Fábio Manuel Ferreira Gouveia Santos Amaral Otimização de ferramentas moleculares para a monitorização de espécies não indígenas em regiões costeiras do Norte de Portugal
dezembro de 2021 UMinho | 2021Fábio M. F. Gouveia S. AmaralOtimização de ferramentas moleculares para a monitorização de espécies não indígenas em regiões costeiras do Norte de Portugal
Universidade do Minho
Escola de Ciências
Fábio Manuel Ferreira Gouveia Santos Amaral Otimização de ferramentas moleculares para a monitorização de espécies não indígenas em regiões costeiras do Norte de Portugal
Dissertação de Mestrado Mestrado em Ecologia
Trabalho efetuado sob a orientação do(a) Doutora Sofia Alexandra Ferreira Duarte Professor Doutor Filipe José Oliveira Costa Universidade do Minho
Escola de Ciências
dezembro de 2021
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DIREITOS DE AUTOR E CONDIÇÕES DE UTILIZAÇÃO DO TRABALHO POR TERCEIROS
Este é um trabalho académico que pode ser utilizado por terceiros desde que respeitadas as regras e boas práticas internacionalmente aceites, no que concerne aos direitos de autor e direitos conexos.
Assim, o presente trabalho pode ser utilizado nos termos previstos na licença abaixo indicada.
Caso o utilizador necessite de permissão para poder fazer um uso do trabalho em condições não previstas no licenciamento indicado, deverá contactar o autor, através do RepositóriUM da Universidade do Minho.
Atribuição CC BY
https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
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Agradecimentos
Em primeiro lugar, gostaria de agradecer a todos os que, de forma direta ou indireta, estiveram presentes nos bons e nos maus momentos nesta etapa, em especial:
Aos meus orientadores Drª Sofia Duarte e Professor Filipe Costa por terem aceitado orientar esta dissertação e todo o conhecimento, motivação e ajuda que providenciaram e foram indispensáveis para a realização deste trabalho assim como por todas as oportunidades proporcionadas durante esta caminhada.
À equipa do ME-Barcode, em particular à Ana Sofia Lavrador pelos vários ensinamentos que providenciou e a paciência que teve no auxílio das tarefas laboratoriais e ao Dr. Pedro Vieira por toda a ajuda prestada. Queria também agradecer aos restantes elementos do laboratório por toda a colaboração.
Aos meus colegas e amigos de curso pelas memórias e momentos incríveis que proporcionaram ao longo destes anos e a ajuda fornecida sempre que necessário mostrando que em conjunto tudo se torna mais fácil.
Aos meus amigos de infância e aos que fui fazendo durante esta jornada que me acompanharam em todos os momentos e permitiram passar a pandemia e os vários confinamentos da melhor forma possível apesar da distância.
A toda a minha família, mais particularmente aos meus pais, à minha irmã, ao meu irmão e aos meus avôs, que fizeram com que tudo fosse possível, que sempre me incentivaram a ultrapassar todos os desafios, testar os meus limites e que me transmitiram ensinamentos incríveis sem os quais não poderia estar nesta posição e ter acabado mais um ciclo de estudos.
Muito obrigado!
Este trabalho foi realizado no âmbito do projeto "NIS-DNA: Deteção precoce e monitorização de espécies não-indígenas (NIS) em ecossistemas costeiros baseadas em ferramentas de sequenciação de alto débito" (PTDC/BIA-BMA/29754/2017), financiado por fundos nacionais através da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P.
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DECLARAÇÃO DE INTEGRIDADE
Declaro ter atuado com integridade na elaboração do presente trabalho académico e confirmo que não recorri à prática de plágio nem a qualquer forma de utilização indevida ou falsificação de informações ou resultados em nenhuma das etapas conducente à sua elaboração. Mais declaro que conheço e que respeitei o Código de Conduta Ética da Universidade do Minho.
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Título: Otimização de ferramentas moleculares para a monitorização de espécies não-indígenas em regiões costeiras do Norte de Portugal
Resumo
Nos ecossistemas marinhos e costeiros, a proliferação de espécies não indígenas (ENI) encontra-se entre as cinco principais causas da perda de biodiversidade. O transporte marítimo é o principal meio de introdução de ENI marinhas e tem vindo a aumentar globalmente. Desta forma é essencial prevenir a entrada de ENI e detetar precocemente a sua presença nos locais mais suscetíveis, como é o caso dos portos e das marinas. As ENI marinhas são sobretudo invertebrados, cuja identificação com base na morfologia é muitas vezes desafiante, e exige um elevado grau de conhecimento a nível taxonómico das espécies, um processo que se pode tornar muito moroso. Por outro lado, técnicas moleculares, que usam como base o ADN na identificação de espécies, como o DNA metabarcoding, poderão ser mais rápidas e eficazes na deteção precoce de ENI, dada a sua elevada sensibilidade que permite a deteção das espécies em qualquer estádio do seu ciclo de vida e quando presentes em densidades muito baixas. O presente estudo teve como objetivo a otimização de ferramentas moleculares para a monitorização de ENI de invertebrados marinhos em regiões costeiras do Norte de Portugal. Numa primeira fase, foi compilada e auditada uma biblioteca de referência de ENI de invertebrados marinhos que ocorrem em Portugal continental, uma vez que constitui a base para uma identificação taxonómica eficaz das sequências geradas por DNA metabarcoding. A lista de ENI de invertebrados marinhos consistiu em 68 espécies, com dominância dos filos Arthropoda: Crustacea, Chordata: Ascidiacea e Mollusca. Para 58 ENI foram encontradas sequências do marcador COI na base de dados BOLD. Após auditoria verificou-se que apenas 18% das ENI foram classificadas com níveis que indicam concordância (A e B), em que um BIN (Barcode Index Number) foi atribuído apenas a uma morfoespécie. No entanto, 59% das espécies foram classificadas com nível E, que indica discordância taxonómica. Uma inspeção pormenorizada revelou que a discordância se deveu a identificações incorretas (38%) e a classificações sinónimas (11%), mas para 51% dos casos não foi possível perceber a sua origem. Numa segunda fase do estudo foram avaliados os efeitos sazonal (primavera, outono e inverno), do método de amostragem (substratos duros e artificiais, zooplâncton e eDNA) e do uso de diferentes marcadores genéticos (COI e 18S) na recuperação de ENI por DNA metabarcoding, na marina Porto Atlântico, localizada no porto de Leixões.
No global, foram identificadas 626 espécies de invertebrados marinhos por DNA metabarcoding pertencentes a 22 filos distintos, com dominância dos filos Arthropoda:Crustacea, Chordata:Ascidiacea e Mollusca. O maior número de espécies foi registado no zooplâncton e no outono. Ambos os fatores (o método de amostragem e a estação do ano) afetaram significativamente a composição das comunidades de invertebrados marinhos recuperadas por DNA metabarcoding, para ambos os marcadores moleculares. No global, foram detetadas 31 ENI por DNA metabarcoding na marina Porto Atlântico, 7 das quais são invasoras e 7 são presumíveis novos registos em Portugal continental. No entanto, apenas 4 ENI foram detetadas por ambos os marcadores. A amostragem de zooplâncton e o inverno foram, respetivamente, o método e a estação do ano em que foi detetado um maior número de ENI, no entanto o número máximo só foi atingido quando reunidos os resultados de todos os métodos de amostragem.
Palavras-chave: DNA metabarcoding; Ecossistemas marinhos e costeiros; Invertebrados marinhos;
Espécies não indígenas (ENI); Norte de Portugal
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Title: Optimization of molecular tools for monitoring non-indigenous species in coastal regions of Northern Portugal
Abstract
In marine and coastal ecosystems, the proliferation of non-indigenous species (NIS) is among the top five causes of biodiversity loss. Shipping is the main vector of introduction of marine NIS and is increasing globally. Thus, it is essential to prevent the entrance of NIS and detect their presence as early as possible at the most susceptible locations, such as ports and marinas. Marine NIS are mainly invertebrates, whose identification based on morphology is often challenging, and requires a high degree of taxonomic knowledge of the species, a process that can become very time consuming. On the other side, molecular techniques that use DNA-based species identification, such as DNA metabarcoding, may be faster and more effective in the early detection of NIS. Its high sensitivity allows the detection of species at any stage of their life cycle and when present at very low densities.
