Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências da Universidade do Porto para cumprimento dos requisitos necessários à obtenção do grau de Mestre em Genética Forense, realizada sob a orientação da Professora Doutora Laura Cainé (INMLCF, I.P. e FMUP); da Doutora Nádia Pinto (IPATIMUP, i3S e CMUP)
Trabalho realizado no laboratório do Serviço de Genética e Biologia Forenses (SGBF) da Delegação Norte do Instituto Nacional de Medicina Legal e Ciências Forenses, I.P. (INMLCF).
À Professora Doutora Laura Cainé quero agradecer, primeiramente, pela oportunidade dada. Foi muito gratificante ter sido orientada por uma pessoa tão competente e inspiradora. Obrigada pela liberdade, pela ajuda e pela compreensão.
Ao Professor Doutor Agostinho Santos, pela sua disponibilidade, amabilidade e compreensão. Sou grata por ter tido a oportunidade de ter recebido orientações de quem tanto admiro enquanto profissional.
À Mestre Benedita Silva, por todo o apoio dado ao longo desta jornada. Sempre preocupada, atenta e solicita, agradeço ainda todo o carinho e os conselhos que me transmitiu e que irei levar comigo.
À Mestre Gabriela Lima, pelo cuidado e auxílio na manutenção dos equipamentos, sempre que necessário. A sua simpatia e disponibilidade, nunca serão esquecidas.
À Mestre Ana Abreu, pela ajuda e disponibilidade demonstrada.
À Doutora Nádia Pinto pelos conselhos na hora certa e pela disponibilidade.
Aos meus queridos pais, porque sem dúvida sem eles teria sido impossível alcançar este patamar, agradeço toda a confiança e motivação que me transmitiram.
Ao David, o meu maior ouvinte e confidente, que aguentou todas as fases ao longo de todo o projeto, que nunca me deixou baixar os braços e sempre me lembrou que eu seria capaz.
A todo o Serviço de Genética e Biologia forenses da Delegação Norte do INMLCF, I.P., pela simpatia com que me acolheram.
Ao INMLCF I.P., por ter autorizado a realização desta dissertação e por me facultar todos os meios necessários.
Cerca de um terço das Mortes Súbitas (MS) sujeitas a autopsia médico-legal permanecem sem explicação (Christiansen et al., 2016). A MS pode ser dividida em Morte Súbita de causa Cardíaca (MSC) ou Morte Súbita de causas não-cardíacas (van der Werf et al., 2012). Sendo que, cerca de 85% de todas as MS são de origem cardíaca (Nichol et al., 2008).
A maioria dos casos de MSC em indivíduos (˃40 anos) são resultado de doença coronária ou ataque isquémico. Por outro lado, a MSC na população jovem adulta (<35 anos) é causada por arritmias e síndromes com ou sem alterações estruturais no músculo cardíaco. Estas patologias resultam de alterações genéticas (Boczek, Tester, & Ackerman, 2012).
Uma síndrome arritmogénica é a Síndrome de Brugada (SBr), trata-se de uma canalopatia cardíaca hereditária responsável por 4% a 20% das MSC. O gene SCN5A é principal gene associado à SBr, responsável pelo fluxo de sódio cardíaco no canal NAv1.5. Este gene contém 28 exões, dos quais foram escolhidos o 4 e 12, com o objetivo de apurar a presença de mutações preditivas para SBr em 50 indivíduos de ambos os sexos, aparentemente saudáveis.
No protocolo utilizado para análise, foram encontradas variações genéticas para o exão 12 do gene SCN5A, correspondendo ao polimorfismo H558R, um dos mais comuns para a SBr.
A identificação de uma patologia genética hereditária responsável por síndromes arritmogénicas podem ajudar os membros da família a adotar medidas preventivas. Uma vez, que muitos desses familiares permanecem assintomáticos, mas o risco de MS continua presente (Campuzano et al., 2014).
Palavras-chave: Morte Súbita Cardíaca; síndromes arritmogénicas; canalopatias
One third of the Sudden Deaths (SD) remains whithout no explanation after an autopsy (Christiansen et al., 2016). SD can be described as a natural and unexpected death in healthy patients, and may occur in the first hour after the symptoms to be started (Pachón & Almendral, 2011).
The majority of the cases of Sudden Cardiac Death (SCD) in patients over 40 years old are the result of coronary disease or ischemic attack. On the other hand, in the young population (<35 anos) it’s caused by arrithmias and syndromes with or without heart structural modifications. These diseases can be inherited by genetics alterations (Boczek et al., 2012)..
Brugada Syndrome (SBr) is na arrythmogenic syndrome, an inherited cardiac channelopathy responsible for 4% to 20% of SD. The main gene related to SBr, is SCN5A responsable for cardiac sodium current in the NAv1.5 channel. This gene have 28 exões and two were selected to the aim of detecting the presence of SBr mutation in 50 healthy individuals of both sexes.
In the analysis of SNC5A gene for exons 4 and 12, only were found genetics variations for the last one. The variations found were H558R polymorphism, one of the most common for SBr.
The identification of an inheritable defect responsible for arrhythmogenic syndromes could help to take preventive measures in asymptomatic family members. Once, many of these relatives are asymptomatic, but the risk of SD remains (Campuzano et al., 2014).
Keywords: Sudden Cardiac Death; Arritmogenic Syndromes; Cardiac Channelophaties;
µM Micramolar
AAD Antiarrhythmic Drugs
BFRD Bloqueio do Fascículo do Ramo Direito Ca2+ Cálcio
CPVT/ TVPC Taquicardia Ventricular Polimórfica Catecolaminérgica DNA Deoxyribonucleic acid
DDT Dithiothreitol
ddNTPs Didesoxinucleotidos dNTPs Desoxinucleotídos
DPCC Doença Progressiva da Condução Cardíaca ECG Eletrocardiograma
EUA Estados Unidos da América FA Fibrilhação Auricular
FMUP Faculdade de Medicina da Universidade do Porto FV Fibrilhação Ventricular
INMLCF Instituto de Medicina Legal e Ciências Forenses, IP. Ito Intensidade da Corrente Transitória
K+ Potássio
LQTS/ SQTL Síndrome de QT Longo MS Morte Súbita
MSC Morte Súbita Cardíaca Na+ Sódio
Nav1.5 Canal de sódio Cardíaco
°C Graus Celsius
OMS Organização Mundial de Saúde PA Potencial de Ação
Rpm
Rotações por minuto SBr Síndrome de Brugada SQTS/ SQTC Síndrome de QT CurtoSRP Síndrome de Repolarização Precoce Tm Temperatura de Melting
1.INTRODUÇÃO
1.1. Morte Súbita e Morte Súbita Cardíaca ……… 16
1.2. Incidência da Morte Súbita Cardíaca……….... 17
1.3. Canalopatias Cardíacas ………. 18
1.4. Síndrome de Brugada……….. 20
1.5. Gene SCN5A………. 25
2.OBJECTIVOS……… 27
3. MATERIAIS E MÉTODOS 3.1. Colheita de Amostras Biológicas……….... 29
3.2. Desenho dos Primers………... 29
3.3. Extração de DNA……….. 32
3.4. Amplificação do DNA………... 34
3.5. Purificação do produto amplificado……….. 36
3.6. Sequenciação do DNA……… 37
3.7. Purificação do produto sequenciado………. 38
3.9. Análise dos resultados ……… 40 4.RESULTADOS………. 42 5.DISCUSSÃO………. 46 6.CONCLUSÕES……… 50 7.REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ………... 52 8.ANEXOS……… 57
Figura 1. ECG com padrão típico de SBr, retirado de Wilde et al., 2002……… 22
Figura 2. A (Padrão eletrocardiográfico em forma arqueada/côncava) caracterizado
por uma elevação rápida do segmento ST seguida de uma onda T negativa;
B (Padrão eletrocardiográfico em forma e alforge/ sela) caracterizado por uma grande
elevação inicial e a presença de uma onda T positiva. O traçado eletrocardiográfico permite delimitar um triangulo com altura de 5 mm no qual se identifica o angulo β com uma amplitude superior a 58°(menor amplitude nos atletas) (Bayés de Luna et
al. 2012)………. 22
Figura 3. Diagrama de sobreposição entre os genes com Síndrome de Brugada
(BrS), Síndrome de QT curto (SQTS). Síndrome do QT longo (LQTS) e taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica (CPVT) (Fernández-Falgueras et al.,
2017)……….. 23
Figura 4: Primers foward e reverse (representado a amarelo) selecionados para os
