RESUMO
Introdução: A Vitis vinifera L. é um antioxidante natural extraído das sementes de uva, seus componentes ativos constituem flavonóides e proantocianidinas, que, além de atuarem como seqüestradores de radicais livres, promovem a vasodilatação, inibem fosfolipases, ciclooxigenases e lipoxogenases, bem como reduzem a peroxidação lipídica. Este estudo visou avaliar o efeito renoprotetor da Vitis vinifera sobre a função renal de ratos com lesão renal aguda isquêmica (LRAi). Métodos: Foram utilizados ratos Wistar, machos, adultos, submetidos à isquemia, procedimento que se constituiu no clampeamento bilateral dos pedículos renais por 40 minutos. Os ratos foram distribuídos em grupos que receberam ou não o pré-tratamento com Vitis
vinifera (3,0mg/kg, VO, uma vez ao dia, durante cinco dias antes do procedimento cirúrgico). Foram avaliados a função renal, por meio da depuração de
creatinina, e o perfil oxidativo, por meio da mensuração de peróxidos urinários, através do método FOX – 2. Resultados: O grupo submetido ao tratamento com Vitis vinifera apresentou melhora significativa da função renal, atenuando a redução da depuração de creatinina e fluxo urinário, além do menor incremento dos níveis de peróxidos urinários. Conclusão: A utilização da Vitis vinifera como agente antioxidante promoveu proteção funcional nos animais com LRA isquêmica, com melhora significativa de função renal e diminuição da excreção de peróxidos urinários, em relação ao grupo controle.
Descritores: Lesão renal aguda. Isquemia. Vitis vinifera. Antioxidante.
ABSTRACT
Introduction: Vitis vinifera L. is an antioxidant agent extracted from grape seeds, and composed of flavonoids and proanthocyanidins. It has been shown to reduce free radicals, induce vasodilation, inhibit phospholipase, cyclooxygenase and lipooxygenase, and reduce the total lipid peroxidation index. The aim of this study was to evaluate the protective renal effect of the Vitis vinifera on renal function in rats with acute renal ischemic injury (ARIi). Methods: Male, adult, Wistar rats underwent renal ischemia for 40 minutes. They were distributed into groups that received or not Vitis vinifera (3.0mg/kg, P.O., once a day, during the 5 days prior to surgery). Renal function was evaluated by creatinine clearance, and the oxidative profile (urinary peroxide) was measured by the FOX – 2 assay. Results: The group submitted to treatment with Vitis vinifera showed a significantly lower degree of renal injury, with almost no reduction in creatinine clearance and in urinary output, along with a reduction in the level of urinary peroxide promoted by the ischemic maneuver. Conclusion: The use of the Vitis vinifera, an antioxidant agent, promoted functional renal protection in the animals with ischemia ARIi.
Keywords: Acute renal injury. Ischemia. Vitis vinifera. Antioxidant.
Efeito Protetor da Vitis Vinifera na Lesão
Renal Aguda Isquêmica em Ratos
Protective Effect of Vitis Vinifera in
Acute Renal Ischemic Injury in Rats
Juliana da Silva Bezerra, Wanessa Teixeira, Maria de Fátima Fernandes Vattimo
Escola de Enfermagem da Universidade de São Paulo – EEUSP
Laboratório Experimental de Modelos Animais (LEMA), Escola de Enfermagem da Universidade de São Paulo (EEUSP), São Paulo, SP.
Artigo Original
Recebido em 06/09/07 / Aprovado em 19/03/08
Endereço para correspondência:
Juliana da Silva Bezerra Rua Vito Chiarella 52 05848-180, São Paulo, SP.
INTRODUÇÃO
Fitoterápicos são medicamentos originados de partes de plantas cujos princípios ativos não foram puri-ficados, podendo ser utilizados na forma de tinturas, extra-to seco em cápsulas, xaropes, elixires, entre outras. Esta linha de medicamentos demonstra ser a grande tendência mundial no tratamento de diversas doenças, tendo hoje um interesse crescente na área de pesquisas científicas1. Entre os diversos fitoterápicos, este estudo deu destaque ao extrato de semente de uva da Vitis vinifera.
