XI Encontro de Iniciação Científica do Centro Universitário Barão de Mauá

Avaliação da correlação dose/concentração plasmática da doxiciclina com evolução

clínica, alterações hematológicas e plaquetárias em cães portadores de Erliquiose

Canina.

Marcello Fernandes Carrijo¹, Wilson Roberto Malfará

_{Centro Universitário Barão de Mauá}

1_{marcellocarrijo@gmail.com,} 1*_{wilson.malfara@baraodemaua.br}

Resumo

A erliquiose é uma doença causada por bactérias do gênero Ehrlichia. O presente estudo teve como objetivo a avaliação em parâmetros hematológicos e plaquetários e concentração plasmática da doxiciclina. O método se mostrou adequado e pertinente. Observou-se melhora hematológica e plaquetária progressiva e através da análise por UPLC-MS/MS, sugere-se que a dose de 7,5mg/kg seja adotada nas terapias, pela sua menor variabilidade entre os animais.

Introdução

A erliquiose canina é uma doença riquetsial também conhecida como Tifo Canino, Pancitopenia Canina Tropical, Febre hemorrágica Canina e Doença do Cão Rastreador (STORTI, 2006). O agente etiológico foi reconhecido pela primeira vez na Argélia em 1935, por Donatien e Lestoquard. (DUBIE, et. al., 2014). Há uma grande prevalência da doença no Brasil (BORIN, et. al., 2009), evidenciando-se maior frequência na região Nordeste (43%) e menor frequência na região Sul, coincidindo com a prevalência do seu vetor (SILVA, 2015). É considerada importante zoonose, devido à exposição de humanos aos vetores e a locais onde a doença é enzoótica (SILVA, et al., 2011). O agente causal é uma riquétsia pertencente ao gênero Ehrlichia, Família Rickttsiaceae, Ordem Rickettsiales (SILVA, 2015), que são bactérias gram negativas, consideradas parasitas intracelulares obrigatórias de células mononucleares (SILVA, et al., 2011). A Ehrlichia canis é a espécie que desempenha maior frequência de parasitismo dos cães, mas estes também podem ser infectados por E. equi, E. platy, E. ewing, E. chaffensis (BORIN, et. al., 2009).

O carrapato Rhipicephalus sanguineous é o principal vetor da erliquiose (Dubie, et. al., 2014), entretanto, Amblyomma americanum e Octobius magnini também são capazes de transmitir a doença (BORIN, et. al., 2009). A multiplicação da bactéria no vetor ocorre nos hemócitos e nas células da glândula salivar, propiciando a

transmissão transestadial (SILVA, 2015). Deste modo, o carrapato ao ingerir sangue do animal para sua alimentação inocula os microorganismos presentes na saliva (SILVA, et. al., 2011). Além desta, outra maneira de infecção de cães suscetíveis é por meio da transfusão sanguínea (BORIN, et. al., 2009). A infecção ocorre principalmente dos agranulócitos, como monócitos e linfócitos, onde os principais agentes envolvidos são E. canis e E. chaffensis, que causam a Erliquiose Monocítica Canina. No caso de envolvimento dos granulócitos, como neutrófilos, comumente há envolvimento E. equi e E. ewingii, caracterizando a Erliquiose Granulocítica Canina. Quando o microorganismo riquetsiano se replica nas plaquetas ocorre a Trombocitopenia Cíclica Canina, causada

principalmente pela E. platys (STORTI, 2006).

Monocitica pode se apresentar clinicamente em três fases aguda, subclínica e crônica. (VIEIRA, et. al., 2011). A severidade dos sinais clínicos é afetada por diversos fatores, entre eles estão, a virulência da cepa, idade do animal, predisposição racial, doença coexistente e alimentação (SILVA, 2015). Cães imunocompetentes são capazes de eliminar o parasita e não desenvolve a forma crônica da doença, caso contrário, os animais são cronicamente infectados (SILVA, et al., 2011). Após a infecção do cão sadio, ocorre um período de incubação de 8 a 20 dias, o animal infectado entra na fase aguda da doença, que perdura por duas a quatro semanas (HARRUS, et. al., 1999). Durante essa fase aguda os sinais clínicos são transitórios e podem ser resolvidos sem tratamento, em uma ou duas semanas (ETTINGER e FELDMAN, 2004).Na fase aguda os sinais clínicos são febre, perda de peso, anorexia, corrimento oculonasal, dispneia, linfadenopatia, hepatoesplenomegalia, vômitos, lesões oculares, edema dos membros ou do escroto (ETTINGER e FELDMAN, 2004; VIEIRA, et. al., 2011;). Além destes, também podem ser observados uma variedade de sinais neurológicos provocados por inflamação ou sangramento no