fragmentos correspondentes aos exões 4 e 12 (representado a vermelho) do gene
SCN5A……… 30
Figura 5: Demonstração esquemática da programação no termociclador com tempo,
temperatura e número de ciclos de cada uma das fases da PCR………. 36
Figura 6: Demonstração esquemática da programação no termociclador com tempo,
temperatura e número de ciclos para a sequenciação do DNA das amostras………… 38
Figura 7: Eletroferograma correspondente a um fragmento de DNA extraído da
zaragatoa bucal da amostra B4, sequenciado com o primer foward do exão 4 do gene SCN5A, visualizado no software Sequencing Analysis® v.5.4 (Applied
gene SCN5A, visualizado no software Sequencing Analysis® v.5.4 (Applied Biosystems®)……….. 42
Figura 9: Exemplo de um eletroferograma correspondente a amostra B4,
sequenciado com o primer foward e reverse do exão 12 do gene SCN5A, visualizado no software Sequencing Analysis ® v.5.4 (Applied Biosystems®) assinalado com
presença de uma variação genética correspondente ao polimorfismo H558R………… 43
Figura 10: Exemplo de um eletroferograma correspondente a amostra B5,
sequenciado com o primer foward e reverse do exão 12 do gene SCN5A, visualizado no software Sequencing Analysis® v.5.4 (Applied Biosystems®) assinalado com
presença de uma variação genética correspondente ao polimorfismo H558R………… 44
Figura 11- Frequência do polimorfismo H558R em pacientes com SBr e para
Tabela 1. Tamanho (em par de bases) dos 28 exões nos quais podem ser detetadas
18% a 30% das mutações do gene SCN5A……… 30
Tabela 2 : Características dos pares de primers selecionados para as sequencias de
exões 4 e 12 do gene SCN5A com 250 nucleótidos nas zonas flanqueantes 5’ e
3’……….. 32
Tabela 3: Condições da reação de amplificação dos exões 4 e 12 do gene SCN5A
com utilização dos primers foward e reverse a uma concentração de 0.5 µM em cada
reação……… 34
Tabela 4: Configuração da reação usando o HotStarTaq Plus Master Mix
(Qiagen)……… 35
Tabela 5: Condições da reação de sequenciação dos exões 4 e 12 para o gene
SCN5A com utilização do BigDye™ Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit num
16
1.1 Morte Súbita e Morte Súbita Cardíaca
Cerca de um terço das Mortes Súbitas (MS) sujeitas a autópsia médico-legal permanecem sem explicação (Christiansen et al., 2016). A (MS) pode ser definida como uma morte natural e inesperada em indivíduos aparentemente saudáveis, que ocorre durante a primeira hora após o início dos sintomas (Pachón & Almendral, 2011).
Se a morte permanece sem explicação após autópsia médico-legal onde se incluem os resultados dos exames complementares, como histologia e toxicologia, a morte é considerada como morte súbita sem causa determinada (Christiansen et al., 2016).
A MS pode ser dividida em Morte Súbita de causa Cardíaca (MSC) ou Morte Súbita de causas não-cardíacas, tais como causas metabólicas, neurológicas ou infeciosas (van der Werf et al., 2012). Sendo que, cerca de 85% de todas as MS são de origem cardíaca (Nichol et al., 2008).
A maior parte dos casos de MSC em indivíduos acima dos 40 anos são resultado de doença coronária ou ataque isquémico. Por outro lado, a MSC na população jovem adulta (<35 anos) é causada por arritmias e síndromes com ou sem alterações estruturais no músculo cardíaco. Estas patologias resultam de alterações genéticas, que podem ser hereditárias (Boczek et al., 2012).
De um modo geral, a MSC é causada por doenças cardíacas hereditárias, especialmente canalopatias cardíacas, como a Síndrome de QT longo (SQTL), Síndrome de Brugada (SBr), Taquicardia Ventricular Polimórfica Catecolaminérgica (TVPC), Síndrome de QT curto (SQTC), Doença Progressiva da Condução Cardíaca (DPCC) ou Síndrome da Repolarização Precoce (SRP), ou seja, patologias cardíacas sem anomalias morfológicas (Christiansen et al., 2016).
Estas cardiopatias hereditárias resultam também de alterações genéticas que se podem identificar como cardiomiopatias, tais como a cardiomiopatia hipertrófica, cardiomiopatia dilatada e cardiomiopatia arritmogénica, patologias que são caracterizadas pela presença de alterações estruturais do coração, e estão altamente relacionadas com a MSC. Estas arritmias são o resultado de alterações genéticas existentes em proteínas do sarcómero, desmossomas e citoesqueleto (Fernandez-Falgueras, Sarquella-Brugada, Brugada, Brugada, & Campuzano, 2017).
17
1.2 Incidência da Morte Súbita Cardíaca
A MS é uma das principais causas de morte, com uma de incidência de 50 a 100 indivíduos por cada 100,000 habitantes, afetando todas as faixas etárias (Fishman et al., 2010). Em cerca de 80% das vítimas de MS, existe a suspeita de uma patologia cardíaca previamente herdada (Proost et al., 2017).
A MSC é uma das maiores causas de morte nos países desenvolvidos. Ao longo dos anos, vários desenvolvimentos tecnológicos surgiram de forma a melhorar o diagnóstico e prevenção da MSC. Na maioria dos casos a primeira manifestação da patologia cardíaca é a morte em si (Fernandez-Falgueras et al., 2017).
Nos casos de MS sem causa aparente, isto é, quando a autópsia não revela uma causa de morte e uma vez que este tipo de distúrbio não causa qualquer tipo de alteração estrutural no coração, pode ser diagnosticado em 22% a 53% dos casos uma patologia cardíaca hereditária através de uma triagem cardiogenética dos familiares da vítima (Behr et al., 2008).
A prevalência exata ainda é desconhecida porque não existe uma base de dados nacional que permita rastrear o número de mortes (Germann & Perron, 2005).
Por ano, nos EUA, ocorrem cerca de 300000 casos de MS, com uma incidência anual de cerca de 0,1 a 0,2% na população adulta. Também na Europa, tal como nos EUA, a incidência anual de MSC varia entre 50 e 100 casos por cada 100000 pessoas (Fernandez-Falgueras et al., 2017)
Em Portugal, presume-se que ocorra 1 morte por cada 1000 habitantes/ano, segundo dados da Fundação Portuguesa de Cardiologia. A falta de registo destas mortes conduz a uma ausência de dados fidedignos e leva à subvalorização dos existentes. Apesar da sua baixa incidência, a MSC representa cerca de 30% de todas as mortes não- traumáticas, com cerca de um terço das vítimas abaixo dos 65 anos de idade (Germann & Perron, 2005; Lown, 1979).
A maioria (cerca de 80%) dos casos de MSC em jovens desportistas acontece durante ou após a prática de um exercício intenso (Maron et al., 1996). Isto sugere que a atividade física pode ser o fator desencadeante para o aparecimento de arritmias cardíacas. Estudos recentes concluíram que cerca de 30% das autopsias, em indivíduos jovens (<15 anos), vítimas de MSC pode ser explicada por variações polimórficas nos genes relacionados com canalopatias (Campuzano et al., 2014).
18
1.3 Canalopatias Cardíacas
O coração funciona como uma bomba eletromecânica acionada eletricamente pela formação e propagação de um potencial de ação (PA) através dos miócitos, seguido por um período de contração e relaxamento muscular até ao próximo impulso (Nerbonne & Kass, 2005; Roden, Balser, George, & Anderson, 2002). O PA a nível do miocárdio é gerado por alterações iónicas da membrana dos cardiomiócitos. A ativação e inativação sequencial dos canais iónicos conduzem a despolarização das correntes internas, Sódio (Na+) e Cálcio (Ca2+), e a repolarização das correntes externas, potássio (K+), possibilitando a ação das correntes iónicas transmembranares e subsequentemente a formação de um PA (Amin, Asghari-Roodsari, & Tan, 2010; Nerbonne & Kass, 2005)
Mudanças na sincronização e/ou propagação do impulso elétrico no PA, predispõe ao aparecimento de arritmias potencialmente malignas (Nerbonne & Kass, 2005; Roden et al., 2002).
