PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
A INOCULAÇÃO RUMINAL DE ENTEROCOCCUS FAECALIS É EFICIENTE NO CONTROLE DA INTOXICAÇÃO POR MONOFLUOROACETATO DE SÓDIO EM
OVINOS?
Geovanny Bruno Gonçalves Dias
CUIABÁ – MT 2015
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
A INOCULAÇÃO RUMINAL DE ENTEROCOCCUS FAECALIS É EFICIENTE NO CONTROLE DA INTOXICAÇÃO POR MONOFLUOROACETATO DE SÓDIO EM
OVINOS?
Autor: Geovanny Bruno Gonçalves Dias Orientadora: Prof.ª Dr.ª Nadia Aline Bobbi Antoniassi Co-orientador: Prof. Dr. Edson Moleta Colodel
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias, área de concentração: Patologia Animal, da Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária da Universidade Federal de Mato Grosso para a obtenção do título de Mestre em Ciências Veterinárias.
CUIABÁ - MT 2015
Ficha catalográfica elaborada automaticamente de acordo com os dados fornecidos pelo(a) autor(a).
Permitida a reprodução parcial ou total, desde que citada a fonte.
D541i Dias, Geovanny Bruno Gonçalves.
A Inoculação Ruminal de Enterococcus faecalis é Eficiente no Controle da Intoxicação por Monofluoroacatetato de Sódio em Ovinos? / Geovanny Bruno Gonçalves Dias. -- 2015
52 f. : il. color. ; 30 cm.
Orientadora: Nadia Aline Bobbi Antoniassi. Co-orientador: Edson Moleta Colodel.
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Mato Grosso, Faculdade de Agronomia, Medicina Veterinária, Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, Cuiabá, 2015.
Inclui bibliografia.
1.. Amorimia sp.. 2. defluoração. 3. fluorocaetato dehalogenas 4.. morte súbita. 5. resistência. I. Títul
Nome do Autor: DIAS, Geovanny Bruno Gonçalves.
Título: A inoculação ruminal de Enterococcus faecalis é eficiente no controle da intoxicação por monofluoroacetato de sódio em ovinos?
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias, área de concentração: Patologia Animal, da Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária da Universidade Federal de Mato Grosso para a obtenção do título de Mestre em Ciências Veterinárias.
Data: Banca Examinadora Prof. Dr.: Instituição: Assinatura: Julgamento: Prof. Dr.: Instituição: Assinatura: Julgamento: Prof. Dr. Instituição: Assinatura: Julgamento:
RESUMO
A INOCULAÇÃO RUMINAL DE ENTEROCOCCUS FAECALIS É EFICIENTE NO CONTROLE DA INTOXICAÇÃO POR MONOFLUOROACETATO DE SÓDIO EM
OVINOS?
Do grupo das plantas que causa morte súbita em animais de interesse pecuário no Brasil, sete delas contém monofluoroacetato de sódio (MFA) como princípio tóxico. MFA causa bloqueio do ciclo de Krebs e consequente acúmulo de citrato nos tecidos. A movimentação dos animais intoxicados desencadeia os sinais clínicos e a morte com evolução superaguda. Uma das alternativas preconizadas para prevenção da intoxicação é a ingestão de doses não tóxicas de plantas que contém MFA. Sugere-se que a resistência ocorra devido à multiplicação de microrganismos que expressam o gene fluoroacetato dehalogenase e degradam o MFA no rúmen. Este estudo teve por objetivo verificar se E. faecalis EF09, JQ661270.1 e E. faecalis EF08, JQ661271.1, isoladas do rúmen de bovinos, degradam MFA in vivo e podem ser usadas para detoxificação de plantas que contém MFA. Para a realização deste experimento, seis ovinos com idade média de dois anos, fêmeas, entre 35-40 kg, de raça Santa Inês, foram divididos em dois grupos com três animais cada. O Grupo Inoculação recebeu durante três dias seguidos o inóculo de E. faecalis de 30 ml dividido em três doses de 10 ml. O Grupo Controle recebeu água destilada durante o mesmo período. Os animais de ambos os grupos foram mantidos em descanso por 48 horas e após esse período, o MFA foi fornecido em uma dose de 1,5 mg/Kg/PV por via oral para todos os ovinos. Os sinais clínicos, frequência cardíaca e respiratória foram obtidos em repouso a cada uma hora, e após 10 minutos de movimentação decorridas seis horas da intoxicação. Todos os animais de ambos os grupos morreram entre três e oito horas após o fornecimento de MFA. Os resultados indicam que os animais não desenvolveram resistência ao MFA após a inoculação com E. faecalis.
Palavras-chave: Amorimia sp., defluoração, fluoroacetato dehalogenase, morte súbita, resistência.
ABSTRACT
THE RUMINAL INOCULATION OF ENTEROCOCCUS FAECALIS IS EFFICIENT IN CONTROL OF SODIUM FLUOROACETATE POISONING IN SHEEP?
From the group of plants that cause sudden death in livestock in Brazil, seven of which contains sodium fluoroacetate (MFA) as toxic principle. MFA cause blockage of the Krebs cycle and subsequent accumulation of citrate in the tissues. The movement of animals that are intoxicated triggers the clinical signs and cause the death with acute evolution. One envisaged alternative to preventing poisoning is the ingestion of nontoxic doses of plants containing the MFA. It is suggested that the resistance occurs due to proliferation of microorganisms that express the MFA degrading gene fluoroacetate dehalogenase and that the MFA is degrade in the rumen. This study aimed to determine whether E. faecalis FY09, JQ661270.1 and FY08, JQ661271.1, isolated from bovine rumen, degrade MFA in vivo and can be used for detoxification of plants containing MFA. To carry out this experiment, six sheep with an average age of two years old, female, between 35-40 kg, Santa Ines, were divided into two groups of three animals each. The inoculation Group received for three consecutive days, E. faecalis - 30 ml inoculum divided into three doses of 10 ml. The control group received distilled water for the same period. The animals of both groups were kept at rest for 48 hours and after this period, the MFA is provided in a dose of 1.5 mg / kg / Live Weight orally to all sheep. Clinical signs, heart and respiratory rate were obtained at rest every hour, and after 10 minutes of elapsed drive six hours of poisoning. All animals in both groups died between three and eight hours after delivery of MFA. The results indicate that the animals have not developed resistance to MFA after inoculation with E. faecalis.
Key-words: Amorimia sp., defluorination, fluoroacetate dehalogenase, sudden death, resistance.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Ovino do Grupo Inoculação com membros em base aberta demostrando incoordenação motora e com relutância à movimentação. ... 26 Figura 2 - Ovinos do Grupo Inoculação apresentando decúbito lateral e manutenção do apetite. ... 27 Figura 3 - Ovino do Grupo Controle com apatia, permanecia em decúbito esternal e veia jugular ingurgitada. ... 28 Figura 4 - Ovino do Grupo Controle com apatia, pleurotonia e permanência em decúbito esternal. ... 28 Figura 5 - Pulmão com áreas de extensa hemorragia nos lobos caudais direito e esquerdo. ... 30
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Principais alterações clínicas e comportamentais dos ovinos inoculados via ruminal por Enterococcus faecalis e intoxicados por monofluoroacetato de sódio. Grupos controle e inoculação...28
SUMÁRIO RESUMO... 5 ABSTRACT ... 6 LISTA DE FIGURAS ... 7 LISTA DE TABELAS ... 8 1. INTRODUÇÃO ... 11 2. REVISÃO DE LITERATURA ... 13
2.1. Principais plantas que causam morte súbita no Brasil ... 13
2.2. Monofluoroacetato de sódio ... 13
2.3. Mecanismo de intoxicação por monofluoroacetato de sódio ... 14
2.4. Achados macroscópicos da intoxicação por MFA em ruminantes ... 15
2.5. Características da intoxicação por MFA em ovinos ... 15
2.6. Controle e prevenção da intoxicação ... 16
2.7. Bactérias que degradam monofluoroacetato de sódio ... 16
2.8. Enterococcus faecalis... 17
2.9. Fluoroacetato dehalogenase ... 18
3. MATERIAL E MÉTODOS ... 19
3.1. Comitê de Ética em Uso de Animais (CEUA) ... 19
3.2. Delineamento experimental ... 19
3.3. Manutenção das cepas de Enterococcus faecalis ... 20
3.4. Formação dos inóculos de E. faecalis ... 20
3.5. Seleção de animais para o experimento ... 21
3.6. Inoculação ruminal de E. faecalis ... 22
3.7. Intoxicação por monofluoroacetato de sódio ... 22
3.8. Acompanhamento clínico dos animais ... 22
3.9. Resistência à intoxicação por monofluoroacetato de sódio ... 23
3.10. Análise patológica ... 23
4. RESULTADOS ... 25
4.1. Manutenção das cepas e teste de defluoração ... 25
4.2.1. Grupo Inoculação ... 25 4.2.2. Grupo Controle ... 27 4.3. Achados de necropsia ... 29 4.4. Achados histopatológicos ... 30 5. DISCUSSÃO ... 31 6. CONCLUSÃO ... 34 7. REFERÊNCIAS ... 35
1. INTRODUÇÃO
Anualmente no Brasil ocorrem aproximadamente 500.000 mortes de bovinos devido às plantas que causam morte súbita associada ao exercício. Essas plantas tóxicas pertencem às famílias Rubiaceae, Bignoniaceae e Malpighiaceae. Na região da Amazônia, aproximadamente 80% das mortes causadas por plantas são causadas por
Palicourea marcgravii (TOKARNIA et al., 2000). No estado de Mato Grosso, nas áreas
de região amazônica, Amorimia pubiflora é mencionada como a principal causa de mortalidade (TOKARNIA et al., 2012). Sete plantas das três famílias de plantas que causam morte súbita contém o monofluoroacetato de sódio (MFA), composto altamente letal, responsável por causar a interrupção do ciclo de Krebs e consequente privação energética. Os bovinos intoxicados por essas plantas apresentam, ao se movimentarem, cansaço, tremores e morte em um período de 5 a 15 minutos (TOKARNIA & DÖBEREINER, 1973).
