limitações e persp ertilidade de fêmeas

N

REVIEW ARTICLE P

P P P Pububububub.972.972.972.972.972

ISSN 1679-9216 (Online)

Received: January 2011 www.ufrgs.br/actavet Accepted: March 2011 Laboratório de Manipulação de Oócitos e Folículos Ovarianos Pré-antrais (LAMOFOPA), Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias (PPGCV), Faculdade de Veterinária (FAVET), Universidade Estadual do Ceará (UECE), Fortaleza, Brasil. CORRESPONDÊNCIA: L.R Faustino [lrfaustino@gmail.com - Fax: + 55 (85) 3101-9860]. Av. Paranjana n. 1700, Campus do Itaperi, CEP 60740-000 Fortaleza, CE, Brasil.

C C C

C Crrrrriopr iopr iopr iopr iopreser eser eser eser eserv vv v vação de t ação de t ação de t ação de t ação de tecido o ecido o ecido o ecido o ecido ov vv v var ar ar ar ariano: iano: iano: iano: iano: limitações e p limitações e p limitações e p limitações e persp limitações e p ersp ersp ersp erspec ec ec ec ectiv tiv tiv tiv tivas par as par as par as par as para a pr a a pr a a pr a a preser a a pr eser eser eserv eser vv v vação da ação da ação da ação da ação da fffffer er er ertilidade de fêmeas er tilidade de fêmeas tilidade de fêmeas tilidade de fêmeas tilidade de fêmeas

Ovarian Tissue Cryopreservation: Limitations and Perspectives for Female Fertility Preservation L

LL

LLuciana Ruciana Ruciana Ruciana Ruciana Rooooocha Fcha Fcha Fcha Fcha Faustinoaustinoaustinoaustinoaustino,,,,, A A A Adeline de A Adeline de Adeline de Adeline de Adeline de Andrndrndrndrndrade Cade Cade Cade Carade Cararararvvvvvalhoalhoalhoalho,,,,, Calho C C C Cleidson Mleidson Mleidson Mleidson Mleidson Manoanoanoanoanoel Gel Gel Gel Gel Gomes da Somes da Somes da Somes da Somes da Silvilvilvilvilva,a,a,a,a, J J J J José Rosé Rosé Rosé Ricosé Ricicicicarararardo deardo dedo dedo dedo de F

FF F

Figueirigueirigueirigueirigueiredo & Aedo & Aedo & Aedo & Aedo & Ana Pna Pna Pna Paula Rna Paula Raula Raula Raula Ribibibibibeireireireireiro Ro Ro Ro Roo Rooodrodrdrdriguesdriguesiguesiguesigues

ABSTRACT

Background: The ovarian tissue cryopreservation has been achieved a great notoriety in the Reproductive Biology area, due to its potential in preserving female fertility through the protection of exocrine and endocrine functions of the ovary. The association of this technique with in vitro culture and/or transplant in adult or young individuals who has not initiated its reproductive activities represents not only the conservation and perpetuation of the genetic material of economic valuable animals, but also the preservation of female gametes from endangered species, or even from young women who may have ovarian dysfunctions caused by gonadotoxic treatments. Studies with some species (human, mice and ovine) have demonstrated the recovery of the ovarian function and the birth of healthy offspring after transplant of ovarian tissue which has been previously cryopreserved.

However, most studies have shown that ovarian cryopreservation process offer risks to different structures (follicle and stroma) as well as to the different cell types (oocyte, granulosa, thecal and stromal cells), which constitute this tissue.

Review: Extreme cold, intracellular ice crystallization, osmotic shock and the toxicity of the cryoprotectant agents are factors that are usually associated with the injuries caused by the cryopreservation process. As a direct or indirect consequence, those factors limit the success of the cryopreservation of ovarian tissue, since they affect the survival or alter the tissue functionality or cellular structure, like the ovarian follicles, for example, after the thawing/warming procedure. Among the injuries that may take place as a consequence of those factors, we can mention: cell death by the necrotic or apoptotic pathways; alterations in normal levels of genic expression; ischemia and changes of communication and interaction between the oocyte and follicular cells. As a result, many authors have studied and developed protocols of cryopreservation that may prevent or minimize the cryoinjuries, since the cryopreservation per si or combined to other techniques (in vitro culture and/or transplant) can compromise the ovarian integrity, leading consequently to a significant loss of follicles. In this regard, the present review seeks to approach the advantages of the cryopreservation of ovarian tissue; indicating the difficulties and challenges that encompass this procedure, with purpose of pointing out solutions to overcome the damages of ovarian tissue cryopreservation, through of convenient cryopreservation protocols that avoid those follicular losses. For this purpose, it is necessary the preservation of the follicular viability as well as the preservation of the tissue integrity and the contact between reproductive (oocytes) or somatic cells, which are essentials to the follicle development, and, consequently, to the embryo production.

Conclusion: The use of cryopreserved ovarian tissue is an important strategy to the preservation of female fertility. This tool has being pointed as an alternative way to the cryopreservation of mature oocytes and embryos. However, additional studies are necessary to diminishing the cellular damages inherent to this procedure, especially those related to the comprehension of the obstacles and mechanisms associated to the exposition to extreme cold.

Keywords: ovary, ovarian follicle, genetic material, cryoinjuries.

Descritores: ovário, folículo ovariano, material genético, crioinjúrias.

I. INTRODUÇÃO

II. PORQUE CRIOPRESERVAR O TECIDO OVARIANO?

III. CRIOPRESERVAÇÃO DO TECIDO OVARIANO E SUAS LIMITAÇÕES

IV. ALTERAÇÕES DE CÉLULAS OVARIANAS E PERDA FOLICULAR APÓS CRIOPRESERVAÇÃO

1. Necrose 2. Apoptose

3. Modificações na expressão gênica 4. Danos causados pela isquemia

5. Alterações sobre a comunicação e interação celular V. CONCLUSÃO

VI. REFERÊNCIAS

I. INTRODUÇÃO

A criopreservação de células e tecidos tem al- cançado cada vez mais relevância e aplicação médica na criobiologia [27]. Devido à exposição a temperaturas consideradas ultrabaixas, a criopreservação permite que materiais biológicos possam permanecer armazenados por tempo indefinido [5]. Na condição de frio extremo, isto é, a partir de -80 °C [6,7], a difusão celular, ou seja, o transporte de substâncias através da membrana é con- siderado insignificante; consequentemente, as reações metabólicas impulsionadas pela energia térmica ocorrem muito lentamente ou são completamente paralisadas [51].

A criopreservação permite, dessa forma, a con- servação de diversos tipos celulares para fins científicos e/ou terapêuticos. Notadamente, na biologia reprodutiva esta técnica tem recebido grande destaque, visto que a criopreservação de germoplasma tem se tornado cada vez mais necessária na área de biotecnologia animal e humana, em virtude de seu potencial para salvaguardar genótipos valiosos e/ou raros [19,100]. Em fêmeas de mamíferos, uma alternativa bastante promissora é a criopreservação de tecido ovariano, devido não somente seu potencial em preservar o material genético, mas tam- bém por permitir a restauração da fertilidade causada por falha ovariana prematura; tratamentos gonadotóxicos (quimio e/ou radioterapia) e até mesmo após a morte do animal. Desta forma, a implantação de um banco de te- cido ovariano associada a tecnologias de reprodução as- sistida complementares, como o cultivo in vitro e o trans- plante desse tecido, poderá representar uma estratégia para a perpetuação de genótipos valiosos, seja de ani- mais de alta produção [18]; de interesse zootécnico ou espécies em vias de extinção [79]. Além disso, um ban- co de tecido ovariano poderá também manter a preser- vação da função ovariana de mulheres jovens que te-

nham sofrido bloqueio da função reprodutiva por razões diversas, como por exemplo, a submissão a tratamentos tóxicos às gônadas [1].