This study aimed to optimize molecular tools for monitoring marine invertebrate NIS in coastal regions of northern Portugal. Initially, a reference library of NIS of marine invertebrates occurring in mainland Portugal was compiled and audited, as it constitutes the basis for an effective taxonomic identification of sequences generated through DNA metabarcoding. The list of NIS of marine invertebrates consisted in 68 species, with dominance of the following phyla: Arthropoda: Crustacea, Chordata: Ascidiacea and Mollusca. For 58 NIS, COI marker sequences were found in the BOLD database. After auditing it was found that only 18% of the NIS were classified with levels indicating concordance (A and B), where a BIN (Barcode Index Number) is assigned to only one morphospecies. However, 59% of the species were classified with level E, which indicates taxonomic disagreement. A detailed inspection revealed that the disagreement was due to incorrect identifications (38%) and synonymous classifications (11%), but for 51% of the cases it was not possible to understand their origin. In a second stage of the study, the seasonal effects (spring, autumn and winter), the sampling method (hard and artificial substrates, zooplankton and eDNA) and the use of different genetic markers (COI and 18S) were evaluated in the recovery of NIS by DNA metabarcoding in the marina Porto Atlântico, located in the port of Leixões. Overall, 626 species of marine invertebrates were identified through DNA metabarcoding belonging to 22 distinct phyla, with dominance of the phyla Arthropoda:
Crustacea, Chordata: Ascidiacea and Mollusca. A higher number of species was recovered in zooplankton and in autumn. Both factors (sampling method and season) significantly affected the composition of marine invertebrate communities recovered through DNA metabarcoding, for both molecular markers. Overall, 31 NIS were detected through DNA metabarcoding at Porto Atlântico marina, 7 of which are invasive and 7 are presumed new records in mainland Portugal. However, only 4 NIS were detected with both markers. Zooplankton sampling and winter were, respectively, the method and the season where the highest number of NIS was detected, but the maximum number was only attained when pooling the results from all sampling methods.
Keywords: DNA metabarcoding; Marine and coastal ecosystems; Marine invertebrates; non-indigenous species (NIS); Northern Portugal
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Índice
Agradecimentos... iii
Resumo ... v
Abstract ... vi
Índice ... vii
Lista de figuras ... ix
Lista de tabelas ... xi
Lista de abreviaturas: ... xii
1 Introdução geral ... 14
1.1 Importância dos ecossistemas marinhos e costeiros ... 14
1.2 Espécies não-indígenas (ENI) e espécies invasoras nos ecossistemas marinhos e costeiros ... 15
1.3 Impacto ecológico, social e económico das ENI e espécies invasoras ... 17
1.4 Identificação e monitorização de ENI nos ecossistemas marinhos e costeiros ... 19
1.5 Objetivos e pertinência deste estudo ... 24
2 Materiais e métodos ... 26
2.1 Biblioteca de referência ... 26
2.1.1 Compilação de uma biblioteca de referência contendo DNA barcodes para espécies não- indígenas (ENI) de invertebrados marinhos que ocorrem em Portugal ... 26
2.1.2 Auditoria da Biblioteca de referência ... 26
2.2 Otimização de ferramentas moleculares para a deteção e monitorização de ENI ... 28
2.2.1 Área de estudo ... 28
2.2.2 Métodos de Amostragem ... 30
2.2.3 Extração do DNA ... 31
2.2.4 Sequenciação de alto débito ... 32
2.2.5 Processamento informático das sequências ... 33
2.2.6 Análise estatística dos dados... 34
3 Resultados ... 36
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3.1 Biblioteca de referência ... 36
3.1.1 Compilação da lista de ENI de invertebrados marinhos e classificação taxonómica ... 36
3.1.2 Compilação da biblioteca de referência de ENI de invertebrados marinhos na BOLD ... 36
3.1.3 Auditoria da Biblioteca de referência ... 39
3.1.4 Casos de distâncias intraespecíficas elevadas na biblioteca de referência ... 41
3.2 Otimização de ferramentas moleculares para a deteção e monitorização de ENI ... 42
3.2.1 Número de sequências iniciais, filtradas e com atribuição taxonómica a invertebrados marinhos, recuperadas por DNA metabarcoding ... 42
3.2.2 Efeitos do tempo e do método de amostragem na diversidade de invertebrados marinhos 44 3.2.3 Efeito do marcador molecular na diversidade de invertebrados marinhos ... 48
3.2.4 Classificação taxonómica da diversidade de invertebrados marinhos recuperada por DNA metabarcoding ... 51
3.2.6 Diversidade de espécies não indígenas ... 56
4 Discussão ... 59
4.1 Compilação e auditoria de uma biblioteca de referência contendo DNA barcodes para espécies não indígenas (ENIs) de invertebrados marinhos que ocorrem em Portugal ... 59
4.2 Otimização de ferramentas moleculares para a deteção e a monitorização de ENI em regiões costeiras portuguesas usando como caso de estudo a marina Porto Atlântico ... 62
4.2.1 Efeito do marcador genético na recuperação da diversidade de invertebrados marinhos na marina Porto Atlântico ... 62
4.2.2 Efeitos sazonais e do método de amostragem na recuperação da diversidade de invertebrados marinhos na marina Porto Atlântico ... 64
4.2.3 Espécies de invertebrados marinhos não-indígenas presentes na marina Porto Atlântico ... 65
5 Considerações finais ... 70
Referências Bibliográficas ... 72
Material Suplementar ... 79
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Lista de figuras
Figura 1 - Custos sofridos com a gestão de espécies invasoras nos ecossistemas em função do tempo decorrido desde a sua introdução. Adaptado de Invasive Plants and Animals Policy Framework, Department of Primary Industries, State of Victoria. Australia. ... 17 Figura 2 - Representação esquemática das técnicas de DNA barcoding e DNA metabarcoding. ... 22 Figura 3 Fluxo de trabalho efetuado pela auditoria automatizada e anotação e de que forma são obtidas as classificações qualitativas para cada espécie a partir de uma biblioteca de referência compilada (adaptado de Oliveira et al., 2016) ... 27 Figura 4 - Imagem satélite da marina do Porto Atlântico e dos 3 locais de amostragem. Figura adaptada do Google Maps. ... 28 Figura 5 - Distribuição por filo das espécies presentes na lista de ENI de invertebrados marinhos com ocorrência em Portugal continental. ... 36 Figura 6 - Número de ENI de invertebrados marinhos, distribuídas pelos diferentes filos representados na lista, com ocorrência em Portugal continental que possuem e não possuem sequências na base de dados BOLD. ... 37 Figura 7 - Distribuição geográfica dos espécimes que foram usados no dataset DS-NISPTC ... 38 Figura 8 - Número de espécies presentes na biblioteca inicial de ENI de invertebrados marinhos que ocorrem em Portugal continental, número de espécies presentes no dataset DS-NISPTC e número de espécies submetidas à auditoria ... 39 Figura 9 - Número de espécies distribuídas por cada classificação (A a E) durante a auditoria efetuada pelo BAGS ... 40 Figura 10 - Distribuição das principais razões de discordância para as espécies que obtiveram classificação “E” na auditoria. ... 41 Figura 11 – Número de espécies obtido usando cada método de amostragem ao longo do tempo, na marina do Porto Atlântico ... 45 Figura 12 – Espécies de invertebrados marinhos exclusivas e partilhadas entre os diferentes tempos para os substratos duros, os substratos artificiais, o zooplâncton e o eDNA, identificadas pelo marcador COI.
... 46 Figura 13 – Espécies de invertebrados marinhos exclusivas e partilhadas entre os diferentes tempos para os substratos duros, os substratos artificiais, o zooplâncton e o eDNA, identificadas pelo marcador 18S.