A forma de controle mais eficaz é realizada através da indução de resistência dos animais através do fornecimento de pequenas quantidades das plantas (BECKER et al., 2012, DUARTE et al. 2014). O que permite que os animais assimilem a substância tóxica presente nas plantas dentro do rúmen e sejam capazes de detoxificá-la. A resistência se baseia na multiplicação ruminal de microrganismos capazes de metabolizar o MFA. A realização deste estudo baseou-se nos resultados obtidos por Pimentel (2011). As cepas de Enterococcus faecalis foram isoladas do rúmen de bovinos, identificadas, sequenciadas geneticamente e testadas para a liberação de fluoretos através da defluoração de mofluoroacetato de sódio (PIMENTEL, 2011). Os resultados demonstraram que as cepas de Bacillus sp. e E. faecalis seriam boas candidatas a serem utilizadas para evitar a intoxicação de bovinos criados em pastos infestados por plantas que contém MFA.
Este estudo tem objetivo de verificar se cepas de E. faecalis encontradas naturalmente no rúmen de bovinos e caprinos, após teste de defluoração, que expressam o gene fluoroacetato dehalogenase, são capazes de degradar monofluoroacetato de sódio no rúmen de ovinos que nunca tiveram contato com plantas
que causam morte súbita, e se dessa forma possam ser utilizadas como método eficaz de controle para intoxicações por monofluoroacetato de sódio.
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Principais plantas que causam morte súbita no Brasil
Atualmente existem quatorze plantas no Brasil que causam morte súbita associada a esforço físico em ruminantes. Essas plantas pertencem a três famílias botânicas distintas. A família Rubiaceae, que contém Palicourea juruana (TOKARNIA & DÖBEREINER, 1981), P. grandiflora (TOKARNIA et al., 1981), P. aeneofusca (TOKARNIA et al., 1983) e P. marcgravii (TOKARNIA & DÖBEREINER, 1986). A família Malpighiaceae, que contém Amorimia rigida (TOKARNIA et al., 1961; SANTOS, 1975; TOKARNIA et al., 1994), A. pubiflora (FERNANDES & MACRUZ, 1964; TOKARNIA & DÖBEREINER, 1973; BECKER et al., 2013), A. elegans (COUCEIRO et al., 1976), A.
aff. rigida (TOKARNIA et al., 1985) e A. exotropica (GAVA et al., 1998), além das
Malpighiaceae recentemente identificadas: Amorimia sepium (SCHONS et al., 2011) e
A. septentrionalis (DUARTE et al., 2014). E a família Bignoniaceae, que contém Pseudocalymma elegans (MELLO & FERNANDES, 1941; TOKARNIA et al., 1969), Arrabidaea bilabiata (DÖBEREINER et al., 1983) e A. japurensis (TOKARNIA &
DÖBEREINER, 1981).
2.2. Monofluoroacetato de sódio
O Monofluoroacetato de sódio (MFA) ocorre naturalmente em sete dessas plantas encontradas no Brasil: Palicourea marcgravii (OLIVEIRA, 1963), P. aenofusca (LEE et al. 2012), Amorimia rigida (CUNHA et al., 2012; LEE et al., 2012), A.
septentrionalis (LEE et al., 2012), A. pubiflora (LEE et al., 2012), Arrabidaea bilabiata
descrito em plantas tóxicas da Austrália (Oxylobium spp., Acacia georginae e
Gastrolobium spp.) e África do Sul (Dichapetalum toxicarium e D. cymosum) (CHEEK,
1998). O MFA é um derivado do ácido monofluoroacético (CRAIG & BLYTHE, 1994), um composto químico não volátil, insolúvel em álcool, acetona e óleos vegetais, mas solúvel em água (EGEKEZE & OEHME, 1979). É quimicamente estável à luz solar e à temperatura de 54ºC (GRIBBLE, 1973), apresentando-se sob a fórmula molecular de CH2FCOONa (BEASLEY, 2002).
2.3. Mecanismo de intoxicação por monofluoroacetato de sódio
A toxicidade do MFA ocorre pela ação do fluorocitrato, seu metabólito tóxico, formado no organismo. O fluoroacetato se liga à acetil coenzima A (CoA) para formar fluoroacetil CoA, que substitui o acetil CoA no ciclo de Krebs, conjuga-se com o oxaloacetato e reage com a enzima citrato sintase para produzir fluorocitrato. O fluorocitrato bloqueia competitivamente a aconitase (KREBS et al., 1994) e impede a conversão do citrato em isocitrato, o que resulta no acúmulo de grandes quantidades de citrato nos tecidos. Há diminuição da produção de ATP em até 50% e processos metabólicos dependentes de energia são bloqueados (CLARKE, 1991), o que leva à privação de energia e consequente manifestação dos sinais clínicos característicos da intoxicação: taquicardia, arritmia cardíaca, ingurgitamento das veias jugulares, pulso venoso positivo, apatia, relutância a movimentação, tremores musculares, incoordenação motora, dismetria, respiração ofegante, micção frequente, nistagmo, opistótono, instabilidade, decúbito esternal, decúbito lateral, convulsão e morte (TOKARNIA et al. 2012; BECKER et al. 2013).
2.4. Achados macroscópicos da intoxicação por MFA em ruminantes
Geralmente não são observadas alterações macroscópicas decorrentes da intoxicação por MFA, mas em alguns casos podem ser observadas alterações cardiovasculares como dilatação e acúmulo de sangue nas veias jugulares e veias cavas, coração globoso e pontilhados brancacentos na superfície de corte do miocárdio (SOARES et al., 2011). Microscopicamente são observadas alterações renais como degeneração hidrópico-vacuolar dos túbulos contorcidos distais (TOKARNIA et al., 2012) e por vezes alterações cardíacas com áreas multifocais a coalescentes de fibrose no miocárdio (SOARES et al., 2011).
2.5. Características da intoxicação por MFA em ovinos
Em ovinos, os sinais clínicos observados após a intoxicação por MFA normalmente são taquicardia, taquipnéia, arritmia, respiração abdominal, ligeira perda de equilíbrio; por vezes os ovinos cambaleiam, apoiam a cabeça no flanco (postura de auto-auscultação), levantam e deitam em decúbito esterno-abdominal repetidamente. Adicionalmente, observaram-se tremores musculares e apatia, relutância em mover-se, prostração, jugulares ingurgitadas, pulso venoso positivo, poliúria, estertores pulmonares, dispneia, pescoço estendido com apoio da cabeça no solo e presença de líquido espumoso saindo pelas narinas e boca. Na fase final, em geral, os animais caíam em decúbito lateral, esticavam os membros, faziam movimentos de pedalagem, apresentavam opistótono, nistagmo, respiração ofegante e morriam em poucos minutos (PEIXOTO et al. 2010).
2.6. Controle e prevenção da intoxicação
Vários estudos vêm sendo desenvolvidos no intuito de prevenir a intoxicação e induzir os animais à resistência. Medidas de controle como uso de cercas, herbicidas ou outros métodos de eliminação das plantas foram mal sucedidas no Brasil (RIET-CORREA & MEDEIROS, 2001). Há alguns estudos que se mostraram efetivos no intuito de induzir a resistência à intoxicação em ruminantes, como nos casos de aversão ao consumo (BARBOSA et al. 2008) e ingestão repetida de doses não tóxicas (OLIVEIRA et al., 2013, BECKER et al., 2013; DUARTE et al., 2014). Seguindo essa linha de pesquisa de ingestão de doses não tóxicas de plantas que contém MFA, o cultivo de bactérias do solo e do rúmen que degradam monofluoroacetato e estão envolvidas na indução de resistência tem sido um tópico bastante estudado (CAMBOIM et al. 2012a, Camboim et al. 2012b).