Nesse sentido, a criopreservação de tecido ova- riano vem sendo amplamente estudada por diversas equi- pes, com o intuito de preservar o grande contingente de material genético das fêmeas, presente nesse tecido. En- tretanto, a exposição do tecido ovariano ao frio extremo pode resultar em injúrias, por muitas vezes irreparáveis, após os procedimentos de criopreservação, não apenas às células foliculares, como também às células do estroma [31]. Essas injúrias afetam a sobrevivência e a função dos folículos ovarianos e podem ser refletidas por danos que podem resultar na perda celular ou má funcionalida- de do tecido, como a necrose, apoptose, desbalanço dos níveis de expressão gênica normais, redução do aporte sanguíneo e interferência na comunicação entre as célu- las foliculares. Diante disso, a presente revisão tem por objetivo descrever as vantagens da criopreservação de tecido ovariano; abordando as dificuldades e desafios inerentes a esse processo, com a finalidade de encontrar soluções alternativas para que a criopreservação alcance um patamar ótimo para aplicação clínica.

II. PORQUE CRIOPRESERVAR O TECIDO OVARIANO?

Atualmente, a criopreservação de embriões é o método de preferência para preservação da fertilidade de fêmeas devido às boas taxas de sobrevivência, im- plantação e nascimento após descongelação/aquecimento [88]. Contudo, para realização desse procedimento se faz necessária a estimulação hormonal da fêmea para coleta dos oócitos e a presença de um parceiro ou do uso do sêmen de um doador para fecundação dos oócitos coletados para, então, prosseguir com a produção de embriões [88,97]. Em virtude desses fatores, bem como às baixas taxas gestação após criopreservação de oócitos maturos ou imaturos (solução alternativa para preserva- ção do material genético de fêmeas), a criopreservação de tecido ovariano tem se destacado como uma escolha promissora à preservação da fertilidade e restauração da função reprodutiva e endócrina das fêmeas.

A criopreservação do tecido ovariano implica na preservação de milhares de oócitos inclusos em folículos pré-antrais, presentes no córtex do ovário. Nesse con- texto, os folículos pré-antrais têm-se tornado um impor- tante alvo de programas de criopreservação, em especial os folículos primordiais, devido ao seu pequeno tama- nho e sua relativa quiescência [35,43,73]. Além disso, a

N

de estimulação hormonal [97], permitindo que o tecido ovariano seja imediatamente coletado em qualquer mo- mento da vida da fêmea, reprodutiva ou não, bem como após a morte da mesma [83]. Somado a essas vantagens, a criopreservação de tecido ovariano pode ser também uma alternativa promissora para preservar a fertilidade de mulheres em idade reprodutiva portadoras de cânce- res, antes de tratamentos como a quimio/radioterapia, que são tóxicos às gônadas, evitando o atraso do tratamento, visto que a indução da ovulação não é necessária. Ade- mais, a criopreservação de tecido ovariano pode ser apli- cada particularmente em crianças e jovens, que em vir- tude das questões éticas sobre indução da ovulação e aspiração folicular, não são candidatas para criopreservação de embriões [26,77,88,97]. A criopreservação de tecido ovariano apresenta ainda como vantagem o não envolvimento com questões religiosas, éticas e legais, no caso de humanos, como por exemplo, o destino de embriões criopreservados em caso de di- vórcio, doenças graves ou falecimento de um dos cônju- ges.

O tecido ovariano criopreservado pode ter dois destinos: o transplante, no qual a maturação folicular ocorre in vivo [25] e o crescimento folicular in vitro atra- vés de sistemas de cultivo [97]. No que se refere ao trans- plante de tecido ovariano criopreservado, existem várias opções disponíveis: o alotransplante (dentro da mesma espécie) e o xenotransplante (entre espécies diferentes), transplantes que necessitam de tratamentos imunossupressores, e o autotransplante (no mesmo ani- mal), o qual evita a utilização de tratamentos imunossupressores. Este último pode ser ainda, classifi- cado em ortotópico, no qual o tecido é transplantado para seu local de origem e a fêmea torna-se capaz de levar a concepção natural, ou heterotópico, método alternativo, no qual o tecido é transplantado para uma região dife- rente da original [95,97].

Apesar do transplante ser uma excelente opção para a reutilização do tecido ovariano após criopreservação, essa prática pode representar para o in- divíduo, em algumas situações, o risco de reintrodução ou recidiva de doenças após o enxerto do mesmo. Além disso, o transplante pode significar um custo bastante elevado para o produtor ou paciente, bem como repre- sentar uma situação de inconveniência pelo fato da ne- cessidade de imunossuprimir, em alguns casos, o indiví- duo que recebe o enxerto, submetendo-o a complicadas

situações de estresse.

Essas observações poderiam ser contornadas através do cultivo in vitro, por meio da produção de em- briões, a partir da fecundação de oócitos oriundos de folículos pré-antrais crescidos e maturados in vitro. Con- tudo, apesar de vários sistemas de cultivo terem sido desenvolvidos visando suportar o crescimento in vitro de folículos pré-antrais para produção de oócitos meioticamente competentes, que podem ser fertilizados e produzir descendentes em camundongos [17,28,56,102], ainda existem limitações nos sistemas de cultivo dessa classe folicular, sobretudo em folículos primordiais de animais de produção e humanos, tornan- do o cultivo in vitro uma alternativa ainda sem aplicação prática [101]. Nesse contexto, atualmente, várias equi- pes têm realizado pesquisas, visando estabelecer siste- mas de cultivo eficientes que assegurem a sobrevivên- cia, o crescimento e a maturação in vitro de oócitos in- clusos em folículos pré-antrais em animais (camundon- gos [74], ovelha [90], cabra [84] e humanos [87,101]).

III. CRIOPRESERVAÇÃO DO TECIDO OVARIANO E SUAS LIMITAÇÕES

Diante da importância da criopreservação do te- cido ovariano e dos milhares de folículos presentes neste tecido, diversos autores têm estudado e desenvolvido protocolos de criopreservação. Entretanto, as condições extremas em que os ovários são submetidos durante esse procedimento podem danificar a integridade do folículo e resultar em crioinjúrias após a descongelação/aqueci- mento [96]. Esses danos podem ser ocasionados em de- corrência do frio direto, temperaturas não fisiológicas e a exposição a agentes crioprotetores. Nesse contexto, alguns entraves da criopreservação, relatados a seguir, devem ser contornados para obtenção de resultados satisfatórios com maior repetibilidade e em diferentes espécies, uma vez que o nascimento após criopreservação de tecido ovariano tem sido limitado a camundongas [58,59], ovelhas [11,47] e mulheres [87,101].

A criopreservação do tecido ovariano, seja por congelação lenta ou por vitrificação, por si mesma, é um desafio para a criobiologia, haja vista a sua composição, que inclui diferentes tipos celulares, como as células do estroma; folículos em diferentes estágios de desenvolvi- mento; células da granulosa e da teca; vasos sanguíneos e nervos, os quais podem exigir diferentes condições para o processo de criopreservação. Essa variedade celular dificulta a difusão de água e crioprotetor [42], compro-

metendo a sobrevivência de cada compartimento celular pós-criopreservação [40]. Além disso, a congelação len- ta, método convencional de criopreservação, causa cris- talização do gelo intracelular e choque osmótico (efeito solução), que levam a danos na célula [65,66,76]. A vitrificação, método alternativo de criopreservação, evi- ta a formação de cristais de gelo, no entanto, exige a exposição do tecido ovariano a altas concentrações de agentes crioprotetores, as quais podem ser tóxicas às cé- lulas [78], caracterizando-se, portanto como o principal inconveniente deste método.

A formação de cristais de gelo intracelular é con- siderada um obstáculo de grande relevância, uma vez que a expansão desses cristais dentro da célula causa um aumento de pressão, tencionando as organelas, que po- dem sofrer consideráveis danos [49]. Conforme pode ser observado através de análise ultraestrutural, as mudan- ças observadas na estrutura celular, principalmente a pre- sença de áreas vazias no citoplasma, sem membranas ao redor, provavelmente estão relacionadas com a cristali- zação. O dano às organelas, observável apenas por meio desse tipo de análise, pode ser a causa da falha no desen- volvimento de células aparentemente normais após o processo de criopreservação [60] (Figura 1). A formação de gelo acontece quando o efluxo da água intracelular não ocorre de modo eficiente, impossibilitando uma de- sidratação celular adequada. Neste caso, a água que per-

manece no interior da célula congela, formando, então, os cristais de gelo. A quantidade e o tamanho dos cristais de gelo que se formam no interior da célula dependem da taxa de resfriamento [71].