interior das meninges (ETTINGER e FELDMAN, 2004). No hemograma pode-se identificar anemia normocítica normocrômica, leucopenia com desvio a esquerda e trombocitopenia (BORIN, et. al., 2009). A fase subclínica da infecção é iniciada seis a nove semanas depois da inoculação, e é caracterizada pela trombocitopenia, leucopenia e anemia regenerativa (VIEIRA, et. al., 2011), o animal não manifesta sinais clínicos e geralmente os carrapatos estão ausentes (SUZUKI,2013). Durante a fase crônica, os sinais clínicos podem ser discretos e ausentes ou graves, dependendo do cão (ETTINGER e FELDMAN, 2004). O diagnóstico da enfermidade pode ser sorológico, parasitológico direto, cultura ou através de técnicas de biologia molecular (DAGNONE et. al., 2003).

Os métodos cromatográficos assumem no contexto analítico uma importância fundamental, especialmente quando se trata da quantificação de fármacos em matrizes biológicas, para que as mesmas possam ser comparadas a evolução clínica do animal, visto que, com a detecção da real concentração plasmática, pode-se estabelecer com certeza uma padronização de dose.

A cromatografia líquida é muito usada para técnicas analíticas de separação, devido as sua detectabilidade e sua adaptabilidade as determinações quantitativas com exatidão (HOLLER et al., 2009). O espectrômetro de massas é um instrumento que produz íons e os separa de acordo com sua razão massa/carga (m/z). Existem diversos tipos de espectrômetros de massas como, por exemplo, triplo quadrupolos, que são utilizados para quantificação de compostos 39 conhecidos, sendo monitoradas as transições de massas específicas (KOSJEK et al. 2007). No sistema MS/MS o íon é separado no primeiro quadrupolo Q1, no segundo quadrupolo Q2 ocorre a colisão entre as moléculas e o íon é fragmentado através de um gás inerte, geralmente nitrogênio. No terceiro quadrupolo Q3 fragmentos são separados de acordo com sua m/z e encaminhados para detecção (SKOOG et al, 2002)

Objetivos

Avaliar as alterações hematológicas e plaquetárias em animais com diagnóstico de erliquiose canina e correlacioná-las com a dose versus concentração plasmática da doxiciclina, principal fármaco utilizado para tratamento da patologia.

Métodos/Procedimentos

O trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal (CEPan) do Centro Universitário Barão de Mauá, sob o número de protocolo 259/16. Foram avaliados 19 cães, de ambos os sexos, de raças e idades variadas, atendidas no período de outubro de 2016 a novembro de 2016 e de maio a outubro de 2017 no Hospital Veterinário (HV) do Centro Universitário Barão de Mauá. Os cães receberam doxiciclina, cedida pelo laboratório Agener (Doxitrat ®) nas doses de 5, 7,5 e 10,0 mg/kg a cada 12 horas por 28 dias oral. Durante o procedimento, foram obtidas amostra de sangue venoso em tubos com EDTA, sendo encaminhadas para a realização de exames hematológicos e sorológicos. Os exames hematológicos e plaquetários foram executados seguindo as técnicas de rotina no laboratório de análises clínicas do próprio HV, no primeiro dia da consulta (diagnóstico) e no 28º dia no retorno. No 14º dia de tratamento os animais cederam sangue para quantificação plasmática do fármaco. Os proprietários receberam gratuitamente o tratamento para todos os animais durante todo o período necessário.

O experimento de quantificação das amostras e da solução padrão de Doxiciclina (figura 1) fornecida pela indústria Ouro Fino foi realizado por UPLC-MS / MS no modo de monitoração de reações múltiplas (MRM) no espectrômetro de massa quadripolar tandem Waters Xevo TQ-S equipado com uma fonte de pulverização Z operando no modo positivo. A fonte de ionização e os parâmetros operacionais foram otimizados da seguinte forma: tensão capilar = 3,20 kV: temperatura da fonte de pulverização Z = 150 ° C, temperatura de dessolvatação (N2) = 350 ° C, fluxo de gás de dessincipação = 600 L h-1.A solução padrão de referência foi preparada por diluições apropriadas da solução de reserva (1,0 mg / mL) com CH3OH resultando nas seguintes concentrações de Doxiciclina: 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 5,0 e 10,0 μg / mL. O composto Minociclina (figura 1) foi utilizado como padrão interno (PI) a uma concentração de 2,0 μg / mL.As amostras de plasma sanguíneo (100 μL) foram homogeneizadas e o PI foi adicionado. O homogenato foi submetido a desproteinização com 300 μL de acetonitrilo gelado e centrifugado a 9000 rpm durante 5 min. Foram injetados cinco microlitros de amostras de plasma e soluções padrão numa coluna Monochrom C18 (50 x 2,0 mm i.d., Tamanho de partícula de 5 μm) de Varian. A fase móvel utilizada para a eluição em gradiente consistiu em 0,1% de ácido fórmico (solvente A) e metanol contendo 0,1% de ácido fórmico (solvente B) a uma taxa de fluxo de 0,4 mL min-1. As injeções duplicadas foram feitas para a solução padrão de Doxiciclina e amostras de plasma sanguíneo. A curva de calibração

y = 0,3402x - 0,0068 R² = 0,9989 0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50 0,00 1,50 3,00 4,50 6,00 7,50 9,00 Respo sta µg/mL Doxiciclina Doxiciclina Linear (Doxiciclina) (figura 2) obtida foi utilizada para quantificação de