... 47
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Figura 14 – Espécies de invertebrados únicas e partilhadas entre os diferentes substratos para o marcador COI, o marcador 18S e detetadas com ambos os marcadores. ... 48 Figura 15 – Número de espécies nativas e não indígenas encontradas em cada amostragem para o marcador COI e para o marcador 18S ... 49 Figura 16 – Número de espécies identificadas exclusivamente por cada marcador (18S e COI) e partilhadas nos diferentes tempos... 50 Figura 17 – Número total de espécies identificadas exclusivamente por cada marcador (18S e COI) e partilhadas nos diferentes métodos, substratos duros, substratos artificiais, zooplâncton e eDNA ... 50 Figura 18 – Diversidade de filos detetada através das diferentes metodologias de amostragem ao longo do tempo para o marcador COI e para o marcador 18S ... 52 Figura 19 – Ordenação da estrutura das comunidades de invertebrados marinhos recuperadas por DNA metabarcoding usando uma análise multivariada de escala multidimensional não métrica (nMDS). ... 55
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Lista de tabelas
Tabela 1 - Parâmetros físico-químicos da água da marina Porto Atlântico medidos em cada tempo de amostragem ... 29 Tabela 2 - Distâncias intraespecíficas médias e máximas para cada espécie do dataset às quais foi atribuída classificação “C” ... 42 Tabela 3 - Número de reads iniciais, reads filtradas de qualidade e número e percentagem de reads de qualidade com correspondência taxonómica a nível da espécie, obtidos por cada método e tempo de amostragem, para os marcadores COI e 18S. ... 44 Tabela 4 - Número de espécies, filos, ENI e percentagem de ENI identificadas em cada tempo e por cada método de amostragem. ... 53 Tabela 5 - Resultados da análise multivariada de variância permutacional (PERMANOVA). ... 56 Tabela 6 - ENI detetadas ao longo de todo o estudo ... 58
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Lista de abreviaturas
• BAGS – Barcode, Audit & Grade System
• BIN – Barcode Index Number
• BOLD – Barcode of Life Data Systems
• COI/ COI-5P – Citocromo oxidase I
• DNA – Ácido desoxirribonucleico
• eDNA – DNA Ambiental
• ENI – Espécie(s) não indígena(s)
• mtDNA – DNA mitocondrial
• nMDS – Análise multivariada de escala multidimensional não métrica
• OTU – Unidade Taxonómica Operacional
• PCR – Polymerase Chain Reaction
• T1 – 1ª Amostra temporal (Primavera 2020)
• T2 – 2ª Amostra temporal (Outono 2020)
• T3 – 3ª Amostra temporal (Inverno 2020/2021)
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1 Introdução geral
1.1 Importância dos ecossistemas marinhos e costeiros
As regiões costeiras são definidas pelo “UN Environment Programme World Conservation Monitoring Centre (UNEP-WCMC)” como a interface ou áreas de transição entre terra e mar, incluindo grandes lagos interiores. Segundo dados do Eurostat, 44% da população europeia vive em regiões costeiras (Eurostat e European Commission, 2011) e aproximadamente metade da população mundial vive a menos de 100 quilómetros da costa e a uma altitude inferior a 50 metros acima do nível médio da água (CIESIN, 2012). Em Portugal a situação assemelha-se ao resto do mundo, através dos dados do Instituto Nacional de Estatística (INE) relativos a 2017, chegou-se à conclusão que aproximadamente 60% da população portuguesa vive a pelo menos 25 quilómetros do litoral e as projeções indicam que essa percentagem irá aumentar nos próximos anos, fruto da menor média de idades da população aí residente (Instituto Nacional de Estatística, 2018).
Contudo, a importância destes ecossistemas não se deve somente a razões demográficas. As regiões costeiras incluem diversos tipos de ecossistemas e habitats altamente produtivos, tais como os estuários, pântanos, mangais, recifes de coral, costões e florestas de kelp que providenciam diferentes serviços benéficos para o Homem e para a natureza já que muitas espécies as usam durante algumas ou todas as fases do seu ciclo de vida como área de alimentação, berçário, desova ou migração (Henseler et al., 2019). Na conferência dos oceanos, realizada pelas Nações Unidas em Nova York no ano de 2017, foram divulgados alguns dados relativos a estes mesmos ecossistemas, estimando-se que existam nos oceanos e regiões costeiras entre 300 mil a 10 milhões de espécies (Costello et al., 2011;Reaka-Kudla, 1997). A economia dos oceanos, que inclui empregos e serviços de ecossistemas fornecidos/relacionados com o oceano e regiões costeiras, é estimada entre 3-6 triliões de dólares americanos/ano tornando estas regiões essenciais em todos os serviços de ecossistemas, o nome dado a bens ou serviços naturais que de forma direta ou indireta contribuem para a sobrevivência e para a qualidade de vida do Homem (NESP, 2016; MEA, 2005). O conceito de serviços de ecossistemas surgiu por volta dos anos 70, do século passado, e tem ganho mais importância para os investigadores e para os decisores políticos que têm em consideração os serviços que cada ecossistema pode prestar ao Homem de forma a retirar o maior proveito para a população e ambiente (Olander et al., 2018). Alguns dos serviços providenciados pelos ecossistemas costeiros incluem: i) serviços de suporte, essenciais no ciclo de nutrientes, na remoção de poluentes e no sequestro de carbono azul; ii) serviços de provisionamento, que fornecem à população alimentos e matérias primas, das quais muitas
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comunidades dependem para a sua sobrevivência; iii) serviços de regulação uma vez que servem de barreira física contra tempestades, tsunamis e outros fenómenos naturais e iv) serviços culturais, que compreendem, por exemplo, o turismo, pois cerca de 50% do turismo mundial concentra-se em regiões costeiras) devido à sua beleza natural, mas, também, e como dito anteriormente, por albergar muita população levando consequentemente com que as maiores e mais históricas cidades se situem nessas regiões. As regiões costeiras são também o habitat de uma grande quantidade de organismos marinhos e terrestres permitindo a manutenção da biodiversidade (Lu et al., 2018; Liquete et al., 2013; UNEP 2006).
No entanto, devido a diversos fatores, as regiões costeiras são vulneráveis à degradação e destruição desvalorizando os seus serviços de ecossistema. Alguns desses fatores são naturais e outros são de origem antropogénica. De entre as causas de origem antropogénica destacam-se a eutrofização causada pelo input excessivo de nutrientes nas águas costeiras, a construção em zonas dunares e costeiras de habitações e outros empreendimentos imobiliários, a poluição, a acidificação dos oceanos, a alterações do solo e a introdução de espécies invasoras (Crain et al. 2009).
1.2 Espécies não-indígenas (ENI) e espécies invasoras nos ecossistemas marinhos e costeiros
Segundo o regulamento (UE) nº 1143/2014 do Parlamento Europeu e do Conselho da União Europeia, espécies não-indígenas (ENI), também conhecidas por espécies exóticas ou espécies alienígenas é o nome dado a qualquer espécime vivo de uma espécie, subespécie ou categoria taxonómica inferior de animais, plantas, fungos ou microrganismos introduzido fora da sua área de distribuição natural, incluindo quaisquer partes, gâmetas, sementes, ovos ou propágulos dessa espécie, bem como quaisquer híbridos, variedades ou raças, que possam sobreviver e posteriormente reproduzir- se.
As espécies invasoras são ENI cuja introdução ou propagação ameaça ou provoca impactos adversos na biodiversidade local e consequentemente afeta os diferentes serviços dos ecossistemas providenciados pelos ecossistemas da zona colonizada (Oliva-Paterna et al., 2021). Em algumas situações, as ENI tornam-se invasoras devido a alguns atributos tais como a sua elevada tolerância a diferentes variáveis físicas e químicas, a sua elevada variabilidade genética, o seu tempo de geração curto, maturidade sexual precoce, grande capacidade reprodutiva e dieta ampla (Essink, 2002; Molnar et al., 2008). Estima-se que na Europa cerca de 10 a 15% de todas as ENI introduzidas se tornam invasoras e os ecossistemas aquáticos são considerados mais suscetíveis à perturbação causada por espécies invasoras do que os ambientes terrestres (Vilà et al., 2010).
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O fenómeno de invasões biológicas e de propagação de ENI mediada pelo Homem é um fenómeno com milhares de anos, que ocorre de forma intencional (por exemplo, na agricultura e com plantas ornamentais) ou acidental e atualmente são consideradas um dos mais importantes fatores diretos da perda de biodiversidade e de recursos naturais causando pressão sobre várias comunidades, com impactos negativos a nível ecológico, económico (por exemplo, no turismo ou agricultura) e na saúde humana (Bonanno e Orlando-Bonaca, 2019).
Devido ao processo de globalização, industrialização, aquecimento global e ao aumento do tráfego de pessoas e mercadoria, principalmente a partir do século XX e XXI, a disseminação de ENI aumentou em todos os ecossistemas, nomeadamente nos ecossistemas costeiros visto ser o transporte marítimo o principal vetor de introdução de ENI em todo o mundo, nomeadamente de invertebrados marinhos (Ruiz et al., 2000). Estes organismos, ou os seus propágulos vivos, são sobretudo transportados nas águas de lastro (anualmente são movidas mais de 10 biliões de toneladas de água em todo o mundo) (Ghosh e Rubly, 2017) e incrustadas nos cascos dos navios (Ferrario et al., 2017).
Outros importantes vetores de introdução de ENI são os canais artificiais (como é o caso do canal do Panamá e do canal de Suez), as mudanças no curso dos rios e as aquaculturas (Minchin, 2007; Ojaveer et al., 2014).