De acordo com algumas evidências, autores acre- ditam que os cristais de gelo podem se formar por meio de proteínas localizadas na membrana que formam po- ros, denominadas aquaporinas [64], conhecidas também como canais específicos para o transporte de água. Ou- tra hipótese é que o gelo possa ser formado por meio de junções comunicantes do tipo gap [10,48]. Outros auto- res sugeriram que a interação do gelo com a membrana plasmática provoca uma mudança estrutural na superfí- cie da membrana interna, resultando em um aumento na eficiência da nucleação de gelo intracelular [93,94].

Muldrew & McGann [69,70], no entanto, propuseram um mecanismo completamente diferente, no qual os au- tores acreditam que o gelo se forma através da membra- na após a formação de uma lesão, como resultado do gradiente de pressão osmótica, e efluxo de água resul- tante do super-resfriamento.

Independente do modo como os cristais de gelo são formados no interior da célula, a formação desses cristais precisa ser prevenida por meio da remoção da maior quantidade de água intracelular possível, o que ocorre quando o resfriamento é suficientemente lento, na tentativa de evitar a injúria celular. Contudo, a remo-

Figura 1. Fotomicrografia eletrônica de folículos criopreservados. (A): Visão geral de um folículo danificado, com perda do conteúdo citoplasmático de células da granulosa (*) (ampliado 2050 vezes). (B): Oócito, com aparência anormal do ooplasma e grandes espaços vazios (*), e as mitocôndrias, sem cristas e matriz granulada (setas pequenas) (aumento de 4500 vezes). Note o aspecto coagulado do ooplasma e a vacuolização do oócito e das células da granulosa (setas grandes). O: oócito; G: células da granulosa. Imagem concedida por Lucci et al. [60] e autorizada pela Elsevier.

N

por meio do efeito do meio intracelular altamente con- centrado nas membranas, conhecido como efeito solu- ção [76]. Esse termo foi criado para descrever, de manei- ra coletiva, os danos resultantes da exposição relativa- mente longa das células ao frio que podem alterar as pro- priedades das soluções intra e extracelular [67]. Meryman e colaboradores [68] sugeriram que os danos do efeito solução podem ser descritos como um evento físico e não biológico, no qual o aumento da concentração de eletrólitos e outros solutos no meio extracelular e a desi- dratação celular resultante têm sido propostos como a origem de danos [27].

Como consequência, todos os fatores mencio- nados, isto é, a formação de cristais de gelo, o choque osmótico e a toxicidade dos crioprotetores limitam o su- cesso da criopreservação, pois afetam a sobrevivência e alteram a funcionalidade dos folículos ovarianos após o procedimento de criopreservação do tecido ovariano.

IV. ALTERAÇÕES DE CÉLULAS OVARIANAS E PERDA FOLICULAR APÓS CRIOPRESERVAÇÃO

A criopreservação do tecido ovariano por si só ou aliada aos problemas inerentes ao transplante, como a isquemia, e/ou ao cultivo folicular pode levar a diver- sos danos celulares, que por sua vez, podem resultar em uma significativa perda folicular, conforme será aborda- do a seguir.

1. NECROSE

Dentre os possíveis danos que a criopreservação pode acarretar, a necrose é apontada, por alguns estudos, como responsável por consideráveis perdas foliculares.

A morte celular por necrose, conhecida como uma mor- te celular passiva, ocorre, geralmente, como consequência de estresse fisio-químico extremo [41,54], como: calor, choque osmótico, estresse mecânico, congelação- descongelação e altas concentrações de peróxido de hi- drogênio [54].

Esse tipo de morte celular é caracterizado morfologicamente pelo aumento do volume celular, de- sorganização do citoplasma, disfunção mitocondrial, colapso de organelas e perda da integridade da membra- na plasmática. Consequentemente, ocorre a ruptura da célula com liberação de seu conteúdo para o meio extracelular [32,39,41,107], causando dano às células vizinhas e uma reação inflamatória no local [106].

O íon cálcio (Ca⁺⁺) e as espécies reativas de oxi- gênio (EROs) são os principais responsáveis pelas fases

de propagação e execução desse tipo de morte celular, provocando, direta ou indiretamente, danos às proteínas, lipídios e DNA [32]. Conforme pode ser observado na figura 2, o aumento da concentração de Ca⁺⁺ intracelular, seja pela ativação de canais de Ca⁺⁺ da membrana plasmática ou pela liberação do retículo endoplasmático, ativa as calpaínas (proteases de cisteína dependentes de Ca⁺⁺), estimula a atividade do ciclo de Krebs e a produ- ção de EROs [107]. A ativação de calpaínas sinaliza a mobilização de catepsinas lisossomais e outras hidrolases [89,107], que, uma vez ativadas, danificam organelas e causam proteólise do material citoplasmático [32,89], resultando na morte da célula.

Apesar de ser considerada uma resposta passi- va, estudos recentes têm apontado que a ativação de re- ceptores de morte, uma via comum na morte por apoptose, que será abordada no próximo tópico, pode levar a uma forma de necrose programada dependente da quinase RIP1, denominada necroptose [21]. A RIP1 ativa o com- plexo de poro de transição da permeabilidade (mPTP), resultando na alteração da permeabilidade mitocondrial e morte celular [41]. Esse mecanismo parece funcionar como um dispositivo celular de segurança para garantir a eliminação de células danificadas sob condições de estresse quando a apoptose é inibida [21].

Estudos em camundongas têm mostrado que a proporção de áreas necróticas em ovários submetidos à criopreservação (congelação convencional ou vitrificação) e cultivo folicular foi significativamente superior ao tecido fresco [14,15]. Contudo, a causa do desenvolvimento de necrose ainda não está completa- mente elucidada. Em humanos, Rahimi et al. [80] com- pararam a área de necrose no tecido ovariano após a con- gelação convencional ou vitrificação, com subsequente xenotransplante em camundongos imunodeficientes. A avaliação de áreas necróticas, utilizando o corante Lucifer Yellow VS (LYVS), não mostrou aumento significativo nas amostras de tecido ovariano após criopreservação e transplante em comparação com o grupo controle (não criopreservado e não transplantado). Esse resultado con- firma a hipótese de que o tecido ovariano criopreservado após transplante pode recuperar-se dos danos sofridos através da neovascularização, importante para a sobre- vivência do enxerto. Uma inadequada neovascularização causa redução do suprimento de nutrientes e oxigênio para o tecido implantado e, então, segue-se a morte celu- lar [80]. No entanto, é importante salientar que na litera- tura esse tipo de morte celular é pouco abordado. A grande maioria dos trabalhos concentra seus esforços no

FFigura 2

cussão a cerca da morte patológica escassa. Nesse senti- do, sugere-se que mais estudos devem ser realizados, a fim de se desvendar o papel da necrose nos procedimen- tos de congelação e vitrificação.

2. APOPTOSE

Embora alguns estudos tenham sugerido que a perda de folículos após criopreservação ocorra pelo pro- cesso de necrose, resultante da formação de gelo intracelular e estresse osmótico [33,67], a maioria dos estudos sugere que as células criopreservadas são elimi- nadas pelo processo de apoptose [30].

A apoptose, conhecida também como morte ce- lular programada, é morfologicamente caracterizada pela condensação da cromatina (picnose celular), fragmen- tação específica do DNA a cada 180 a 200 pares de base, perda de volume celular e formação de protuberâncias na membrana plasmática (blebs) e de corpos celulares condensados, conhecidos como corpos apoptóticos [45,91,107].

Esse tipo de morte celular pode ocorrer por duas

vias: extrínseca e intrínseca (Figura 3). A via extrínseca é estimulada por receptores de morte, como o receptor Fas e o TNFR, localizados na membrana plasmática. A ativação dos receptores de morte prossegue com a sina- lização de caspases iniciadoras (caspase-8 e -10), que ativam outras caspases efetoras, como a caspase-3. Em contraste, a via intrínseca é iniciada através da liberação de fatores apoptogênicos da mitocôndria, como o citocromo c e o fator indutor de apoptose (AIF), no meio intracelular, sendo este processo regulado por proteínas da família Bcl-2, como o fator anti-apoptótico Bcl-2 e o pró-apoptótico Bax. A liberação do citocromo c forma um complexo no citoplasma com a proteína adaptadora Apaf-1 (fator ativador de protease apoptótica-1), que ativa a caspase-9. Em contrapartida, a caspase-9 se acopla ao citocromo c e a Apaf-1 para formar o complexo apoptossoma, que ativa a caspase-3. A caspase-3 ativa cliva, então, uma série de substratos e aciona DNAse, coordenando a destruição da célula. Como consequência as células são fagocitadas, prevenindo uma resposta in- flamatória [20,45,55,91].

