SELEÇÃO DE BACTÉRIAS DA CAATINGA PRODUTORAS DE CMCASE E L-ASPARAGINASE

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SELEÇÃO DE BACTÉRIAS DA CAATINGA PRODUTORAS DE CMCASE E L-ASPARAGINASE

Silva, I. L.(1); Silva, W. O.(1); Oliveira, T. G. L.(1); Nascimento, D. C.(1); Silva, J. F.(2); Silva, L. A. O.(3) iasmim.lusi@gmail.com

(1)_{Universidade de Pernambuco – UPE, Recife - PE, Brasil;} (2)_{Faculdade Frassinetti do Recife – FAFIRE, Recife - PE, Brasil;}

(3)_{Departamento de Antibióticos, Universidade Federal de Pernambuco – UFPE,}

Recife - PE, Brasil / Universidade Federal de Amazonas – UFAM, Manaus - AM, Brasil.

RESUMO

Na rizosfera, observa-se uma intensa atividade microbiana, em razão da presença de exsudatos e secreções radiculares que representam as maiores fontes de carbono prontamente disponíveis para os microrganismos. O objetivo deste trabalho foi isolar micro-organismos da rizosfera da Catingueria e quantificar a atividade enzimática dos isolados produtores de enzimas, CMCase e L-asparaginase, produzidas por meio da fermentação líquidas. As condições tempo de fermentação foram determinadas em função da resposta da atividade enzimática de fermentação (24, 48, 72, 96 e 120 horas). As mesmas foram realizadas sobre agitação de 120 rpm a 37ºC. Os resultados demonstram que a maior produção para a CMCase pela bactéria M5 foi de 0,1228 U/mg em 48 horas de fermentação, enquanto que para a L-asparaginase a atividade máxima ocorreu em 24horas para a bactéria I5 com 3476,09 U/mg e 72horas para a I4 com 1487,93 U/mg de fermentação. Com os dados obtidos neste estudo, evidenciou-se a importância sobre a microbiota dos diferentes ecossistemas. Mostrando a necessidade da realização de experimentos quanto à produção e caracterização das referidas enzimas excretadas por bactérias isoladas da rizosfera da Catingueira.

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Resumos Expandidos do I CONICBIO / II CONABIO / VI SIMCBIO (v.2) Universidade Católica de Pernambuco - Recife - PE - Brasil - 11 a 14 de novembro de 2013

2 INTRODUÇÃO

Com o desenvolvimento de processos biotecnológicos indo de encontros com as normas de políticas ambientais, necessitando assim de substituição dos processos químicos convencionais por processos enzimáticos a fim de aprimorar a tecnologia atual. Passou-se a utilizar as enzimas, estas são canalizadores orgânicos responsáveis por reações químicas envolvidas em processos biológicos dos sistemas e apresentam ampla utilidade na indústria farmacêutica, alimentícias e energéticas. As enzimas podem ser encontradas no solo na forma livre, excretadas por células vivas (exoenzimas), liberadas por células que se rompem (endoenzimas) e enzimas ligadas a constituintes celulares (SILVA et al., 2012). Dentre as enzimas, a Celulases e a L-asparaginases, tem apresentado significativa importância biotecnológica.

As Celulases são biocatalisadores altamente específicos que atuam em sinergia para a liberação de açúcares, dos quais glicose é o que desperta maior interesse industrial, devido à possibilidade de sua conversão em etanol. A classificação das celulases, de acordo com seu local de atuação no substrato celulósico, as divide em três grandes grupos: endoglucanases (EnG), que clivam ligações internas da fibra celulósica; exoglucanases (ExG), que atuam na região externa da celulose; e

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-3 glicosidases (BG), que hidrolisam oligossacarídeos solúveis em glicose (CASTRO; PEREIRA JR, 2010). A L-asparaginase (L-asparagina aminohidrolase), é a enzima que converte a asparagina em ácido L-aspártico e amônia, a qual tem sido usada como um agente quimioterapêutico. O manejo clínico desta enzima é atribuído à redução de L-asparagina, impossibilitando as células tumorais de sintetizar este aminoácido e consequentemente morte destas células. (AMENA, 2010). Com base na especificidade do substrato, L-amidohidrolases bacterianas podem ser divididas em duas grandes classes. A primeira classe, representada pelas asparaginases que utilizam primariamente L-asparagina como substrato. E a segunda classe, também chamada de gutaminase-asparaginases, catalisam a hidrólise de asparagina e L-glutamina. (AGHAIYPOUR et al., 2001).