Desta forma, os portos e as marinas são locais de entrada primária e secundária de ENI e devem ser cuidadosamente monitorizados e vigiados (através de diferentes técnicas e metodologias) para impedir a propagação das ENI. As estruturas artificiais, como docas e pontões flutuantes encontrados em portos e marinas, fornecem habitats adequados para hospedar espécies de invertebrados marinhos, e, portanto, facilitar e acelerar o processo de entrada, fixação e propagação das ENI (Darbyson et al., 2009; Davidson et al., 2010; Mineur et al., 2012).
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1.3 Impacto ecológico, social e económico das ENI e espécies invasoras
Num artigo recente publicado pela revista Nature (Diagne et al., 2021) foi dado a conhecer que entre 1970 e 2017 as espécies invasoras foram responsáveis por custos económicos avaliados em 128 biliões de dólares a nível mundial, ou seja, 26,8 mil milhões de dólares anuais, cujo impacto se alastrou por diferentes setores como os da agricultura, turismo e saúde pública. O mesmo artigo refere que estes números têm uma tendência crescente sendo de esperar que nos próximos anos as espécies invasoras provocarão custos económicos mais avultados e consequentemente problemas sociais. Num outro artigo, também publicado em 2021, estima-se que, entre 1960 e 2020, os custos provocados pelos danos das espécies invasoras e sua gestão, ultrapassaram os 116 mil milhões de euros na Europa e os 7,89 mil milhões em Portugal, o sétimo país europeu mais afetado por espécies invasoras (Haubrock et al., 2021). A melhor forma de diminuir estes custos exorbitantes é prevenindo a introdução destes organismos nos ecossistemas. Caso não seja possível, o indicado é tentar erradicar a espécie o mais rapidamente possível e prevenir a sua disseminação, por fim, caso a espécie já esteja estabelecida no novo habitat, será necessário gerir e minimizar o impacto da mesma nos ecossistemas e a sua dispersão (Government of Canada, 2018). O custo destas medidas vai sendo progressivamente mais dispendioso com o tempo decorrido após a introdução (Figura 1).
Tal como no resto do mundo, em Portugal continental tem-se verificado um número crescente de ENI de invertebrados marinhos nas regiões costeiras e nos estuários (Chainho et al., 2015). Em 2015 estavam reportadas em todo o território português 86 ENI marinhas distribuídas por 8 filos, e em Portugal
Figura 1 - Custos sofridos com a gestão de espécies invasoras nos ecossistemas em função do tempo decorrido desde a sua introdução. O custo envolvido na prevenção da introdução de espécies invasoras é menor do que gerir os seus impactos depois de estabelecida. Após a introdução da espécie, a ordem de ações da menos dispendiosa para a mais dispendiosa é a seguinte: erradicação, prevenção da propagação e gestão de impactos. Adaptado de Invasive Plants and Animals Policy Framework, Department of Primary Industries, State of Victoria. Australia.
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continental 41 ENI de 6 filos distintos, com principal destaque para o estuário do rio Tejo como o local com mais ENI reportadas (Chainho et al., 2015). No mesmo estudo também foi possível chegar à conclusão que a maioria das ENI identificadas já tinham uma população estável em Portugal e o seu principal vetor de entrada seria, tal como previsto, através de transporte marítimo, quer pelas águas de lastro, quer pelas incrustações dos navios (Chainho et al., 2015). Este número está, no entanto, subavaliado devido a novos relatórios produzidos a nível nacional e internacional que retificam o número e as espécies não-indígenas frequentemente, nomeadamente o relatório do 2.º Ciclo das Estratégias Marinhas da DQEM (atualizado anualmente) que contempla a reavaliação do estado ambiental (artigo 8.º e artigo 9.º) e a definição de metas ambientais (artigo 10.º), por subdivisão, para os 11 descritores qualitativos, efetuada com base na nova Decisão (UE) 2017/848.
Em 2019 foi implementado o decreto-lei n.º 92/2019 contendo a lista de espécies que são consideradas invasoras em território português, sendo que nesta lista se encontram reportadas mais de 25 espécies de invertebrados marinhos. Agrupando os dados de 2015 com a lista de espécies invasoras, foi possível chegar à conclusão que 12 das 25 espécies já tinham sido registadas em Portugal continental e muitas delas com populações estabelecidas e em crescimento.
O número de publicações e estudos sobre o impacto das ENI em Portugal a nível social, económico e ecológico continua a ser muito reduzido, isto apesar de serem conhecidos os efeitos nefastos que as espécies invasoras, nomeadamente de espécies de invertebrados marinhos invasores, têm sobre o funcionamento normal dos ecossistemas a partir da redução das populações de espécies nativas e consequentemente a quantidade de alimento disponível nesses locais (Marques et al., 2017).
A escassez de estudos acaba por impossibilitar os especialistas em avaliar o verdadeiro impacto das espécies invasoras e encontrar alternativas e medidas para combater esses efeitos negativos. No entanto, ao longo dos últimos anos, sobretudo a partir da última década do século XX, devido ao avançado estado de degradação das zonas costeiras e ao impacto económico negativo que está a ser causado pelas espécies invasoras, tem havido um maior investimento monetário e humano em campanhas de sensibilização, erradicação de espécies, campanhas de ciência cidadã e criação de medidas legislativas para restaurar a qualidade ambiental destes ecossistemas (Ojaveer et al., 2014).
Com o objetivo de melhorar esses ecossistemas foram desenvolvidas várias metodologias para detetar e monitorizar precocemente ENI e essa identificação e deteção idealmente deve passar pela taxonomia integrativa que utiliza marcadores moleculares de DNA, caracteres morfológicos e caracteres ecológicos na identificação da biodiversidade (Padial et al., 2010). Mas não existe ainda uma metodologia padrão a nível global que permita comparar dados espaciais e temporais (Ojaveer et al., 2018). Existem,
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porém, medidas que ajudam a detetar e monitorizar assim como prevenir a sua introdução que passam por traçar áreas de risco (por exemplo, portos e marinas) e fazer um levantamento da biodiversidade do local regularmente, monitorizar com ferramentas genéticas, aumentar o controlo e fiscalização do comércio de espécies vivas e especificar locais onde uma determinada ENI ocorre (Lehtiniemi et al., 2015).
Em 2004, foi assinada nova regulamentação para navios de mercantis na International Convention for the Control and Management of Ships' Ballast Water and Sediments (BWM Convention), de forma a prevenir a propagação de organismos aquáticos potencialmente nocivos de uma região para outra. Essa convenção, que abrangeu 79 países de todos os continentes e entrou em vigor em setembro de 2017, estabeleceu a necessidade de todos os navios cumprirem certas normas das quais se destacam a fase D1 e a fase D2. A fase D1 obriga todos os navios a trocarem as águas de lastro a uma distância de pelo menos 200 milhas náuticas da costa, ou em locais de despejo próprios e devidamente regulamentados, diminuindo assim a probabilidade de organismos presentes nas águas de lastro sobreviverem e se propagarem na costa do novo local. A fase D2, mais rigorosa e ambiciosa, requer o uso de um sistema de tratamento das águas de lastro. O sistema deve garantir que a maior parte dos organismos viáveis morram após o tratamento, de modo a minimizar o impacto ambiental do transporte.
A mesma medida indica que todos os navios produzidos depois de 2017 já devem ter instalados sistemas de tratamento de águas, e até 2024 os restantes navios (mais antigos) também. Caso não cumpram estas diretrizes, serão aplicadas penalizações que variam consoante a gravidade dos atos (BWM Convention, 2004).
1.4 Identificação e monitorização de ENI nos ecossistemas marinhos e costeiros
Para detetar e monitorizar a presença de ENI é necessário recorrer ao uso de métodos de identificação, que podem ser tradicionais ou através de técnicas moleculares. Apesar de serem amplamente usados na identificação de espécies, os métodos tradicionais que usam como base a morfologia para a identificação das espécies, mais recentemente têm sido complementados com métodos moleculares, que têm por base a análise do DNA dos organismos. Devido ao progresso científico, e ao maior conhecimento existente sobre a taxonomia e a genética, o uso exclusivo dos métodos tradicionais é cada vez menos frequente devido a uma série de limitações que possuem, tais como: i) exigirem um elevado grau de conhecimento taxonómico dos organismos, ii) necessitarem de amostras em boas condições, em que os organismos possuam todos os caracteres morfológicos que os permitam diferenciar corretamente, iii) a capacidade de identificação rigorosa das espécies poder ser
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limitada pela fase de desenvolvimento e pelo tamanho dos organismos; frequentemente só o estádio adulto ou organismos de maiores dimensões são passíveis de serem corretamente identificados e iv) a existência de espécies que não possuem caracteres anatómicos diferenciadores (espécies crípticas) em que os métodos morfológicos não são efetivos. Como tal, esses métodos têm sido cada vez mais substituídos ou complementados com métodos moleculares, com especial destaque para o DNA barcoding e o DNA metabarcoding.