Em humanos, Martinez-Madri et al. [61] não

Figura 2. Participação do Ca⁺⁺ e das espécies reativas de oxigênio (EROs) na execução da morte celular por necrose.

N

método de terminal deoxynucleotidil tranferase-mediated deoxyuridine triphosphate biotin nick end-labeling (TUNEL) ou expressão de caspase-3 ativa em folículos primordiais ou primários, após exposição e perfusão do crioprotetor ou criopreservação propriamente dita. Além disso, após vitrificação, a marcação pelo TUNEL não foi observada [44] ou foi similar ao tecido não vitrificado [98,105]. Em concordância, foi demonstrado recentemen- te que a vitrificação de tecido ovariano humano não afe- tou a expressão das proteínas Bax e Bcl-2 [24].

Análises por PCR em tempo real (qPCR) em homogeneizados de tecido ovariano suíno revelaram

valores similares de taxa Bax/Bcl-2 em ambos os teci- dos frescos e criopreservados [46]. Resultados semelhan- tes também foram observados em um estudo com con- gelação de ovários inteiros de ovelhas, no qual não fo- ram observadas diferenças significativas nas taxas de sobrevivência vascular ou folicular, antes e após conge- lação-descongelação [2]. Nesta mesma espécie, Bedaiwy et al. [8] compararam aplicações do mesmo protocolo de congelação lenta com ovário inteiro junto com o pedículo vascular (n = 11) e fragmentos ovarianos (n = 6). As lesões da criopreservação não foram associadas com alterações no padrão de expressão das proteínas Bcl- 2 e p53. Utilizando a técnica de TUNEL, outros autores

Figura 3. Representação dos eventos apoptóticos observados nas vias extrínseca e intrínseca.

não observaram qualquer indução de apoptose em folículos primordiais ou primários ovinos após a descongelação do córtex ovariano [23] ou ovário inteiro [9]. Estudos com camundongos também não evidencia- ram diferenças no grau de apoptose entre o tecido ovari- ano vitrificado e o fresco [62,63].

Apesar dos estudos citados não terem relatado o fenômeno da apoptose associado com o processo de criopreservação do tecido ovariano, os danos deste teci- do após criopreservação não podem ser negligenciados, podendo a redução do número de folículos sobreviven-

tes após esse procedimento estar relacionada com esse tipo de morte celular. De acordo com Zhou e colabora- dores [105], para análise do fenômeno apoptótico, é in- teressante a associação de técnicas de detecção de apoptose combinada com a detecção de genes envolvi- dos com a sobrevivência, uma vez que esses procedi- mentos podem avaliar a apoptose do tecido ovariano de forma mais apropriada, visto que algumas células po- dem não ser marcadas pela técnica de TUNEL, devido à perda do DNA fragmentado ou à falta do plano do nucléolo.

Em contraste com os resultados acima, Rimon et al. [82] relataram através da detecção por TUNEL a indução de apoptose em folículos primordiais e primári- os após congelação de fragmentos de córtex ovariano humano. Esses autores demonstraram que folículos ova- rianos criopreservados apresentaram uma maior incidên- cia de apoptose (60,9%) em comparação com os do teci- do fresco (25,4%). Mais recentemente, outro trabalho demonstrou que o processo apoptótico foi aumentado após congelação/descongelação, quando comparado com tecido cortical ovariano humano fresco, revelando au- mento no número de células foliculares TUNEL positi- vas, bem como aumento da detecção da capase-3 ativa- da e da proteína Bax [30] (Figura 4). Rahimi et al. [81]

avaliaram o efeito de diferentes protocolos de vitrificação sobre os níveis de EROs e de apoptose em tecido ovari- ano humano. Com esse estudo, os autores demonstra- ram que o tecido resfriado de forma mais lenta, aumen- tou os níveis de EROs e apoptose após o aquecimento.

O aumento da apoptose em células da granulosa após criopreservação, provavelmente foi causada por altera- ções físicas devido à baixa temperatura, altas concentra- ções de sais e metabolismo antioxidante deficiente [92].

Siebzehnrubl et al. [86] sugeriram que as células da granulosa são mais vulneráveis às crioinjúrias em com- paração com os oócitos quando o tecido ovariano huma- no é congelado. Além de células foliculares, as células do estroma também podem sofrer apoptose. Em macacas, por exemplo, as células do estroma apresentaram um nível superior de marcação para o TUNEL após criopreservação quando comparado ao tecido fresco [50].

Para contornar os efeitos da apoptose, um estu- do anterior examinou os efeitos da adição de um agente anti-apoptótico, a esfingosina-1-fosfato (S-1-P), na criopreservação de ovário, porém, os resultados não melhoraram a posterior viabilidade do tecido ovariano criopreservado [75]. Por outro lado, foi demonstrado em um estudo recente que a adição de um inibidor global de caspase (Z-VAD-FMK) diminuiu a incidência de apoptose no tecido ovariano de camundongas induzida pela criopreservação, melhorando a eficácia da criopreservação de tecido ovariano [104].

3. MODIFICAÇÕES NA EXPRESSÃO GÊNICA

Além da morte celular desencadeada pela necrose e apoptose, alguns estudos têm demonstrado que

Figura 4. Painel mostrando diferentes formas de detecção de apoptose em um folículo primordial incluso em tecido ovariano congelado-descongelado. (A): Coloração de Masson.

(B): Técnica de TUNEL, nucléolo da célula da pré-granulosa marcado positivamente em marrom escuro (seta). (C): Marcação positiva da caspase-3 ativa. (D): Detecção da prote- ína BAX. Imagem concedida por Fauque et al. [30] e autorizada pela Elsevier.

N

com o comprometimento de importantes genes que re- gulam o desenvolvimento folicular. Utilizando um mé- todo modificado de microarranjo de expressão de cDNA, a expressão gênica em folículos de camundongas, após criopreservação foi estudada [57]. Nesse estudo, 66 genes foram detectados após criopreservação. Quando anali- sado cada gene separadamente, 44 genes não foram sig- nificativos em termos de expressão, 11 estavam supri- midos, seis foram superexpressos e cinco foram ativados por causa da criopreservação. Dos seis genes superexpressos e cinco ativados, três eram proteínas de choque térmico, um era proteína de dano no DNA indu- zido pela proteína 45 e dois genes foram associados com a apoptose (Fas, Fas-ligand). Dos 11 genes suprimidos, um era uma proteína quinase, quatro eram receptores e um era uma citoquinase. Para esses autores, o estudo dos perfis de expressão gênica pode facilitar o desenvolvi- mento de estratégias que otimizem as técnicas de criopreservação, uma vez que as respostas biológicas dos folículos são dependentes da ativação, expressão e pro- dução de genes, cujas alterações no padrão de expressão acabam interferindo no comportamento celular.

Ao estudarem o proteoma do tecido ovariano bovino criopreservado, Kim et al. [53] mostraram alte- rações no perfil e expressão de proteínas após transplan- te. As proteínas identificadas estavam relacionadas com a sobrevivência e o metabolismo dos tecidos, como a actina e laminina, e propriedades antioxidantes, como a glutationa S-transferase. Além disso, observações de que a criopreservação do tecido ovariano é responsável por retardar o desenvolvimento de folículos pré-antrais du- rante o cultivo in vitro [85], levaram Choi et al. [14] a estudarem os efeitos da criopreservação sobre a prolife- ração das células da granulosa em cultivo de folículos pré-antrais de camundongas. Os autores pretendiam com- preender o mecanismo tardio do desenvolvimento folicular e concluíram que a criopreservação suprime temporariamente a proliferação das células da granulosa de folículos pré-antrais, através da redução da expressão de proteínas do ciclo celular, no caso a ciclina D2, Cdk4, ciclina E e Cdk2.

