A BUSCA DE IMPRESSÃO DIGITAL METABOLÔMICA EM FOLHAS DA ERVA-MATE – EFEITO DE SOLVENTE EXTRATOR
Ieda Spacinio Scarminio1, Fernanda Delaroza1, Leandro José Souza Duo1, Miroslava Rakocevic2 1 Universidade Estadual de Londrina - UEL, Departamento de Química, Laboratório de Quimiometria
em Ciências Naturais, Rodovia Celso Garcia Cid km 380, 86051-980 Londrina, Paraná, Brasil, e-mail: ieda@uel.br,fernandadelaroza@yahoo.com.br, duo@hotmail.com
2 Instituto Agronômico do Paraná - IAPAR, Rodovia Celso Garcia Cid km 375, 86047-902 Londrina,
Paraná, Brasil, e-mail: miroslava@iapar.br
Resumo
O objetivo do trabalho foi realizar uma análise exploratória do extrato bruto das folhas da Ilex
paraguariensis St. Hil (erva-mate) por métodos quimiométricos, visando obter subsídios para o
desenvolvimento da impressão digital metabólica, diferenciando dois ambientes de cultivo de plantas e dois sexos desta espécie. As folhas foram coletadas na onda de crescimento que ocorre na primavera em plantas clonais de dois sexos, cultivadas no mesmo sistema agroflorestal, sob sombreamento de 70% e nas clareiras. Na escolha do solvente extrator usou-se um planejamento estatístico de mistura tipo centróide simplex de quatro componentes (etanol, acetato de etila, diclorometano e hexano). Nos espectros no infravermelho com transformação de Fourier (FTIR) associados à análise de componentes principais (ACP), diferenciaram-se grupos metabólicos para o efeito de ambiente luminoso de cada sexo, quando a o solvente extrator foi mistura quaternária.
Palavras chave: ambiente luminoso dimorfismo sexual, FTIR, grupos metabólicos, quimiometria.
DETECTION OF THE METABOLIC FINGERPRINT IN YERBA-MATE LEAVES – EXTRACTION SOLVENT EFFECT
Abstract
The aim of this work was to conduct an exploratory analysis of the yerba-mate (Ilex paraguariensis St. Hil.) leaf crude extracts by the chemometric methods, aiming at obtaining the tools for the metabolic fingerprint, differencing two light environments and two genders of this species. The leaves were collected during a spring growth on clone plants of two genders, cultivated in agroforestry system in two light regimes: ones under the 70% of shade and others at sunny areas. The statistical planning of simplex-centroid design with four components (ethanol, ethyl-acetate, dichloromethane, and hexane) was used to choose of the extraction solvent. Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) and principal component analysis (PCA) shown the differentiation in metabolic groups for the light environment and yerba-mate sex effects, when the applied solvent was the quaternary mixture.
Key words: chemometry, FTIR, light environment, metabolic groups, sexual dimorphism. Introdução
Ilex paraguariensis St. Hil. (erva-mate) é uma espécie Sul-americana, arbórea, dióica, originada de
florestas subtropicais. No seu habitat natural ela ocupa o primeiro estrato que se encontra abaixo de
Angustifolia angustifolia, atingindo a altura de 15m. Erva-mate é considerada uma espécie umbrófila
(Carpanezi 1995). Devido o seu uso para produção de diferentes tipos de bebidas, as plantas são podadas no segundo ou terceiro ano. Por isso hoje raramente encontramos os indivíduos em crescimento livre, os que atingem a altura máxima e a forma não alterada por poda, com a exceção de algumas matrizes fêmeas, deixadas esporadicamente na borda de sistemas tradicionais agroflorestais, para a produção de sementes.
A bebida produzida de erva-mate possui as características medicinais, de ação hipocolesterolêmica, hepatoprotetora, estimulante do sistema central nervoso, diurética, beneficiária para sistema cardiovascular, recomendável para regime contra obesidade, com alta capacidade antioxidante e associada à prevenção até causa de alguns tipos de câncer (Heck e Mejia, 2007). As folhas são ricas em xantinas (cafeína, teobromina e teofilina), ácido clorogênico, saponinas e minerais.
