Microbiologia – BC1606 Roteiros das Aulas Práticas

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Microbiologia – BC1606 Roteiros das Aulas Práticas

Docentes:

Prof

^a

. Dra. Fernanda Dias da Silva (matutino) Prof

^a

. Dra. Lívia Seno Ferreira Camargo (noturno)

Santo André 2019

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SUMÁRIO

CRONOGRAMA ...3 SEGURANÇA E NORMAS DE TRABALHO NO LABORATÓRIO...5 PRÁTICA 1 – Presença dos microrganismos nos diferentes tipos de

ambiente... 7 PRÁTICA 2 – Classificação das bactérias em Gram-positivas e Gram-

negativas... 11 PRÁTICA 3 – Investigação de presença de estrutura de locomoção...15 PRÁTICA 4 – Investigação de atividades metabólicas das bactérias – Provas

Bioquímicas e emprego de meios de cultura seletivo-indicadores

... 17 PRÁTICA 5 – Quantificação de microrganismos através de correlação entre

absorbância e massa seca (A) e Obtenção de curva de crescimento bacteriano através de dados de absorbância (B)

... 19 PRÁTICA 6 – Isolamento de bactérias pelos métodos de esgotamento e

diluição seriada...24 PRÁTICA 7 – Análise macroscópica e microscópica de fungos...29 PRÁTICA 8 – Obtenção de suspensão de conídios...31 PRÁTICA 9 – Análise da eficácia de diferentes desinfetantes e antissépticos....

... 35 PRÁTICA 10 – Antibiograma...40

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CRONOGRAMA

SEMANA ATIVIDADES

1 (13/02)

Apresentação do curso prático.

Prática 1. Presença dos microrganismos nos diferentes tipos de ambiente.

2 (20/02) Prática 2. Classificação das bactérias em Gram-positivas e Gram-negativas.

3 (27/02

Práticas 3 e 4.

Investigação de presença de estrutura de locomoção.

Investigação de atividades metabólicas das bactérias – Provas Bioquímicas e emprego de meios de cultura seletivo-indicadores.

4 (05/03)

Prática 5. Quantificação de microrganismos através de correlação entre absorbância e massa seca (A) e Obtenção de curva de crescimento bacteriano através de dados de absorbância (B).

5 (12/03) Prática 6. Isolamento de bactérias pelos métodos de esgotamento e diluição seriada.

6 (11/03) Prática 7. Análise macroscópica e microscópica de fungos.

7 (26/03) Prática 8. Obtenção de suspensão de conídios.

8 (02/04) Prática 9. Análise da eficácia de diferentes desinfetantes e antissépticos.

9 (16/04) Prática 10. Antibiograma.

SEGURANÇA E NORMAS DE TRABALHO NO LABORATÓRIO

Leia integralmente o Guia de Segurança, Experimentos e Atividades (3ªed.) da disciplina de Base Experimental das Ciências Naturais. Destacamos:

Segurança

 Conheça a localização dos chuveiros de emergência, extintores e lavadores de olhos.

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 Use sempre avental, mantenha os cabelos presos e use calçados fechados, mesmo na aula reservada para o preparo das próximas práticas;

 Os óculos são obrigatórios!

 Usar a capela sempre que possível;

 Nunca pipete com a boca, não cheire, nem experimente os produtos químicos;

 Comes e bebes, só fora do laboratório;

 Consulte o professor cada vez que notar algo anormal ou imprevisto;

 Comunique qualquer acidente ao professor, por menor que seja;

 Se utilizar chama, mantenha longe de qualquer reagente!

 Nunca brinque no laboratório;

 Evite o contato de qualquer substância com a pele;

 Nunca aqueça o tubo de ensaio, apontando a extremidade aberta para um colega ou para si mesmo.

 Cuidado ao aquecer vidro em chama: o vidro quente tem exatamente a mesma aparência do frio.

Procedimentos gerais

 Siga rigorosamente as instruções fornecidas pelo professor.

 Pesquise sempre a toxicidade dos reagentes antes das práticas.

 Nunca abra um recipiente de reagente antes de ler o rótulo.

 Evite contaminar reagentes, nunca retorne o excedente aos frascos de origem.

 Adicione sempre ácidos à água, nunca água a ácidos.

 Não coloque nenhum material sólido dentro da pia ou nos ralos.

 Não coloque resíduos de solventes na pia ou ralo; há recipientes apropriados para isso.

 Não atire vidro quebrado no lixo comum. Deve haver um recipiente específico para fragmentos de vidro.

 Verifique se as conexões e ligações estão seguras antes de iniciar uma reação/destilação

 Ao terminar a prática, lave o material utilizado e deixe-o em ordem.

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AVALIAÇÃO PRÁTICA

 As atividades experimentais serão realizadas em grupo.

Semanalmente será recolhido um roteiro por grupo, referente à última aula prática.

 O conteúdo prático equivale a 30% da nota final da disciplina.

BIBLIOGRAFIA – PARA AS ATIVIDADES TEÓRICAS E PRÁTICAS DA DISCIPLINA

Ementa: A disciplina de Microbiologia I visa fornecer uma visão introdutória sobre os principais microrganismos: bactérias, fungos e vírus. Serão introduzidos e discutidos conceitos básicos de microbiologia como estruturas, modos de reprodução e nutrição dos microrganismos, seu controle e utilização em processos biotecnológicos importantes.