Também foi observada uma redução significati- va na taxa de desenvolvimento, após o cultivo in vitro de folículos primordiais criopreservados, seja por congela- ção ou vitrificação, associada com uma ligeira redução nos níveis de expressão de RNAm para o fator de cresci- mento e diferenciação-9 (GDF-9), para subunidade alfa da inibina e para a proteína ZP3 [15]. No entanto, outros

trabalhos demonstraram que as funções de vascularização do estroma ovariano permanecem normais após conge- lação e transplante, determinado por imunolocalização de marcadores específicos da vascularização e prolifera- ção celular como o fator VIII (marcador de células endoteliais), o fator de crescimento do endotélio vascular – VEGF (expresso por células do músculo liso e por pericitos, que são células do tipo mesenquimal, associa- das com as paredes de pequenos vasos sanguíneos), SMCA (marcador de células do músculo liso e pericitos) e antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA) [38].

Outro estudo também demonstrou que ovários inteiros de ovinos criopreservados e transplantados também ex- pressaram o fator VIII [2].

Recentemente, Jin et al. [50] observaram que as células da granulosa de folículos inclusos no tecido ova- riano criopreservado e cultivado por 48 horas mantive- ram a capacidade de proliferação e sustentaram a ex- pressão de subunidades da ativina e pSmad2, importan- tes indicadores de crescimento e desenvolvimento folicular. De forma contrária, Depalo et al. [24] verifica- ram que a criopreservação tem um efeito inibitório sobre os níveis de RNAm para o receptor beta de estradiol (ERβ), apontando também que as injúrias da criopreservação podem ser associadas com o compro- metimento na expressão de importantes fatores associa- dos com a sobrevivência folicular.

4. DANOS CAUSADOS PELA ISQUEMIA

Durante a criopreservação e subsequente trans- plante, o tecido ovariano pode ainda estar sujeito aos danos ocasionados pela isquemia, ou seja, pela redução do leito sanguíneo no tecido vascular. Esta interrupção do aporte de oxigênio tem sido relacionada a uma eleva- da taxa de perda folicular pós-transplante [4,36].

Em geral, conforme relatado por Varghese et al.

[97], um grande número de folículos (até dois terços) é perdido logo após o transplante de tecido ovariano criopreservado. No entanto, segundo esses autores, esta perda deve estar mais associada com a isquemia pós- transplante do que pelo procedimento de criopreservação.

Em concordância, Aubard et al. [3] ao investigarem a contagem folicular e a eficiência do transplante heterotópico de tecido ovariano ovino fresco em compa- ração com transplante ovariano congelado e desconge- lado, concluíram que o fator chave para a sobrevivência folicular e o restabelecimento da ovulação foi o tempo de isquemia pós-transplante, mostrando que a redução do tempo de isquemia após reimplante é crucial para o

retorno da função reprodutiva de enxertos de tecido ova- riano. De forma semelhante, através de estudos recentes com ovários de camundongas foi confirmado que a so- brevivência tecidual é melhor mantida com a redução do tempo de isquemia [16].

Alguns trabalhos apontam que a maior perda folicular ocorre de forma mais aguda após transplante do que após procedimento de congelação-descongelação.

Baird et al. [4] estimaram que a perda dos folículos devi- do à criopreservação é de 7% e devido à isquemia pós- transplante em torno de 60% a 70%. Isso confirma os resultados obtidos previamente em diferentes espécies, que mostraram uma substancial perda folicular após trans- plante do córtex ovariano devido os danos por isquemia, ocorrendo antes do estabelecimento de neovascularização [99,103,105]. Isso confirma a hipótese de que os folículos morrem mais por isquemia durante o transplante do que devido aos prejuízos causados pelo processo de criopreservação [12]. Em ovelhas, Imhof et al. [47] rela- taram a gestação e o nascimento após a reanastomose microvascular ortotópica de ovários ovinos inteiros con- gelados e descongelados. Contudo, a perda folicular foi alta, conforme revelado através de avaliação histológica (taxa de sobrevivência folicular média de aproximada- mente 4,3%), sugerindo a necessidade do aperfeiçoamen- to dos protocolos de criopreservação, bem como do trans- plante de tecido ovariano, de modo a aumentar o índice de sobrevivência folicular.

5. ALTERAÇÕES SOBRE A COMUNICAÇÃO E INTERAÇÃO CELULAR

Para obtenção de oócitos meioticamente com- petentes, além da viabilidade do oócito e das células da granulosa, a presença de junções do tipo gap e coopera- ção metabólica entre essas células são requeridas [52].

No entanto, os protocolos de criopreservação também podem afetar interações cruciais entre o oócito e as célu- las da granulosa. Segundo Irimia & Karlsson [48], as interações célula-célula são significativamente afetadas pela presença de cristais de gelo intracelular. Além dis- so, a imersão em solução hipertônica causa retração ce- lular, a qual pode romper as células da granulosa e as junções comunicantes do tipo gap com o oócito, consi- deradas vitais para o transporte de nutrientes e molécu- las regulatórias [37]. Nesse contexto, a manutenção das junções gap entre ambos os tipos celulares é fundamen- tal para um desenvolvimento folicular apropriado e ab- solutamente necessário para a maturação do oócito.

Em função da importância das conexões menci- onadas acima, a abundância de duas importantes trans- crições de junção gap, Gja4 (conhecido como conexina 37) e Gja1 (conhecido como conexina 43), foi caracteri- zada entre folículos criopreservados e frescos durante o desenvolvimento in vitro, mostrando que o processo de criopreservação resultou em injúrias a alguns oócitos e células da granulosa [101]. Somado a isso, tem sido rela- tado que a criopreservação de folículos pré-antrais ovi- nos, seguida de crescimento in vitro, afeta especifica- mente a permeabilidade das junções gap e prejudica a progressão de processos reguladores, tais como a aquisi- ção de uma configuração específica da cromatina do oócito [13]. Além disso, George et al. [34] demonstra- ram que a criopreservação dos oócitos de camundongos e humanos prejudicam a organização dos microtúbulos e microfilamentos e, recentemente, Navarro-Costa et al.

[72] também demonstraram que a criopreservação de tecido ovariano interfere na interface granulosa-oócitos induzindo uma clara diminuição na interação celular atra- vés de processos transzonais contendo actina filamentosa.

O comprometimento da integridade da interface oócito-granulosa, que pode ocorrer durante a criopreservação, sugere que a otimização de protocolos de criopreservação ainda é requerida para evitar quebra das rotas de comunicação celular no ovário, uma vez que a orientação célula-célula alterada pode resultar na difusão de sinais parácrinos longe das células-alvo [97].

Portanto, é imprescindível preservar a viabilidade folicular, bem como a integridade do tecido e o contato estreito entre oócitos e células somáticas, igualmente importantes para o desenvolvimento dos folículos du- rante a maturação in vitro [57].

V. CONCLUSÃO

De certa forma, a utilização do tecido ovariano criopreservado como uma estratégia para a preservação da fertilidade de fêmeas pode ser considerada um campo relativamente novo na biologia reprodutiva. Até recen- temente, somente a criopreservação de oócitos maturos e de embriões eram considerados como as opções clíni- cas disponíveis para se alcançar gestação e nascimento de indivíduos saudáveis. Entretanto, devido à evolução da criotecnologia, a criopreservação de tecido ovariano tem sido apontada como uma terceira via para esse fim.

No entanto, estudos adicionais são necessários nesta área com o objetivo de reduzir os danos durante o procedi- mento de criopreservação, uma vez que a quantidade de

N

são dos mesmos. Nesse sentido, o entendimento dos obs- táculos e dos mecanismos associados à exposição ao frio é de extrema importância para alcançar esse objetivo,

VI. REFERÊNCIAS

1 Andersen C.Y., Rosendahl M., Byskov A.G., Loft A., Ottosen C., Dueholm M., Schmidt K.L.T., Andersen A.N. &

Ernst E. 2008. Two successful pregnancies following autotransplantation of frozen/thawed ovarian tissue. Human Reproduction. 23(10): 2266-2272.

2 Arav A., Revel A., Nathan Y., Bor A., Gacitua H., Yavin S., Gavish Z. & Uri M. 2005. Oocyte recovery, embryo development and ovarian function after cryopreservation and transplantation of whole sheep ovary. Human Reproduction.

20(12): 3554-3559.