O crescimento de erva-mate é rítmico, com duas ondas de crescimento que ocorrem na primavera e outono e duas pausas de crescimento (verão e inverno) – (Rakocevic et al., 2006a). O crescimento é geneticamente determinado e modificado por ambiente (Rakocevic e Martim, 2010). As modificações de morfogênese exercitadas pelas influências ambientais são mais pronunciadas quando as plantas são cultivadas sob um sistema que é menos parecido com o habitat natural desta espécie (monocultura), do que quando cultivadas em sub-bosque de floresta com A. angustifolia (Rakocevic e Martim, 2010). A erva-mate apresenta maior plasticidade morfogênica em monocultura do que na floresta e os indivíduos masculinos são mais sensíveis nas modificações ambientais do que os femininos (dimorfismo sexual morfológico), especialmente em monocultura.
Ambiente luminoso e sexo mostraram o seu efeito no sensorial de chimarrão - a bebida preparada com folhas oriundas de plantas masculinas foi menos amarga do que das femininas, particularmente quando coletadas das ponteiras dos ramos (Rakocevic et al., 2007), ou em monocultura comparada com floresta (Rakocevic et al., 2008), porém, o dimorfismo sexual não foi evidenciado em conteúdo geral de macro- e micro-elementos (Rakocevic et al., 2007). Devido ambigüidade na análise rotineira de metabólitos específicos, começou-se com a análise metabolômica, por meio da “impressão digital dos metabólitos”. O experimento metabolômico (amostragem, preparação da amostra, instrumentação analítica e preparação e interpretação dos dados), tem como objetivo obter informação biológica relacionada ao metaboloma. O metaboloma representa uma série completa de todos os metabólitos que existem em uma espécie biológica (Ellis e Dunn, 2005). Na análise metabolômica o objetivo é analisar tantos metabólitos quanto possível em uma única análise, e sendo assim, o extrato não é usualmente purificado, em contraste com os procedimentos de rotina usados para análise de metabólitos específicos.
Na abordagem de impressão digital dos metabólitos, um ou dois marcadores ou componentes farmacológicos ativos de plantas ou mistura de plantas são correntemente empregados no intuito de avaliar a qualidade e autenticidade de plantas medicinais, para identificar uma espécie ou mistura de espécies vegetais e para obter a quantificação desses componentes (Liang,et al., 2005). Este tipo de determinação não fornece um parâmetro completo, pois os efeitos terapêuticos muitas vezes são alcançados por múltiplos constituintes, os quais podem agir sinergicamente e dificilmente podem ser separados em “partes ativas”. Atualmente, muitas técnicas cromatográficas e espectrométricas são aplicadas para obter este tipo de resposta, já que neste caso o perfil cromatográfico ou espectroscópico inteiro seria tomado como “composto ativo” (Zhang, et al. 2005; Yan et al., 2005).
O objetivo do trabalho foi realizar primeiros passos na análise exploratória do extrato bruto das folhas da erva-mate por métodos quimiométricos, visando obter subsídios para o desenvolvimento da impressão digital metabólica, diferenciando dois ambientes de cultivo de plantas e dois sexos desta espécie.
Material e métodos
As plantas de erva-mate foram cultivadas no sistema agroflorestal (SAF) de indústria ‘Baldo’, em São Mateus do Sul (25°52'26"S e 50°22'58"W), Paraná, Brasil. Elas originaram de estaquias produzidas de duas árvores, cada uma de sexo oposto (matrizes registradas na indústria como M9 e F5). As duas árvores originárias (macho e fêmea) foram encontradas em SAF’s da mesma região.
As plântulas ’clonais’ da erva-mate foram plantadas no SAF em 2005 e foram coletadas as folhas na primavera de 2009 de alguns indivíduos (quarto ano de idade) que desta maneira foram submissos a poda pela primeira vez. Amostraram-se as folhas maduras e as novas emitidas na onda de brotação atual de primavera. Na amostragem foi diferenciado o sexo de plantas (machos e fêmeas) e disponibilidade de radiação solar (coleta de plantas muito sombreadas e das clareiras). Os dois ambientes luminosos definem-se pelo sombreamento de 70% (sombreadas) e clareiras que recebem a luz solar direto o dia todo. Respectivamente, as quatro amostras foram nomeadas Ms (machos sombreados), mc (machos de clareiras), Fs (fêmeas sombreadas) e fc (fêmeas de clareiras). As folhas serviram para a análise exploratória do extrato bruto de folhas.