Becker et al. (2013) e Duarte et al. (2014) comprovaram que a ingestão repetida de doses não tóxicas de plantas que contém MFA é capaz de induzir resistência à intoxicação e essa resistência pode ser transferida para outros animais que nunca tiveram contato com plantas que contém MFA através da transfaunação de conteúdo ruminal. Cooper, Schafer & Gregg (1995) e Gregg et al. (1994, 1998) desenvolveram um método que utiliza a inoculação ruminal de cepas de Butyrivibrio fibrisolvens modificadas geneticamente para receber a enzima fluoroacetato dehalogenase proveniente de Moraxella sp., tornando então as cepas de Butyrivibrio fibrisolvens capazes de degradar o monofluoroacetato de sódio.
2.7. Bactérias que degradam monofluoroacetato de sódio
Vinte e quatro microrganismos capazes de degradar monofluoroacetato de sódio foram isolados de solo na Austrália Central, pertencentes a sete gêneros bacterianos
(Acinetobacter, Arthrobacter, Aureobacterium, Bacillus, Pseudomonas, Weeksella e
Streptomyces) e quatro gêneros de fungos (Aspergillus, Fusarium, Cryptococcus e Penicillium) (TWIGG & SOCHA, 2001). No Brasil, recentemente foram isoladas sete
cepas bacterianas de solo, pertencentes aos gêneros Ancylobacter, Burkholderia,
Cupriavidus, Paenibacillus, Staphylococcus, Stenotrophomonas e Ralstonia (CAMBOIM
et al., 2012a). No entanto, há poucos microrganismos exclusivamente ruminais descritos como sendo capazes de degradar o monofluoroacetato de sódio (LEONG et al., 2010). No Nordeste do Brasil, Camboim et al. (2012b) isolaram Pigmentiphaga sp. e
Ancylobacter sp., na região de Queensland, na Austrália, Davis et al. (2012) isolaram Synergistes sp. e no Estado de Mato Grosso, no Brasil, recentemente foram
identificadas cepas de Bacillus sp. e Enterococcus faecalis como degradadoras de MFA (PIMENTEL, 2011).
2.8. Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis é descrita na mucosa do trato respiratório, urogenital e no
trato gastrointestinal de diversos animais e no homem, causando enfermidades em bovinos, ovinos, caprinos, equinos, suínos, aves domésticas, pássaros, cães, gatos e humanos. Esta espécie já foi isolada do rúmen de diversas espécies de ruminantes tanto domésticos quanto silvestres (HUDSON et al., 2000), sendo considerada um habitante pacífico do trato gastrointestinal (YUEN & AUSUBEL, 2014).
No estudo prévio de Pimentel (2011) cepas de E. faecalis sobreviveram e cresceram na presença de MFA no teste de defluoração, indicando que são resistentes ao MFA e conseguem utilizar os substratos da degradação do MFA para sua multiplicação. A atividade de liberação do íon fluoreto, que é o produto da defluoração do monofluoroacetato demonstrou que a quantidade do íon fluoreto aumentou na presença do MFA. Sem a presença de monofluoroacetato de sódio, os níveis de íon fluoreto se mantiveram basais (PIMENTEL, 2011).
2.9. Fluoroacetato dehalogenase
O fluoroacetato dehalogenase é a enzima responsável por degradar a forte ligação dos átomos de carbono com os halogênios (KAWASAKI et al., 1981, KURIHARA et al., 2003). Alguns halogênios possuem dehalogenases específicas para clivar suas ligações (FETZNER & LINGENS, 1994). Nesse sentido, Kurihara et al. (2003) demonstrou que o fluoroacetato dehalogenase é altamente específico na degradação dos haloacetatos, em especial, o monofluoroacetato. De forma que a resistência à intoxicação por MFA em ovinos observada por Gregg et al. (1994, 1998) está relacionada ao aumento no número de bactérias que expressam o gene fluoroacetato dehalogenase no rúmen. Fluoroacetato dehalogenase é a única enzima capaz de quebrar a forte ligação entre o carbono e o flúor (FETZNER & LINGENS, 1994) do monofluoroacetato de sódio. E a energia liberada pela dissociação dessa ligação está entre as mais altas encontradas na natureza (GOLDMAN, 1969), liberando fluoretos e glicolato (LIU et al., 1998), que são utilizados pelas próprias bactérias para sua manutenção no rúmen (CAMBOIM et al., 2012b, PIMENTEL, 2011).
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Comitê de Ética em Uso de Animais (CEUA)
Todos os procedimentos realizados neste experimento foram aprovados pelo Comitê de Ética em Uso de Animais da Universidade Federal de Mato Grosso (UFMT) sob o título “Utilização de bactérias ruminais na prevenção da intoxicação por monofluoroacetato de sódio (FS) em camundongos e ovinos”, através do processo número 23108.052786/12-0, de 23 de abril de 2013.
3.2. Delineamento experimental
O isolamento, identificação e sequenciamento genético das cepas de
Enterococcus faecalis utilizadas neste experimento foram realizados previamente por
Pimentel (2011).
O delineamento experimental foi definido como inteiramente casualizado (DIC) com parcelas subdivididas no tempo. A variação total foi decomposta em duas partes: a variação entre os tratamentos do Grupo Inoculação de E. faecalis e do Grupo Controle e a variação entre os ovinos com o mesmo tratamento. Foram selecionados seis animais, que foram divididos em dois grupos. Foram consideradas respostas de interesse, as variáveis quantitativas: frequência cardíaca e frequência respiratória e as variáveis qualitativas: sinais clínicos desenvolvidos pelos ovinos como apatia, ingurgitamento das veias jugulares, taquicardia, pulso venoso evidente, relutância em caminhar, arritmia cardíaca, tremores musculares, incoordenação motora, respiração ofegante (dispneia), nistagmo, opistótono, instabilidade, decúbito lateral, micção frequente, convulsão, opistótono e morte (BECKER et al., 2013). Os dados foram
coletados a cada uma hora a partir do momento em que os ovinos foram intoxicados com MFA até o desfecho clínico.
3.3. Manutenção das cepas de Enterococcus faecalis
As colônias de E. faecalis obtidas por Pimentel (2011) foram mantidas em meio de cultura sólido Luria Bertani (LB), com repiques a cada 15 dias e em meio de cultura líquido LB acrescido de 30% de glicerol (Pimentel, 2011). As colônias de E. faecalis foram mantidos em temperaturas de 37°C (meio LB líquido – acrescido de glicerol 30%); 4°C (meio LB sólido) no Laboratório de Microbiologia Veterinária do Hospital Veterinário da Universidade Federal de Mato Grosso (Brandão et al., 2013).
3.4. Formação dos inóculos de E. faecalis
As colônias de E. faecalis EF09 (JQ661270.1) e EF08 (JQ661271.1) mantidas em meio LB sólido a 4ºC foram selecionadas utilizando palitos esterilizados e adicionadas a frascos de Erlenmeyer contendo 50 ml de meio de cultura líquido LB e 50µl de monofluoroacetato de sódio. A suspensão obtida foi mantida em agitador orbital
overnight a 37° C até o seu turvamento (Brandão et al., 2013). Amostras da suspensão
obtida foram selecionadas para identificação morfológica através de coloração de Gram. Após o crescimento das colônias de E. faecalis, as colônias foram submetidas ao teste de defluoração através de um eletrodo seletivo de fluoretos (F-) em placas de 24
furos contendo 500µl da suspensão de E. faecalis e 500µL de Tampão de Ajuste de Força Iônica Total (TISAB), composto por cloreto de sódio, ácido acético glacial e diaminocliclohexano, com pH 5,5 (Camboim et al., 2012b). Os íons de fluoreto liberados
através da defluoração microbiana do MFA foram medidas em millimoles. A faixa de defluoração foi de 20mmol L-1 correspondente à liberação de 20mmol L-1 de fluoreto
(Camboim et al., 2012a). As amostras positivas para liberação de fluoretos foram submetida à centrifugação durante 20 minutos, 5000 RPM, à 4º C, por 3 vezes para lavagem das colônias de E. faecalis. Após a centrifugação, os precipitados formados de
E. faecalis foram ressuspendidos em 30 ml de água miliQ e mantidos a 4º C para
composição do inóculo (Brandão et al., 2013). Para contagem das unidades formadoras de colônia (UFC), 100 µl do total de 50 ml do inóculo foi distribuído em diluições seriadas de 101 a 105. As diluições seriadas foram plaqueadas em placas contendo
meio de cultura sólido LB e então acondicionadas em estufa, overnight a 37º C. Após o crescimento das colônias de E. faecalis de cada amostra, foi realizada a contagem e o valor médio obtido para cada inóculo foi de 348x109 UFC.