Bibliografia Básica:

MAADIGAN, Michel T.; MARTINKO, John M.; PARKER, Jack. Microbiologia de brock. São Paulo: Prentice Hall, 2004. 608 p.

TORTORA, Gerard; FUNKE, Berdell R.; CHRISTINE L. CASE. Microbiologia. 8.ed. Porto Alegre: Artmed, 2005. 894 p.

VERMELHO, Alane Beatriz. Práticas de microbiologia. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2006. xiv, 239 p. Inclui bibliografia e índice.

Bibliografia Complementar: MURRAY, Patrick R.; ROSENTHAL, Ken S.; KOBAYASHI, George et al. Microbiologia médica. Rio de Janeiro: Elsevier, 2006. 979, il p.

PELCZAR JR., Michael J. et al. Microbiologia: conceitos e aplicações. 2 ed. São Paulo:

Pearson Makron Books, 1997. v. 1. 524 p.

TORTORA, Gerard J.; FUNKE, Berdell R.; CASE, Christine L. Microbiology: an introduction.

10th ed.. San Francisco, CA: Pearson Benjamin, 2010. 812 p.

TUOMANEN, Elaine I et al. The pneumococcus. Wahington: ASM Press, 2004. 421 p.

UJVARI, Stefan Cunha. A história da humanidade contada pelos vírus, bactérias, parasitas e outros microorganismos. São Paulo: Contexto, 2009. 202 p.

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PRÁTICA 1: Presença dos microrganismos nos diferentes tipos de ambiente.

Objetivos:

 Detectar a presença de microrganismos (bactérias e fungos) em diferentes tipos de ambiente;

 Avaliar a importância de se utilizar diferentes meios de cultura para isolar microrganismos do ambiente;

 Avaliar se a metodologia utilizada permite diferenciar os diferentes tipos de microrganismos presentes no ambiente pesquisado.

Materiais:

 Meio LB + ágar;

 Meio Sabouraud dextrose + ágar;

 Água destilada;

 Espátula para pesagem;

 Papel alumínio para pesagem;

 Balança semi-analítica;

 Erlenmeyers para preparo dos meios;

 Proveta graduada de 100 mL;

 Bastão de vidro;

 Autoclave;

 Solução salina estéril (NaCl 0,85%);

 Placas de Petri estéreis;

 Cotonetes estéreis;

 Tubos graduados de 50 mL estéreis;

 Bico de Bunsen ou lamparina;

 Filme plástico para embalar as placas;

 Estufa bacteriológica a 37º C.

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Procedimentos:

ETAPA 1: Preparo dos meios de cultura.

 Preparar 25 mL de cada meio;

 Calcular a quantidade de cada meio a ser pesada, utilizando as recomendações do fabricante;

 Após a pesagem, colocar o pó no frasco e identificar cada frasco com o tipo de meio que ele contém e com o nome do grupo;

 Utilizar a proveta para medir 25 mL de água destilada para dissolver cada meio;

 Homogeneizar cada solução com o bastão de vidro. Lavar o bastão toda vez que for trocar de meio;

 Autoclavar por 20 min.

ETAPA 2: Preparo das placas.

 Identificar a placa de Petri na base da mesma (porção menor), indicar se é LB ou Sabouraud (SAB), com cuidado para não abrir as placas;

 Acender o bico de Bunsen ou lamparina e trabalhar na zona de segurança;

 Abrir parcialmente a placa e verter o meio;

 Aguardar solidificar, deixando a placa semi-aberta (a abertura deve estar voltada para o lado da chama);

 Inverter as placas após solidificar.

ETAPA 3: Coleta das amostras.

 Grupo 1: Pesquisa de microrganismos presentes no ar.

 Deixar uma placa com meio LB e outra com meio SAB abertas na bancada, por no mínimo, 15 minutos;

 Após este período, tampar as placas.

 Grupo 2: Pesquisa de microrganismos presentes na pele.

 Remover o papel alumínio de uma das extremidades do cotonete estéril, tomando cuidado para não contaminar a ponta com o seu dedo;

 Umedecer o cotonete na solução salina estéril e esfregá-lo do dorso

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da mão de um dos integrantes do grupo, em uma área de + ou - 5 cm;

 Abrir a placa com LB e semear o conteúdo do cotonete;

 Fechar a placa;

 Repetir o mesmo procedimento para a placa com meio Sabouraud, utilizando a outra extremidade do cotonete estéril.

 Grupos 3, 4, etc: Pesquisa de microrganismos presentes em diferentes superfícies.

 Remover o papel alumínio de uma das extremidades do cotonete estéril, tomando cuidado para não contaminá-lo com o seu dedo;

 Umedecer o cotonete na solução salina estéril e esfregá-lo em uma área de + ou - 5 cm da superfície;

 Abrir uma das placas e semear o conteúdo do cotonete;

 Fechar a placa;

 Repetir o mesmo procedimento para a outra placa, utilizando a outra extremidade do cotonete estéril.

ETAPA 4: Incubar as amostras.

