Técnica de
Observação de Células e Tecidos
Desenvolvimento da Microscopia
-Microscópio Óptico (luz)
-Microscópio Eletrônico (elétrons)
Microscópio óptico – utiliza feixes de luz
Sistemas de lentes (condensador, objetiva e ocular)
Resolução: menor distância para que duas partículas apareçam como objetos separados. O limite de resolução do MO é de 0,2 µm e depende essencialmente da objetiva.
Microscópio óptico
Desenvolvimento da Microscopia
Microscópio óptico de campo claro
Desenvolvimento da Microscopia
Microscópio óptico de fluorescência
Desenvolvimento da Microscopia
Microscópio óptico de fluorescência
Tipos de microscópios ópticos
Desenvolvimento da Microscopia
Iluminação direta (sem coloração)
Contraste de fase (refração da luz)
Contraste diferencial de interferência (refração da luz)
Microscópio óptico confocal
Desenvolvimento da Microscopia
Microscópio eletrônico -utiliza feixes de elétrons
Desenvolvimento da Microscopia
→Alta resolução, abaixo de 0,3 nm.
→Material biológico é impregnado com metais pesados como ósmio, chumbo e urânio
Microscópio eletrônico de transmissão:
Estrutura e funcionamento
→Alta resolução
→Necessita de cortes muito finos (0,02 a 0,1 µm)
→Material biológico é impregnado com metais pesados como ósmio, chumbo e urânio
→Elétron-denso (escuro) e elétron-lúcido (claro)
Microscópio eletrônico de transmissão
Centro de Microscopia Eletrônica-IB/UNESP
Desenvolvimento da Microscopia
Microscópio eletrônico de transmissão
Desenvolvimento da Microscopia
Microscópio eletrônico de varredura
Desenvolvimento da Microscopia
→Alta resolução
→Fragmentos maiores ou tecidos inteiros
→Material biológico é recoberto com metais como ouro ou platina
→Estrutura tridimensional (3D)
Microscópio eletrônico de varredura
MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA
Microscópio eletrônico
de varredura
Centro de Microscopia Eletrônica
UNESP - Botucatu
microscópio
As células e tecidos precisam estar perfeitamente preservados, apresentando a mesma estrutura e composição química que possuíam quando vivas.
Preparação de material para análise ao microscópio
Fixa FixaFixa
Fixaçççãoçãoão – Preserva a morfologia e composição do tecido. Fixador mais utilizado ão →Formaldeído. Para microscopia eletrônica (ME) os tecidos necessitam de tratamentos especiais em soluções de aldeído glutárico e tetróxido de ósmio.
Preparação de material para análise ao microscópio
Lavagem Lavagem Lavagem Lavagem
Preparação de material para análise ao microscópio
Diafaniza Diafaniza Diafaniza
Diafanizaçççãoçãoão ou ãoou ou ou clareamentoclareamentoclareamentoclareamento – Substituição do etanol por líquido miscível (geralmente xilol) com o meio de impregnação e retirada de lipídios.
Preparação de material para análise ao microscópio
Meio de impregna Meio de impregnaMeio de impregna
Meio de impregnaçççãoçãoão – Substituição do líquido ão (xilol) por parafina ou resina sintética. A resina sintética possibilita cortes mais finos (1 a 2 µm).
O ME necessita de cortes muito finos (0,02 a 0,1 µm) e por isso utiliza se resinas mais duras.
Neste caso os cortes são feitos com navalhas de vidro ou diamante.
Preparação de material para análise ao microscópio
Meio de inclusão Meio de inclusão Meio de inclusão
Meio de inclusão – Suporte para o tecido impregnado.
Preparação de material para análise ao microscópio
MicrMicr MicrMicróóótomoótomotomotomo
Instrumento para cortar finas fatias do tecido (menores que 1µm de espessura).
Preparação de material para análise ao microscópio
MicrMicrMicr
Micróóóótomo automatizado tomo automatizado tomo automatizado – Permite a obtenção rápida de cortes sem tomo automatizado passar pelas etapas descritas antes.
Preparação de material para análise ao microscópio
Micr Micr Micr Micróóótomoótomotomotomo
Realizando cortes do material
Preparação de material para análise ao microscópio
Estufa 60 Estufa 60 Estufa 60 Estufa 60 ooooCCCC
Derreter e eliminar a parafina
Preparação de material para análise ao microscópio
Xilol Xilol Xilol Xilol
Retirada da parafina
S SS
Sééérie alcoérie alcorie alcoórie alcoóóólica lica lica lica ---- Rehidratação.
Hidratação completa
Preparação de material para análise ao microscópio
Coloração
Preparação de material para análise ao microscópio
Hematoxilina/Eosina (HHHHEEEE))))
Coloração freqüentemente utilizada Colora
ColoraColora
Coloraçççãoçãoãoão – A maioria dos corantes utilizados se comportam como ácido ou base.
→Estrutura celular basófila, liga-se a corantes básicos.
→Estrutura celular acidófila, liga-se a corantes ácidos.
Corantes básicos: azul-de-tuluidina, azul-de-metileno, hematoxilina...
Corantes ácidos: eosina, orange G, fucsina ácida...
Além destas colorações frequentemente utilizadas, outros métodos baseados em reações químicas (citoquímica), imunológicas (imunocitoquímica), entre outras, também podem ser empregados.
Preparação de material para análise ao microscópio
Montagem das lâminas
Preparação de material para análise ao microscópio
Análise do Material