3.5. Seleção de animais para o experimento
Foram selecionados seis ovinos com idade média de dois anos, 25-30 kg, de raça Santa Inês, provenientes de áreas onde não ocorrem plantas que contém MFA. Os animais foram divididos em dois grupos, Grupo Inoculação (GI) com três animais e Grupo Controle (GC) com três animais. Cada grupo foi acondicionado em baia separada no Hospital de Grandes Animais da Faculdade de Agronomia, Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal de Mato Grosso. Previamente os ovinos foram tratados com Cloridrato de Levamisol para controle de helmintoses e Toltrazurila para o controle de coccidioses. Uma semana antes do início do experimento, a alimentação dos ovinos foi mantida a três vezes por dia (8hs, 12hs, 18hs) com dieta consistindo de 30% de ração concentrada composta de milho integral moído, sorgo integral moído, milheto, farelo de soja, casca de soja moída, ureia, cloreto de sódio, calcário calcítico, fosfato bicálcico; premix mineral vitamínico contendo manganês, cobalto, zinco, selênio, ferro, iodo, vitaminas A, D e E. Além de 70% de
volumoso (Brachiara sp. fresca e feno de Cynodon cv. Tifton) e água fornecida à vontade.
3.6. Inoculação ruminal de E. faecalis
Os inóculos de E. faecalis foram administrados em doses iguais de 10 ml, por 3 dias seguidos através de sonda ruminal para os três ovinos do Grupo Inoculação. Os três ovinos do Grupo Controle receberam água destilada em doses iguais de 10 ml, por 3 dias seguidos por sonda ruminal. Foi considerado um intervalo de 48 horas para a estabilização de E. faecalis no rúmen dos ovinos (Gregg et al., 1998).
3.7. Intoxicação por monofluoroacetato de sódio
O monofluoroacetato de sódio (Sigma-Aldrich 1g) foi fornecido em uma única dose tóxica de 1,5 mg/Kg/peso vivo (PV) por via oral para todos os ovinos do GI e do GC após as 48 horas consideradas necessárias para a estabilização de E. faecalis no rúmen dos ovinos (Gregg et al., 1998).
3.8. Acompanhamento clínico dos animais
Exames clínicos foram realizados nos ovinos previamente à administração do monofluoroacetato para obtenção dos dados fisiológicos basais de cada ovino em repouso e após movimentação. Após a intoxicação, o exame consistia na auscultação
da frequência cardíaca e respiratória dos ovinos em repouso, a cada hora, e observação de movimentos respiratórios, comportamento, postura, ingestão de água e alimentos. Após seis horas da intoxicação, os ovinos foram movimentados por dez minutos, e imediatamente após a movimentação dos animais, foram auscultadas as frequências cardíaca e respiratória.
3.9. Resistência à intoxicação por monofluoroacetato de sódio
Para determinar se os ovinos foram resistentes ou susceptíveis à intoxicação por MFA, após o fornecimento de MFA, foram acompanhados os sinais clínicos característicos da intoxicação. Na natureza, a morte em ruminantes por intoxicação por monofluoroacetato pode ocorrer em até 72 horas (TOKARNIA et al. 2012). Nesse período, os sinais clínicos observados foram classificados quanto à sua severidade em:
- Leves (taquicardia, dorso arqueado, andar rígido, apatia, jugular ingurgitada); - Moderados (taquicardia, jugular ingurgitada, pulso venoso positivo, arritmia, apatia, relutância à movimentação, quedas repentinas);
- Acentuados (taquicardia, jugular ingurgitada, pulso venoso positivo, arritmia, tremores musculares, dorso arqueado, andar rígido, apatia, tremores de cabeça, trismo mandibular, relutância a movimentação, quedas bruscas, permanência em decúbito, cianose, convulsão e morte).
Os ovinos que apresentaram sinais clínicos acentuados, incapazes de se recuperar, com progressão clínica para a morte não foram considerados resistentes.
Os ovinos que morreram durante o experimento foram necropsiados, anotando-se as alterações macroscópicas e fragmentos de linfonodos, intestino, rúmen, retículo, omaso, abomaso, pâncreas, adrenais, bexiga, rim, tireoide, coração, pulmão e encéfalo foram coletados. As amostras foram fixadas em formol a 10%. Após fixação, os fragmentos foram clivados, incluídos em parafina, cortados em 3-5μm, corados pela hematoxilina e eosina (HE) e avaliados microscopicamente no Laboratório de Patologia Veterinária do Hospital Veterinário da Universidade Federal de Mato Groso.
4. RESULTADOS
4.1. Manutenção das cepas e teste de defluoração
As cepas EF09 (JQ661270.1) e EF08 (JQ661271.1) cresceram em meio de cultura acrescido de monofluoroacetato de sódio como única fonte de carbono. A suspensão se turvou em agitador orbital overnight a 37° C após doze horas. Ao teste de defluoração todas as amostras utilizadas apresentaram liberação de fluoretos.
4.2. Acompanhamento clínico dos ovinos
4.2.1. Grupo Inoculação
Após quatro horas da intoxicação a ovelha GI2 desenvolveu quadro súbito com queda brusca, convulsão e tremores intensos. A ovelha demonstrava relutância à movimentação, mantendo-se em estação com respiração ofegante e durante a auscultação apresentando frequência cardíaca superior a 250 batimentos por minutos (bpm). Apresentou queda brusca, com movimentos de pedalagem e tremores intensos ao tentar se levantar, permanecendo em decúbito lateral e eliminando conteúdo sanguinolento e espumoso pelas narinas e indo à óbito em aproximadamente cinco minutos. Os ovinos GI1 e GI3 não manifestaram sinais clínicos até aproximadamente seis horas após a intoxicação. Ao serem movimentados para se alimentarem ambos os animais desenvolveram quadro súbito com queda brusca, convulsão, nistagmo e tremores intensos por todo o corpo. O ovino GI3 apresentou rigidez muscular,
permanecendo em decúbito com os membros em intensa extensão. Após a cessão dos tremores, ovino apresentou bradicardia, sem eliminação de conteúdo espumoso e sanguinolento, indo à morte. O ovino GI1 após o quadro súbito, resistiu aos sinais clínicos demonstrados, permanecendo com andar rígido, quedas repentinas, incoordenação, leves tremores musculares, com progressão para relutância à movimentação e permanência em estação, com respiração ofegante, eliminação de conteúdo espumoso e sanguinolento pelas narinas, desenvolvimento de queda e morte às 8 horas após a intoxicação. As Figuras 1 e 2 evidenciam alguns dos sinais clínicos apresentados pelos ovinos do grupo inoculação.
Figura 1 - Ovino do Grupo Inoculação com membros em base aberta demostrando incoordenação motora e com relutância à movimentação.
Figura 2 - Ovinos do Grupo Inoculação apresentando decúbito lateral e manutenção do apetite.
4.2.2. Grupo Controle
Dois ovinos não apresentaram sinais clínicos até três horas após o fornecimento de MFA. A ovelha GC1 desenvolveu jugular ingurgitada e pulso venoso positivo após primeira hora, permanecendo em estação, apática e com relutância a movimentação até a morte, após sete horas da intoxicação (fig. 3). Entre 3 a 7 horas, a frequência cardíaca gradativamente aumentou, variando entre 120 - 170 batimentos por minutos (bpm), com elevação até 235 bpm em período anterior à morte, quando a ovelha GC1 desenvolveu decúbito lateral e começou a eliminar conteúdo espumoso e sanguinolento pelas narinas. As ovelhas GC2 e GC3 iniciaram alterações de frequência cardíaca após três horas da inoculação. Após quatro horas, apresentaram leve relutância a movimentação, com respiração ofegante e por vezes, perda de equilíbrio. Sete horas após a intoxicação, com diferença de cinco minutos entre as manifestações das ovelhas
GC2 e GC3, elas desenvolveram queda repentina, permanecendo imóveis (fig.4), com progressão para decúbito lateral, que se intercalava com decúbito esterno-abdominal, até aproximadamente oito horas após a intoxicação, quando os animais apresentaram bradicardia e começaram a eliminar conteúdo espumoso sanguinolento pelas narinas com consequente morte. A frequência cardíaca variou entre 110-150 bpm em repouso e após os dez minutos de movimentação, entre 190-230 bpm, com elevação para 250-270 e posterior bradicardia no período anterior à morte.
Figura 3 - Ovino do Grupo Controle com apatia, permanecia em decúbito esternal e veia jugular ingurgitada.
Todos os ovinos do Grupo Controle e do Grupo Inoculação apresentaram sinais clínicos relacionados à intoxicação por monofluoroacetato de sódio. O desfecho clínico de todos foi a morte, sem recuperação clínica, sem manifestação de resistência.
As alterações clínicas e comportamentais apresentadas pelos ovinos inoculados por via ruminal por Enterococcus faecalis e intoxicados por monofluoroacetato de sódio estão descritos na tabela 1.
Tabela 1 - Alterações clínicas e comportamentais dos ovinos intoxicados por monofluoroacetato de sódio dos grupos controle e inoculação.
