações com RM na concentração de 10 mM de CaCl2. Podemos observar que houve aumento significativo (p<0,05, ANOVA, BONFERRONI) de 38,28% na RM obtida em traquéia de animais sensibilizados e desafiados, em relação à RM das CCE obtidas com traquéia do grupo naive. Nota-se ainda que não ocorreu alteração significativa na
4.9 Efeito do hipotireoidismo no desenvolvimento de hiperreatividade em traquéia
isolada de ratos sensibilizados e desafiados à OVA na resposta contrátil induzida
pela adição de Ca2+ em preparações mantidas em solução zero Ca2+ na presença de
carbacol
4.10 Hiperreatividade da traquéia isolada de rato para a resposta contrátil
induzida por serotonina após sensibilização e desafio antigênico com OVA
As CCE, obtidas para a serotonina 24 horas após o desafio antigênico, em traquéia isolada de ratos naive, apenas sensibilizados ou sensibilizados e desafiados com
OVA (SD24), são apresentadas na figura 6a. A tabela 06a apresenta os respectivos valores das CE50 e RM. A aplicação cumulativa de serotonina (10-7 a 3x10-4 M) produziu, de maneira dependente de concentração (p < 0,001, ANOVA), desenvolvimento de força contrátil cuja resposta máxima foi atingida com 0,1 mM de serotonina. Podemos observar que houve aumento significativo (p < 0,001, ANOVA, BONFERRONI) de 97,54% na RM obtida em traquéias de animais SD24, em relação à RM das CCE obtidas com traquéias do grupo naive. Nota-se ainda que não ocorreu