O uso de agentes antioxidantes naturais contidos na dieta e em bebidas como o vinho tem merecido desta-que por suas propriedades antioxidantes. Evidências recen-tes comprovaram as propriedades antioxidanrecen-tes dos com-postos fenólicos presentes em produtos derivados da uva (Vitis vinifera), especialmente no vinho tinto2. O extrato de semente de uva é obtido a partir das sementes da Vitis
vinifera L.. Estudos mostram que seu potencial
antioxi-dante é melhor que o da vitamina E3. A semente de uva contém uma grande quantidade de proantocianidinas e catequinas, que são flavonoídes (digômeros polifenólicos derivados de flavan-3-óis e flavan-3,4-dióis), responsáveis pelo caráter polifenólico com propriedades antioxidantes. Os outros componentes ativos presentes no extrato de uva incluem os ácidos graxos essenciais e tocofenóis4.
Há evidências que demonstram a capacidade des-ses componentes polifenólicos de evitar a oxidação da lipo-proteína de baixa densidade (LDL)5 e inibir a agregação plaquetária6, que se caracterizam como fatores de risco para coronariopatias; além de possuírem efeito antiinfla-matório7, reduzirem a pressão arterial, inibindo a enzima de conversão da angiotensina8,9e até mesmo de bloquearem a expansão de formações tumorais como o melanoma10-13, A Lesão Renal Aguda (LRA) se caracteriza por uma redução abrupta da função renal definida por aumento absoluto da creatinina sérica de pelo menos 0,3mg/dL, elevação de 50% (até 1,5 vez) do valor basal ou redução do fluxo urinário, documentado como oligúria ou menor de 0,5mL/kg por hora por mais de seis horas14. O mecanismo de isquemia-reperfusão é a etiologia mais comumente relacionada à lesão renal15.
Na isquemia, um dos eventos mais precoces é a redução dos níveis intracelulares de ATP, que compro-mete preferencialmente porções do néfron que possuem alta taxa de reabsorção tubular com gasto de energia, como o túbulo proximal e a alça ascendente espessa de Henle. A depleção de ATP desencadeia uma série de eventos, incluindo desestruturação do citoesqueleto, perda da polaridade celular e interação célula-célula, produção de espécies reativas de oxigênio, alterações do pH intracelular, podendo culminar com morte celular15,16.
Enquanto perdura a hipóxia, o estoque de ATP da célula é rapidamente consumido, gerando quantidades enormes de adenosina e de seu principal metabólito, a hipoxantina. A metabolização da hipoxantina só pode ocorrer em condições aeróbicas. Portanto, a hipoxantina acumula-se na célula até que a oxigenação da mesma seja restabelecida. Quando isso finalmente acontece, todo o estoque de hipoxantina é rapidamente transformado em xantina e ácido úrico, que é o catabólito final. Essa reação gera também superóxido e hidroxila, radicais livres com grande potencial citotóxico. Em condições normais, esses compostos são formados em quantidade pequena, o sufi-ciente para que a célula evite facilmente a elevação de seus níveis através de enzimas que os removem.
Nas condições de reperfusão, no entanto, o acúmulo de hipoxantina leva à formação de grandes quan-tidades radicais livres, também chamados de espécies reativas de oxigênio (EROs) que, embora existam durante um intervalo de tempo extremamente curto, têm efeitos tóxicos devastadores17. A peroxidação lipídica, a oxida-ção das proteínas celulares e a lesão dos ácidos nucléicos são alguns desses efeitos causados pelas EROs14 que contribuem para o dano celular funcional e a necrose. A esse mecanismo dá-se o nome de estresse oxidativo, lesão oxidativa ou desequilíbrio do mecanismo redox15,18.
Estudos experimentais com ratos demonstraram que a administração de agentes antioxidantes tem conferido proteção frente à lesão pela redução dos índices de estresse oxidativo19-21.
Assim sendo, este estudo visou avaliar a ação antioxidante da Vitis vinifera como estratégia de proteção da função renal em animais com LRAi.
OBJETIVOS
Avaliar o efeito da Vitis vinifera sobre a função renal (FR) de ratos com Lesão Renal Aguda isquêmica.
Avaliar o efeito da Vitis vinifera sobre a excreção de peróxidos urinários de ratos com Lesão Renal Aguda isquêmica.
MATERIAIS
Foram utilizados ratos de raça Wistar, adultos, machos, pesando entre 250-315 gramas (peso prévio ao procedimento cirúrgico), distribuídos nos seguintes grupos:
Grupo 1 : grupo Sham (controle) - animais submetidos a laparotomia e cirurgia semelhante ao grupo isquemia, sem clampeamento do pedículo renal. Esses animais não receberam nenhuma droga ou veículo da droga utilizado nos grupos tratados.