Ovinos
Sinais clínicos GC1 GC2 GC3 GI1 GI2 GI3
Apatia P P P P P P Taquicardia P P P P P P Arritmia A P A A A A Dispneia P P A A A A Jugular ingurgitada A A A P A A Pulso venoso A A A P A A Relutância em caminhar P P P P P P Tremores musculares P P P A P P Incoordenação P A A P P P Nistagmo A A A P P P Instabilidade P A A P P P Micção frequente P P P P P P Decúbito P P P P P P Convulsão A A A P P P Desfecho clínico M M M M M M
GC1 - ovino 1, Grupo controle; GC2 - Ovinos 2, Grupo controle; GC3 - Ovino 3, Grupo controle; GI1 - ovinos 1, Grupo inoculação; GI2 - ovino 2, Grupo inoculação; GI3 - Ovino 3, Grupo inoculação; P - Presente; A - Ausente; M - morte.
4.3. Achados de necropsia
As principais alterações observadas em todos os ovinos foram alterações ocasionais como o pulmão aumentado de volume, com petéquias, áreas de equimoses a áreas de extensa hemorragia nos lobos caudais direito e esquerdo (fig. 5), leve edema interlobular e ao corte, com áreas parenquimatosas moderadamente avermelhadas a vermelho enegrecidas. Foi observada ainda moderada quantidade de espuma rosada a avermelhada no interior da traqueia e brônquios. Nos rins,
observou-se petéquias multifocais distribuídas pela região cortical e medular. Com pequenas diferenças em relação à intensidade, todos os ovinos apresentaram hidrotórax.
Figura 5 - Pulmão com áreas de extensa hemorragia nos lobos diafragmáticos direito e esquerdo.
4.4. Achados histopatológicos
Os principais achados histológicos foram observados no pulmão com edema difuso e hemorragia alveolar multifocal moderada e no rim com tumefação e vacuolização (degeneração hidrópico-vacuolar) e cariopicnose em células epiteliais dos túbulos uriníferos contorcidos. Nos demais órgãos não foram observadas alterações histológicas significativas.
5. DISCUSSÃO
O desfecho clínico de todos os ovinos utilizados neste experimento sugere que as cepas de E. faecalis não foram eficazes no controle da intoxicação por monofluoroacetato de sódio nas condições em que foi realizado este experimento, utilizando uma única dose tóxica alta de MFA.
Todos os ovinos que morreram de ambos os grupos apresentaram achados clínicos similares, com pequena diferença entre os sistemas acometidos (cardiovascular e nervoso) e quanto a hora em que os sinais clínicos foram manifestados (1 – 4 horas). No Grupo Controle, a partir do momento que os sinais clínicos foram evidenciados, eles evoluíram continuamente, com sinais clínicos principalmente cardiovasculares, apresentando por vezes sinais nervosos, mas menos severos. No Grupo Inoculação, os animais não apresentaram os sinais leves comuns da intoxicação (ingurgitamento das veias jugulares, taquicardia, arritmia) por aproximadamente três horas, até serem observados em conjunto com os sinais nervosos abruptos: quedas bruscas, nistagmo, convulsão, tremores intensos e cegueira (Becker et al. 2013). Essa diferença entre os sistemas acometidos e a hora em que ocorre a manifestação dos sinais clínicos nos ovinos dos grupos Controle e Inoculação pode estar associada à presença das cepas de E. faecalis, já que no Grupo Controle, os animais, por não possuírem as cepas de E.
faecalis tiveram contato imediato com grande quantidade de MFA e manifestaram sinais
clínicos cardiovasculares, enquanto no Grupo Inoculação houve um período de três a quatro horas sem sinais clínicos, no qual as cepas de E. faecalis tentavam assimilar o MFA, mas sem serem capazes de efetivar a detoxificação, então permitindo que o MFA, em menor quantidade, posteriormente ficasse livre no organismo, levando a um quadro clínico mais tardio, principalmente neurológico.
Todos os ovinos de ambos os grupos apresentaram achados macroscópicos pulmonares pouco frequentes (petéquias, equimoses e sufusões nos lobos caudais direito e esquerdo, leve edema interlobular e áreas parenquimatosas moderadamente avermelhadas a vermelho enegrecidas na superfície de corte), que já foram descritos anteriormente em pequenos ruminantes após intoxicação por monofluoroacetato de
sódio em um surto na Califórnia, EUA, em 2011, relacionado a um pasto contaminado pelo composto químico 1080 (GIANNITTI et al. 2013). As alterações pulmonares observadas neste estudo e no caso descrito por Giannitti et al. (2013) estão relacionadas, principalmente, às alterações cardiovasculares decorrentes da intoxicação, como frequência cardíaca elevada. Os animais também apresentaram lesões renais de intensidade leve a moderada, com degeneração hidrópico-vacuolar dos túbulos uriníferos, compatível com a intoxicação por MFA em ovinos (PEIXOTO et al. 2010, NOGUEIRA et al. 2010, TOKARNIA et al. 2012). Não é uma alteração específica, mas é um importante achado diagnóstico em animais intoxicados por plantas que contém MFA (DÖBEREINER & TOKARNIA 1959, TOKARNIA & DÖBEREINER 1986, TOKARNIA et al. 1983, 2012, HELAYEL et al. 2009).
O isolamento de E. faecalis realizado por Pimentel (2011) e os testes positivos para defluoração e a identificação do gene fluoroacetato dehalogenase nas cepas EF09 (JQ661270.1) e EF08 (JQ661271.1) nos permitiu considerar que as cepas de E.
faecalis utilizadas neste experimento são capazes de assimilar o MFA, expressar o
gene fluoroacetato dehalogenase (GREGG et al., 1994, PIMENTEL, 2011) e prevenir a intoxicação por monofluoroacetato de sódio in vitro (FETZNER & LINGENS, 1994, Gregg et al. 1994, Liu et al. 1998, Pimentel 2011). No entanto, os resultados deste estudo demonstraram que as cepas de Enterococcus faecalis apresentaram um comportamento em ambiente ruminal diferente do demonstrado em ambiente in vitro. No ambiente in vitro, as cepas de E. faecalis são eficazes pois o MFA é a única fonte de carbono que as cepas utilizam para se manter viáveis, por isso, elas utilizam sua energia para expressar o gene fluoroacetato dehalogenase e degradar o MFA (Pimentel 2011), o que permite a liberação de fluoretos e glicolato que são utilizados como substrato para a manutenção dos microrganismos (CAMBOIM et al. 2012a, 2012b). No ambiente ruminal, a quantidade de MFA fornecida é maior do que os microrganismos são capazes de assimilar, dessa forma, as cepas de E. faecalis ou degradam uma pequena quantidade de MFA ou degradam outros compostos, já que são disponíveis diversas fontes de carbono no rúmen, como os cloroacetatos, bromoacetatos e iodoacetatos (DONNELLY & MURPHY, 2007, LIU et al. 1998, KURIHARA et al. 2003) e como as cepas de E. faecalis podem expressar genes como L-2-holoácido
dehalogenase, Dl-2-haloácido dehalogenase e Haloálcool dehalogenase, que são capazes de dissociar as ligações entre o carbono e outros compostos halogenados (KEUNING et al., 1985, LIU et al., 1994), as cepas de E. faecalis podem acabar por preferi-los, e essa preferência se dá exatamente pela ligação mais frágil com o carbono que esses compostos apresentam (GREGG et al., 1998).
Os resultados sugerem que essas bactérias são capazes de expressar o gene fluoroacetato dehalogenase e degradar o monofluoroacetato de sódio, porem somente quando essas cepas de E. faecalis entram em contato com doses baixas (não letais) de plantas que contém MFA, o que permitiria às cepas assimilarem adequadamente o MFA, se multiplicarem e degradarem o MFA presente no rúmen (SILVA et al. 2008, PIMENTEL 2011, DUARTE et al. 2014).
Conclui-se que a inoculação ruminal de E. faecalis em ovinos que nunca tiveram contato com plantas que contém MFA não seja efetiva no controle da intoxicação por monofluoroacetato de sódio. Adicionalmente, sugere-se que os animais necessitem receber pequenas doses de MFA para que os microrganismos sejam capazes de assimilar o MFA e então detoxificá-lo eficientemente. Além disso, os métodos de resistência já desenvolvidos atualmente como consumo de doses baixas de MFA e a transfaunação ruminal são medidas mais efetivas no controle à intoxicação por monofluoroacetato de sódio.
6. CONCLUSÃO
Baseado nas evidências observadas neste estudo:
- A inoculação ruminal de Enterococcus faecalis não é efetiva no controle da intoxicação por monofluoroacetato de sódio em ovinos.
Sugere-se que métodos de controle já desenvolvidos como consumo de doses baixas de plantas que contém MFA e a transfaunação de conteúdo ruminal ainda são medidas de controle mais efetivas na prevenção à intoxicação por MFA de sódio. Além disso, mais estudos relacionados às características ecológicas dos microrganismos ruminais degradadores de MFA, visando o esclarecimento do comportamento diverso apresentado por esses microrganismos em ambientes in vitro e ruminal devem ser realizados.