A perturbação no fluxo de iões altera a atividade elétrica no coração é o substrato para o desencadeamento de arritmias ventriculares que podem causar síncope e aumento do risco de MSC (Stattin et al., 2016). Estas modificações podem ser introduzidas por variações genéticas em genes que codificam canais iónicos associados a proteínas, que dão origem ao aparecimento de canalopatias.
As canalopatias podem ser de carácter hereditário causadas principalmente por mutações em genes que codificam os canais iónicos transmembranares de Na+, K+ ou de Ca2+ e/ou os seus recetores, ou podem ser adquiridas como resultado da exposição a fármacos, imunoglobulinas ou toxinas que modificam a função do canal iónico (Abriel & Zaklyazminskaya, 2013).
A maioria das mutações que conduzem a disfunções dos canais iónicos (Goldenberg, Zareba, & Moss, 2008) que participam no PA celular, alteram a atividade elétrica no coração, o que aumenta a suscetibilidade dos indivíduos para arritmias cardíacas fatais, sem alterações morfológicas do tecido cardíaco.
As canalopatias cardíacas são um grupo patológico clínica e geneticamente heterogéneo (Abriel & Zaklyazminskaya, 2013). As suas traduções eletrocardiográficas são por regra bastante diferentes e específicas, mas algumas das suas expressões clínicas básicas são muitas vezes semelhantes, como é o caso das síncopes espontâneas ou provocadas por fármacos que provocam disritmias ventriculares que podem ser fatais.
19 Estas podem ser frequentemente diagnosticadas erradamente como “convulsões” ou “epilepsia”. Episódios como este são comuns, sendo frequente a prescrição de antiepiléticos antes da obtenção de um diagnóstico correto(Abriel & Zaklyazminskaya, 2013; Guggino & Stanton, 2006).
As alterações genéticas associadas às canalopatias cardíacas são complexas. Desta forma, a maioria das síndromes associadas a arritmias podem ser causadas por mutações em diferentes genes, ou por várias mutações num único gene (Abriel & Zaklyazminskaya, 2013). Ambas as situações podem originar fenótipos distintos. Os principais fenótipos observados são: a Síndrome de QT Longo (SQTL), a Síndrome de QT Curto (SQTC), a Síndrome de Brugada (SBr) e a Taquicardia Ventricular Polimórfica Catecolaminérgica (TVPC) (Abriel & Zaklyazminskaya, 2013). Estudos realizados demonstraram que estas síndromes podem ser detetadas através do estudo de mutações nos genes KCNQ1 (SQTL do tipo 1), KCNH2 (SQTL do tipo 2 e SQTC), SCN5A (SBr do tipo 1 e SQTL do tipo 3) e RyR2 (TVPC do tipo 1), os quais, são frequentemente associados a estas patologias.
20
1.4
Síndrome de Brugada
Em 1992, o termo SBr foi usado pela primeira vez para descrever um pseudobloqueio completo do ramo direito, acompanhado de uma elevação em rampa descendente do segmento ST do lado direito precordial nas derivações de V1 a V3 (Alings & Wilde, 1999; J. Brugada & Brugada, 1996; P. Brugada & Brugada, 1992). Alguns anos depois, SBr foi descrita como uma “síndrome noturna inexplicável de morte
súbita” que conduz a um aumento do risco de fibrilhação ventricular (Berne & Brugada,
2012) (P. Brugada & Brugada, 1992).
A SBr carateriza-se como sendo uma canalopatia autossómica dominante podendo ser familiar ou esporádica (Chen et al., 1998). Os doentes com SBr geralmente permanecem assintomáticos (Benito, Brugada, Brugada, & Brugada, 2008). A primeira manifestação da patologia pode ocorrer durante o sono devido ao elevado tónus vagal. Até 20% dos doentes afetados com a patologia podem apresentar arritmias supraventriculares (Eckart et al., 2011) e, por isso, manifestarem uma sintomatologia de palpitações e/ou tonturas.
Esta síndrome manifesta-se a partir da puberdade e são raras as suas manifestações na infância. Neste contexto, os casos detetados poderão ser precipitados por episódios febris. Assim, a existência na história familiar de casos de MS representa o principal motivo para a realização de um eletrocardiograma (ECG) numa criança com apresentação de episódio febril. No entanto, este procedimento afasta os casos esporádicos e assintomáticos da patologia (Daimi et al., 2015).
Esta patologia manifesta-se geralmente durante a idade adulta, em indivíduos do sexo masculino, situando-se a média de idade para MS nos 41 anos (± 15 anos), no entanto as idades em que a patologia se pode manifestar são muito variadas, um estudo apontou que o paciente mais jovem descrito e diagnosticado clinicamente com a SBr tinha 2 dias e o mais velho de 84 anos (Antzelevich, Brugada, & Borggrefe, 2005).
Desconhecem-se ainda as razões exatas para a maior predominância masculina numa patologia com transmissão autossómica dominante, como a SBr. No entanto, o fenótipo clínico observado é 8 a 10 vezes mais frequente nos homens que nas mulheres, o que pode ser justificado pela maior intensidade da corrente transitória (Ito,) no epicárdio ventricular direito do sexo masculino. Este fenómeno parece resultar da inativação mais rápida dos canais Ito nas mulheres (Di Diego et al., 2002). Além disso, modelos animais sugerem que o impacto da testosterona nas correntes iónicas, em particular nas correntes externas de potássio, pode contribuir para uma maior incidência das manifestações clínicas da SBr em indivíduos do sexo masculino(Bai, Kurokawa,
21 Tamagawa, Nakaya, & Furukawa, 2005; Di Diego et al., 2002). Estima-se que a síndrome seja responsável, pelo menos, por 4% dos casos de MS a 20% das mortes em pacientes com corações estruturalmente normais (Antzelevich et al., 2005). Em cerca de um terço dos casos, a pessoa descobre ser portador da patologia durante a triagem genética familiar. Apesar da SBr ter apresentação hereditária autossómica dominante, muito pacientes não apresentam histórico de SBr ou MSC na família (Kyndt et al., 2001).
A SBr é uma desordem genética cardíaca onde as mutações no gene SCN5A são responsáveis por 18 a 30% dos casos (Daimi et al., 2015).
O diagnóstico da SBr deverá ser baseado em manifestações clínicas e electrocardiográficas, nas alterações genéticas e nas manifestações dinâmicas observadas no ECG. Foram reportados em pacientes de alto risco, marcadores de polarização e repolarização no ECG; no entanto, os resultados revelaram-se inconclusivos. Alguns estudos sugerem que a base desta patofisiologia seja designada como “conduction delay in the right ventricular outflow tract” (Calo et al., 2016).
Atualmente, o diagnóstico clínico requer a observação de uma elevação no segmento ST em, pelo menos, uma das derivações precordiais direitas na linha basal ou após uso de fármacos de classe I (antiarrítmicos- AAD) bloqueadores dos canais de sódio, tais como: a flecainida, ajmalina e procainamida (Berne & Brugada, 2012).
Numa primeira abordagem de diagnóstico foram atribuídos à SBr três tipos de padrões tipicos no ECG e que podem ser descritos como tipo I, II ou III (Fernandez-Falgueras et al., 2017). O tipo I é caracterizado pela elevação do segmento ST seguida de uma onda T negativa em “coved morphology” (padrão em forma arqueada/côncavo) (Wilde et al., 2002). O ECG do tipo II e tipo III apresenta um padrão “saddleback shape” (padrão em forma de alforge/ sela) com um grande aumento inicial seguido de uma elevação maior que 2mm para o tipo II e menor que 2mm para o tipo III (Fernandez-Falgueras et al., 2017) como pode ser visualizado nas figuras 1 e 2.