3 Aubard Y., Piver P., Cogni Y., Fermeaux V., Poulin N. & Driancourt M.A. 1999. Orthotopic and heterotopic autografts of frozen-thawed ovarian cortex in sheep. Human Reproduction. 14(8): 2149-2154.

4 Baird D.T., Webb R., Campbell B.K., Harkness L.M. & Gosden R.G. 1999. Long-term ovarian function in sheep after ovariectomy and transplantation of autografts stored at -196 °C. Endocrinology. 140(1): 462-471.

5 Bakhach J. 2009. The cryopreservation of composite tissues: Principles and recent advancement on cryopreservation of different type of tissues. Organogenesis. 5(3): 119-126.

6 Baust J.M. 2002. Molecular mechanisms of cellular demise associated with cryopreservation failure. Cell Preservation Technology. 1(1): 17-31.

7 Baust J.M., Snyder K.K., VanBuskirk R.G. & Baust J.G. 2009. Changing paradigms in biopreservation. Biopreservation and Biobanking. 7(1): 3-12.

8 Bedaiwy M.A., Hussein M.R., Biscotti C. & Falcone T. 2006. Cryopreservation of intact human ovary with its vascular pedicle. Human Reproduction. 21(12): 3258-3269.

9 Bedaiwy M.A., Jeremias E., Gurunluoglu R., Hussein M.R., Siemianow M., Biscotti C. & Falcone T. 2003. Restoration of ovarian function after autotransplantation of intact frozen-thawed sheep ovaries with microvascular anastomosis. Fertility and Sterility. 79(3): 594-602.

10 Berger W.K. & Uhrik B. 1996. Freeze-induced shrinkage of individual cells and cell-to-cell propagation of intracellular ice in cell chains from salivary glands. Experientia. 52(9): 843-850.

11 Bordes A., Lornage J., Demirci B., Franck M., Courbiere B., Guerin J.F. & Salle B. 2005. Normal gestations and live births after orthotopic autograft of vitrified-warmed hemi-ovaries into ewes. Human Reproduction. 20(10): 2745-2748.

12 Candy C.J., Wood M.J. & Whittingham D.G. 1997. Effect of cryoprotectants on the survival of follicles in frozen mouse ovaries. Journal of Reproduction and Fertility. 110(1):11-19.

13 Cecconi S., Capacchietti G., Russo V., Berardinelli P., Mattioli M. & Barboni B. 2004. In vitro growth of preantral follicles isolated from cryopreserved ovine ovarian tissue. Biology of Reproduction. 70(1): 12-17.

14 Choi J., Lee B., Lee E., Yoon B., Bae D. & Choi D. 2008. Cryopreservation of ovarian tissues temporarily suppresses the proliferation of granulosa cells in mouse preantral follicles. Cryobiology. 56(1): 36-42.

15 Choi J., Lee J.Y., Lee E., Yoon B.K., Bae D. & Choi D. 2007. Cryopreservation of the mouse ovary inhibits the onset of primordial follicle development. Cryobiology. 54(1): 55-62.

16 Cleary M., Snow M., Paris M., Shaw J., Cox S.L. & Jenkin G. 2001. Cryopreservation of mouse ovarian tissue following prolonged exposure to an ischemic environment. Cryobiology. 42(2): 121-133.

17 Cortvrindt R., Smitz J. & Van Steirteghem A.C. 1996. In vitro maturation, fertilization and embryo development of immature oocytes from early preantral follicles from prepuberal mice in a simplified culture system. Human Reproduction.

11(12): 2656-2666.

18 Cozzi E. & White D.J. 1995. The generation of transgenic pigs as potential organ donors for humans. Nature Medicine.

1(9): 964-966.

19 Critser J.K. & Russell R.J. 2000. Genome resource banking of laboratory animal models. ILAR Journal. 41(4): 183-186.

20 Danial N.N. & Korsmeyer S.J. 2004. Cell death: critical control points. Cell. 116(2): 205-219.

haja vista que a correção ou redução dos mesmos pode interferir de maneira positiva nos resultados da criopreservação do tecido ovariano.

21 Degterev A., Huang Z., Boyce M., Li Y., Jagtap P., Mizushima N., Cuny G.D., Mitchison T.J., Moskowitz M.A. &

Yuan J. 2005. Chemical inhibitor of nonapoptotic cell death with therapeutic potential for ischemic brain injury. Nature Chemical Biology. 1(2): 112-119.

22 Demeestere I., Simon P., Emiliani S., Delbaere A. & Englert Y. 2007. Fertility preservation: Successful transplantation of cryopreserved ovarian tissue in a young patient previously treated for Hodgkin’s disease. The Oncologist. 12(12): 1437- 1442.

23 Demirci B., Salle B., Frappart L., Franck M., Guerin J.F. & Lornage J. 2002. Morphological alterations and DNA fragmentation in oocytes from primordial and primary follicles after freezing-thawing of ovarian cortex in sheep. Fertility and Sterility. 77(3): 595-600.

24 Depalo R., Lorusso F., Bettocchi S. & Selvaggi L. 2009. Assessment of estrogen receptors and apoptotic factors in cryopreserved human ovarian cortex. Systems Biology in Reproductive Medicine. 55(5-6): 236-243.

25 Desai N., AbdelHafez F., Ali M.Y., Sayed E.H., Abu-Alhassan A.M., Falcone T. & Goldfarb J. 2011. Mouse ovarian follicle cryopreservation using vitrification or slow programmed cooling: Assessment of in vitro development, maturation, ultra-structure and meiotic spindle organization. The Journal of Obstetrics and Gynecology Research. 37(1): 1-12.

26 Donnez J. & Dolmans M.M. 2010. Cryopreservation and transplantation of ovarian tissue. Clinical Obstetrics and Gynecology. 53(4): 787-796.

27 Elmoazzen H.Y. 2000. Parameters affecting water permeability across biological cell membranes. 141f. Alberta, Canadá.

Dissertação (Mestrado em Engenharia Química e Patologia Experimental) - Faculdade de Pós-graduação e Pesquisa, Departamentos de Química e Engenharia de Materiais e Medicina Laboratorial e Patologia, Universidade de Alberta.

28 Eppig J.J. & Schroeder A.C. 1989. Capacity of mouse oocytes from preantral follicles to undergo embryogenesis and development to live young after growth, maturation, and fertilization in vitro. Biology of Reproduction. 41(2): 268-276.

29 Ernst E., Bergholdt S., Jørgensen J.S. & Andersen C.Y. 2010. The first woman to give birth to two children following transplantation of frozen/thawed ovarian tissue. Human Reproduction. 25(5): 1280-1281.

30 Fauque P., Ben Amor A., Joanne C., Agnani G., Bresson J.L. & Roux C. 2007. Use of trypan blue staining to assess the quality of ovarian cryopreservation. Fertility and Sterility. 87(5): 1200-1207.

31 Faustino L.R., Santos R.R., Silva C.M.G., Pinto L.C., Celestino J.J.H., Campello C.C., Figueiredo J.R. & Rodrigues A.P.R. 2010. Goat and sheep ovarian tissue cryopreservation: Effects on the morphology and development of primordial follicles and density of stromal cell. Animal Reproduction Science. 122(1-2): 90-97.

32 Festjens N., Vanden Berghe T. & Vandenabeele P. 2006. Necrosis, a well-orchestrated form of cell demise: Signalling cascades, important mediators and concomitant immune response. Biochimica et Biophysica Acta. 1757(9-10): 1371- 1387.

33 Gao D. & Critser J.K. 2000. Mechanisms of cryoinjury in living cells. ILAR Journal. 41(4): 187-196.

34 George M.A., Pickering S.J., Braude P.R. & Johnson M.H. 1996. The distribution of a- and g-tubulin in fresh and aged human and mouse oocytes exposed to cryoprotectant. Molecular Human Reproduction. 2(6): 445-456.

35 Gook D.A., Edgar D.H. & Stern C. 1999. Effect of cooling rate and dehydration regimen on the histological appearance of human ovarian cortex following cryopreservation in 1, 2-propanediol. Human Reproduction. 14(8): 2061-2068.

36 Gosden R.G. 2000. Low temperature storage and grafting of human ovarian tissue. Molecular and Cellular Endocrinology.

163(1-2): 125-129.