Grupo 2 : grupo isquemia - animais que foram submetidos a isquemia renal por 40 minutos, através do clampeamento do pedículo renal.
Grupo 3 : grupo isquemia + Vitis vinifera- animais que foram submetidos à isquemia renal por 40 minutos, através do clampeamento do pedículo renal + administração de Vitis
vinifera (Vittis; Herbarium Laboratório Botânico Ltda);
3,0mg/kg, via oral por gavagem, uma vez ao dia, durante cinco dias antes da cirurgia.
MÉTODOS
Todos os grupos tiveram livre acesso à água e ração padronizada e permaneceram em condições térmicas adequadas. Os animais foram anestesiados com solução de hidrato de cloral (Merck – Damstadt, Alemanha) a 10% (0,1mL/kg), intraperitoneal. Os animais do grupo isquemia foram subme-tidos à isquemia renal por meio de clampeamento bilateral do pedículo renal por 40 minutos, utilizando clamps (Medicon Instrumente – Tuttlingen, Alemanha) vasculares não traumá-ticos. Decorrido este tempo, os clamps foram retirados, ocorren-do a reperfusão renal espontânea. Por fim, foi realizada a sutura da incisão. Os animais do grupo SHAM foram submetidos ao mesmo procedimento, porém sem o clampeamento, apenas manipulação delicada do pedículo renal.
Ao término da cirurgia, os animais foram devolvidos à gaiola coletiva, onde permaneceram por 24 horas para recuperação do ato cirúrgico. Em seguida, os animais foram colocados em gaiola metabólica para coleta de urina de 24 horas para posterior verificação da depuração de creatinina e coleta de amostra urinária para mensuração de peróxidos urinários.
Após o período de 24 horas, os ratos foram retirados da gaiola da metabólica, anestesiados com hidrato de Cloral, conforme descrito anteriormente, e foi realizada nova lapara-tomia para coleta de amostra sanguínea por punção da aorta abdominal para posterior mensuração da creatinina sérica.
Ao final do experimento, os animais foram sacrificados de acordo com as recomendações para utilização de animais para fins científicos.
Os animais dos grupos foram submetidos a análise de função renal por depuração de creatinina (Clcr ) como descrito pela fórmula abaixo:
Clcr = creatinina urinária (mg/dL) x fluxo urinário (mL/min) creatinina plasmática (mg/dL)
Os resultados foram apresentados como valores ajustados por 100g de peso corporal dos animais conforme classicamente aplicado nesses modelos.
A mensuração da creatinina plasmática e urinária foi realizada pelo método de Jaffé22.
O método ferro - xylenol orange versão 2 (FOX-2),foi utilizado para mensurar a excreção de peróxido urinário . Para 100µl da amostra urinária fresca, foram acrescentados 900µl da solução FOX-2 [90mL de metanol (Carlos Erba – SP, Brasil) e 10mL de água bidestilada, 100µM Xylenol Orange (Xylenol orange – Sigma; St Louis, USA), 4mM BHT (BHT – Butylated Hydroxytoline – Sigma; St Louis, USA), 25mM da solução de ácido sulfúrico (Sigma; St Louis, USA) e 250µM de sulfato ferroso de amônio (Vetec Química – RJ, Brasil)].
A leitura foi realizada por espectrofotometria (BECKMAN, USA) em absorbância de 560nm (coeficiente de extinção de 4,3 x 104M-1cm-1)23,24.
Os valores foram estabilizados por grama de creatinina urinária e expressos por nmol de peróxidos/grama de creatinina25,26.
ANÁLISE DE DADOS
A técnica de análise empregada foi o GLM univariado (modelo linear generalizado/univariado). Quando o nível de significância na tabela A nova foi ≤0,05, concluiu-se que o efeito de pelo menos um dos grupos era diferente dos outros. Para se verificar quais grupos diferiam entre si ou não, empregaram-se os testes múltiplos de comparação 2 a 2 de Bonferroni ajustado. O p-descritivo levou em consideração o número de comparações do modelo. O programa de estatística para análise dos dados foi o SPSS (Statistical Package for the Social Sciences) for Windows versão 16.
LOCAL DE COLETA DE DADOS
Os experimentos foram desenvolvidos no Laboratório de Pesquisa Experimental com Modelos Animais (LEMA) da Escola de Enfermagem da Universidade de São Paulo – EEUSP.