Após as plantas serem secas em estufa no máximo 38-40o C (para evitar desnaturação das proteínas), as folhas foram trituradas em um liquidificador. O extrato bruto foi preparado com 10,00 g das folhas secas moídas submetidas à extração por maceração em banho de ultrassom por 30 minutos, com 60 mL do solvente extrator escolhido seguindo um planejamento experimental do tipo centróide-simplex com quatro componentes (Neto et al., 2001). Este planejamento é representado por um tetraedro (Figura 1), no qual os pontos 1, 2, 3 e 4 (vértices) correspondem aos solventes puros: etanol (et), acetato de etila (ae), diclorometano (dc) e hexano (hx). Os pontos 5, 6, 7, 8, 9 e 10 (arestas) correspondem às misturas de volumes iguais dos solventes (et-ae); (et-dc); (et-hx); (ae-dc); (ae-hx) e (dc–hx), respectivamente. Os pontos 11, 12, 13 e 14 (centro de cada face) correspondem às misturas de volumes iguais dos solventes (et-ae-dc); (et-ae-hx); (et-dc-hx) e (ae-dc-hx), respectivamente, e finalmente o ponto 15 (central) que corresponde à mistura de volumes iguais dos quatro solventes.
Figura 1. Planejamento
experimental do tipo centróide- simplex com quatro componentes.
Os extratos foram submetidos à filtração em papel filtro e submetidos à evaporação num evaporador rotativo a 40ºC e colocados para secar a temperatura ambiente até atingir peso constante.
Para a análise por espectroscopia no infravermelho com transformação de Fourier (FTIR) as pastilhas foram preparadas pesando 0,0010 g de cada extrato e homogeneizadas com 0,2000 g de KBr e algumas gotas de clorofórmio. Os espectros no infravermelho foram registrados na região de 4000-400 cm-1, com resolução de 1,93 cm-1 e média de
80 leituras. Para a realização dos métodos quimiométricos primeiro foi realizada análise visual para verificar problemas de variação da linha de base e ruídos dos espectros definindo com isto a região do espectro que contém a informação química necessária para a construção da matriz.
Os dados foram convertidos na forma de uma matriz (tabela de resultados), na qual é representada por X(nxp). As ‘n’ linhas da matriz representam as amostras (extratos), enquanto que as ‘p’ colunas são
variáveis que correspondem a uma propriedade medida para cada amostra, neste caso 3397 valores de absorbâncias. Para o pré-processamento da matriz Xnxp foi usada a normalização por comprimento do
vetor unitário, dividindo cada valor original pela soma dos quadrados de todos os valores das variáveis da mesma linha (Equação 1):
2 / p ij ij j 1 ' = = ∑ x x x Equação 1.
Após os cálculos de normalização, os resultados foram interpretados pela análise de componentes principais (ACP), um método que tem por finalidade a redução de dados a partir de combinações lineares das variáveis originais (Neto e Moita, 1998). A decomposição em ACP foi calculada através da diagonalização da matriz XtX e XXt. A matriz X
n x p foi decomposta no produto de
duas matrizes menores:
X = T Pt + E Equação 2. etanol (et) 1 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 diclorometano (dc) acetato de etila (ae) hexano (ae:dc) (et:dc) (ae:hx) (hx) (et:ae:dc:hx) 2 8 (dc:hx) (et:hx) (et:ae) (ae:dc:hx) (et:ae:dc) (et:dc:hx) (et:ae:hx)
no qual Tnxq é a matriz dos escores e Pqxp é a matriz “loadings” (pesos) das componentes principais, E é a
matriz dos resíduos. O sobrescrito ‘t’ indica a transposta da matriz e ‘q’ é um escalar que indica o número de componentes principais que descreve a maior parte da variância dos dados. Para análise da ACP foi usada a rotação varimax (Joreskog et al., 1976) que maximiza a variância dos pesos das componentes principais (agora nominadas de fatores 1, 2, 3, 4 e 5), sujeitos a restrição que eles retenham a ortogonalidade.