O DNA barcoding constitui uma abordagem universal para a identificação de espécies eucariotas, que foi proposta em 2003 por investigadores da Universidade de Guelph, no Canadá (Hebert et al., 2003), e que consiste no uso de sequências curtas de DNA de uma região pré-definida do genoma, funcionando como o equivalente a uma etiqueta para identificação de espécies, ou DNA barcode.
Pretende-se que esta abordagem proporcione identificações mais rápidas e precisas de espécies a partir de uma pequena amostra de tecido das mesmas (Hebert et al., 2003). O pressuposto fundamental desta abordagem é que os DNA barcodes deverão ser muito semelhantes entre indivíduos da mesma espécie, mas diferentes o suficiente para distinguir espécies. Em termos gerais esta abordagem tem sido bem- sucedida, tendo-se revelado eficiente e muito útil na identificação de espécies nos vários reinos de eucariotas, embora com várias exceções bem documentadas (Costa e Antunes, 2012). Esta abordagem tem sido aplicada numa enorme diversidade de estudos como estudos de conservação, estudos de biodiversidade, controlo ambiental e estudo de interações tróficas (Valentini et al., 2009; Taylor e Harris, 2012). De forma simplificada, o DNA barcoding divide-se em 4 etapas): i) isola-se o DNA da espécie em estudo que queremos identificar; ii) amplifica-se a região padronizada do genoma através de uma reação em cadeia da polimerase (PCR), usando primers específicos ou abrangentes; iii) sequenciam-se os produtos de PCR e, por fim, iv) comparam-se as sequências obtidas com as sequências de DNA barcodes existentes nas bases de dados de referência, de forma a identificar a espécie correspondente.
No caso do Reino Animalia, a região do genoma estipulada como DNA barcode é um segmento com cerca de 658 pares de bases localizado na extremidade 5´do gene que codifica a subunidade I da enzima citocromo c oxidase (COI) presente no DNA mitocondrial (mtDNA). A utilização de mtDNA é particularmente útil para amostras com concentrações baixas de DNA ou DNA degradado, uma vez que cada célula contém múltiplas mitocôndrias, podendo possuir por sua vez múltiplas cópias do genoma mitocondrial, que tem a singularidade de ser um cromossoma haploide somente herdado pelo lado materno, fora raríssimas situações, e consequentemente não sofrer recombinações geracionais. Estas características tornam o marcador COI bastante útil devido ao facto da sua taxa de mutação ser rápida o suficiente para distinguir espécies diferentes, mas ao mesmo tempo lenta o suficiente para distinguir
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espécimes da mesma espécie e para conduzir estudos filogenéticos (Hebert et al., 2003; van Oven e Kayser, 2009).
A Barcode of Life Data Systems (BOLD), é uma plataforma informática de acesso livre que, entre várias funções, permite armazenar, analisar e publicar os diferentes registos de DNA barcodes servindo como um instrumento nuclear na implementação do DNA barcoding como sistema universal de identificação das espécies. À data encontram-se no sistema mais de 10 milhões de DNA barcodes pertencentes a mais de 300 mil espécies e um total de 719 mil Barcode Index Numbers (BIN). Os BINs consistem num algoritmo de delimitação de unidades taxonómicas operacionais (OTUs) que agrupam as sequências consoante a sua similaridade, associados a um sistema de indexação permanente (Ratnasingham e Hebert, 2007). Para que sejam introduzidos registos na BOLD, são recomendadas algumas informações adicionais e meta-dados, nomeadamente o local e data de colheita, nome do coletor, o país de origem do espécime usado para gerar a sequência, os cromatogramas das sequências e a sequência consenso (Ratnasingham e Hebert, 2007). Esta ferramenta permite ainda realizar uma série de análises (como análises filogenéticas), que facilitam a implementação e o uso dos DNA barcodes na identificação de espécies e na criação de bibliotecas de referência.
A biomonitorização é essencial para a preservação e gestão adequada dos ecossistemas, sobretudo em regiões de elevada diversidade como é o caso dos ecossistemas marinhos e costeiros. No entanto, devido às limitações anteriormente mencionadas sobre as abordagens tradicionais, que usam como base a morfologia, a metodologia do DNA metabarcoding tem sido cada vez mais usada na inventariação taxonómica das comunidades, em exclusivo ou complementando as abordagens convencionais (Deiner et al., 2018; Djurhuus et al., 2018; Duarte et al., 2021).
O DNA metabarcoding é um método que alia o DNA barcoding com a sequenciação de alto débito. Nesta metodologia, os DNA barcodes são obtidos a partir da biomassa total de uma comunidade de organismos ou de amostras ambientais (por exemplo, sedimento ou água do mar), usando primers de gama larga para o grupo-alvo do estudo (por exemplo, animais, algas, protistas). Milhares a milhões de sequências podem ser obtidas numa única reação, que são posteriormente analisadas através de um fluxo de processamento bioinformático que culmina com a atribuição de uma identificação taxonómica das sequências por comparação com sequências de referência depositadas nas bases de dados genéticas, como a BOLD ou o GenBank (Taberlet et al., 2012a; Pavan-Kumar et al., 2015) (Figura 2).
Apesar de ser uma técnica recente, já existem numerosos estudos que comprovam a sua eficácia e os benefícios do DNA metabarcoding na biomonitorização e estudo de ecossistemas marinhos e costeiros destacando-se: i) a avaliação do impacto de contaminantes (Chariton et al., 2010; Xie et al.,
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2018) e de plataformas de extração de petróleo e de gás (Laroche et al., 2018; Cordier et al., 2019); ii) a identificação de padrões biogeográficos em larga escala (Cahill et al., 2018; Pearman et al., 2020;
Obst et al., 2020); iii) a deteção de nova diversidade molecular e críptica (Carvalho et al., 2019) e iv) a deteção precoce e monitorização de espécies invasoras (Zaiko et al., 2015; Borrell et al., 2017; Rey et al., 2020, Azevedo et al., 2020). As principais diferenças entre as metodologias de DNA barcoding e metabarcoding encontram-se ilustradas na Figura 2.
Para que estes métodos sejam fiáveis e consistentes na identificação taxonómica das sequências geradas, é necessária a compilação de bibliotecas de referência contendo DNA barcodes para as espécies em estudo (Oliveira et al., 2016). Apesar de muitos dos dados depositados na BOLD estarem suportados por espécimes devidamente identificados por especialistas, podem estar igualmente sujeitos a erros operacionais que podem advir da identificação incorreta de espécies, erros laboratoriais, inadequada verificação da qualidade das sequências, entre outros (Paz e Rinkevich, 2021; Oliveira et al., 2016). Como tal, a curadoria das bibliotecas de referência é estritamente necessária, de forma a perceber a origem dos erros e de que forma poderão afetar a identificação taxonómica das sequências geradas pelas metodologias moleculares (Oliveira et al., 2016; Radulovici et al., 2021). Atualmente já existem ferramentas que auxiliam nesse processo como é o caso do Barcode, Audit & Grade System (BAGS; Fontes et al., 2021). Este software realiza uma compilação das sequências dos DNA barcodes de COI de um determinado grupo taxonómico a partir da BOLD, seguida de uma auditoria automatizada em que para cada espécie na biblioteca de referência é atribuída uma de cinco classificações, desde o nível A (concordância consolidada) a E (agrupamento de espécies discordantes), de acordo com os atributos dos dados e congruência dos nomes das espécies com as sequências agrupadas em BINs (Ratnasingham e Hebert, 2013, Fontes et al., 2021).
No entanto, o DNA metabarcoding também apresenta desvantagens e limitações, tais como: i) a inexistente padronização dos protocolos analíticos incluindo a ausência de consenso nos primers a utilizar para cada comunidade alvo; ii) a fraca qualidade ou inexistência de algumas bibliotecas de referência
Figura 2 - Representação esquemática das técnicas de DNA barcoding (cima) e DNA metabarcoding (baixo). Enquanto o DNA barcoding procura e identifica uma espécie específica, o DNA metabarcoding procura obter a identificação de espécies de toda a comunidade.