Tabela 1. Parâmetros globais, de função renal e de excreção de peróxidos urinários dos grupos SHAM, Isquemia e Isquemia tratada
com Vitis vinífera (Isquemia+ Vitis). Resultados estão expressos como média ± desvio padrão (X ± DP).
Grupo P (g) U (mL/min) Clcr/100g Peróxidos Urinários
(mL/min) (nmol/g creatinina)
SHAM (n=5) 268 ± 34 0,014 ± 0,008 0,55 ± 0,14 5,6 ± 0,7
Isquemia (n=8) 314 ± 33* 0,004 ± 0,001* 0,22 ± 0,07* 13,5 ± 0,8*
Isquemia+Vitis (n=11) 281 ± 18** 0,014 ± 0,004** 0,48 ± 0,10** 6,89 ± 1,6**
Sendo P: peso corporal; U: fluxo urinário; Clcr: clearance de creatinina/100g. *p< 0,05 vs SHAM, ** p< 0,05 vs Isquemia.
RESULTADOS
Os resultados demonstram que, quanto ao peso corporal, os grupos apresentaram diferenças entre si, porém, esse fato não pode ser atribuído ao procedimento de clampeamento ou tratamento instituído, já que os animais iniciaram os protocolos com pesos já diferentes. Conforme descrito anteriormente, na relação peso/idade, os animais do grupo SHAM deveriam ter uma média de 57 a 67 dias de vida, enquanto que o grupo Isquemia seria de animais com 68 a 73 dias e, no grupo Isquemia+Vitis, os ratos teriam em torno de 62-67 dias de vida. Considera-se essa variação de idade entre os animais irrelevante para efeito de comparação funcional renal entre os grupos, uma vez que, em modelos de ratos velhos, a idade mínima seria de aproximadamente 550 dias27.
Por outro lado, todos os animais apresentavam padrão de normalidade de função renal antes do início dos estudos. Os estudos de triagem funcional de todos os animais constam de diversas dosagens bioquímicas. Entre essas, ressalta-se que a média da uréia plasmática da colônia de ratos utilizada neste estudo era de 23,8mg/d. Os resultados demonstraram que o procedimento cirúrgico do grupo SHAM (sem clampeamento renal) não determinou comprometimento da função renal desses animais quando comparados com o grupo controle deste laboratório19,28 (depuração de creatinina = 0,55 vs. 0,60mL/min). Esse dado confirma que o grupo “SHAM” pôde ser utilizado como controle para este estudo.
Adicionalmente, já foi demonstrado por estudos anteriores que ratos da linhagem Wistar apresentam maturidade funcional renal a partir de peso corporal de 150g, que corresponde à idade de 35 a 40 dias. A partir daquele momento, e, no estudo apresentado, a análise foi implementada até o peso corporal de 350g, não cons-tatando diferenças significativas nas taxas de filtração por néfron único ou na filtração total com cálculo incluindo os néfrons justamedulares. No estudo ora apresentado, pode-se considerar que os grupos SHAM, Isquemia e Isquemia+Vitis, a despeito da diferença estatística nos valores de peso, não mostraram diferença basal de função que pudesse comprometer a interpretação dos dados de função a seguir apresentados29.
Os animais isquêmicos apresentaram redução da função renal quando comparados ao grupo SHAM (0,22 ± 0,07 vs 0,55 ± 0,14). A redução significativa de fluxo urinário nesse grupo confirmou o episódio de LRA isquêmica oligúrica (p< 0,05).
Quanto à excreção de peróxidos, usados como mar-cadores de peroxidação neste estudo, observou-se que o grupo Isquemia, quando comparado ao grupo SHAM, apre-sentou elevação nesse parâmetro (13,5 ± 0,8 vs. 5,6 ± 0,7).
Por outro lado, o tratamento com Vitis vinifera aos animais que posteriormente foram submetidos a isquemia renal promoveu melhora significativa na função renal, acompanhada de normalização do fluxo urinário (p< 0,05). Esses achados parecem ter respaldo na redução do com-ponente oxidativo, uma vez que o tratamento com o antio-xidante no grupo isquêmico determinou diminuição na excreção de peróxidos urinários (6,89 ± 1,6 vs. 13,5 ± 0,8).