 Selar a borda das placas com filme plástico;

 Incubar a placa com LB ágar em estufa a 37^o C e a placa com SAB na bancada, à temperatura ambiente. Atenção: as placas devem ficar na posição invertida (base com o meio de cultura voltada para cima).

ETAPA 5: Observação dos resultados.

 Observar o crescimento microbiano, após 24 h e 1 semana de incubação;

 Atenção: Não abrir as placas! A presença de colônias deve ser observada pelo verso da placa;

 Registrar os resultados com fotos (dia 1 do experimento, após 24 h e após 1 semana).

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PRÁTICA 1 – Questões:

1. Material de coleta do grupo:...

2. Você espera encontrar diferenças quantitativas em relação ao conteúdo de microrganismos das placas após 24 h e uma semana de incubação?

Justifique a sua resposta.

3. Você espera encontrar diferenças em relação ao conteúdo de microrganismos entre as placas contendo ágar LB e ágar SAB? Justifique a sua resposta.

4. Que outros fatores, além do meio de cultura, poderiam determinar uma diferença de conteúdo entre as placas?

5. Você espera que o resultado obtido com a pesquisa dos microrganismos presentes no seu ambiente de estudo seja diferente dos resultados obtidos pelos outros grupos? Justifique a sua resposta.

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PRÁTICA 2: Classificação das bactérias em Gram-positivas e Gram- negativas.

Objetivos:

 Aplicar a coloração de Gram e o teste de KOH 3% (método de Ryce) para diferenciar bactérias Gram-positivas de Gram-negativas;

 Analisar as bactérias coradas ao microscópio óptico e diferenciá-las quanto à coloração, morfologia e forma de agrupamento das células.

Materiais:

 Placas de cultura de bactérias Escherichia coli e Micrococcus luteus;

 Placas de cultura obtidas na Prática 1;

 Lâminas para microscopia;

 Béquer para descarte dos corantes;

 Alça de platina;

 Fio de platina;

 Solução salina (NaCl 0,85%) estéril;

 Solução pronta de cristal violeta;

 Solução pronta de lugol;

 Solução pronta de safranina;

 Álcool 95%;

 Álcool 70% para limpeza das lâminas;

 Solução de KOH 3%;

 Palitos de dente esterilizados;

 Lamparina;

 Microscópio;

 Óleo de imersão;

 Lenços de papel.

Procedimentos:

ETAPA 1: Coloração de Gram.

Preparação do esfregaço de bactérias cultivadas em meio sólido.

 Limpar as lâminas com álcool 70%, utilizando lenço de papel;

 Acender a lamparina ou bico de Bunsen;

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 Aquecer a alça de platina na chama até ficar rubra, indicando que ela está estéril;

 Com a alça esterilizada, colocar 1-2 gotas de solução salina estéril sobre uma das lâminas;

 Aquecer novamente a alça;

 Esfriar a alça no próprio meio de cultura da placa de Petri contendo as culturas de bactérias;

 Utilizar a alça para pegar uma pequena porção da colônia de bactérias e transferi-la para a lâmina, diluindo a amostra na solução salina com movimentos circulares. Cuidado para não deixar a solução muito densa, isso pode prejudicar o resultado final da coloração;

 Deixar o esfregaço secar a temperatura ambiente (demora alguns minutos).

Coloração.

 Cobrir o esfregaço com solução de cristal violeta por aproximadamente 1 minuto. (Atenção para o lado da lâmina antes de colocar a solução);

 Lavar em água corrente;

 Cobrir com solução de lugol por aproximadamente 1 minuto;

 Deixar escorrer o excesso de lugol e, mantendo a lâmina inclinada, pingar a solução de álcool 95% até que o corante não se desprenda mais;

 Lavar imediatamente em água corrente ;

 Cobrir o esfregaço com solução de safranina (contra-corante) por aproximadamente 1 minuto;

 Lavar a lâmina em água corrente e deixá-la secar bem ao ar e/ou secar com papel absorvente (não esfregar o papel na lâmina, apenas coloque-o cuidadosamente por cima do material fixado para absorver o excesso de líquido).

Observação e análise dos resultados ao microscópio óptico.

 Levar a lâmina ao microscópio e focalizar no menor aumento;

 Observar na objetiva de 100 x (Não esquecer de usar o óleo de imersão e limpar a objetiva após o uso);

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 Observar os microrganismos e seus padrões de coloração (violeta ou rosa), formas (cocos, bacilos, etc.) e modo de agrupamento (isolados ou agrupados).

 Registrar suas observações com desenhos ou fotos.

 Realize as colorações com as culutruas de Escherichia coli, Micrococcus luteus e escolha também uma colônia da placa obtida pelo seu grupo na Prática 1.

ETAPA 2: Teste do KOH 3%.

 Colocar uma gota de solução 3% de KOH em uma lâmina;

 Com o palito de dente esterilizado ou o fio de platina, transferir uma quantidade considerável de bactérias para a gota de KOH na lâmina.

Homogeneizar a amostra com o palito;

 Após + ou – 60 segundos, afastar e aproximar o palito da superfície da lâmina e verificar a viscosidade da gota;

 Faça o procedimento com E. coli, M. luteus e a colônia que o grupo utilizou na coloração de Gram.