22 Figura 1. ECG com padrão típico de SBr, retirado de Wilde et al., 2002.
A
B
Figura 2. A Padrão eletrocardiográfico em forma arqueada/côncava caracterizado por uma elevação rápida do segmento ST seguida de uma onda T negativa;
B Padrão eletrocardiográfico em forma e alforge/ sela caracterizado por uma grande elevação inicial e a presença de uma onda T positiva. O traçado eletrocardiográfico permite delimitar um triângulo com altura de 5 mm no qual se identifica o angulo β com uma amplitude superior a 58° (menor amplitude nos atletas) (Bayés de Luna et al. 2012).
A alteração da colocação das derivações pré-cordiais direitas para o segundo e terceiro espaço intercostal podem aumentar a sensibilidade de deteção das alterações eletrocardiográficas para a SBr (Sangwatanaroj et al., 2001).
Num consensosobre a SBr propõe-se o diagnóstico apenas com o tipo I (Antzelevich et al., 2005) e em 2013 foi proposto que o tipo I espontâneo e o tipo I provocado (com
23 padrão basal do tipo II e III) em pelo menos um ramo direito precordial (V1 e V2) deve ser considerado suficiente para um diagnóstico definitivo da SBr (Priori et al., 2013). A onda S alargada nas derivações laterais esquerdas, que é característica do bloqueio completo do ramo direito, está ausente, na maioria dos doentes com SBr. Esta observação sugere a existência de uma elevação do segmento ST no lado pré-cordial direito, ou seja, o aparecimento de uma onda “J” mais do que um verdadeiro bloqueio completo.
O diagnóstico genético da SBr, é uma questão antiga que tem preocupado a comunidade científica desde há muitos anos.
A primeira alteração genética associada à síndrome foi identificada no gene SCN5A que codifica a subunidade do canal cardíaco de sódio Nav 1.5 (Chen et al., 1998). Desde então mais de 450 variantes patogénicas foram identificadas em 24 genes que codificam canais de sódio, potássio e cálcio ou proteínas associadas (ABCC9, CACNA1C, CACNA2D1, CACNB2, FGF12, GPD1L, HCN4, HEY2, KCND2, KCND3, KCNE3, KCNE5, KCNH2, KCNJ8, PKP2, RANGRF, SCN10A, SCN1B, SCN2B, SCN3B, SCN5A, SEMA3A, SLMAP e TRPM4) (figura 1).
Figura 3. Diagrama de sobreposição entre os genes com Síndrome de Brugada (BrS), Síndrome de QT curto (SQTS). Síndrome do QT longo (LQTS) e taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica (CPVT) adaptado de (Fernández-Falgueras et al., 2017).
Aproximadamente 20-25% dos pacientes apresentam variações genéticas no gene SCN5A. No entanto, sabe-se que os genes responsáveis pela suscetibilidade da SBr apenas explicam 30-35% dos casos clinicamente diagnosticados, indicando que 65 a 70% dos doentes permanece ainda por desvendar a origem da patologia (Campuzano et al., 2014).
24 Além do SCN5A foram identificadas outras variantes com relevância patogénica, destacadas no diagrama da figura 3, tais como: SCN1B(Watanabe et al., 2008), SCN2B (Riuro et al., 2013) e SCN3B (Hu et al., 2009) que codificam as subunidades β do canal de sódio Nav 1.5 e por fim o gene SCN10A que codifica o canal neuronal de sódio, vários estudos apontam mutações no gene SCN10A em 2,5% a 16% dos pacientes com SBr (Behr et al., 2015; Fukuyama, Ohno, Makiyama, & Horie, 2016; Hu et al., 2014; Le Scouarnec et al., 2015).
Os genes que codificam as subunidades dos canais de cálcio (CACNA1C, CANB2b e CACNA2D1) também foram reportados como suscetíveis a desencadear a SBr. Variantes patogénicas no CACNA1C e CACNB2, que codificam as α-1c e β-2b subunidades do canal do tipo L cardíaco Ca2+, respetivamente, causam um declínio nos canais ICa e perto de 11,5% dos casos de SBr sofre uma sobreposição com outra síndrome, com um intervalo padrão típico de QT curto, no ECG (Antzelevitch et al., 2007; Cordeiro et al., 2009). O gene CACNA2D1, apesar da baixa prevalência está associado à SBr, e é responsável por codificar a subunidade α-2/δ do canal tipo L cardíaco Ca2+, e também por regular a densidade circulante bem como a ativação/inativação cinética do canal Ca2+ (Burashnikov et al., 2010).
Foram também reportados em alguns casos de SBr, variações genéticas classificadas como “putative gain-of-function mutations” (este tipo de mutações originam um novo alelo associado a uma nova função. Qualquer heterozigótico que contenha este novo alelo, juntamente com o alelo original expressará a função do novo alelo, comportando-se como uma variação genética dominante), nos genes KCNE3, KCNE5, KCNH2 que responsáveis por codificar os canais condutores da corrente externa de potássio. Variações genéticas gain-of-function no gene KCND3 foram também implícitas para a SBr (Giudicessi et al., 2011). Foram ainda encontradas variações genéticas
gain-of-function , para a SBr, no gene KCND2 que se encontra associado à síndrome na onda
J, (Perrin et al., 2014) bem como no gene KCNJ8 relacionado com a síndrome de repolarização precoce (Proost et al., 2017). Foram também descritas variações genéticas loss-of-function nos genes responsáveis pelos canais de cálcio e sódio, CACNA1C, CACNB2, CACNA2D1 e SCN5A (Proost et al., 2017) associadas com a síndrome de repolarização precoce. Uma vez que esta e a SBr exibem características clínicas semelhantes, são consideradas patologias pertencentes ao grupo fenotípico de síndromes da onda J (Antzelevitch et al., 2007; Proost et al., 2017).
Por fim, o gene GPD1L afeta o trânsito normal do canal de sódio cardíaco até à superfície da célula e o controlo da corrente de sódio cardíaco; todavia este fenómeno É importante salientar que, exceto para os genes SCN5A e GPD1L, a maioria dos genes associados com suscetibilidade para a SBr foram identificados apenas em
25 pacientes isolados, em pacientes sem grau de parentesco ou em pequenos grupos de famílias candidatas a testes para genes específicos. Assim sendo, torna-se premente o desenvolvimento da investigação dos genes envolvidos na patogénese da SBr, de forma a evitar falsos positivos (Wilde et al., 2010). Atualmente, a maioria dos laboratórios de Genética Forense realizam preferencialmente análise para o gene SCN5A
.
1.5
Gene SCN5A
O gene SCN5A é o primeiro associado à SBr, e é responsável por codificar a subunidade α do canal de sódio cardíaco (Nav1.5). Este gene localiza-se no cromossoma 3p21 e consiste em 101617 bases e 28 exões que codificam 2016 aminoácidos do Nav1.5 (Chen et al., 1998).
Foram identificadas mais de 80 mutações deste gene, que condicionam alterações de perda de função e resultam numa variedade de alterações na atividade dos canais de sódio, incluindo diminuição quantitativa de expressão, alterações na voltagem e ativação dependente do tempo, e recuperação acelerada ou prolongada da inativação (Antzelevich et al., 2005).
Existem, contudo, considerações importantes que devem ser tecidas relativamente à mutação no gene SCN5A, seja o facto de esta também estar associada a outras alterações eletrofisiológicas, tais como a síndrome do QT longo congénita do tipo 3, defeitos isolados da condução Auriculoventricular, síndrome da doença do nó sinusal congénito e cardiomiopatia dilatada familiar com defeitos de condução e suscetibilidade para fibrilhação auricular (FA). As manifestações clínicas divergentes são, provavelmente, consequência das diferenças nas alterações eletrofisiológicas induzidas pelas variações genéticas específicas (Clancy & Kass, 2002; Priori et al., 2000; Smits et al., 2005).
É recomendada a prescrição de testes genéticos, para suporte do diagnóstico clínico, deteção precoce de parentes com potencial de risco, e para apurar a relação genótipo-fenótipo (Antzelevich et al., 2005).
27 O objetivo principal deste estudo incidiu na investigação de possíveis variações genéticas nos exões 4 e 12 do gene SCN5A numa população de 50 indivíduos saudáveis, de ambos os géneros, entre os 18 e os 40 anos.