Resultados e discussão
A separação de extratos provenientes de plantas masculinas e femininas da erva-mate, cultivadas em dois regimes luminosos em SAF está apresentada na Figura 2. O gráfico da ACP dos fatores 3 com 4 separou os extratos das folhas de machos quando cultivados em dois ambientes luminosos (Figura 2A). A separação foi mais significativa quando os extratos foram submissos sob a mistura dos quatro solventes (combinação 15). Os extratos originados de folhas de plantas femininas cultivadas em dois ambientes também se separaram com a mesma mistura de solventes (Figura 2B), porém na análise de matriz de fatores 1 com 3. Os resultados apresentados na Figura 2 mostram que a combinação igual de quatro solventes (solvente 15) extrai diferentes grupos metabólicos que formam nas folhas como resultado de adaptação na falta/excesso de radiação solar. Embora o sistema extrator seja o mesmo para as plantas masculinas e femininas, os gráficos da matriz dos loadings, associados aos gráficos dos escores e os espectros originais, mostram que os conjuntos de grupos funcionais que discrimina as plantas masculinas das femininas são diferentes, levando a inferir que os metabólicos para as duas plantas nesta condição de extração são diferentes.
M s1 Ms2 M s3 Ms4 M s5 Ms6 M s7 M s8 Ms9 M s10 Ms11 Ms12 Ms13 Ms14 Ms15 mc1 m c2 m c3 m c4 mc5 mc6 mc7 mc8 m c9 mc10 mc11 m c12mc13 mc14 mc15 -0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Fator 3 -0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 F a to r 4 Fs1 Fs2 Fs3 Fs4 Fs5 Fs6 Fs7 Fs8 Fs9 Fs10 Fs11 Fs12 Fs13 Fs14 Fs15 fc1 fc2 fc3 fc4 fc5 fc6 fc7 fc8fc9 fc10 fc11fc12 fc13 fc14 fc15 fc15a 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 Fator 1 -0,2 -0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 F a to r 3 A/ B/
Figura 2. A) Fatores 3 e 4 da matriz dos escores da ACP (varimax) no confrontamento de machos
cultivados em clareiras (mc) versus sombreados (Ms); B/ Fatores 1 e 3 da matriz dos escores da ACP (varimax) no confrontamento de fêmeas cultivadas em clareiras (fc) versus sombreadas (Fs).
O sensorial de folhas provenientes de ambiente mais aberto mostrou-se mais suave do que de floresta (Rakocevic et al., 2008). Folhas de áreas ensolaradas contêm mais compostos fenólicos (Rakocevic et al., 2006b) e teobromina (Esmelindro et al., 2004; Rakocevic et al., 2006b) do que de floresta. Na análise de Esmelindro et al. (2004) em folhas das áreas abertas formou-se até três vezes mais cafeína do que em sombreadas, enquanto os resultados de Rakocevic et al. (2006) mostram que não houve as diferenças significativas no conteúdo de cafeína entre as folhas de floresta e das de áreas abertas. Por causa desta ambigüidade, espera-se que o novo método aplicado neste estudo, trará os resultados mais claros na separação dos grupos metabólicos para fatores estudados.
Na continuação de análise os extratos foram confirmados por análise em infravermelho em sextuplicatas pelas componentes principais (ACP) dos fatores 2 e 5. Esta análise mostrou possibilidade de separar os grupos metabólicos dois sexos, além da separação ambiental (Figura 3). Percebe-se que se separam os machos das fêmeas em dois ambientes luminosos. O efeito de dimorfismo sexual foi mais intensivo na separação de grupos metabólicos por FTIR quando analisadas as folhas provenientes de ambientes sombreados do que das clareiras.
Figura 3. Scores de matriz de fatores 2 e 5 no confrontamento entre machos cultivados em clareiras
(mc), machos sombreados (Ms), fêmeas cultivadas em clareiras (fc) e fêmeas sombreadas (Fs) para os extratos dos solventes de mistura quaternária (mistura 15).
Conclusões
1/ Escolheu-se o meio extrator (mistura quaternária de etanol, acetato de etila, diclorometano e hexano) para a busca da impressão digital espectroscópica para a diferenciação de folhas da erva-mate, com a aplicação dos métodos quimiométricos aos espectros de infravermelho com transformada de Fourier.
2/ Os extratos de folhas de erva-mate apresentam diferenças na composição química relacionada de ambiente luminoso e dimorfismo sexual, porém a composição será analisada em próximos passos.
3/ Os grupos de metabólicos que discriminam as plantas masculinas cultivadas em dois ambientes luminosos são diferentes daqueles das plantas femininas. Isso se poderia relacionar com maior sensibilidade de plantas masculinas nas mudanças de ambiente e sua maior plasticidade morfogenética.