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nas bases de dados públicas, provocando identificações incorretas, a ausência de identificações ao nível da espécie ou ausência de sequências nas bases de dados genéticas; iii) a ocorrência de falsos positivos, quando são detetadas espécies que estão ausentes da amostra ou do local em estudo, que poderá ocorrer devido a contaminações laboratoriais, e de falsos negativos, quando falha a deteção de espécies presentes na amostra ou local em estudo, devido à ineficiência dos métodos de extração, amplificação;
iv) o constante e rápido avanço das técnicas de sequenciação e das cadeias de processamento bioinformáticas, que necessita de atualizações frequentes e tornam mais difícil a padronização dos protocolos; v) a impossibilidade de identificar a fase do ciclo de vida em que se encontra uma dada espécie e vi) a impossibilidade de obter dados de abundância absoluta das espécies (Duarte et al., 2021).
Estas desvantagens acabam por limitar o uso do DNA metabarcoding, e dificultam a análise e a comparação entre estudos e entre os dados obtidos (Elbrecht et al., 2017). No caso das espécies invasoras as identificações taxonómicas corretas são cruciais, uma vez que a identificação incorreta pode levar a um investimento desnecessário de erradicação sem haver necessidade, ou a situação inversa.
Adicionalmente, a curto prazo, e dependendo da área de estudo, o DNA metabarcoding, tal como o DNA barcoding, pode também ser uma técnica dispendiosa e apenas acessível em determinadas regiões e países. Isto prende-se ao facto desta metodologia necessitar de laboratórios bem equipados de forma a permitir extrair e amplificar eficientemente o DNA das amostras. Os laboratórios devem ser espaços livres de contaminações e possuir equipamento de sequenciação de última geração e idealmente, todas as etapas devem ainda ser realizadas em espaços laboratoriais separados (por exemplo, o pré- processamento de amostras, a extração de DNA, a amplificação), para evitar contaminações, que podem ser preocupantes dada a elevada sensibilidade da técnica (Grant et al., 2021).
No entanto são também conhecidas várias vantagens que levam ao desenvolvimento e ao uso cada vez mais recorrente destas técnicas (Duarte et al., 2021). As principais e mais notórias são: i) o aumento de sensibilidade e precisão relativamente às técnicas tradicionais, uma vez que permite a diferenciação de espécies que sejam morfologicamente muito similares ou a deteção de espécies quando ainda em densidades muito baixas; ii) a deteção e identificação de espécies, independentemente do estado do ciclo de vida em que se encontrem; iii) o elevado rendimento concretizado na possibilidade de identificação simultânea de numerosos organismos numa só amostra, mesmo pertencentes a grupos taxonómicos filogeneticamente distintos; iv) a comparativa rapidez na identificação das espécies e obtenção dos resultados da composição taxonómica das comunidades; v) uma curva de aprendizagem mais curta, comparativamente à envolvida no treino de um taxonomista “tradicional” e vi) a melhoria da relação custo-benefício, com economias de escala, o que permite intensificar as escalas temporais e
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espaciais de amostragem, e como tal gerar uma maior densidade de dados em programas de biomonitorização (Duarte et al., 2021).
As vantagens mencionadas acabam por levar a uma série de novas oportunidades, pois ajudam a uma maior capacidade de diferenciação de espécies, na deteção precoce de ENI e a uma alta resolução e precisão espacial e temporal em trabalhos de bio vigilância. Podem ser utilizados procedimentos de extração de DNA não destrutivos e, como tal, a identificação morfológica dos organismos pode ser confirmada posteriormente. Adicionalmente, como só é necessário muito pouco tecido de cada espécime, é possível guardar grandes quantidades de amostras, e no futuro, com a evolução tecnológica, será possível a sua portabilidade para o campo e efetuar análises in situ. É ainda um método de mais fácil automação, o que em vários campos, nomeadamente na indústria, é algo positivo e prometedor (Duarte et al., 2021).
1.5 Objetivos e pertinência deste estudo
Desde o início da década passada que se tem verificado um aumento progressivo na quantidade de estudos que usam o DNA metabarcoding e a sequenciação de alto débito na monitorização de ENI marinhas, e esses estudos têm-se mostrado eficazes e com um potencial enorme na monitorização da biodiversidade (Duarte et al., 2021). Contudo grande parte dos estudos referidos são focados nas regiões e países do mundo mais afetadas com o aumento de ENI e espécies invasoras, como é o caso da Austrália, Nova Zelândia ou Estados Unidos (Duarte et al., 2021). Em Portugal, contrariamente ao que tem acontecido nos países mencionados anteriormente, a quantidade de estudos que envolvem o uso de técnicas moleculares como o DNA metabarcoding e a monitorização de portos, marinas, navios e estuários é ainda muito baixa (por exemplo, Azevedo et al., 2020), isto apesar da sua localização estratégica e de alta vulnerabilidade como “porta da Europa” entre o Atlântico e o Mediterrâneo.
A nível mundial também se tem constatado que a grande maioria dos estudos que utilizam técnicas moleculares na biomonitorização são bastante gerais não se focando num grupo taxonómico em específico. Os estudos têm incidido sobretudo na análise do DNA ambiental (eDNA) da água ou do sedimento, que tem a vantagem de fornecer potencialmente de forma rápida e eficaz a composição de uma dada comunidade e a deteção precoce de ENI (Duarte et al., 2021). No entanto nem todos organismos são igualmente e facilmente detetáveis através do eDNA por variadas razões. Para tal é necessário amostrar através de diferentes métodos e em diferentes substratos uma vez que asENI têm ciclos de vida e preferência de habitat diferentes, o que poderá influenciar a sua deteção num substrato específico. Estudos preliminares que comparam diferentes substratos encontraram que a diversidade
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total, incluindo diferentes grupos taxonómicos de ENI, apenas foi recuperada quando usando uma combinação de diferentes metodologias de amostragem (Koziol et al., 2018; Leduc et al., 2019; Huhn et al., 2020; Rey et al., 2020; Westfall et al., 2029). Por exemplo, Koziol e colaboradores (2018) observaram que os peixes são detetados sobretudo através da análise do eDNA, por libertarem na coluna de água bastantes vestígios, os nemátodes em sedimentos, os crustáceos usando redes de plâncton e os briozoários e as ascídias, que por serem organismos incrustantes, em substratos duros e artificiais.
No entanto a quantidade de estudos que comparam a eficiência de diferentes metodologias de amostragem na captura de ENI é muito reduzida.
De forma a colmatar estas insuficiências na investigação, o objetivo deste projeto foi a otimização da metodologia do DNA metabarcoding, para a deteção e a monitorização de ENI em marinas de recreação portuguesas, nomeadamente de algumas das etapas da cadeia analítica da metodologia que mais podem influenciar o resultado final, tais como a amostragem no meio natural, a extração de DNA e a seleção da região genética alvo (i.e., primers a aplicar). Para esse efeito, utilizou-se a marina Porto Atlântico, como caso de estudo. Esta marina está localizada no interior do porto de Leixões, um porto amplamente reconhecido em Portugal pelo seu elevado tráfego marítimo e consequentemente um local de risco para a introdução de ENI presentes nas águas de lastro dos variados navios. Mais especificamente pretendemos:
i) compilar uma biblioteca de referência de ENI que ocorrem em Portugal continental; verificar as ausências da biblioteca, isto é, registar quais as espécies que ainda não possuem DNA barcodes;
ii) efetuar uma auditoria à biblioteca de referência, uma vez que é a base de uma identificação taxonómica eficiente das sequências geradas por DNA metabarcoding;
iii) otimizar várias das etapas da cadeia analítica do DNA metabarcoding, nomeadamente as que podem afetar mais a deteção das espécies, como a metodologia de amostragem, a extração de DNA e a região genética alvo. Dada a elevada diversidade filogenética dos invertebrados marinhos o emprego de diferentes regiões genéticas que abranjam a máxima diversidade de grupos taxonómicos pode ser crucial para aumentar consideravelmente o número de espécies detetadas usando DNA metabarcoding.