 Se a solução formada for viscosa, formando um filamento quando se levanta o palito, a bactéria em análise é Gram-negativa. Se não formar o filamento, a bactéria é Gram-positiva.

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1. O conhecimento de qual estrutura da célula bacteriana foi importante para que a técnica de coloração de Gram fosse desenvolvida?

2. Considerando-se as duas técnicas apresentadas para identificação de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, o que você apontaria como vantagens e desvantagens de cada técnica?

2. Qual a importância de se diferenciar bactérias Gram-positivas de Gram- negativas?

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PRÁTICA 3: Investigação de presença de estrutura de locomoção.

Objetivos:

 Avaliar a presença de estruturas de locomoção bacteriana.

Materiais:

 Três tubos de ensaio contendo 10 mL ágar LB semi-sólido (0,075% de ágar);

 Placas de Petri contendo colônias de bactérias Escherichia coli e Micrococcus luteus;

 Fio de platina;

 Estufa a 37°C.

Procedimentos:

 Identificar os tubos (um tubo para cada cultura de bactérias);

 Acender a lamparina ou bico de Bunsen;

 Aquecer o fio de platina na chama até que fique rubro;

 Esfriar o fio no meio de cultura e raspar uma colônia de uma das placas contendo culturas de E. coli, M. luteus ou bactérias da Prática 1;

 Introduzir o fio de platina bem no centro do tubo contendo meio LB ágar semi-sólido, até aproximadamente ¾ da profundidade do meio;

 Entre uma cultura e outra, esterilizar novamente o fio na chama e escolher outra colônia para o outro tubo;

 Esterilizar a alça na chama após o término de todo o procedimento;

 Após a inoculação dos tubos, armazená-los em estufa a 37º C.

 Observar o crescimento bacteriano após 24 h;

 Registrar os resultados com foto.

 Positivo para locomoção: crescimento fora do local da picada.

 Negativo para locomoção: crescimento somente ao redor da picada.

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1. Em relação à motilidade bacteriana, o que você observou nos tubos 1, 2 e 3? Justifique sua resposta com fotos.

2. Para E. coli e M. luteus, os seus resultados ficaram de acordo com os dados da literatura? Justifique a sua resposta.

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PRÁTICA 4: Investigação de atividades metabólicas das bactérias – Emprego de meios de cultura seletivo-indicadores e prova bioquímica (teste da catalase).

Objetivos:

 Isolar grupos de bactérias utilizando-se:

- Meio de cultura seletivo-indicador ágar MacConkey;

- Meio de cultura seletivo ágar Manitol.

 Teste da catalase: identificação de bactérias que produzem a enzima catalase.

Materiais:

 Experimento I.

 1 placa de Petri contendo meio de cultura ágar MacConkey;

 1 placa de Petri contendo meio de cultura ágar Manitol;

 Cultura de bactérias E. coli e M. luteus crescidas overnight em caldo LB e em placas com LB ágar;

 Autoclave;

 Estufa bacteriológica a 37º C.

 Experimento II.

 Lâminas para microscopia;

 Solução de peróxido de hidrogênio 3% em frasco conta-gotas;

 Fio de platina ou palitos de dente esterilizados;

 Placas de cultura com amostras de bactérias;

 Bico de Bunsen ou lamparina.

Procedimentos:

 Experimento 1. Cultivo das bactérias nos meios ágar MacConkey e ágar Manitol.

 Identificar as placas na base e dividir em duas partes;

 Ligar o bico de Bunsen;

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 Esterilizar a alça de platina na chama;

 Esfriar a alça na parede do tubo com a cultura de bactérias;

 Introduzir a alça na cultura de bactérias E. coli e semeá-las com movimento de estrias em uma das metades da placa com ágar MacConkey;

 Esterilizar a alça novamente para semear E. coli no ágar manitol;

 Repetir os procedimentos anteriores para M. luteus.

 Tampar as placas e selar as bordas com filme plástico;

 Incubar as placas em posição invertida a 37^o C por 24 h;

 Observar o crescimento microbiano após 24 h;

 Registrar resultado com fotos.

 Experimento 2. Teste da catalase.

 Colocar uma gota de solução de peróxido de hidrogênio em uma lâmina;

 Com o palito de dente esterilizado, transferir uma quantidade de bactérias para a gota de H2O2 na lâmina;

 Homogeneizar a amostra com o palito;

 Observar a ocorrência de efervescência ou não;

 Repetir o procedimento para diferentes colônias.

 Bactérias catalase-positivas: há efervescência.

 Bactérias catalase-negativas: não há efervescência.

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1. Observe a composição dos meios de cultura utilizados, indicada nos rótulos dos frascos, e indique quais componentes tornam esses meios seletivos e diferenciais. Justifique as suas respostas.

2. Qual o princípio do teste da catalase? Quais grupos de bactérias podem ser identificados com este teste?

3. Descreva os resultados obtidos no experimento I. Eles estão de acordo com os dados da literatura para essas espécies?

4. De acordo com os seus resultados, as suas amostras são de bactérias catalase positiva ou negativa? A qual grupo de bactérias elas podem pertencer?

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PRÁTICA 5: Quantificação de microrganismos através de correlação entre absorbância e massa seca (A) e Obtenção de curva de crescimento bacteriano através de dados de absorbância (B).