37 Gosden R.G. 2005. Prospects for oocyte banking and in vitro maturation. Journal of the National Cancer Institute.

Monographs. 34: 60-63.

38 Grazul-Bilska A.T., Banerjee J., Yazici I., Borowczyk E., Bilski J.J., Sharma R.K., Siemionov M. & Falcone T. 2008.

Morphology and function of cryopreserved whole ovine ovaries after heterotopic autotransplantation. Reproductive Biology and Endocrinology. 6: 16.

39 Grivicich I., Regner A. & Rocha A.B. 2007. Morte Celular por Apoptose. Revista Brasileira de Cancerologia. 53(3): 335- 343.

40 Harp R., Leibach J., Black J., Keldahl C. & Karow A. 1994. Cryopreservation of murine ovarian tissue. Cryobiology.

31(4): 336-343.

41 Hitomi J., Christofferson D.E., Ng A., Yao J., Degterev A., Xavier R.J. & Yuan J. 2008. Identification of a molecular signaling network that regulates a cellular necrotic cell death pathway. Cell. 135(7): 1311-1323.

N

42 Hovatta O. 2005. Methods for cryopreservation of human ovarian tissue. Reproductive Biomedicine Online. 10(6): 729- 734.

43 Hovatta O., Silye R., Krausz T., Abir R., Margara R. & Trew G. 1996. Cryopreservation of human ovarian tissue using dimethylsulphoxide and propanediol–sucrose as cryoprotectant. Human Reproduction. 11(6): 1268-1272.

44 Huang L., Mo Y., Wang W., Li Y., Zhang Q. & Yang D. 2008. Cryopreservation of human ovarian tissue by solid-surface vitrification. European Journal of Obstetrics, Gynecology and Reproductive Biology. 139(2): 193-198.

45 Hussein M.R. 2005. Apoptosis in the ovary: molecular mechanisms. Human Reproduction Update. 11(2): 162-177.

46 Hussein M.R., Bedaiwy M.A. & Falcone T. 2006. Analysis of apoptotic cell death, Bcl-2, and p53 protein expression in freshly fixed and cryopreserved ovarian tissue after exposure to warm ischemia. Fertility and Sterility. 85(1): 1082-1092.

47 Imhof M., Bergmeister H., Lipovac M., Rudas M., Hofstetter G. & Huber J. 2006. Orthotopic microvascular reanastomosis of whole cryopreserved ovine ovaries resulting in pregnancy and live birth. Fertility and Sterility. 85(1): 1208-1215.

48 Irimia D. & Karlsson J.O.M. 2005. Kinetics of intracellular ice formation in one-dimensional arrays of interacting biological cells. Biophysical Journal. 88(1):647-660.

49 Jain J.K. & Paulson R.J. 2006. Oocyte cryopreservation. Fertility and Sterility. 6(4): 1037-1046.

50 Jin S., Lei L., Shea L.D., Zelinski M.B., Stouffer R.L. & Woodruff T.K. 2010. Markers of growth and development in primate primordial follicles are preserved after slow cryopreservation. Fertility and Sterility. 93(8): 2627-2632.

51 Kartha K.K. 1985. Meristem culture and germplasm preservation. In: Kartha K.K. (Ed). Cryopreservation of plant cells and organs. Florida: CRC Press, pp.115-134.

52 Katska-Ksiazkiewicz L. 2006. Recent achievements in in vitro culture and preservation of ovarian follicles in mammals.

Reproductive Biology. 6(1): 3-16.

53 Kim S., Kim H., Lee H.C., Yang H., Lee H.H. & Yoon Y. 2005. Alteration of protein expression in bovine ovarian tissue after cryopreservation: Slow freezing vs. Vitrification. Fertility and Sterility. 84(1): S34.

54 Krysko D.V., Berghe T.V., D’Herde K. & Vandenabeele P. 2008. Apoptosis and necrosis: Detection, discrimination and phagocytosis. Methods. 44(3): 205-221.

55 Leist M. & Jäättelä M. 2002. Four deaths and a funeral: from caspases to alternative mechanisms. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 2(8): 589-598.

56 Lenie S., Cortvrindt R., Adriaenssens T. & Smitz J. 2004. A reproducible two-step culture system for isolated primary mouse ovarian follicles as single functional units. Biology of Reproduction. 71(5): 1730-1738.

57 Liu H-C., He Z. & Rosenwaks Z. 2003. Mouse ovarian tissue cryopreservation has only a minor effect on in vitro follicular maturation and gene expression. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 20(10): 421-431.

58 Liu J., Van der Elst J., Van den Broecke R. & Dhont M. 2001. Live offspring by in vitro fertilization of oocytes from cryopreserved primordial mouse follicles after sequential in vitro transplantation and in vitro maturation. Biology of Reproduction. 64(1): 171-178.

59 Liu L., Wood G.A., Morikawa L., Ayearst R., Fleming C. & McKerlie C. 2008. Restoration of fertility by orthotopic transplantation of frozen adult mouse ovaries. Human Reproduction. 23(1): 122-128.

60 Lucci C.M., Kacinskis M.A., Lopes L.H.R., Rumpf R. & Bao S.N. 2004. Effect of different cryoprotectants on the structural preservation of follicles in frozen zebu bovine (Bos indicus) ovarian tissue. Theriogenology. 61(6): 1101-1114.

61 Martinez-Madrid B., Camboni A., Dolmans M.M., Nottola S., Van Langendonckt A. & Donnez J. 2007. Apoptosis and ultrastructural assessment after cryopreservation of whole human ovaries with their vascular pedicle. Fertility and Sterility. 87(5): 1153-1165.

62 Mazoochi T., Salehnia M., Pourbeiravand S., Forouzandeh M., Mowla S.J. & Hajizadeh E. 2009. Analysis of apoptosis and expression of genes related to apoptosis in cultures of follicles derived from vitrified and non-vitrified ovaries. Molecular Human Reproduction. 15(3): 155-164.

63 Mazoochi T., Salehnia M., Valojerdi M.R. & Mowla S.J. 2008. Morphologic, ultrastrutural, and biochemical identification of apoptosis in vitrified-warmed mouse ovarian tissue. Fertility and Sterility. 90(4): 1480-1486.

63 Mazur P. 1965. The role of cell membranes in the freezing of yeast and other single cells. Annals of the New York Academy of Sciences. 125(2): 658-676.

64 Mazur P. 1984. Freezing of living cells: mechanism and implications. The American Journal of Physiology. 247(3): C125- C142.

65 Mazur P., Leibo S.P. & Chu E.H.Y. 1972. A two-factor hypothesis of freezing injury: Evidence from Chinese hamster

tissue-culture cells. Experimental Cell Research. 71(2): 345-355.

66 Mazur P., Rall W.F. & Leibo S.P. 1984. Kinetics of water loss and the likelihood of intracellular freezing in mouse ova.

Influence of the method of calculating the temperature dependence of water permeability. Cell Biophysics. 6(3): 197-213.

67 Meryman H.T., Williams R.J. & Douglas M.S. 1977. Freezing injury from “solution effects” and its prevention by natural or artificial cryoprotection. Cryobiology. 14(3): 287-302.

68 Muldrew K. & McGann L.E. 1990. Mechanisms of intracellular ice formation. Biophysical Journal. 57(3): 525-532.

69 Muldrew K. & McGann L.E. 1994. The osmotic rupture hypothesis of intracellular freezing injury. Biophysical Journal.

66(2): 532-541.

70 Mullen S.F. & Crister J.K. 2007. The Science of Cryobiology. In: Woodruff T.K. & Snyder K.A. (Eds). Oncofertility:

Fertility preservation for cancer survivors. New York: Springer, pp.83-109.

71 Navarro-Costa P., Correia S.C., Gouveia-Oliveira A., Negreiro F., Jorge S., Cidadao A.J., Carvalho M.J. & Plancha C.E. 2005. Effects of mouse ovarian tissue cryopreservation on granulosa cell-oocyte interaction. Human Reproduction.

20(6): 1607-1614.

72 Newton H., Aubard Y., Rutherford A., Sharma V. & Gosden R. 1996. Low temperature storage and grafting of human ovarian tissue. Human Reproduction. 11(7): 1487-1491.