Assim sendo, o principal objetivo foo:
o Estudar os exões 4 e 12 do gene SCN5A como potencial marcador da presença da Síndrome de Brugada, através da análise das sequências obtidas, em
software adequado, por comparação com as sequências referência, a fim de se
29
3.1 Colheita de Amostras Biológicas
As amostras fornecidas, para este estudo, são compostas por uma amostra de 50 indivíduos composta por 7 indivíduos do sexo feminino e 43 indivíduos do sexo masculino, aparentemente saudáveis e com idades compreendidas entre os 18 e os 40. Estes voluntários são residentes no Norte de Portugal e praticantes regulares de atividades desportivas.
A colheita de amostras biológicas foi previamente realizada através de um método indolor e não invasivo, que consiste na utilização de uma zaragatoa WhatmanTM (Sigma-Aldrich) para recolher algumas células da mucosa bucal. Após a colheita, as amostras foram devidamente identificadas, secas à temperatura ambiente e, posteriormente, armazenadas num local limpo e seco.
Estas amostras foram estudadas anteriormente para os genes RyR2 e NOS1AP, que mostraram estar estreitamente relacionados com Taquicardia Ventricular Polimórfica Catecolaminérgica (Abreu, A. (2017) Taquicardia ventricular polimórfica
catecolaminérgica e expressão do gene RyR2) e Síndrome de QT Longo
respetivamente (Sousa, D. (2017) Genotipagem do gene NOS1AP e risco
cardiovascular. Estudo de uma população do Norte de Portugal).
Desta forma, o protocolo experimental utilizado, neste estudo seguirá diretrizes similares às descritas para os genes anteriores.
3.2 Desenho dos Primers
Antes do início da execução do protocolo experimental foi decidido que apenas se iriam estudar 2 dos 28 exões do gene SCN5A.
Como referido anteriormente, diversos estudos apontam para que cerca de 18 a 30% das variações genéticas no gene SCN5A possam ser detetadas através do rastreio de 28 exões. Foi dada especial atenção ao tamanho dos exões (Tabela 1), de modo a que estes não fossem demasiado pequenos, para facilitar o desenho dos primers, nem muito grandes, para permitir a posterior análise e interpretação dos resultados. Deste modo os exões escolhidos, para análise, foram os exões 4 e 12.
30 Tabela 1. Tamanho (em par de bases) dos 28 exões nos quais podem ser detetadas 18% a 30% das variações genéticas do gene SCN5A.
Após selecionados os exões, procedemos ao desenho dos respetivos primers
foward e reverse. O processo teve início com a pesquisa da sequência nucleotídica dos
exões 4 e 12 do gene SCN5A através do browser Ensembl genome (http://www.ensembl.org/index.htm). De seguida, foram exportadas as sequências dos exões garantindo que cada uma possuía 250 nucleótidos nas zonas flanqueantes 5´e 3´ (Figura 4), uma vez que será nessas zonas intrónicas que se deverá selecionar os
primers de forma a que mesmo com a perda das extremidades durante a sequenciação
(comum devido à falha de leitura de algumas bases), seja possível analisar o exão por completo.
• Exão 4
Exão Tamanho Exão Tamanho Exão Tamanho Exão Tamanho Exão Tamanho
1 142 7 231 13 133 19 121 25 138 2 325 8 64 14 239 20 155 26 105 3 119 9 142 15 174 21 174 27 271 4 90 10 198 16 351 22 123 28 3497 5 129 11 180 17 441 23 282 6 92 12 372 18 162 24 54 GTCTCTGGTGCCTATTAGGTGTCATGGAGCAGGCCAGGGGGCCAGCTGCAAGTGCCGGGGAAGGGA AAGAGACCAGCCTGGGTGGAGGGGGATTGGCATGGACTGGTCACAGCCCCAGTGTGTCTCCTTGGA GACCCTGTTTATTGTCTGGTAGCACTGGCCTGGCAGTGATGACCCCCAGGGGCAGGACCCCCCCAGC GGTGGTGGCGTGGCCGGCCCATGCTGCTCAGCTTTCCTTGACCCCACGCACGCTCTTCAACATGCTCAT CATGTGCACCATCCTCACCAACTGCGTGTTCATGGCCCAGCACGACCCTCCACCCTGGACCAAGTATGT CGAGTGAGTATCTTCAGGGCCTCTTCTCCACGTGGCCCCCTCCCTTCCTTTCCATTCCATGCCATGGCTC CTGAAGCTGCCCTGGAAGGGGGCTTGTGTCCAGGCCCAGGAACTTACCCATGGCGGTGGGGCAGCCC TTGGCTCAGCTTCTACCCTCTTTTGCCTTTCCCAGTCCTGCCAACTTCTGGCATTAATTTGAGTTGTGCCT TCTAGGGAGGAAGCTCTCCAGAGTGGCAAAGTAGAAAGTTTCTCC
31 • Exão 12
Figura 4: Primers foward e reverse (representado a amarelo) selecionados para os fragmentos correspondentes aos exões 4 e 12 (representado a vermelho) do gene SCN5A.
Para seleção dos primers foi utilizado o programa PerlPrimer. Essa seleção obedeceu a uma série de critérios, descritos na tabela 2.
Em primeiro lugar, e além da complementaridade com a sequência alvo, a sequência de bases dos primers foward e reverse não devem ter dímeros extensíveis (Ext dímer dG= 0), ou seja, não deve haver complementaridade entre os primers, uma vez que isso pode diminuir a capacidade de deteção da técnica de PCR (Polymerase
Chain Reaction) e aumentar os riscos de aparecimento de falsos negativos.
Em segundo lugar, a energia do Full dimer dG (Kcal/mol) deve ser a maior possível (>-3), pois se os primers apresentam valores muito baixos de dG, a quantidade de energia necessária para romper o dímero é maior, ou seja, seriam necessárias temperaturas mais altas, o que pode perturbar a reação PCR.
Por último, o par de primers deve possuir Temperaturas de Melting (Tm) semelhantes, ou seja, os respetivos pontos de fusão médios devem ser próximos de modo a facilitar o Annealing e possibilitar a continuidade dos ciclos.
A confirmação da especificidade dos primers foi realizada por meio de consulta na base de dados Primer-BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/). Este passo é importante porque os primers podem ser semelhantes a duas ou mais regiões do genoma, e, ao contrário do esperado, poderão ser amplificadas outras regiões para além das de interesse para o estudo. Além disso, colocaram-se as sequências dos
primers foward e reverse dos exões 4 e 12 do gene SCN5A na base de dados National
GTTAAGTTTCAGGCTCCCAGCTCCAGAGACATAGATTTGAGGGGAGTAGACATCCCAGAAGATACAGG ATTATCTCTAACCCCACATCCCCTCTTCCAAATACCCCCGGCCCAACCCACCTGGTTCCTGTGTGGCCAA AAAAGCCCTCAATGCTCTGAGAAGTTTAGCTGAGGCCAGTGGCACAAAAGACAGGCTGGGAGCACAT GAAGAGCACATGTCATGGTCGTGTCCCCTCTCCTCATGCCCTTAGAATCATCTCAGCCTCACCCGTGGC CTCAGCAGGACTTCTATGAAGCCACGTTCCAGCCGCGGGAGCATTTTCACCTTTCGCAGGCGAGACCT GGGTTCTGAAGCAGATTTTGCAGATGATGAAAACAGCACAGCGGGGGAGAGCGAGAGCCACCACACA TCACTGCTGGTGCCCTGGCCCCTGCGCCGGACCAGTGCCCAGGGACAGCCCAGTCCCGGAACCTCGGC TCCTGGCCACGCCCTCCATGGCAAAAAGAACAGCACTGTGGACTGCAATGGGGTGGTCTCATTACTGG GGGCAGGCGACCCAGAGGCCACATCCCCAGGAAGCCACCTCCTCCGCCCTGTGATGCTAGAGCACCCG CCAGACACGGTGAGCCAGCCCCGAGATGCAGGCACCACAGCAGGTCTGGTCTCCCAAACTGATCACCA GTGCCAAGTCCAAAAATACACGTCAAATATTTGTTGAGCACCTACTGTGTGCTGGGCTCTAGGTGCATA AACTTACAAAAAAAAAACTGGGCCCTCATAGAGCATCCATGCTAATGGGGACAGACAGACAAAACTCA AAAGAAAGCCAGGTGCGATGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCC
32
Institute of Standards and Technology (NIST)
(https://wwws.nist.gov/dnaAnalysis/primerToolsPage.do) de modo a verificar-se, através dos resultados do Auto Dimer, que os primers dos exões não formavam dímeros entre si. Posição Tamanho (pb) Extension Dimer dG Ful dímer dG Tm(°C)* EXÃO 4 Primer Foward CCCTGTTTATTGTCTGGTAGC 134 21 0 -1,26 58.84°C Primer Reverse CATGGAATGGAAAGGAAGGG 378 20 58,70°C EXÃO 12 Primer Foward CCAGAGACATAGATTTGAGGG 22 21 0 -0.93 57,72°C Primer Reverse GTAAGTTTATGCACCTAGAGCC 735 22 59,03°C *temperatura de melting
Tabela 2 : Características dos pares de primers selecionados para as sequencias de exões 4 e 12 do gene SCN5A com 250 nucleótidos nas zonas flanqueantes 5’ e 3’.