Agradecimentos
À indústria ’Baldo’, filial São Mateus do Sul, e ao engenheiro agrônomo Danilo Martim Domingos pelas amostras coletadas. À CNPq, CAPES e IICA que financiaram as bolsas de Pesquisador Visitante para Dra M. Rakocevic, bolsa de produtividade para Dra. Ieda S. Scarminio e as de pós-graduação de F. Delaroza.
Referencias bibliográficas
Carpanezzi, A.A. 1995. Cultura da erva-mate no Brasil: Conflitos e lacunas. In: Winge, H.; Ferreira, A.G.; Mariath, J.E.A. e Tarasconi, L. C. (Eds.). Erva-mate: biologia e cultura no Cone Sul. Porto Alegre: Ed. da UFRGS: 43-46.
Ellis, D.I. e Dunn, W.B. 2005. Metabolic: current analytical platforms and methodologies. Trends in Analitical Chemistry, 24 (5): 285-291.
Esmelindro, A.A.; Girardi, J.D.S.; Mossi, A., Jacques, R.A. e Dariva C. 2004. Influence of agronomic variables on the composition of Mate tea leaves (Ilex paraguariensis) extracts obtained from CO2
extraction at 30 degrees C and 175 bar. Journal of Agricultural and Food Chemistry 52:1990–1995. Heck, C.I. e Mejia E.G. de. 2007. Yerba Mate Tea (Ilex paraguariensis): A Comprehensive Review on
Chemistry, Health Implications, and Technological Considerations. Journal of Food Science 72(9): R138-R151.
Joreskog, K.G.; Klovan, J.E. e Reyment, R.A. 1976. Geological factor Analysis. Geochimica et Cosmochimica Acta 43(3): 450.
Liang, Y.Z.; Xie, P. e Chan, K. 2004. Quality control of herbal medicines, Journal of chromatography B, 812 (1-2): 53-70.
Neto, B.B.; Scarminio, I.S. e Bruns, R.E. 2001. Como fazer experimentos: pesquisa e desenvolvimento na ciência e na indústria. Ed. 2, Campinas: Editora da UNICAMP: 313-319.
Neto, J.M.M. e Moita, G.C. 1998. Uma introdução a analise exploratória de dados multivariados. Quimica nova, 21(4): 467-469.
Rakocevic, M.; Medrado, M.J.S.; Lavoranti, O.J. e Valduga, A.T. 2007. Quality of yerba-mate leaves originating from male and female plants. Pesquisa Florestal Brasileira 54:71-83
Rakocevic, M.; Medrado, M.J.S.; Lucambio, F. e Valduga, A.T. 2008. Intensity of bitterness of processed yerba-mate leaves originated in two contrasted light environments. Brazilian Archive of Biology and Technology 51: 569-579.
Rakocevic, M. e Martim S.F. 2010. Time series in analysis of yerba-mate biennial growth modified by environment. International Journal of Biometeorology,published online 03 June 2010.
Rakocevic, M.; Medrado, M.J.S.; Lucambio, F. e Valduga, A.T. 2006a. Caracterização de crescimento do caule da erva-mate (Ilex paraguariensis St. Hil.) cultivada em dois ambientes luminosos contrastantes. In: Anais de 4° Congresso Sul-Americano da erva-mate, Pousadas, Ed. da INYM: 244-249.
Rakocevic, M.; Medrado, M.J.S.; Lucambio, F. e Valduga, A.T. 2006b. Influência do sexo, da sombra e da idade de folhas no sabor do chimarrão. In: Anais de 4° Congresso Sul-Americano da erva-mate, Pousadas, Ed. da INYM: 31-37.
Yan, S.K.; Xin, W.F.; Lou, G.A.; Wang, Y.M. e Cheng,Y.Y. 2005. An Approach to 2D fingerprint for the quality control of Qingkailing injection by high-performance liquid chromatography with diode array detection. Journal of Chromatography A, 1990: 90-97.
Zhang, J.L.; Cui, M.; He, Y.; Yu, H.L. e Guo, D. 2005. Chemical fingerprint and metabolic fingerprint analysis of Danshen injection by HPLC-UV and HPLC-MS methods. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 36(5): 1029-1035.