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2 Materiais e métodos
2.1 Biblioteca de referência
2.1.1 Compilação de uma biblioteca de referência contendo DNA barcodes para espécies não- indígenas (ENI) de invertebrados marinhos que ocorrem em Portugal
Para a biblioteca de referência foi compilada, em primeira instância, uma lista de ENI de inver- tebrados marinhos que ocorrem em Portugal continental. Para tal foi necessário consultar a literatura existente nomeadamente o artigo “Non-indigenous species in Portuguese coastal areas, coastal lagoons, estuaries and islands” (Chainho et al., 2015) e os relatórios anuais do International Council for the Ex- ploration of the Sea (ICES), elaborados pelo grupo de investigação denominado por Working Group on Introduction and Transfers of Marine Organisms (WGITMO), nomeadamente os relatórios publicados en- tre 2015 e 2018. Posteriormente foram validadas, na base de dados World Register of Marine Species (WoRMS), a nomenclatura das espécies e a sua autoridade de forma a descartar possíveis espécies sinónimas e garantir o uso do nome científico atualmente em vigor. Salienta-se o facto de a lista neste momento não ser a mais atual, devido a um relatório mais recente que foi publicado no âmbito da Diretiva-Quadro “Estratégia Marinha Descritor 2 – Espécies não indígenas” (IPMA, 2018).
Após a elaboração da lista de ENI que ocorrem em Portugal continental foi compilado um dataset (DS-NISPTC) na base de dados genética BOLD (http://www.boldsystems.org/), permitindo assim a com- pilação de todos os registos públicos existentes das espécies compiladas num único espaço, contendo bastante informação relativa a cada um dos espécimes usados para gerar os DNA barcodes, nomeada- mente os locais de amostragem dos espécimes, o número de espécimes e de sequências e os marca- dores genéticos utilizados para gerar sequências para cada uma das espécies. Uma vez que a compila- ção de um número considerável de sequências sem qualquer tipo de filtração, excetuando aquela reali- zada pela BOLD, poderia levar à introdução de dados que carecessem de qualidade, foi necessário fazer uma auditoria dos dados, e que se encontra descrita na próxima subsecção.
2.1.2 Auditoria da biblioteca de referência
Nesta segunda fase da auditoria da biblioteca de referência foi utilizada a ferramenta BAGS:
Barcode, Audit & Grade System (Fontes et al., 2021; https://bags.lsd.di.uminho.pt/). Esta ferramenta permitiu, com os dados obtidos na primeira compilação, fazer uma segunda onde foi possível eliminar automaticamente os espécimes com sequências inferiores a 500 pares de bases, espécimes não identi- ficados até ao nível da espécie e que careciam de dados sobre o país/região de origem e continham
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ocasionalmente caracteres ambíguos presentes no nome da espécie e nas sequências de COI-5P e es- pécimes com sequências com um número de Ns superiores a 1%. Ainda utilizando o BAGS efetuou-se uma auditoria, também ela automática, que permitiu de acordo com a qualidade e disponibilidade dos dados diferentes classificações - entre A e E - para cada espécie em que : a classificação “A” indica concordância consolidada, ou seja, as morfoespécies são todas concordantes e estão todas agrupadas no mesmo BIN, além disso, as espécies encontram-se representadas por mais de 10 espécimes na biblioteca; o nível “B” indica concordância basal, que ocorre quando as morfoespécies se agrupam todas no mesmo BIN, que só possui espécimes da mesma espécie, mas há 10 ou menos espécimes na bibli- oteca; “C” indica a existência de múltiplos BINs para a mesma espécie, assinalando que as morfoespé- cies podem ser ligeiramente diferentes, sendo agrupadas em diferentes BINs embora cada um desses BINs só possua membros dessa espécie, esta classificação sugere uma grande diversidade intraespecí- fica; nível “D” indica dados insuficientes, ou seja, quando existem menos de 3 espécimes disponíveis na biblioteca e, por fim, classificação “E”, quando o agrupamento das espécies é discordante, o que acon- tece quando espécies diferentes se agrupam no mesmo BIN (Figura 3) (Fontes et al., 2021).
Após a atribuição das classificações às diferentes espécies foi realizada uma pesquisa manual, na BOLD, com o intuito de perceber qual a origem ou origens das discordâncias encontradas e as razões
Figura 3 - Fluxo de trabalho efetuado pela auditoria automatizada e anotação e de que forma são obtidas as classificações qualitativas para cada espécie a partir de uma biblioteca de referência compilada (adaptado de Oliveira et al., 2016).
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para algumas espécies terem sido classificadas com classificação “E”. As razões podem ser variadas e foram divididas em diferentes categorias adaptadas do artigo “Revision and annotation of DNA barcode records for marine invertebrates: report of the 8th iBOL conference hackathon” (Radulovici et al., 2021).
Os motivos dividiram-se em “MIS-ID”, quando algum registo nesse BIN foi mal identificado devido a má etiquetagem ou má identificação taxonómica, seguindo, em alguns casos, a regra da maioria; “SYN”, quando se verifica que a única diferença se deve à nomenclatura do espécime que pode estar desatua- lizada e “AMBIG”, quando, com o conhecimento atual, não é possível saber a razão da discordância ou quando não é possível identificar o BIN ao nível da espécie. Isto permitiu completar a curadoria e em alguns casos resolver as discordâncias, o que é crucial para obter uma classificação taxonómica o mais confiável possível usando métodos moleculares.
Foram também registadas as distâncias intraespecíficas médias e máximas para cada espécie do dataset com classificação “C”, através da ferramenta Barcode gap analysis da BOLD e a distância
“Kimura 2-parameter” para somente sequências de COI-5P superiores a 500 bp e usando a opção de alinhamento “BOLD Aligner (Amino Acid based HMM)”. Para estas espécies foram também registados o número de BINs e as regiões geográficas dos espécimes usados para gerar os DNA barcodes.
2.2 Otimização de ferramentas moleculares para a deteção e monitorização de ENI 2.2.1 Área de estudo
As amostragens deste projeto foram realizadas na Marina Porto Atlântico (Latitude: 41º 11,0’N;
Longitude: 08º 42,3’W) (Figura 4).
Figura 4 - Imagem satélite da marina do Porto Atlântico inserida no porto de Leixões e dos 3 locais de amostragem (marcados a vermelho). Figura adaptada do Google Maps.
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A marina Porto Atlântico é uma marina de recreio artificial construída em 1992 com capacidade para 240 embarcações, com tamanho máximo de 35 metros e um calado entre 2 e 4 metros. Esta marina localiza-se a 2,5 milhas a norte da foz do rio Douro, no concelho de Matosinhos. A escolha do local deveu-se ao facto de ser uma marina artificial e consequentemente um local de risco de introdução de ENI, devido ao elevado fluxo de navios e pessoas. Para além do mais, esta marina localiza-se mesmo à entrada do porto de Leixões, que é o segundo maior porto artificial de Portugal e o maior da região norte do país. De acordo com o mais recente boletim estatístico anual desta instituição, no ano de 2020 um total de 2477 navios, provenientes de 47 países diferentes oriundos de todos os continentes, embar- caram no porto. Este número foi ligeiramente inferior ao de 2019 (2575), devido à pandemia que afetou o comércio internacional. O porto de Leixões é responsável por aproximadamente 25% de todo o tráfego internacional marítimo português e foram movimentadas no último ano 17 076 085 toneladas de mer- cadoria (APDL, 2020).
As amostragens foram efetuadas em diferentes estações do ano: na primavera, quase transição para o verão – 17 de junho de 2020 (T1), no outono – 14 de outubro de 2020 (T2) e no inverno – 3 de março de 2021 (T3), e em pontos distintos da mesma marina de forma a obter uma maior representati- vidade da comunidade e observar a variabilidade sazonal na riqueza presente ao longo do ano. As amostragens por razões logísticas não foram realizadas em períodos de precipitação e devido aos cons- trangimentos causados pela COVID-19 os substratos artificiais correspondentes ao inverno (T3) ficaram mais 21 dias na coluna de água do que os substratos artificiais usados na primavera (T1) e no outono (T2).
No local de amostragem foram registados alguns parâmetros físico-químicos, nomeadamente a condutividade, a salinidade e o pH recorrendo a uma sonda multiparâmetros (Sea Gauge YSI EXO 2). Os dados da temperatura foram obtidos diariamente através do Instituto Português do Mar e Atmosfera (IPMA) (https://www.ipma.pt/pt/maritima/costeira/index.jsp?selLocal=28&idLocal=28), durante todo o período da experiência (3 de fevereiro de 2020 a 3 de março de 2021) (Tabela 1).
Tabela 1 - Parâmetros físico-químicos da água da marina Porto Atlântico medidos em cada tempo de amostragem. Para o parâmetro temperatura, encontra-se indicado o intervalo de valores obtidos em cada período de exposição dos substratos artificiais e entre parênteses a média dos valores obtidos.