3.3 Extração de DNA
A extração de DNA a partir de zaragatoas bucais foi efetuada numa câmara com uma fonte de raios U.V. (Aura PCR, EuroClone®) com recurso ao Kit Prep-n-GoTM Buffer
(Applied Biosystems®).
Estas mesmas amostras, tal como mencionado anteriormente, já se encontravam extraídas e armazenadas a -20 ºC.
No entanto, para confirmação de resultados foi realizada uma nova extração com o Kit PrepFiler® Forensic DNA Extraction (Applied Biosystems®) conforme as instruções estabelecidas pelo fornecedor.
Este método de extração recorre ao uso de partículas magnéticas com multi- componentes químicos otimizados para fornecer um rendimento superior de DNA nas mais variadas amostras forenses, como as zaragatoas.
A partir das zaragatoas bucais recolhidas, foi colocada uma pequena porção num PrepFiler™ Spin Tube juntamente com um PrepFiler™ Filter Column.
33 Para cada tubo foi adicionado 500 µL de uma mistura, contendo 500µL de PrepFiler™ Lysis Buffer e 5 µL do reagente DTT, com uma concentração de 1.0 M. De seguida, os tubos foram colocados num termobloco de Hettich a uma temperatura de 70°C e a 750 rpm durante 40 minutos.
Após este processo, os tubos foram centrifugados a 10 000g durante 2 minutos na centrifuga (EppendorfTM).
A extração do DNA foi realizada no equipamento AutoMate Express™ Forensic DNA Extraction System (Applied Biosystems™). Este equipamento foi desenvolvido para aumentar a qualidade e quantidade de DNA extraído por amostra. De fácil utilização e bastante robusto, este robot trabalha com recurso a cartridges selados com os reagentes específicos para cada etapa do processo extrativo.
O equipamento foi previamente preparado com todos os componentes necessários ao processo de extração.
Após a centrifugação, foram descartados os PrepFiler™ Filter Column, os PrepFiler™ Spin Tube contendo o filtrado foram colocados no equipamento AutoMate Express™ Forensic DNA Extraction System (Applied Biosystems™) no local adequado.
Este equipamento está previamente configurado, com o programa específico para extração de DNA em amostras secas provenientes de zaragatoas, apenas foi necessário escolher o volume total para a amostra final de 100µL.
Por fim, as amostras foram seladas e armazenadas a -20 ºC, para uso posterior.
34
3.4 Amplificação do DNA
O processo de reação em cadeia das amostras para os exões 4 e 12 do gene SCN5A, foi efetuado utilizando o termociclador GeneAmp® PCR System 9700 (Applied
Biosystems ®), e com recurso ao Kit HotStarTaq® Plus Master Mix (Qiagen).
As condições da reação de amplificação utilizando a HotStarTaq® Plus Master
Mix (Qiagen) preconizadas no protocolo fornecido pelo fabricante estão descritas na
Tabela 4.
Componente Volume/reação Concentração final
HotStarTaq Plus Master Mix, 2x
10 µl 1 unidade de HotStarTaq Plus DNA Polymerase 1x PCR Buffer* 200 µM de cada dNTP Primers: Foward 1 µl 0.5 µM Reverse 1 µl 0.5 µM H2O RNase-free 7 µl - Amostra 1 µl
Volume total da reação 20 µl
Tabela 3: Condições da reação de amplificação dos exões 4 e 12 do gene SCN5A com utilização dos primers foward e reverse a uma concentração de 0.5 µM em cada reação.
As reações de amplificação foram realizadas em tubos de reação sem
tampa MicroAmp
®de 0,2mL (Applied Biosystems).
Em cada tubo de reação foi pipetado 19µL de mix, previamente elaborada
para cada par de primers, e contendo HotStarTaq Plus Master Mix 2x, os primers
foward e reverse e a H
2O RNase-free de acordo com a Tabela 3.
Posteriormente, foi pipetado 1µL de amostra, em cada tudo de reação de
cada par de primers dos dois exões em estudo, e selados os tubos com tampas
MicroAmp
®12 (Applied Biosystems).
35
Na reação de PCR foram conjugadas 3 fases, nas quais as amostras
foram submetidas a uma combinação adequada de tempo e temperatura
seguindo as recomendações do fabricante do Kit de amplificação HotStarTaq
®Plus Master Mix (Qiagen), de acordo com a tabela 4.
Tabela 4: Configuração da reação usando o HotStarTaq Plus Master Mix (Qiagen).
Face aos resultados obtidos, as reações de amplificação das amostras contendo os pares de primers dos exões 4 e 12 para o gene SCN5A foram realizadas algumas alterações ao protocolo fornecido. Uma vez que o exão 12 apresenta um tamanho considerável, foi necessário aumentar os tempos de desnaturação, annealing e extensão, bem como o número de ciclos para garantir que resultava amplificado suficiente para obtenção de resultados na sequenciação da cadeia do exão completa e com qualidade. A temperatura de annealing que se mostrou adequada para amplificação foi de 61ºC. Desta forma, o termociclador foi programado de acordo com o esquema da figura 5.
Fases Tempo Temperatura
1 Ciclo
Ativação inicial 5 min 95ºC
38 Ciclos
Desnaturação 30 s 94ºC
Annealing 30 s 50ºC-68ºC
Extensão 1 min 72ºC
1 Ciclo
36
1 Ciclo 40 Ciclos
1 Ciclo
95ºC
94ºC
5´
1´
72ºC
72ºC
61ºC
1´
2´
10´
Figura 5: Demonstração esquemática da programação no termociclador com tempo, temperatura e número de ciclos de cada uma das fases da PCR.
3.5 Purificação do produto amplificado
A purificação de produto amplificado foi realizada por um sistema enzimático ExoSAP-IT® (Alfagene) que trata os produtos da PCR, removendo os primers e nucleótidos não utilizados na reação, sem que ocorra perda de amostra.
O protocolo de purificação consistiu na adição direta de 5µL de reagente ExoSAP-IT® ao produto de amplificação. De seguida as amostras foram incubadas a 37°C durante 15 minutos, de modo a ocorrer a degradação restante de primers e nucleótidos e posteriormente a 80°C durante 15 minutos, para inativar o reagente atrás mencionado. No final, os produtos de PCR tratados foram armazenados a -20ºC até serem utilizados na sequenciação do DNA das amostras.
37
3.6 Sequenciação do DNA
As condições da reação de sequenciação utilizando os volumes de reagentes preconizados no protocolo fornecido pelo fabricante do BigDye™ Terminator v3.1 Cycle
Sequencing Kit foi reduzida em 2x e está descrita na Tabela 5 a seguir.
Tabela 5: Condições da reação de sequenciação dos exões 4 e 12 para o gene SCN5A com utilização do BigDye™ Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit num volume final de 10µL.
Seguindo-se as recomendações do fabricante, quando se utiliza um volume de
BigDye™ Terminator 3.1 Ready Reaction Mix inferior a 8µL deve ser utilizado o BigDye™ Terminator v1.1 & v3.1 5X Sequencing Buffer (Applied Biosystems). O uso do
tampão permite reduzir os custos da sequenciação sem afetar a precisão da sequência ou o comprimento da leitura.