7. REFERÊNCIAS
ANDERSON, W.R. Eight segregates from the neotropical genus Mascagnia (Malpighiaceae). Novon 16 (2):168-204, 2006.
BARBOSA, R.R.; PACÍFICO DA SILVA, I.; SOTO-BLANCO, B. Development of conditioned taste aversion to Mascagnia rigida in goats. Pesquisa Veterinária Brasileira 28(12):571-574, 2008.
BEASLEY, M. Guidelines for the Safe Use of Sodium Fluoroacetate (1080). Occupational Safety and Health Service. New Zealand. 20p, 2002.
BECKER, M.; CALDEIRA, F.H.B.; CARNEIRO, F.M.; OLIVEIRA, L.P.; TOKARNIA, C.H.; RIET-CORREA, F.; LEE, S.T.; COLODEL, E.M. Importância da intoxicação por Amorimia pubiflora (Malpighiaceae) em bovinos em Mato Grosso: reprodução experimental da intoxicação em ovinos e bovinos. Pesquisa Veterinária Brasileira 33(9):1049-1056, 2013.
BRANDÃO, L. N. S.; PITCHENIN, L. C.; PIMENTEL, M. F. A.; ROCHA, I. S. M.; UBIALI, D. G.; REIS, I. H. V.; COLODEL, E. M.; DUTRA, V.; NAKAZATO, L. Caracterização de bactérias ruminais resistentes a monofluoroacetato de sódio. Resumo. Microbiologia Industrial e Biotecnologia. AP 02/10: 319. 27º Congresso Brasileiro de Microbiologia, 2013.
CAMBOIM, E.K.A.; ALMEIDA, A.P.; TADRA-SFEIR, M.Z.; JUNIOR, F.G.; ANDRADE, P.P.; MCSWEENEY, C.S.; RIET-CORREA, F.; MELO, M.A. Isolation of sodium fluoroacetate degrading bacteria from caprine rumen in Brazil. The Scientific World Journal. Article ID 178254, 6 pages. doi:10.1100/2012/178254.10. 2012a.
CAMBOIM, E.K.A.; TADRA-SFEIR, M.Z.; SOUZA, E.M.; PEDROSA, F.O.; ANDRADE, P.P.; MCSWEENEY, C.S.; RIET-CORREA, F.; MELO, M.A. Defluorination of sodium fluoroacetate by bacteria from soil and plants in Brazil. The Scientific World Journal. Article ID 149893, 5 pages. doi:10.1100/2012/149893. 2012b.
CHEEK, P.R. Natural Toxicants in Feeds, Forages, and Poisonous Plants, 2nd edn. Interstate Publishers: Illinois. 1998.
CHENOWETH, M.B. Monofluoroacetic acid and related compounds. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 97: 383–424. 1949.
CHENOWETH, M.B., GILMAN A. Studies on the pharmacology of fluoroacetate. 1. Species response to fluoroacetate. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 87: 90–103. 1946.
CLARKE, D.D. Fluoroacetate and fluorocitrate: Mechanism of action. Neurochemical Research 16(9):1055–1058, 1991.
COOPER, C.; SCHAFER, D.J.; GREGG, K. Use of engineered rumen bacteria to degrade fluoroacetate. Recent Advances in Animal Nutrition in Australia. University of New England, Armidale, Australia, 104-107, 1995.
COUCEIRO, J.E.M.; SILVA, A.C.C.; SILVA, J.A. Observações e ensaios sobre a alegada intoxicação de bovinos por plantas, no Estado de Pernambuco. Resumo em Anais XV Congresso Brasileiro de Medicina Veterinária, Rio de Janeiro, 1976.
CRAIG, A.M. & BLYTHE, L.L. Review of ruminal microbes relative to detoxification of plant toxins and environmental pollutants. In: Plant Associated Toxins, Colegate, S.M., Dorling, P.R. (eds.) CAB International: Willingford; 462–467. 1994.
DAVIS, C.K.; WEBB, R.I.; SLY, L.L.; DENMAN, S.E.; MCSWEENEY, C.S. Isolation and survey of novel fluoroacetate-degrading bacteria belonging to the phylum
synergistetes. FEMS Microbioly Ecology 80:671-684, 2012.
DÖBEREINER J. & TOKARNIA C.H. Intoxicação de bovinos pela "erva de rato" (Palicourea marcgravii St. Hil.) no vale do Itapicuru, Maranhão. Arquivos do Instituto Biológico e Animal, Rio de Janeiro 2:83-91, 1959.
DÖBEREINER, J.; TOKARNIA, C.H.; SILVA, M.F. Intoxicação por Arrabidaea
bilabiata (Bignoniaceae) em bovinos na Região Amazônica do Brasil. Pesquisa
Veterinária Brasileira 3(1):17-24, 1983.
DONNELLY, C.; MURPHY, C. D. Purification and properties of fluoroacetate dehalogenase from Pseudomonas fluorescens DSM 8341. Biotechnology Letters 31(2): 245–250, 2009.
DUARTE, A.L.L.; MEDEIROS, R.M.T.; CARVALHO, F.K.L.; LEE, S.T.; COOK, D.; PFISTER, J.A.; COSTA, V.M.M.; RIET-CORREA, F. 2014. Induction and transfer of resistance to poisoning by Amorimia (Mascagnia) septentrionalis in goats. Journal of Applied Toxicology 34(2):220-223, 2014.
EGEKEZE, J.O.; OEHME, F.W. 1979. Sodium monofluoroacetate (SMFA, Compound 1080): a literature review. Veterinary and Human Toxicology 21: 411–416, 1979.
EGYED, M. N. Clinical, pathological, diagnostic and therapeutic aspects of fluoroacetate research in animals. Fluoride 6: 215–223. 1973.
EGYED, M., SHUPE J. Experimental acute fluoroacetamide poisoning in sheep and dogs. I. Symptomatology and pathology. Fluoride 4: 129–136. 1971.
FERNANDES, N.S.; MACRUZ, R. Toxicidade da corona - Mascagnia pubiflora (Juss.) Griseb. (Malpighiaceae). Arquivos do Instituto Biológico, São Paulo, 31(1):1-4, 1964.
FETZNER, S.; LINGENS, F. Bacterial Dehalogenases: Biochemistry, Genetics, and Biotechnological Applications. Microbiological Reviews 58(4): 641-685, 1994.
GIANNITTI, F.; ANDERSON, M.; CASPE, S.G.; METE, A.; EAST, N.E.; MOSTROM, M.; POPPENGA, R. An outbreak of sodium fluoroacetate (1080) intoxication in selenium- and copper-deficient Sheep in California. Veterinary Pathology 50(6):1022-7. 2013.
GAVA, A.; CRISTANI, J.; BRANCO, J.V. et al. Mortes súbitas em bovinos causadas pela ingestão de Mascagnia sp. (Malpighiaceae) no Estado de Santa Catarina. Pesquisa Veterinária Brasileira 18: 16-20, 1998.
GOLDAMN, P. The Carbon-Fluorine Bond in Compounds of Biological Interest. Science 6(164): 1123-1130, 1969.
GREGG, K.; COOPER, C. L.; SCHAFER, D. J.; SHARPE, H.; BEARD, C. E.; ALLEN, G.; XU, J. Detoxification of the plant toxin fluoroacetate by a genetically modified rumen bacterium. Biotechnology (N Y) 12, 1361–1365, 1994.
GREGG, K.; HAMDORF, B.; HENDERSON, K.; KOPECNY, J.; WONG, C. 1998. Genetically modified ruminal bacteria protect sheep from fluoroacetate poisoning. Applied and Environmental Microbiology 64: 3496–3498, 1998.
GRIBBLE, G.W. Fluoroacetate toxicity. Journal of Chemical Education 50:460-463, 1973.
HELAYEL, M.A.; FRANÇA, T.N.; SEIXAS, J.N.; NOGUEIRA, V.A.; CALDAS, S.A.; PEIXOTO, P.V. Morte súbita em bovinos causada pela ingestão de
Pseudocalymma elegans (Bignoniacea) no município de Rio Bonito, RJ. Pesquisa
Veterinária Brasileira 29(7):498-508, 2009.
HUDSON, J. A.; MACKENZIE, C.A.; JOBLIN, K. N. Factors affecting the formation of 10-hydroxystearic acid from oleic acid by a ruminal strain of Enterococcus faecalis. Applied Microbiology and Biotechnology 45: 404-407, 1996.
KAWASAKI, H.; MIYOSHI, K.; TONOMURA, K. Purification, crystallization and properties of haloacetate halidohydrolase from Pseudomonas species. Agricultural and Biological Chemistry 45:543–544, 1981.
KEUNING, S.; JANSSEN, D. B.; WITHOLT, B. Purification and characterization of hydrolytic haloalkane dehalogenase from Xanthobacter autotrophicus GJ10. Journal of Bacteriology 163 (2):635-639. 1985.