Doxiciclina e a concentração nas amostras de plasma sanguíneo foi expressa em μg / mL. Para este efeito, cada concentração testada foi corrigida utilizando um fator de diluição de três vezes. Os dados foram adquiridos e processados usando o software TargetLynx ™ Application Manager (Waters, Corporation). As análises cromatográficas foram realizadas no Departamento de Química (FFCL-USP) no

Laboratório de Espectrometria de Massas e Produtos Naturais. Todas as análises estatísticas e gráficos foram realizados com auxílio dos “softwares” GraphPad Instat, Statgraphics e Prisma® empregando o teste não paramétrico de Kruskal-Wallis através de medianas, limite superior e inferior A significância estatística foi avaliada usando valores de p<0,05 com um intervalo de confiança (IC) de 95%.

Figura 1- Estrutura química da Doxiciclina e da Minociclina (P.I.)

Doxiciclina Minociclina

Resultados

A figura abaixo ilustra a curva analítica demonstrando a linearidade da doxiciclina em plasma de cães, obtida na padronização analítica.

Pela curva, observa-se que a linearidade está dentro dos parâmetros analíticos aceitáveis.

Figura 2 – Linearidade da curva analítica da doxiciclina em plasma de cães

Não se observou nesses parâmetros diferenças estatisticamente significativas entre as doses, que pudessem sugerir uma correlação dose/concentração plasmática, efetividade e superioridade no efeito farmacoterapêutico,

exceto no parâmetro plaquetas (D), onde observou-se uma diferença significativa (p<0,05) apresentando uma elevação, quando se compara o primeiro dia com o 28º dia.

5,0 7,5 10,0 5,0 7,5 10,0 0 20 40 60 80 1º Dia 28º Dia Dose mg/kg He m a tó c ri to % 5,0 7,5 10,0 5,0 7,5 10,0 0 5 10 15 1º Dia 28º Dia Dose mg/kg E ri tr ó c it o s m il /m m 3 5,0 7,5 10,0 5,0 7,5 10,0 0 5000 10000 15000 20000 25000 1º Dia 28º Dia Dose mg/kg L e u c ó c it o s m il /m m 3 5,0 7,5 10,0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 Dose mg/kg Co n c e n tr a ç ã o p la sm á ti c a u g /m L 5,0 7,5 10,0 5,0 7,5 10,0 0 100000 200000 300000 400000 500000 1º Dia 28º Dia

*

*

*

Figura 3 – Análise dos parâmetros hematológicos e plaquetários observados nos cães tratados com as doses de 5,0; 7,5 e 10,0mg/kg, administrados a cada 12 horas, no primeiro dia da consulta e no 28º dia.

A B

C D

Figura 4 – Análise do parâmetro concentração plasmática observados nos cães tratados com as doses de 5,0; 7,5 e 10,0mg/kg, administrados a cada 12 horas, no 14º dia do tratamento.

Na concentração plasmática a mediana não demonstrou diferença estatisticamente significativa entre as doses, porém, uma variação marcante entre os limites na concentração de 10mg/kg foi observada.

Conclusões

O método utilizado e padronizado para análise de doxiciclina em plasma por UPLC-MS/MS demonstrou-se aplicável para a quantificação proposta. Dos parâmetros eritrócitos, hematócrito

e leucócitos, embora observou-se uma variabilidade grande entre os animais, estes se demonstraram superiores, conferindo que em todos os regimes de dosagem com o continuar da terapêutica há uma melhora progressiva nos mesmos. Uma diferença ainda mais marcante (p<0,05) observou-se no parâmetro plaquetas, fato este reforçado pelo uso do glicocorticóide prescrito (prednisona).

Na comparação entre as concentrações plasmáticas não se observou diferença estatisticamente significativa, porém, uma variabilidade bem acentuada no grupo que recebeu 10 mg/kg, porém, ainda este não apresentou mediana tão diferente das demais doses.