As reações foram realizadas em placas de 96 poços (VWR®) devidamente seladas com película de vedação térmica (Axygen®) no selador térmico Eppendorf.
O processo foi realizado no termociclador GeneAmp® PCR System 9700 (Applied Biosystems) programado segundo as recomendações de fabricante do
BigDye™ Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit, descrito no esquema da figura 6. Ao
programar os ciclos de temperatura foi garantido que a rampa de temperatura do termociclador subia e descia a uma velocidade de 1ºC por segundo e que no final as amostras eram mantidas a 4ºC.
Componente Foward Reverse
BigDye™ Terminator 3.1 Ready Reaction Mix
2 µL 2 µL
BigDye™ Terminator v1.1 & v3.1 5X Sequencing Buffer
1 µL 1 µL
Primer (3.2 μM) 1 µL 1 µL
H2O RNase-free 5 µL 5 µL
Amostra 1 µl 1 µl
38
Incubação Etapas
Espera
25 Ciclos
Desnaturação Annealing Extensão 1ºC/segundo
96ºC
96ºC
1´
10´´
60ºC
60ºC
5´´
4´
4ºC
∞
Figura 6: Demonstração esquemática da programação no termociclador com tempo, temperatura e número de ciclos para a sequenciação do DNA das amostras.
3.7 Purificação do produto sequenciado
Os terminadores ddNTPs marcados com fluorescência, os dNTPs e os sais devem ser removidos dos produtos da sequenciação antes da análise de eletroforese capilar de modo a aumentar a qualidade das sequências produzidas.
As reações de sequenciação foram purificadas com o kit de purificação BigDye® Xterminator™ (Applied Biosystems) que remove eficientemente os terminadores BigDye não incorporados sem perda de amostra e num curto espaço de tempo.
O protocolo de purificação, seguindo as recomendações do fabricante, foi efetuado em placas de reação de sequenciação de 96 poços, nas quais foram adicionados 45µL de SamTM Solution a 10µL de XTerminatorTM Solution.
Após este procedimento as placas foram novamente seladas com a película anteriormente referida e depois colocadas no agitador de placas IKA MS3 digital (IKA®), durante 30 minutos a 2.000 rotações por minuto (rpm). No fim, a placa foi centrifugada a 1,000 x g durante 2 minutos na centrifuga 5810 (EppendorfTM).
39 Após a purificação as amostras devem ser processadas no sequenciador num prazo máximo de 48 horas de modo a prevenir a degradação da fluorescência, o que poderia comprometer o sinal durante a sequenciação.
3.8 Sequenciação de DNA
A sequenciação automática de DNA permite determinar a sequência dos nucleótidos num determinado fragmento de DNA, através de um sequenciador automático. Este método baseia-se na capacidade da DNA polimerase incorporar ddNTPs e na eficiência da eletroforese capilar que separa os fragmentos de DNA.
Assim, para a sequenciação automática foram preparadas placas PCR-96-AB-C (Axygen®) contendo 6µL de HiDiTM Formamide (Applied Biosystems) e 10µL de suspensão dos produtos da PCR de sequenciação purificados anteriormente centrifugados. Seguidamente, as placas de reação foram cerradas com septas de silicone (Axygen®) e submetidas a uma eletroforese capilar no sequenciador automático
ABI Prism® 3130xl Genetic Analyser (Applied Biosystems).
Neste aparelho de 16 capilares os fragmentos a serem sequenciados são injetados para o interior do capilar entrando em contato com o polímero. Quando submetidos a alta voltagem, esses fragmentos tendem a mover-se, no interior do capilar preenchido com o polímero, do polo negativo em direção ao polo positivo. Assim, os fragmentos marcados em diferentes locais com ddNTPs fluorescentes migram progressivamente, de acordo com o seu peso molecular, sendo a sua fluorescência emitida detetada por um laser de deteção e separada por comprimento de onda. Os resultados obtidos são depois transferidos para um programa do que permite a sua transformação em eletroferogramas.
40
3.9 Análise dos resultados
Os dados obtidos após sequenciação automática foram analisados através do
software SeqScape® v.3 (Applied Biosystems) e Sequencing Analysis® v.5.4 (Applied
Biosystems), com o objetivo de se averiguar a presença das variações de sequência
das amostras em estudo por comparação com as sequências de referência dos exões 4 e 12 do gene SCN5A obtidas na base de dados Ensembl (http://www.ensembl.org).
42
Eletroferogramas com as sequências obtidas através da sequenciação dos exões 4 e 12 do gene SCN5A
Cada uma das 50 amostras foi sequenciada no equipamento ABI prism 3130 xl
Genetic Analyser (Applied Biosystems®), e para interpretação dos dados foi usado o
software Sequencing Analysis® v5.4 (Applied Biosystems®). Os fragmentos de DNA
analisados foram representados através de eletroferogramas, onde é possível observar a composição dos nucleótidos que compõe esses mesmos fragmentos.
No esquema de cores de leitura dos nucleótidos a Adenina está representada pela cor verde; a Timina pela cor vermelha; a Citosina com a cor azul e a Guanina com a cor preta.
Figura 7 : Eletroferograma correspondente a um fragmento de DNA extraído da zaragatoa bucal da amostra B4, sequenciado com o primer foward do exão 4 do gene SCN5A, visualizado no software Sequencing Analysis® v.5.4
(Applied Biosystems®).
Figura 8: Eletroferograma correspondente a um fragmento de DNA extraído da zaragatoa bucal da amostra D23, sequenciado com o primer foward do exão 12 do gene SCN5A, visualizado no software Sequencing Analysis® v.5.4
43 Nos eletroferogramas que se seguem, foi observado para o exão 12 uma variação genética numa base, do fragmento de DNA analisado correspondente ao rs145880131. Este padrão foi possível observar nas amostras B1, B3, B4, B5, B7, B11, B22, D28, D29, D31, D42 e D45 (eletroferogramas em anexo).
As figuras que se seguem ilustram dois exemplos de eletroferogramas obtidos para o exão 12, contendo a variação genética referida.
Figura 9: Exemplo de um eletroferograma correspondente a amostra B4, sequenciado com o primer foward e reverse do exão 12 do gene SCN5A, visualizado no software Sequencing Analysis ® v.5.4 (Applied Biosystems®) assinalado
44 Figura 10: Exemplo de um eletroferograma correspondente a amostra B5, sequenciado com o primer foward e reverse do exão 12 do gene SCN5A, visualizado no software Sequencing Analysis® v.5.4 (Applied Biosystems®) assinalado
46 Desde a descoberta do gene SCN5A como o primeiro gene com suscetibilidade para a SBr, esta tem sido consistentemente relatada como uma patologia hereditária de caracter autossómico dominante (P. Brugada & Brugada, 1992; Chen et al., 1998; Gourraud et al., 2016).O gene SCN5A permanece como principal indicador para diagnóstico da SBr, com mais de 300 variantes de genéticas descritas em mais de 75% dos pacientes geneticamente diagnosticados (Crotti et al., 2012; Gourraud et al., 2016; Kapplinger et al., 2010)
Os autores Alings and Wilde, em 1999, sugeriram que a SBr contabiliza acima de 40 a 60% dos casos de Fibrilhação Ventricular (FV) previamente classificados como idiopáticos. Cerca de 5 a 10% dos sobreviventes de uma arritmia cardíaca, não apresentavam evidências de doença coronária ou anomalia estrutural do coração. Não existe um critério rigoroso no diagnóstico do SBr. O ECG é o exame complementar usado no diagnóstico; o padrão do lado direito precordial de forma assemelhada aquele que se observa no bloqueio do fascículo do ramo direito (BFRD) com uma elevação variável do segmento ST de forma semelhante à de alforge. Em 1999, constataram também que apenas 200 casos de SBr foram reportados e que mais de 90% dos casos foram em pacientes do sexo masculino e a média das idades do primeiro evento cardíaco variou entre os 22 e os 65 anos.
No ano de 2000, o estudo de Priori et al., apresentou dados clínicos de 130 doentes com SBr e 70 familiares afetados pela mesma doença. Do total da amostra, 28 pacientes revelaram variações genéticas no gene SCN5A.