73 O’Brien M.J., Pendola J.K. & Eppig J.J. 2003. A revised protocol fordevelopment of mouse oocyte from primordial follicles dramatically improves their development competence. Biology of Reproduction. 68(5): 1682-1686.

74 Onions V.J., Mitchell M.R.P., Campbell B.K. & Webb R. 2008. Ovarian tissue viability following whole ovine ovary cryopreservation: assessing the effects of sphingosine-1-phosphate inclusion. Human Reproduction. 23(3): 606-618.

75 Orief Y., Schultze-Mosgau A., Dafopoulos K. & Al-Hasani S. 2005. Vitrification: will it replace the conventional gamete cryopreservation techniques? Middle East Fertility Society Journal. 10(3): 171-184.

76 Posillico S., Kader A., Falcone T. & Agarwal A. 2010. Ovarian tissue vitrification: Modalities, challenges and potentials.

Current Women’s Health Reviews. 6(4): 352-366.

77 Prentice J.R. & Anzar M. 2010. Cryopreservation of mammalian oocyte for conservation of animal genetics. Veterinary Medicine International. 2011: 11.

78 Pukazhenthi B.S. & Wildt D.E. 2004. Which reproductive technologies are most relevant to studying, managing and conserving wildlife. Reproduction, Fertility and Development. 16(1-2): 33-46.

79 Rahimi G., Isachenko E., Isachenko V., Sauer H., Wartenberg M., Tawadros S., Hescheler J., Mallmann P. & Nawroth F. 2004. Comparison of necrosis in human ovarian tissue after conventional slow freezing or vitrification and transplantation in ovariectomized SCID mice. Reproductive Biomedicine Online. 9(2): 187-193.

80 Rahimi G., Isachenko E., Sauer H., Isachenko V., Wartenberg M., Hescheler J., Mallmann P. & Nawroth F. 2003.

Effect of different vitrification protocols for human ovarian tissue on reactive oxygen species and apoptosis. Reproduction, Fertility and Development. 15(6): 343-349.

81 Rimon E., Cohen T., Dantes A., Hirsh L., Amit A., Lessing J.B., Freimann S., Amsterdam A. & Azem F. 2005.

Apoptosis in cryopreserved human ovarian tissue obtained from cancer patients: a tool for evaluating cryopreservation utility. International Journal of Oncology. 27(2): 345-353.

82 Rodrigues A.P.R., Faustino L.R., Celestino J.J.H. & Figueiredo J.R. 2010. Progress in caprine and ovine preantral follicles cryopreservation In: XXIV Reunião anual da sociedade brasileira de tecnologia de embriões (Porto de Galinhas, PE). pp.s425-s435.

83 Saraiva M.V.A., Rossetto R., Brito I.R., Celestino J.J.H., Silva C.M.G., Faustino L.R., Almeida A.P., Bruno J.B., Magalhães D.M., Matos M.H.T., Campello C.C. & Figueiredo J.R. 2010. Dynamic medium produces caprine embryo from preantral follicles grown in vitro. Reproductive Sciences. 17(12): 1135-1143.

84 Segino M., Ikeda M., Hirahara F. & Sato K. 2005. In vitro development of cryopreserved mouse ovarian tissue.

Reproduction. 130(2): 187-192.

85 Siebzehnrubl E., Kohl J., Dittrich R. & Wildt L. 2000. Freezing of human ovarian tissue-not the oocytes but the granulosa is the problem. Molecular and Cellular Endocrinology. 169(1-2): 109-111.

86 Smitz J., Dolmans M.M., Donnez J., Fortune J.E., Hovatta O., Jewgenow K., Picton H.M., Plancha C., Shea L.D., Stouffer R.L., Telfer E.E., Woodruff T.K. & Zelinski M.B. 2010. Current achievements and future research directions in ovarian tissue culture, in vitro follicle development and transplantation: implications for fertility preservation. Human Reproduction Update. 16(4): 395-414.

87 Sonmezer M., Shamonki M.I. & Oktay K. 2005. Ovarian tissue cryopreservation: Benefits and risks. Cell and Tissue

N

Research. 322(1): 125-132.

88 Syntichaki P. & Tavernarakis N. 2002. Death by necrosis: Uncontrollable catastrophe, or is there order behind the chaos?

EMBO reports. 3(7): 604-609.

89 Tamilmani G., Rao B.S., Vagdevi R., Amarnath D., Naik B.R., Mutharao M. & Rao V.H. 2005. Nuclear maturation of ovine oocytes in cultured preantral follicles. Small Ruminant Research. 60(3): 295-305.

90 Tilly J.L. 1996. Apoptosis and ovarian function. Reviews of Reproduction. 1(3): 162-172.

91 Tirelli M., Basini G., Grasselli F., Bianco F. & Tamanini C. 2005. Cryopreservation of pig granulosa cells: effect of FSH addition to freezing medium. Domestic Animal Endocrinology. 28(1): 17-33.

92 Toner M., Cravalho E.G. & Marcus K. 1990. Thermodynamics and kinetics of intracellular ice formation during freezing of biological cells. Journal of Applied Physics. 67(3): 1582-1593.

93 Toner M., Cravalho E.G., Stachecki J., Fitzgerald T., Tompkins R.G., Yarmush M.L. & Armant D.R. 1993.

Nonequilibrium freezing of one-cell mouse embryos. Membrane integrity and developmental potential. Biophysical Journal.

64(6): 1908-1921.

94 Van den Hurk R. & Santos R.R. 2009. Development of fresh and cryopreserved early-stage ovarian follicles, with special attention to ruminants. Animal Reproduction. 6(1): 72-95.

95 Vanhoutte L., Cortvrindt R., Nogueira D. & Smitz J. 2004. Effects of chilling on structural aspects of early preantral mouse follicles. Biology of Reproduction. 70(4): 1041-1048.

96 Varghese A.C., du Plessis S.S., Falcone T. & Agarwal A. 2008. Cryopreservation/ transplantation of ovarian tissue and in vitro maturation of follicles and oocytes: Challenges for fertility preservation. Reproductive Biology and Endocrinology. 6:

47.

97 Wang L.H., Mullen S.F., Li Y., Zhong J.Q., Crister J.K. & Chen Z.J. 2009. Morphological and apoptotic comparison of primordial and primary follicles in cryopreserved human ovarian tissue. Reproduction in Domestic Animal. 44(6): 879- 883.

98 Wang X., Chen H., Yin H., Kim S.S., Lin Tan S. & Gosden R.G. 2002. Fertility after intact ovary transplantation. Nature.

415(6870): 385.

99 Wildt D.E. 1997. Genome resource banking, impact on biotic conservation and society. In: Karow A.M. & Critser J.K.

(Eds). Reproductive tissue banking: Scientific principles. San Diego: Academic Press, pp.399-439.

100 Xu M., Banc A., Woodruff T.K. & Shea L.D. 2009. Secondary follicle growth and oocyte maturation by culture in alginate hydrogel following cryopreservation of the ovary or individual follicles. Biotechnology and Bioengineering. 103(2):

378-386.

101 Xu M., Kreeger P.K., Shea L.D. & Woodruff T.K. 2006. Tissue-engineered follicles produce live, fertile offspring.

Tissue Engineering. 12(10): 2739-2746.

102 Yin H., Wang X., Kim S., Chen H., Tan S. & Gosden R. 2003. Transplantation of intact rat gonads using vascular anastomosis: Effects of cryopreservation, ischaemia and genotype. Human Reproduction. 18(6): 1165-1172.

103 Zhang J-M., Li L-X., Yang Y-X., Liu X-L. & Wan X-P. 2009. Is caspase inhibition a valid therapeutic strategy in cryopreservation of ovarian tissue? Journal of Assisted Reproduction Genetics. 26(7): 415-420.

104 Zhou X-H., Wub Y-J., Shi J., Xia Y-X. & Zheng S-S. 2010. Cryopreservation of human ovarian tissue: Comparison of novel direct cover vitrification and conventional vitrification. Cryobiology. 60(2): 101-105.

105 Ziegler U. & Groscurth P. 2004. Morphological features of cell death. News in Physiological Sciences. 19: 124-128.

106 Zong W-X. & Thompson C.B. 2006. Necrotic death as a cell fate. Genes and Development. 20(1): 1-15.

P PP PPububububub... 972 972 972 972 972

www.ufrgs.br/actavet