(A)Quantificação de microrganismos através de correlação entre absorbância e massa seca.

Objetivos:

 Introduzir os conceitos dos métodos de Massa seca e Turbidimetria;

 Realizar método de massa seca para quantificação de microrganismos;

 Realizar diluições de microrganismos em suspensão com água e curva de calibração para correlação entre absorbância e massa seca;

 Construir curva de calibração para correlação de absorbância e massa seca de levedura.

Materiais (por grupo):

 Pipetas automáticas P1000, P200 e 3 ponteiras de cada

 Pipeta graduada de 10 e 25 mL

 3 Falcons de 50mL

 3 Falcons de 15mL

 1 béquer de 100mL

 1 bastão de vidro

 Espátula

 1 placa de Petri de vidro

 Lâmina e lamínula

 Pipeta pasteur

 1 kitassato

 1 funil pequeno (para membrana de 47mm) com adaptador para kitassato

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Equipamentos:

 Microscópio

 Estufa

 Espectrofotômetro

 Balança semi-analítica

 Balança analítica

 Dessecador

 Bomba de vácuo

Reagentes:

 Fermento biológico (Fornecido pelo Professor)

 Água deionizada Procedimentos:

1. Preparo da suspensão de células:

 Pesar 1g de fermento biológico em um bécker de 100 mL

 Dissolver em água destilada e diluir em balão volumétrico de 100 mL

2. Determinação do peso seco de células

 Nomear a placa de petri, colocar 1 membrana dentro e pesar em balança analítica;

 Pipetar 10 mL da suspensão recém preparada e

homogeneizada, e transferir para o filtro com tara conhecida;

 Secar em estuda a 70ºC por 12 h;

 Determinar, por diferença de massa o peso seco e expressar o resultado em massa de células seca mg/L de suspensão.

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3. Turbidimetria

 Diluir a suspensão de 1 g de levedura em 100 mL:

Diluições Volume de Amostra (µL)

Volume total (mL)

10 100 1

25 100 2,5

50 500 25

100 100 10

250 100 25

 Ler a absorbância das suspensões a λ=570 nm, utilizando água deionizada como branco.

(B)Curva de crescimento bacteriano – exercício a ser realizado extra- classe a partir dos dados fornecidos.

Objetivos:

 Construir curvas de crescimento para diferentes espécies de microrganismos, utilizando medidas de absorbância ao longo do tempo;

 Identificar as diferentes fases de crescimento microbiano (lag, exponencial ou log, estacionária, declínio ou morte);

Materiais:

 Tabelas com valores de densidade óptica (D.O. a 600 nm) ao longo do tempo para diferentes microrganismos. Esses valores serão previamente obtidos e fornecidos pela professora.

Procedimentos:

 Construir um gráfico de crescimento microbiano para cada microrganismo a partir dos dados das Tabelas.

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Parte (A):

1) Preencher os espaços, efetuando os cálculos.

Determinação do peso seco das células (p/v):

Volume da suspensão: _________

Tara do filtro: _________

Filtro + células secas: _________

Peso das células secas: _________

Peso seco (mg/L): _________

Diluição (Voltotal/ Volamostra)

Vol.

Amostra (mL)

Vol.total da solução

(mL)

ABS (570nm)

ABS média

Peso Seco (mg/L)

2) I. Construir um gráfico no Excel (não fazer a mão) da DO570 x massa seca.

II. Obter a equação da reta

Parte (B)

1. Construir um gráfico no Excell ou outro programa (não fazer a mão) da DO600 x Tempo (h).

2. Indicar cada uma das fases do ciclo de crescimento bacteriano no gráfico e descrever o que ocorre em cada uma dessas fases.

3. Explique como a turbidimetria pode ser utilizada para estimar a quantidade de bactérias em uma amostra.

4. O que significa tempo de geração (g) de uma cultura de bactérias? Com os dados de DO600 obtidos é possível calcular o tempo de geração? Justifique a sua resposta.

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PRÁTICA 6: Isolamento de bactérias pelos métodos de esgotamento e diluição seriada.

Objetivos:

 Isolar bactérias, a partir de culturas prontas, através dos métodos de esgotamento em placa e diluições seriadas;

 Determinar o número de unidades formadoras de colônias (UFC) por mL de uma suspensão.

Materiais:

 Tubo de ensaio, previamente preparado, contendo cultura de bactérias E. coli em meio LB (1 por grupo);

 Alça de platina (1 por grupo);

 Placa de Petri com meio LB ágar (6 por grupo);

 Alça de Drigalski (1 por grupo);

 Erlenmeyer com álcool para flambar a alça de Drigalski (1 por grupo);

 Tubos de ensaio com 9 mL de meio LB estéril (6 por grupo);

 Micropipetas para volume de 1 mL e 200 µL;

 Ponteiras estéreis para 1 mL e 200 µL;

 Caneta para identificação das placas;

 Estufa a 37º C.

Procedimentos:

 Acender o bico de Bunsen ou lamparina. Trabalhar somente na zona de segurança.

 ETAPA I. Técnica de esgotamento em placa.