Tempo Salinidade Condutividade
(µS/cm) pH Temperatura
(ºC)
Primavera (T1) 33,2 51,6 8,12 13,0-17,9 (14,7)
Outono (T2) 34,2 53,5 7,71 13,3-18,9 (16,2)
Inverno (T3) 27,1 43,4 7,87 11,8-15,9 (14,1)
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2.2.2 Métodos de Amostragem
Em cada tempo de amostragem, foram usados 4 métodos diferentes de recolha: recolha de água para a análise de DNA ambiental (eDNA); recolha de zooplâncton da coluna de água; recolha de organis- mos incrustantes em substratos duros da marina e recolha de organismos de substratos artificiais tridi- mensionais colocados a colonizar na marina durante períodos fixos de tempo.
2.2.2.1 eDNA
Foi recolhido aproximadamente 1 litro de água a aproximadamente 1 metro de profundidade, junto aos pontões, em frascos de 1L de polipropileno previamente lavados com lixívia 10% e água ultra- pura. Em cada ponto de amostragem cada frasco foi lavado 3 vezes com água do local. Após a recolha, a água foi armazenada no frio a 4ºC por um período máximo de 24h. De seguida a água foi filtrada através de um filtro com poro com 0,45 µm (S-Pak Filters 0.45µm 47mm white gridded, Ref.
HAWG047S6, Millipore), e os filtros guardados a -20ºC até à extração do DNA.
2.2.2.2 Zooplâncton
Para obter amostras de zooplâncton foi utilizada uma rede de plâncton com uma malha com 55 µm, uma abertura de 40 cm de diâmetro e comprimento de 100 cm. Em cada ponto de amostragem, foram realizados 3 arrastamentos de 5 metros durante 40 a 45 segundos mantendo a rede sempre numa posição oblíqua ao longo da coluna de água. Após a recolha, as amostras concentradas foram armazenadas no frio a 4ºC, por um período máximo de 24h. Posteriormente, tal como nas amostras de eDNA, o concentrado amostrado foi filtrado através de um filtro com poro com 0,45 µm (S-Pak Filters 0.45µm 47mm white gridded, Ref. HAWG047S6, Millipore). Os filtros foram armazenados a -20ºC até à extração do DNA.
2.2.2.3 Substratos duros
Em cada ponto da marina, foram efetuadas raspagens de substratos duros submersos, como pontões, cordas e boias, totalizando uma área de 20 x 20 cm, para o interior de “sacos zip” de plástico, que foram armazenados no frio a 4ºC e com água do local, até ao seu processamento. No laboratório, os organismos recolhidos foram lavados e crivados através de um crivo com 500 µm, assim como a água presente nos sacos. As algas recolhidas foram também lavadas e os organismos a elas associadas
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retidos no crivo. Os organismos retidos no crivo foram posteriormente preservados em recipientes con- tendo etanol absoluto e armazenados a -20ºC, até à extração do DNA.
2.2.2.4 Substratos artificiais
Os substratos artificiais tridimensionais consistiram em esponjas de banho de nylon, com uma malha de 1 mm e tamanho máximo de 15 centímetros (compactadas) e 1 metro (abertas). Estes subs- tratos têm a capacidade de reter diferentes organismos e servir de substrato para outros, nomeadamente organismos sésseis. Estes substratos foram imersos durante períodos de 3-4 meses a uma profundidade de 1 metro, e recolhidos e processados nos mesmos tempos de amostragem em que foram realizados os restantes métodos. Em cada tempo de amostragem, os substratos artificiais foram recolhidos e arma- zenados num “saco zip” contendo água do local e armazenados no frio, a 4ºC, até ao seu processa- mento. De seguida todos os organismos retidos nestes substratos foram removidos e passados por um crivo de 500 µm. Os organismos retidos no crivo foram armazenados em recipientes contendo etanol absoluto e armazenados a -20ºC, até extração de DNA.
2.2.3 Extração do DNA
O DNA genómico das amostras de eDNA e de zooplâncton foi extraído de cada filtro usando o kit DNeasy PowerSoil Kit (QIAGEN) e seguindo as instruções do fabricante. Por sua vez, a extração do DNA das amostras provenientes dos substratos artificiais e dos substratos duros foi realizada usando um método de extração não destrutivo adaptado do protocolo “An inexpensive automation-friendly protocol recovering high-quality DNA” (Ivanova et al., 2006). Primeiramente foram adicionadas às amostras a quantidade de Vertebrate Lysis Buffer (VLB) de acordo com as razões peso húmido/volume de tampão necessário (50 a 250 mL). De seguida as amostras foram incubadas durante aproximadamente 14 horas a uma temperatura de 56°C e agitação de 40 rpm numa incubadora (Infors MT Multitron Pro). Após a incubação, 1mL do lisado de cada amostra foi transferido para tubos Eppendorf e centrifugado a 5000 xg durante 5 minutos. Depois misturaram-se 100 µL de Binding Mix (BM) com 50 µL do sobrenadante proveniente da centrifugação, num novo tubo. Essa mesma mistura foi transferida para um tubo con- tendo um spin filter e centrifugada a 5000 xg durante 5 minutos. Adicionaram-se 180 µL de Protein Wash Buffer (PWB) e voltou-se a centrifugar a 5000 xg durante 2 minutos. O sobrenadante foi descartado e adicionados ao tubo 750 µL de Wash Buffer (WB); voltou-se a centrifugar a 5000 xg, durante 5 minutos e descartou-se o sobrenadante (o mesmo processo repetiu-se 2 vezes). Por fim, de forma a eliminar os resíduos de etanol do spin filter, uma vez que poderia interferir com os passos subsequentes, voltou-se
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a centrifugar a 5000xg, durante 5 minutos e os tubos foram colocados a incubar a 56°C, durante 30 minutos. Por fim, adicionaram-se 60 µl de Elution Buffer (EB) e incubou-se à temperatura ambiente durante 1 minuto. Os extratos de DNA foram armazenados a -20°C, até serem enviados para sequenci- ação. Foram também preparados e enviados para sequenciação os controlos negativos e processados com as restantes amostras durante todo o processo de extração. A qualidade e concentrações de DNA de cada amostra, assim como as razões A260/A230 e A260/A280, foram determinadas usando o Na- nodrop (Nanodrop C, Thermo Scientific).
2.2.4 Sequenciação de alto débito
As amostras foram preparadas para sequenciação de Illumina MiSeq para os marcadores dos genes 18S do DNA ribossomal (18S) (região hipervariável V4) e da subunidade I da enzima citocromo c oxidase mitocondrial (COI). O DNA foi amplificado para cada uma das regiões usando primers específicos e posteriormente amplificados novamente numa reação de PCR com um número de ciclos limitado, com o objetivo de adicionar os adaptadores de sequenciação e os índices duplos.
Para a região 18S, as reações de PCR foram realizadas para cada amostra usando o KAPA HiFi HotStart PCR Kit e seguindo as instruções do fabricante. Foram adicionados 0,3 μM de cada primer de PCR: primer forward TAReuk454FWD1 (5’– CCAGCASCYGCGGTAATTCC -3’) e o primer reverse TA- ReukREV3 (5’– ACTTTCGTTCTTGATYRA -3’) (Lejzerowicz et al., 2015) e 50 ng do DNA molde, num volume total de 25 μL. As condições de PCR foram as seguintes: 3 minutos de desnaturação a 95ºC, seguidos de 10 ciclos de 98 ºC durante 20 segundos, 57 ºC durante 30 segundos e 72 ºC durante 30 segundos, e 25 ciclos de 98 ºC durante 20 segundos, 47 ºC durante 30 segundos e 72 ºC durante 30 segundos e uma extensão final a 72 ºC, durante 5 minutos.
Para a região COI, as reações de PCR foram realizadas para cada amostra usando também o KAPA HiFi HotStart PCR Kit e seguindo as instruções do fabricante. Foram adicionados 0,3 μM de cada primer de PCR: primer forward mlCOIintF (5’– GGWACWGGWTGAACWGTWTAYCCYCC-3’) e primer re- verse LoboR1 (5’– TAAACYTCWGGRTGWCCRAARAAYCA -3’) (Leray et al., 2013; Lobo et al., 2013) e 50 ng do DNA molde perfazendo um volume total de 25 μL. As condições de PCR foram as seguintes: 3 minutos de desnaturação a 95 ºC, seguidos de 35 ciclos de 98 ºC durante 20 segundos, 60 ºC durante 30 segundos e 72 ºC durante 30 segundos e uma extensão final a 72 ºC, durante 5 minutos.
Nas segundas reações de PCR foram adicionados índices e adaptadores de sequenciação nas extremidades da região alvo amplificada seguindo as recomendações do fabricante (Illumina, 2013). Os