DISCUSSÃO
A necessidade da realização de estudos com a utilização de fitoterápicos, como a Vitis vinífera, na LRAi, com o objetivo de propor intervenções terapêuticas para prevenir ou acelerar o restabelecimento do paciente com LRAi, pode ser promissora, uma vez que a lesão renal aguda, apesar do enorme avanço tecnológico experi-mentado nas últimas décadas, não apresentou mudança significativa na taxa de mortalidade, permanecendo ao redor de 50%17.
A LRAi provocada pela isquemia, por meio do clampeamento do pedículo renal por 40 minutos, visou, neste estudo, reconstruir a cadeia fisiopatológica da LRAi renal em ratos. Os dados obtidos caracterizaram a ocor-rência de LRAi do tipo oligúrica, ou seja, com redução do fluxo urinário.
O estresse oxidativo, resultante do mecanismo isquemia-reperfusão, contribui para danos celulares e funcionais observados após a instalação da síndrome, principalmente pela produção intensificada de EROs15,17. Uma das principais enzimas envolvidas na formação de EROs é a xantina-oxidase, ativada com o influxo de cálcio decorrente da disfunção de membrana e com depleção de ATP durante a isquemia15.
Os flavonóides do vinho representam um grupo de plantas fenólicas que tem merecido destaque por suas propriedades antioxidantes, que, além de seqüestrar radi-cais livres, modulam atividades enzimáticas em prol da inibição da peroxidação lipídica, presente em vários pro-cessos patológicos, como em questão a doença renal 28,30. Estudos demonstraram que alguns flavonóides (querce-tina e resveratol) são capazes de inibir a atividade da xantina-oxidase, diminuindo assim o dano oxidativo31-33. Para confirmar a geração de EROs na lesão isquê-mica, são utilizados alguns marcadores de lesão celular. Neste estudo, os peróxidos urinários foram analisados por meio do método FOX - 2. A administração de Vitis vinifera, previamente à isquemia, resultou na diminuição signi-ficativa dos níveis de peróxidos, determinando também melhora na função renal, considerando-se a depuração de creatinina como marcador biológico. Resultados
semelhantes foram encontrados em estudos realizados em ratos com LRAi por rabdomiólise34.
Acredita-se que este efeito renoprotetor do grupo tratado possa estar relacionado ao bloqueio da cascata de formação de EROs, seja ele pela inibição da xantina-oxidase ou através do seqüestro de radicais livres, pelos compostos polifenólicos presentes no extrato de semente de uva, ou ainda, pela atuação nessas duas vias.
Recentemente, foi demonstrado que o bioflavonói-de proantocianidina usado em mobioflavonói-delo bioflavonói-de lesão renal por glicerol, também extraído das sementes de uvas, melho-rou significativamente a histologia renal, com redução do volume tubular e dos restos celulares tubulares. Observou-se também a recuperação da função renal e foi sugerido que a melhora histofuncional poderia ser atribuída ao relaxamento vascular determinado pela proantocianidina. Contudo, naqueles dados, não foi realizado mensuração de peroxidação lipídica35.
Por outro lado, em modelo de isquemia, à seme-lhança do que foi reproduzido neste estudo, constatou-se o efeito renoprotetor das proantocianidas. Demonstrou-se que o pré tratamento com uma mistura de bioflavonóides em ratos submetidos a isquemia renal bilateral protegeu a função com elevação da depuração de creatinina e redução da creatinina plasmática. Observou-se ainda melhora histológica caracterizada por redução da necrose tubular na faixa externa da medula externa36.
Em síntese, os resultados apresentados neste estudo realçaram o efeito protetor da Vitis vinifera na função renal de ratos submetidos ao modelo de isquemia renal por clampeamento de 40 minutos. Esse achado foi comple-mentado com a redução de peróxidos urinários, o que pode validar a hipótese de que o fitoterápico empregado neste estudo teve efeito antioxidante e que essa foi uma das vias de lesão no modelo reproduzido. Outros estudos que discutam maiores detalhes a respeito do perfil oxidativo após o tratamento com a Vitis e que mecanismos intracelulares estão envolvidos nessa proteção certamente trarão mais clareza aos dados apresentados neste estudo, assim como também à histologia das lesões renais.
CONCLUSÕES
O modelo de clampeamento utilizado promoveu episódio de LRAi oligúrica, tendo o mecanismo oxidativo como um dos ramos fisiopatológicos.
A utilização da Vitis vinifera como agente antio-xidante demonstrou efeito de proteção funcional nos ani-mais com LRAi, atenuando de forma significativa a redução da função renal, além de ter induzido menor incremento do nível de peróxidos urinários daqueles animais.
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