 Flambar a alça na chama até ficar rubra;

 Resfriar a alça na parede do tubo contendo a cultura de bactérias;

 Introduzir a alça na cultura de bactérias;

 Semear as bactérias na placa de Petri com meio LB ágar, fazendo uma estria, conforme indicado na Figura 1. Cuidado para não furar o meio

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com a alça;

 Girar a placa e puxar uma segunda estria a partir do ponto indicado na Figura 1 A;

 Repetir o mesmo procedimento para fazer uma terceira estria e, até mesmo uma quarta, caso ainda haja espaço na placa;

 Observar a placa após incubação de 24 h a 37^oC;

 A técnica é conhecida como esgotamento, pois a cada nova estria, uma quantidade menor de bactérias é espalhada, possibilitando o isolamento de colônias (Figura 1 B).

Figura 1: Semeadura em placa pela técnica de esgotamento. A: Desenho esquemático do estriamento; B: Obtenção de colônias isoladas de bactérias pela técnica.

 ETAPA II. Técnica da diluição seriada.

 Retirar 1 mL da cultura de bactérias com o auxílio da micropipeta de 1 mL;

 Inserir essa amostra em um tubo de ensaio contendo 9 mL de caldo LB e agitar;

 Repetir este procedimento até que se obtenha 6 diluições, como indicado na Figura 2.

 Retirar 0,1 mL de cada uma das diluições com a micropipeta de 200 µL

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e adicionar no centro da placa de Petri contendo meio de cultura LB ágar;

 Flambar a alça de Drigalski. Para isso, mergulhar a alça em recipiente com álcool e aproximá-la cuidadosamente da chama, para flambá-la.

Em caso de dúvida, aguarde o professor ou o monitor para realizar essa etapa;

 Esfriar a alça na tampa da placa de Petri;

 Espalhar homogeneamente a amostra na placa com a alça. Cuidado para não furar o meio com a alça;

 Flambar novamente a alça e realizar o próximo plaqueamento;

 Incubar as placas a 37^o C e observá-las após 24 h de incubação.

 Após 24 h, realizar a contagem do número de colônias obtidas para as diluições aonde foram obtidas colônias isoladas.

 Registrar os resultados com fotos.

Figura 2: Técnica de diluição em série. Fonte: Vermelho et al. (2011). Práticas de Microbiologia.

Ed. Guanabara Koogan.

 ETAPA III. Contagem do número de UFC/mL presente na suspensão de bactérias.

 Após 24 h de incubação das placas preparadas pela técnica de

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diluição seriada, escolher uma placa com no mínimo 20-30 colônias e no máximo 200-300 colônias para calcular a quantidade aproximada de bactérias presentes em 1 mL da solução inicial. Lembrar que cada colônia isolada é gerada a partir de uma única célula bacteriana, sendo por isso denominada unidade formadora de colônia (UFC);

 Para o cálculo considerar o número de colônias obtidas, o fator de diluição e o volume inoculado na placa.

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1. O que diferencia as técnicas de esgotamento e diluição seriada? Elas podem ser utilizadas com os mesmos propósitos? Justifique a sua resposta.

2. O que você observou, após 24 h de incubação, nos dois experimentos?

Justifique sua resposta com as imagens obtidas.

3. Foi possível calcular o número de UFC/mL no experimento de diluição seriada? Descreva aqui seu cálculo e resultado.

4. Dentro das diferentes linhas de pesquisa que trabalham com microrganismos, cite um ou mais exemplos sobre a importância de se obter colônias isoladas e/ou quantificar o número de microrganismos em uma amostra.

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PRÁTICA 7: Análise macroscópica e microscópica de fungos.

Objetivos:

 Observar características macroscópicas e microscópicas de fungos.

Materiais:

 Placas com fungos coletados na Prática 1 em meio Sabouraud;

 Lâminas e lamínulas para microscopia;

 Solução de azul de lactofenol em frasco conta gotas;

 Microscópio óptico;

 Óleo de imersão;

 Bico de Bunsen ou lamparina.

Procedimentos:

 Observar as diferentes colônias quanto à sua macromorfologia;

 Acender a lamparina;

 Colocar uma gota de lactofenol na lâmina;

 Flambar a alça de platina e esfriá-la no meio de cultura da placa;

 Com a alça, raspar a superfície de uma colônia;

 Colocar o raspado na lâmina com a gota de lactofenol;

 Cobrir com uma lamínula;

 Observar ao microscópio na objetiva 40 x.

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1. Quanto ao aspecto macroscópico da colônia escolhida, indicar:

a. Cor da colônia:...

b. Presença de pigmento no reverso na colônia (verso da placa):

Sim (...) ou Não (...)

c. Superfície da colônia (indicar se é lisa, rugosa, algodonosa, brilhante,

cremosa, opaca, aveludada, pastosa, ou

coriácea):...

d. Borda da colônia: (indicar se é ondulada, franjada ou arredondada):...

e. Elevação da colônia:

Achatada (...) ou Levantada (...)

2. Esquematize o que você observou nas lâminas quanto à forma das células fúngicas, incluindo legendas.

Objetiva de 100 x. Aumento final: ...

3. A colônia que você observou era de um fungo filamentoso (bolor) ou levedura? Caso você tenha observado um fungo filamentoso, foi possível localizar estruturas reprodutivas na sua lâmina?