KREBS, H.C.; KEMMERLING, W.; HABERMEHL, G. Qualitative and quanti-tative determination of fluoroacetic acid in Arrabidaea bilabiata and Palicourea marcgravii by F-19-NMR Spectroscopy. Toxicon 32 (6):909-913, 1994.
KURIHARA, T.; YAMAUCHI, T.; ICHIYAMA, S.; TAKAHATA, H.; ESAKI, N. Purification, characterization, and gene cloning of a novel fluoroacetate dehalogenase from Burkholderia sp. FA1. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 23, 347-355, 2003.
LEONG, L.E.X.; DENMAN, S.E.; DAVIS, C.K.; HUBER, T.; MCSWEENEY, C.S. Peptide utilization of the novel fluoracetate-degrading ruminal bacterium. Proceedings of the Australian Society of Animal Production 28: 64, 2010.
LIU, J.Q.; KURIHARA, T.; MIYAGI, M.; ESKAI N.; SODA, K. Reaction mechanism of fluoroacetate dehalogenase from Moraxella sp. B. The Journal of Biological Chemistry 273:30897–30902, 1998.
LIU, J.Q.; KURIHARA, T.; HASAN, A.K.; NARDI-DEI, V.; KOSHIKAWA, H.; ESAKI, N.; SODA, K. Purification and characterization of thermostable and nonthermostable 2-haloacid dehalogenases with different stereospecificities from Pseudomonas sp. strain YL. Applied and Environmental Microbiology 60(7): 2389– 2393, 1994.
MELO, S.; AZEVEDO, J. L. Como isolar microrganismos degradadores de moléculas xenobióticas. In: Microbiologia Ambiental, I. S. Melo and L. J. Azevedo, Eds., pp. 167–183, EMBRAPA-CNPMA, Jaguariúna, Brasil, 1997.
MELLO, E.M.M.; FERNANDES, J.S. Contribuição ao estudo de plantas tóxicas brasileiras. Serviço de Informação Agrícola, Ministério da Agricultura, Rio de Janeiro, 1941.
MORAES-MOREAU, R.L.; HARAGUCHI, M.; MORITA, H.; PALERMO-NETO, J. Chemical and biological demonstration of the presence of monofluoroacetate in the leaves of Palicourea marcgravii St. Hil. Brazilian Journal Of Medical and Biological Research 28: 658–692, 1995.
OLIVEIRA, M.D.; RIET-CORREA, F.; CARVALHO, F.K.; SILVA, G.B.; PEREIRA, W.S.; MEDEIROS, R.M.T. Indução de resistência à intoxicação por Palicourea
aeneofusca (Rubiaceae) mediante administração de doses sucessivas não tóxicas.
Pesquisa Veterinária Brasileira 33(6):731-734, 2013.
OLIVEIRA, M.M. Chromatographic isolation of monofluoroacetic acid from Palicourea marcgravii St. Hil. Experientia 19, 586–587, 1963.
PIMENTEL, M. F. A. Isolamento e identificação de microrganismo resistente ao fluoroacetato de sódio. Dissertação de Mestrado, Programa de Pós-graduação em Ciências veterinárias, Faculdade de Agronomia, Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Federal de Mato Grosso, Cuiabá. 42p, 2011.
PROUDFOOT, A.T.; BRADBERRY, S.M.; VALE, J.A. Sodium fluoroacetate poisoning. Toxicological Reviews 25(4):213–219, 2006.
RIET-CORREA, F.; MEDEIROS, R.M.T. Intoxicações por plantas em ruminantes no Brasil e no Uruguai: importância econômica, controle e riscos para a saúde pública. Pesquisa Veterinária Brasileira 21:38-42, 2001.
SANTOS, H.L. Aspectos clínicos, laboratoriais e anatomo-histopatológicos na intoxicação experimental de bovinos pela Mascagnia rigida Gr. Tese de Mestrado, Esc. Vet. UFMG, Belo Horizonte. 36 p. Resumo em Arquivos da Escola de Veterinária, UFMG, Belo Horizonte, 27(3):398-399, 1975
SILVA, I.P.; LIRA, R.A.; BARBOSA, R.R.; BATISTA, J.S. & SOTO-BLANCO, B. Intoxicação natural pelas folhas de Mascagnia rigida (Malpighiaceae) em ovinos. Arquivos do Instituto Biológico de São Paulo 75(2):229-233. 2008.
SHERLEY, M. The traditional categories of fluoroacetate poisoning signs and symptoms belie substantial underlying similarities. Toxicology Letters 151: 399–406. 2004.
SOARES, M.P.; PAVARINI, S.P.; ADRIEN, M.L.; QUEVEDO, P.S.; SCHILD, A.L.; PEIXOTO, P.V.; CRUZ, C.E.F.; DRIEMEIER, D. Amorimia exotropica poisoning as a presumptive cause of myocardial fibrosis in cattle. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation 23:1226-1229, 2011.
TOKARNIA, C.H.; BRITO, M.F.; BARBOSA, J.D.; PEIXOTO, P.V.; DÖBEREINER, J. Plantas que causam “morte súbita” (intoxicação de evolução superaguda, sem alterações cardíacas morfológicas significativas). p.29-71. In: Ibid. (Eds), Plantas Tóxicas do Brasil para animais de produção. 2 ed. Editora Helianthus, Rio de Janeiro, 2012.
TOKARNIA, C.H; DÖBEREINER, J. Intoxicação por Arrabidaea japurensis (Bignoniaceae) em bovinos em Roraima. Pesquisa Veterinária Brasileira 1 (1), p.7-17, 1981.
TOKARNIA, C.H.; DÖBEREINER, J. Intoxicação por Mascagnia pubiflora em bovinos no Estado de Mato Grosso. Pesquisa Agropecuária Brasileira 8: 61-68, 1973.
TOKARNIA, C.H.; DÖBEREINER, J.; CANELLA, C.F.C. Intoxicação por um “tingui” (Mascagnia rigida Griseb) em bovinos no Nordeste do Brasil. Arquivo do Instituto de Biologia Animal 4: 203-215, 1961.
TOKARNIA, C.H.; DÖBEREINER, J.; CANELLA, C.F.C.; GUIMARÃES, D.J. Intoxicação experimental por Pseudocalymma elegans (Vell.) Kuhlm. em bovinos. Pesquisa Agropecuária Brasileira 4: 195-204, 1969.
TOKARNIA, C.H.; DÖBEREINER, J.; SILVA, M.F. Intoxicação por palicourea
grandiflora (Rubiaceae) em bovinos no Território de Rondônia. Pesquisa Agropecuária
Brasileira 1 (3):85-94, 1981.
TOKARNIA C.H. & DÖBEREINER J. Intoxicação por Palicourea
marcgravii (Rubiaceae) em bovinos no Brasil. Pesquisa Veterinária Brasileira
6(3):73-92, 1986.
TOKARNIA C.H., DÖBEREINER J., COUCEIRO J.E.M. & SILVA A.C.C. Intoxicação por Palicourea aeneofusca(Rubiaceae), a causa de mortes súbitas em
bovinos na Zona da Mata Pernambucana. Pesquisa Veterinária Brasileira 3(3):75-79, 1983.
TWIGG, L.E.; SOCHA, L.V. Defluorination of sodium monofluoroacetate by soil microorganisms from central Australia. Soil Biology & Biochemestry 33:227-234, 2001.
YUEN, G.J.; AUSUBEL, F.M. Enterococcus infection biology: lessons from invertebrate host models. Journal of Microbiology 52(3):200-210. 2014.
APÊNDICE A – ARTIGO CIENTÍFICO
Trabalho...
Inoculação ruminal de Enterococcus faecalis não demostra capacidade de indução de resistência ao consumo de monofluoroacetato de sódio em ovinos1.
Geovanny B. G. Dias2, Kalinne S. Bezerra2, Laila N. S. Brandão2, Maria F. A. Pimentel2, Luciano Nakazato2,
Franklin Riet-Correa3, Edson M. Colodel2, Nadia A. B. Antoniassi4*
ABSTRACT.- Dias G.B.G., Bezerra K.S., Brandão L.N.S., Pimentel M.F.A., Nakazato L., Riet- Correa F., Colodel E.M. & Antoniassi N.A.B. 2014. [Ruminal inoculation of Enterococcus faecalis does not demonstrate the induction of resistance capacity to the consumption of sodium monofluoroacetate in sheep] Inoculação ruminal de Enterococcus faecalis não demostra capacidade de indução de resistência ao consumo de monofluoroacetato de sódio em ovinos. Pesquisa Veterinária Brasileira 00(0):00-00. Laboratório de Patologia Veterinária, Departamento de Clínica Médica Veterinária, Faculdade de Agronomia, Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Federal de Mato Grosso, Av. Fernando Corrêa da Costa 2367, Boa Esperança, Cuiabá, MT 78068-900, Brasil. E-mail: naassi@gmail.com.