O achado não é suficiente para a alegação de que exista uma dose padronizada para todos os casos, porém, destaca-se a importância da dose de 7,5 mg/kg, pois neste grupo não observa-se variação entre os animais que receberam a mesma. Ainda, os achados ilustram o quão importante é a realização de estudos que possam correlacionar dose administrada, concentração plasmática e efeito, pois a variabilidade biológica e parâmetros farmacocinéticos estão fortemente ligados a variação de concentração plasmática dos fármacos, incorrendo em muitas situações exigentes de modificações na terapêutica. Deve-se ainda se complementar que os estudos clínicos envolvendo animais são de extrema complexidade, onde a maioria de proprietários não retornou no 28º dia, e não se teve uma condição de acompanhamento nas administrações dos fármacos em seus animais, o que mostra a dificuldade de avaliação por questões externas às farmacológicas.

Referências

BORIN, S.; CRIVELENTI, L. Z.; FERREIRA, F. A. Aspectos epidemiológicos, clínicos e hematológicos de 251 cães portadores de mórula de Ehrlichia spp. naturalmente infectados.

Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, v.61, n.3, p.566-571, 2009.

DAGNONE, A. S.; MORAIS, H. S. A.; VIDOTTO, O. Erliquiose nos animais e no homem. Ciências

Agrárias, n. 2, p.191-201, 2001.

DAGNONE, A.S; MORAIS, H.S.A.; VIDOTTO, M.C.; JOJIMA, F. S.; VIDOTTO, O. Ehrlichiosis in anemic, thrombocytopenic, or tick-infested dogs from a hospital population in South Brazil.

Veterinary Parasitology, Estados Unidos, v. 117,

p.285-290, 2003.

DUBIE, T., MOHAMMED, Y., TEREFE, G., MUKTAR, Y. An insight review on canine ehrlichiosis with emphasis on its epidemiology

and pathogenesity importance. Global Journal of

Veterinary Medicine and Research, v.2 (4), p.

059-067, 2014.

ETTINGER, S.J.; FELDMAN, E.C. Riquetsioses. In: BREITSCHWERDT, E. B. TRATADO DE

MEDICINA INTERNA VETERINÁRIA: DOENÇAS

DO CÃO E DO GATO. 5ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2004. Cap. 86. p. 422-429.

HARRUS, S., WANER, T., BARK, H., JONGEJAN, F., CORNELISSEN, A. W.

Recent Advances in Determining the Pathogenesis of Canine Monocytic Ehrlichiosis.

American Society for Microbiology, v.37, n. 9,

p. 2745–2749, 1999.

HOLLER, F.J.; SKOOG, A.D.; CROUCH, R.S.; Princípios de Análise Instrumental. 6ed. Porto Alegre, Bookman, 11, 296-316, 2009.

KOSJEK, T.; HEATH, E.; PETROVIC, M.; BARCELÓ, D.; Mass spectrometry for identifying pharmaceutical biotransformation products in the environmental. Trends in Analytical Chemistry, 26, 1076-1085, 2007.

MANOEL, C. S. Alterações clínicas, hematológicas e sorológicas em cães infectados por Ehrliquia Canis, 2010. 67f. Dissertação (Mestrado) – Curso de Medicina Veterinária, Universidade de São Paulo, São Paulo, 100.

SILVA, M. V. M., FERNANDES, R. A., NOGUEIRA, J. L., AMBRÓSIO, C. E.. Erliquiose Canina: Revisão de Literatura. Arquivo de

Ciências Veterinárias e Zoologia da UNIPAR, v.

14, n. 2, p. 139-143, 2011.

SILVA, I. P. M. ERLIQUIOSE CANINA – Revisão de Literatura. Revista Científica de Medicina Veterinária, 2015.

SKOOG, D. A.; HOLLER, F.J.; NIEMAN, A.T.; Análise instrumental. 5 ed. Porto Alegre: Bookman, 2002.

STORTI, G. R. ERLIQUIOSE CANINA, 2006. 33 f. Monografia (Especialização) - Curso de

Medicina Veterinária, Clinica Médica de

Pequenos Animais, Universidade Castelo Branco Qualittas, Ribeirão Preto, 2006.

SUZUKI, F. T. Eficácia do medicamento

Doxiciclina na resolução da enfermidade Erliquiose Monocítica Canina (EMC), 2013. 18

f. TCC (Graduação) - Curso de Medicina Veterinária, Universidade Estadual Paulista, Júlio de Mesquita Filho, Araçatuba, 2013.

VIEIRA, R. F. C., BIONDO, A. W., GUIMARÃES, A. M. S., SANTOS, A. P, SANTOS, R. P., DUTRA, L. H., DINIZ, P. P. V. P., MORAIS, H. A,

MESSICK, J. B., LABRUNA, M., B., VIDOTTO, O. Ehrlichiosis in Brazil. Revista Brasileira Parasitologia Veterinária, v.20, n.1, p. 1-12, 2011.