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PRÁTICA 8: Obtenção de suspensão de conídios.

Objetivos:

 Preparar e quantificar uma suspensão de conídios e quantificá-la através de contagem em câmara de Neubauer.

Materiais por grupo:

 Microrganismo: fungo isolado do ambiente (fornecido pela professora);

 Pipeta sorológica de 10 mL estéril;

 Pipeta sorológica de 20 ou 25 mL estéril;

 Pipetador;

 Espátula estéril;

 1 tubo Falcon de 50 mL estéril;

 3 eppendorfs estéreis;

 Micropipetas de 10, 200 e 1000 µL;

 Ponteiras estéreis de 10, 200 e 1000 µL;

 1 placa de Petri para cultivo do fungo;

 Lãminas e lamínulas;

 Kit para filtrar os conídios (1 kit por turma)

 Funil de vidro para encaixe em erlenmeyer de 250 mL;

 Erlenmeyer de 250 mL;

 Gaze para fazer camadas dentro do filtro.

O kit funil-gaze- erlenmeyer deverá ser esterilizado junto e previamente à aula.

Materiais - Reagentes:

 Meio de cultivo Potato Dextrose Agar para preparo de 25 mL por placa de Petri;

 250 mL de solução de NaCl 0,15 M estéril.

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Materiais - Equipamentos:

 Lamparina;

 Centrífuga com suporte para tubo Falcon de 50 mL e para eppendorf de 1,5 mL;

 Microscópio;

 Câmara para contagem de células (câmara de Neubauer).

Procedimentos:

Cultivo do fungo:

 Os fungos terão sido inoculados com 15 dias de antecedência a aula em placas de Petri contendo meio de cultura Potato Dextrose Agar;

 As placas serão mantidas em temperatura ambiente até o momento de preparo da suspensão de conídios;

Preparo da suspensão de conídios:

 Todos os procedimentos deverão ser realizados próximos à chama da lamparina;

 Com o auxílio da pipeta sorológica, colocar aproximadamente 5 mL de solução salina dentro da placa contendo o fungo (poderá ser adicionada mais solução, caso necessário);

 Com a espátula, “amassar” o fungo até que ele fique totalmente imerso na solução salina. Cuidado para não furar o ágar ou remover pedaços deste durante esse processo;

 Pegar a solução e filtrar no “kit conídio”. Para melhorar o rendimento da filtragem, adicionar mais 5 mL de solução salina ao funil;

 Quando todos os grupos tiverem realizado esse processo, cada grupo deverá adicionar 10 mL da solução que passou pelo funil em seu Falcon de 50 mL;

 Centrifugar a 3000 rpm durante 20 min;

 Descartar o sobrenadante;

 Ressuspender o que ficou no tubo “pellet” em 1 mL de solução salina estéril;

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 Centrifugar novamente a 10.000 rpm durante 3 min, descartar o sobrenadante e ressuspender em 1 mL de solução salina (realizar essa etapa duas vezes);

 Após a última centrifugação, descartar o sobrenadante e ressuspender em 1 mL de solução salina;

 Com a micropipeta de 10 µL, pegar 10 µL da solução de conídios e adicionar na Câmara de Neubauer para contagem no microscópio (as instruções para contagem serão dadas durante a aula).

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PRÁTICA 8: Questões.

1. Pesquise sobre o fungo utilizado em aula e esquematize onde estariam as estruturas que você isolou hoje.

2. Qual a função dessas estruturas?

3. Sugira uma aplicação para a técnica aprendida hoje.

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PRÁTICA 9: Análise da eficácia de diferentes desinfetantes e antissépticos.

Objetivos:

 Comparar a eficácia de diferentes desinfetantes e antissépticos no controle de micro-organismos.

 Experimento 1: Ação de diferentes desinfetantes Materiais:

 Tubos de ensaio estéreis (12 para cada grupo);

 Tubos de ensaio contendo 3 mL de meio de cultura LB líquido (15 para cada grupo);

 Tampões de algodão para as culturas (colocados nos tubos);

 Tubos Falcon de 50 mL contendo meio de cultura LB líquido + bactéria Escherichia coli + 3 palitos de dente (4 tubso para cada grupo);

 Estufa a 37°C;

 Pinças esterilizadas;

 Desinfetantes a serem testados (o grupo deverá escolher um):

a. Hipoclorito de sódio (0,1%, 1%, 3%, água, controle) b. Álcool etílico (30%, 70%, 96%, água, controle) c. Lisoforme (30%, 70%, 100%, água, controle) d. Detergente comum (1%, 5%, 10%, água, controle)

Procedimentos:

 Preparar as 3 soluções do produto escolhido para 10mL (em tubos de ensaio, 3 para cada diluição, o que resultará em 9 tubos de ensaio).