No estudo de Antzelevitch et al., apresentado em 2007, este sequenciou amostras de 82 voluntários com diagnóstico clínico conhecido para SBr, os quais apresentaram variações genéticas em 16 genes do canal iónico. Das 82 amostras, 7 indivíduos apresentavam variações genéticas para os genes CACNA1C ou CACNB2 dos quais 3 pacientes tinham Intervalos QTc de curta duração. Cerca de 15% dos pacientes em estudo exibiam uma mutação patogénica para o gene SCN5A.
Em 2008, no estudo de Delpon et al., foram rastreados 14 genes responsáveis pela codificação dos canais iónicos em 105 pacientes com SBr diagnosticada. Os resultados revelaram que em 14,3% dos indivíduos foram detetadas variações genéticas para o gene SCN5A, seguido dos genes CACNA1C e CACNB2 com 6,7% e 4,8% respetivamente.
Os autores, Hu et al. em 2009, analisaram 9 genes suscetíveis à SBr, nomeadamente os genes SCN5A, GPD1L, CACNB2, CACNA1C, SCN1B, KCNE2, KCNE3, KCNE4 e IRX5 e também a subunidade do canal beta de sódio do gene SCN3B em 179 pacientes com SBr; 129 dos pacientes (72,07%) apresentaram resultado negativo para todos os genes testados.
47 No ano de 2009, Crotti et al., investigaram 12 genes suscetíveis para a SBr em 129 pacientes sem nenhum grau de parentesco entre si, 21 dos pacientes (16.3% da amostragem), apresentavam mutação para o gene SCN5A, apenas 6 pacientes (cerca de 4,6%) tinham 1 mutação para 1 dos restantes 11 genes.
No presente estudo, foram analisados, 50 indivíduos saudáveis e praticantes regulares de atividade desportiva, para os exões 4 e 12 do gene SCN5A. Para o exão 4 não foram obtidas variações genéticas. Para o exão 12 verificou-se a presença de um polimorfismo em 12 das amostras em estudo, apresentando uma frequência de heterozigóticos de 24% e uma frequência alélica de 12%. A variação genética em questão corresponde ao polimorfismo H558R, A˃G como pode ser observado nos eletroferogramas exemplo, apresentados nas figuras 9 e 10. Este polimorfismo apresenta uma frequência alélica entre 20.4% a 32% na população caucasiana, 29% na população africana e cerca de 10.4% na população asiática (Ackerman et al., 2004; Vatta et al., 2002).
Vários estudos reportam a presença de um alelo minor A/G para o polimorfismo H558R, o que se poderá traduzir num incremento dos achados no ECG, em doentes com SBr com presença de variações genéticas para o gene SCN5A.
Noutro estudo, sobre a frequência do polimorfismo H558R em 166 doentes com SBr e 232 indivíduos controlo saudáveis, Maekawa et al. no ano de 2005, reportou que a frequência para H558R na população japonesa com diagnóstico de arritmia era de 6.93%, enquanto nos controlos saudáveis a frequência desce para 7.97%. Estes resultados sugerem que este polimorfismo possa ter um efeito protetor contra arritmias. Em 2009, Lizzotte et al., concluem, através do estudo de uma população de 75 pacientes com SBr com mutação presente no gene SCN5A, comparativamente a 92 indivíduos com diagnóstico de SBr, mas sem mutação no gene SCN5A, que o polimorfismo H558R é um indicador para SBr, em indivíduos com diagnóstico conhecido da patologia com mutação no gene SCN5A com uma frequência alélica de 29%. Para os indivíduos com diagnóstico de SBr, Lizzotte et al., concluiu que sem a presença de mutação no gene SCN5A a sua frequência alélica descia para 17%.
Num estudo recente, em 2017, Matsumura et al., analisou uma amostra com 100 pacientes com diagnóstico de SBr estabelecido, bem como 1875 individuos controlo. Após análise dos resultados, concluiu que nos pacientes com SBr, a frequência do polimorfismo era menor, comparativamente aos indivíduos controlo (Figura 11).
Concluiu ainda que nos indivíduos com SBr portadores do polimorfismo H558R, mas sem presença de mutação para o gene SCN5A, apresentavam resultados melhores no ECG e não apresentavam episódios de FV. Além disso, concluíram que a expressão do gene SCN5A era elevada e a metilação do gene SCN5A era menor em pacientes
48 com o polimorfismo H558R do que nos pacientes sem a presença desta variação genética.
Desta forma, os resultados sugeriram que a presença do polimorfismo H558R nos indivíduos com SBr, evita o aparecimento de episódios de FV, mesmo em pacientes sem presença de mutação para o gene SCN5A, pela modulação da expressão genética e metilação que causa neste gene.
Figura 11- Frequência do polimorfismo H558R em pacientes com SBr e para controlos saudáveis, adaptado de (Matsumura et al., 2017).
Face aos resultados apresentados, pensa-se ser fundamental proceder a uma investigação mais aprofundada dos resultados obtidos, nomeadamente ser necessário alargar o número de exões e genes a estudar, bem como integrar uma abordagem multidisciplinar (Medicina Geral e Familiar, Cardiologia e Medicina Legal na vertente da Patologia Forense), de forma a identificar os verdadeiros riscos associados aos membros da população em estudo, alargando a amostragem para familiares de primeiro grau. Deverá ainda proceder-se a uma monitorização para confirmação do padrão eletrocardiográfico típico da SBr, de modo a iniciar o tratamento e monitorização adequada para o efeito, caso se justifique do ponto de vista clínico.
Uma vez que predominam estudos realizados para a população asiática é importante salientar a importância de realizar estudos, para populações europeias, para suportar ou contra-argumentar estes resultados.
50 Na vasta maioria dos casos em que se confirma o diagnóstico de MSC, esta é causada por arritmias cardíacas entre as quais as canalopatias, como a SBr, e que em maior parte dos casos a primeira manifestação da doença é a morte (Yokoi et al., 2005). Atualmente, o rastreio genético para o gene SCN5A é a forma mais eficaz de diagnóstico para a SBr (Yokoi et al., 2005).
No protocolo utilizado para análise dos exões 4 e 12 do gene SCN5A, foi anteriormente utilizado e padronizado com sucesso para o estudo de outros genes relacionados com patologias genéticas cardíacas. No entanto, devido ao tamanho distinto dos exões foi necessário um aperfeiçoamento das condições usadas na amplificação, realizado com sucesso.
Todo o processo de execução protocolar foi realizado nos equipamentos adequados e os resultados analisados no software indicado para o efeito, através da comparação com as sequências de referência para deteção de variações genéticas em cada um dos exões em estudo, verificando-se a presença do polimorfismo H558R para o exão 12 do gene SCN5A. Foram apenas encontradas variações genéticas para o exão 12 do gene SCN5A. No entanto não é possível confirmar uma exclusão da existência de variações genéticas para o exão 4 como marcador do gene SCN5A para a SBr, uma vez que a amostragem utilizada era reduzida.
É importante ainda salientar que, apesar de os resultados não mostrarem a existência de variações genéticas, pelo que não se pode afastar a hipótese de que a população em estudo não possa apresentar variações genéticas que sejam responsáveis pela SBr.
A inclusão de estudos genéticos post-mortem de casos de MSC em corações estruturalmente normais, é de extrema importância para despiste e monitorização das canalopatias mais frequentes como a SBr, na população jovem portuguesa, com ou sem história de MSC, por essa via poderá haver uma franca diminuição da mortalidade relacionada com esta patologia. A informação que estes testes trazem, constitui um contributo fundamental na prevenção de novas mortes em famílias com este tipo de alterações genéticas.
Após a investigação, da presença de variações genéticas suscetíveis, para a SBr nos indivíduos apresentados anteriormente, perspetiva-se a emergente criação de uma base de dados que permita rastrear o número de MSC em indivíduos saudáveis, para que seja possível abrir novos caminhos para a investigação de novas patologias associadas.
É ainda recomendável a continuação deste estudo para: efeitos de comparação de resultados com amostras de autópsias de indivíduos com causa de morte
51 diagnosticada de MSC; estudo da prevalência da SBr na população portuguesa e posterior publicação.
Em suma, o caminho ainda é longo para a medicina personalizada ultrapassar a grande variabilidade fenotípica encontrada em formas familiares da doença.