Seven plants in Brazil contain sodium fluoroacetate (MFA) as toxic principle. The mode of action of MFA is based on the blocking of the citric acid cycle and consequent accumulation of citrate in the tissues, which during movement triggers the clinical signs and consequently leads to the sudden death in ruminants. The resistance can be occurs through increase of microorganisms that degrade MFA in rumen. These microorganisms in an environment containing high concentration of MFA, express a fluoroacetate dehalogenase gene, which decouples the strong carbon - fluorine bond. For this research, colonies of E. faecalis were isolated from bovine rumen, submitted to defluorination test and inoculated in sheep that never had contact with plants containing MFA. The strains of E. faecalis EF09, JQ661270.1 and E. faecalis EF08, JQ661271.1 were selected. Six sheep with a mean age of 2 years between 35-40 kg were divided into two groups of 3 animals each. The clinical signs and data from heart and respiratory rate were obtained every 1 hour. All sheep from the two groups died between 3 – 8 hours after intoxication. After all the accompany trial, the resistance it was not observed in sheep inoculated with E. faecalis, result that demonstrate E. faecalis is not able to prevent MFA poisoning in sheep.
INDEX TERMS: Amorimia sp., defluorination, fluoroacetate dehalogenase, sudden death, resistance.
RESUMO.- Do grupo das plantas que causa morte súbita em animais de interesse pecuário no Brasil, sete delas contém monofluoroacetato de sódio (MFA) como princípio tóxico. MFA causa bloqueio do ciclo de Krebs e consequente acúmulo de citrato nos tecidos. A morte ocorre após evolução clínica superaguda e é frequentemente precipitada pela movimentação. Uma das alternativas preconizadas para prevenção da intoxicação é através da ingestão de doses não tóxicas de plantas que contém MFA aventando-se a possibilidade de aumento da resistência ao consumo de MFA. Sugere-se que a resistência ocorra devido à multiplicação de microrganismos que expressam o gene fluoroacetato dehalogenase e degradam o MFA no rúmen. Este estudo teve por objetivo verificar se E. faecalis EF09, sequência parcial JQ661270.1 e E. faecalis EF08, sequência parcial JQ661271.1, isoladas do rúmen de bovinos, expressoras do gene fluoroacetato dehalogenase degradam MFA in vivo e podem ser usadas para detoxificação preventiva de plantas que contém MFA. Seis ovinos com idade média de 2 anos, fêmeas, entre 35-40 kg, de raça Santa Inês, foram divididos em
1 Recebido em... Aceito para publicação em...
2 Departamento de Clínica Médica Veterinária, Faculdade de Agronomia, Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Federal de Mato Grosso, Av. Fernando Corrêa da Costa 2367, Boa Esperança, Cuiabá, MT, CEP 78068-900, Brasil.
3Hospital Veterinário, Centro de Saúde e Tecnologia Rural (CSTR), Campus de Patos da Universidade Federal de Campina Grande (UFCG), Patos, PB 58700-000, Brasil.
4 Instituto de Ciências da Saúde, Universidade Federal de Mato Grosso, Campus Sinop, Avenida Alexandre Ferronato, 1.200, Bairro Setor Industrial, CEP 78557-287. *Autor para correspondência: naassi@gmail.com
dois grupos com 3 animais cada. O Grupo Inoculação recebeu durante 3 dias seguidos 10ml/dia do inóculo de
E. faecalis. O Grupo Controle recebeu água destilada durante o mesmo período. Os animais de ambos os
grupos foram mantidos em descanso por 48 horas e após esse período, o MFA foi fornecido em uma dose de 1,5 mg/Kg/PV por via oral para todos os ovinos. Os sinais clínicos e os dados de frequência cardíaca e respiratória foram obtidos em repouso a cada 1 hora, e após 10 minutos de movimentação decorridas seis horas da intoxicação. Todos os animais de ambos os grupos morreram entre 3 – 8 horas após o fornecimento de MFA. Os resultados indicam que os ovinos inoculados com E. faecalis não desenvolveram resistência à intoxicação por monofluoroacetato de sódio.
TERMOS DE INDEXAÇÃO: Amorimia sp., defluoração, fluoroacetato dehalogenase, morte súbita, resistência. INTRODUÇÃO
Atualmente, no Brasil, existem treze plantas que causam morte súbita associada a esforço físico em ruminantes. Essas plantas pertencem a três famílias botânicas distintas. A família Rubiaceae, que contém
Palicourea juruana (Tokarnia & Döbereiner 1982), P. grandiflora (Tokarnia, Döbereiner, Silva 1981), P. aeneofusca (Tokarnia et al. 1983) e P. marcgravii (Tokarnia & Döbereiner 1986). A família Malpighiaceae, que
contém Amorimia rigida (Cunha et al. 2012, Lee et al. 2012), A. pubiflora (Lee et al. 2012, Becker et al. 2013),
M. elegans (Couceiro, Silva & Silva 1976) e A. exotropica (Pavarini et al. 2011), além das Malpighiaceae
recentemente identificadas: Amorimia sepium (Schons et al. 2011), A. septentrionalis (Lee et al. 2012, Duarte et al. 2014). E a família Bignoniaceae, que contém Pseudocalymma elegans (Tokarnia et al. 1969), Tanaecium
bilabiatum (Arrabidaea bilabiata) (Döbereiner, Tokarnia & Silva 1983, Krebs et al. 1994) e A. japurensis
(Tokarnia & Döbereiner 1981).
O monofluoroacetato de sódio (MFA) foi caracterizado como princípio tóxico em sete dessas plantas:
Palicourea. marcgravii (Oliveira, 1963), P. aenofusca (Lee et al. 2012), Amorimia rigida (Cunha et al. 2012, Lee
et al. 2012), A. septentrionalis (Lee et al. 2012), A. pubiflora (Lee et al. 2012), Tanaecium bilabiatum (Krebs et al. 1994) Pseudocalymma. elegans (Helayel et al. 2011), sendo também descrito em plantas tóxicas da Austrália (Oxylobium spp., Acacia georginae e Gastrolobium spp.) e África do Sul (Dichapetalum toxicarium e D.
cymosum) (Cheek 1998). O MFA é um derivado do ácido monofluoroacético (Craig & Blythe 1994), um
composto químico não volátil, insolúvel em álcool, acetona e óleos vegetais, mas solúvel em água (Egekeze & Oehme 1979). É quimicamente estável à luz solar e à temperatura de 54ºC (Gribble 1973), apresentando-se sob a fórmula molecular de CH2FCOONa (Beasley 2002).
O mecanismo de intoxicação do MFA é relacionado com a formação de fluorocitrato no ciclo de Krebs, que bloqueia competitivamente a aconitase e o succinato desidrogenase e impede a conversão de citrato em isocitrato, resultando no acúmulo de citrato em vários tecidos e no plasma (Clarke 1991, Proudfoot, Bradberry & Vale 2006), o que leva manifestação dos sinais clínicos característicos da intoxicação: taquicardia, arritmia cardíaca, ingurgitamento das jugulares, apatia, relutância a movimentação, tremores musculares, incoordenação motora, dismetria, respiração ofegante, micção frequente, nistagmo, opistótono, instabilidade, decúbito esternal, decúbito lateral, convulsão e morte (Tokarnia et al. 2012; Becker et al. 2013).
Medidas de controle como uso de cercas, herbicidas ou outros métodos de eliminação das plantas não foram satisfatórios para diminuir as perdas econômicas à pecuária no Brasil (Riet-Correa & Medeiros 2001). Há alguns estudos promissores, utilizando a aversão ao consumo (Barbosa, Silva & Soto-Blanco. 2008), a indução de resistência à intoxicação em ruminantes através da ingestão repetida de doses não tóxicas (Oliveira et al. 2013, Becker et al. 2013, Duarte et al. 2014) e o uso de bactérias, do solo e da microbiota ruminal, que degradam monofluoroacetato de sódio (Camboim et al. 2012a, Camboim et al. 2012b). Becker et al. (2013) e Duarte et al. (2014) comprovaram que a ingestão repetida de doses não tóxicas de plantas que contém MFA é capaz de induzir à resistência à intoxicação e essa resistência pode ser transferida para outros animais que nunca tiveram contato com plantas que contém MFA através da transfaunação de conteúdo ruminal. Cooper, Schafer & Gregg (1995) e Gregg et al. (1994, 1998) desenvolveram um método que utiliza a inoculação ruminal de cepas de Butyrivibrio fibrisolvens modificadas geneticamente para receber a enzima fluoroacetato dehalogenase proveniente de Moraxella sp., tornando então as cepas de Butyrivibrio fibrisolvens capazes de degradar o monofluoroacetato de sódio.
Fluoroacetato dehalogenase é uma enzima que degrada a forte ligação entre os átomos de carbono com o flúor (Kawasaki, Miyoshi & Tonomura 1981, Kurihara et al. 2003, Fetzner & Lingens 1994). É um gene expresso por microrganismos na presença de monofluoroacetato de sódio, uma atividade específica,