Não esqueça de identificar o tubo, incluindo a diluição do produto;

 Preparar 3 tubos de ensaio com 10mL de água destilada;

 Cada grupo terá 4 tubos de ensaio com meio de cultura LB líquido + E.

coli + 3 palitos de dente. Os palitos serão as superfícies infectadas;

 Pegar os tubos de ensaio com os palitos infectados, observar que o meio de cultura está turvo, retirar cada um dos palitos com a pinça

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estéril e colocá-los separadamente nos tubos contendo a solução do produto testado, inclusive na água;

 Deixar agir por 10 minutos;

 Atenção: durante este intervalo, acenda a lamparina e posicione os tubos contendo meio LB líquido na zona de segurança proporcionada pela chama;

 Passados os 10 minutos, retirar cada um dos palitos com a pinça esterelizada e inseri-los em cada um dos tubos de ensaio com meio de cultura LB líquido (puro).

 Após a inserção do palito, feche o tubo e identifique o mesmo.

Cuidado para não aproximar os palitos com os produtos perto da chama;

 Incubar os tubos a 37°C;

 Observar a ocorrência de crescimento bacteriano após 24 h. Registrar o resultado com fotos.

 Experimento 2: Ação de diferentes antissépticos.

Materiais:

 Placa de Petri contendo meio LB ágar (1 por grupo). Abrir somente na hora de semear os micro-organismos;

 Solução salina estéril (1 por grupo);

 Sabonete neutro para lavagem das mãos;

 Cotonetes estéreis (6 por grupo);

 Gaze estéril;

 Antissépticos a serem testados (2 tipos por grupo):

a. Álcool 70%

b. Álcool-iodado c. Povidona-iodo

d. Digluconato de clorexidina (mertiolate)

 Estufa a 37°C;

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Procedimentos:

 Com o auxílio da caneta de retroprojetor, dividir o fundo da placa (porção menor da placa) em quatro partes iguais. Atenção: não é necessário abrir a placa neste momento;

 Numerar os quadrantes de 1 a 4. Cada quadrante irá corresponder a um dos procedimentos descritos abaixo:

 QUADRANTE 1:

a) Na zona de segurança da chama, remover o papel alumínio de uma das extremidades do cotonete estéril, tomando cuidado para não expor a outra extremidade, e molhá-lo em solução salina estéril, que também deve ser aberta na zona de segurança;

b) Esfregar o cotonete molhado no dorso de uma das mãos, em uma área de + ou - 5 cm;

c) Na zona de segurança, abrir a placa e semear com este cotonete a placa na região correspondente ao quadrante 1. Fechar a placa.

 QUADRANTE 2:

d) Não semear nada.

 QUADRANTE 3 (Antisséptico 1):

e) Embeber a extremidade não utilizada do cotonete em uma das soluções de antisséptico e esfregá-la no dorso da outra mão, em uma área de + ou - 5 cm;

f) Aguardar 5 minutos para que o antisséptico possa agir sobre os micro-organismos da pele;

g) Pegar outro cotonete e molhar uma das extremidades na solução salina e esfregá-lo na área tratada com o antisséptico.

h) Abrir a placa e semear com este cotonete a placa na região correspondente ao quadrante 3. Fechar a placa.

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 QUADRANTE 4 (Antisséptico 2):

i) Repetir procedimentos e, f, g e h (Quadrante 3) em uma região da mão diferente da que foi utilizada para testar o antisséptico anterior;

 Embalar as placas com o filme plástico e identificá-las;

 Incubar a 37^o C;

 Observar a placa após 24 h e 96 h (segunda-feira).

 Registrar o resultado com fotos.

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1. Desinfetante testado no experimento 1: ...

2. Antissépticos testados no experimento 2: ...

3. Qual a importância dos controles em um experimento como este? Quais são os controles positivo e negativo dos experimentos 1 e 2 e o que você espera de resultado para ambos em relação ao crescimento microbiano?

4. Considerando o Desinfetante e Antisséptico utilizados, qual deles se mostrou mais eficaz?

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PRÁTICA 10: Antibiograma.

Objetivos:

 Analisar a susceptibilidade da bactéria E. coli a determinados antibióticos pelo método de difusão em ágar.

Materiais:

 Cultura pura de bactérias E. coli em meio líquido (1 tubo por grupo);

 Placa de Petri contendo ágar Mueller-Hinton;

 Discos comerciais impregnados com os antibióticos: oxacilina (OXA), rifampicina (RIF), sulfonamida (SUL) e estreptomicina (EST);

 Swab estéril (1 por grupo)

 Pinça pequena esterilizada para pegar os discos;

 Estufa à 37^o C.

Procedimentos:

 Dividir a placa de com meio em 4, anotar qual antibiótico irá em cada quadrante;

 Acender o bico de Bunsen;

 Introduzir o swab estéril na cultura de bactérias. Retire o excesso de líquido comprimindo a ponta do swab na parede do tubo;

 Espalhar o conteúdo do swab na placa com movimento estriado. Fazer estrias bem próximas uma da outra, a fim de obter um tapete de bactérias em toda a superfície do meio;

 Aguardar uns 3 min para que a placa fique seca;

 Com o auxílio de uma pinça estéril, colocar os discos de papel contendo os antibióticos sobre a cultura seca;

 Incubar em estufa a 37º C por 24 h;

 Após 24 h, medir os halos formados (em mm) com uma régua;

 Tirar foto das placas.

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1. Qual a utilidade de um teste Antibiograma?

2. Qual dos antibióticos utilizados se mostrou mais eficaz quanto ao controle do crescimento bacteriano?