Verificando-se crescentes estudos de bactérias isoladas da rizosfera do Bioma da Caatinga produtoras de enzimas com diferentes aplicações, o presente trabalho objetivou isolar bactérias da rizosfera com base na amostra de solo coletada da rizosfera da Catingueira no período de inverno, cedida para experimentos pelo Departamento de Antibióticos da Universidade de Pernambuco (UFPE), avaliando qualitativamente e quantitativamente os isolados quanto à capacidade de produzir enzimas extracelulares, celulases e L- asparaginase, analisando-as a partir da produção destas em fermentação líquida.

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4 MATERIAL E MÉTODOS

Amostra da rizosfera da Catingueira no período de inverno serviu de base para o isolamento bacteriano. A amostra foi preparada e diluída em soluções salinas de NaCl a 0,9% (p/v) esterilizadas, nas concentrações 10-3, 10-4 e 10-5, inoculadas em triplicata nos meios específicos para crescimento bacteriológico (Tryptic Soy Agar e Ágar Nutritivo), purificadas e preservadas em óleo mineral (KING et al., 1954). Para avaliar a capacidade das referidas bactérias em degradar a celulose, estas foram inoculadas em meio sólido contendo sais e Carboximetilcelulose (1%) como fonte de carbono, posteriormente foram incubadas a 370C por 24 e/ou 48 horas, e avaliadas quanto à capacidade de degradar a celulose após a revelação com a solução de vermelho congo 5% (QUEIROZ et al., 2002). A Triagem das bactérias produtoras de L-asparaginase foi desenvolvida utilizando o meio M-9 modificado contendo L-asparagina a 1% e vermelho de fenol como indicador (GULATI et al., 1997).

Após selecionar as melhores bactérias produtora do complexo celulolítico e produtoras de L-asparaginase, foram realizadas cinéticas enzimáticas para avaliar o melhor tempo de produção dos complexos enzimáticos, utilizando carboximetilcelulose como substrato indutor para Celulases e L-asparagina como substrato indutor L- Asparaginase, em fermentações submersas nos seus respectivos meios de seleção. Na

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5 pré-fermentação foi inoculada alçadas da colônia cultivada (ERNANDES et al., 2003), em meio de crescimento caldo Muller Hington e incubadas sob agitação de 120 rpm por 24h. As fermentações realizadas em triplicada utilizando frascos de Erlenmeyer de 250 mL, com 50 mL dos meios CMC 2% e M-9, os meios foram esterilizados por 15 min, a 121ºC, resfriados e inoculados com o pré-inóculo em uma proporção de 10% (v/v) (MEIRA, 2007). Em seguida os foram frascos incubados sob agitação de 120 rpm por até 120 horas a 37ºC. Alíquotas de 1 mL foram retiradas a cada 24 horas. Posteriormente, as amostras foram centrifugadas e os sobrenadantes foram submetidos à quantificação enzimática e proteica (BARROS et al., 2002).

A atividade da enzima CMCase, foi realizada pela dosagem dos açúcares redutores totais produzidos pela degradação de carboximetilcelulose (CMC) utilizando-se CMC a 1% tamponado em Acetato de sódio a 50mM de pH 5,6, incubados a 50ºC durante 30 min utilizando-se o banho seco, após essa reação ocorreu a adição de 100 L de Ácido Dinitrosalicílico depois incubado por 5 min numa temperatura de 100ºC. Completado esse processo retira-se a amostra do banho maria e completa com 750 L de água destilada (MILLER, 1959). A leitura espectrométrica foi realizada a 540 nm (SANTOS et al., 2011). A quantificação da L-asparaginase utilizou-se 1 mL do sistema de incubação contendo asparagina 0,02M em Tris/HCl 0,05M,

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6 pH 8,0 e uma quantidade de enzima apropriada foram incubados a 37ºC por 30 minutos. A reação foi interrompida pela adição de 0,125 mL de ácido tricloroacético (TCA) 15%. A mistura foi centrifugada a 10000 rpm por 2 a 3 minutos e uma alíquota de 0,5 mL foi retirada, diluída com 2,25 mL de água destilada e adicionados 0,25 mL do reativo de Nessler. Esta solução foi mantida por 10 minutos à temperatura ambiente e procedeu-se à leitura da absorbância em 450 nm. (TIZZOT et al., 2005).

RESULTADOS E DISCURSÃO

Dentre as 47 amostras bactérias isolados a rizosfera da catingueira no período de inverno, 28% das amostras apresentaram atividades celuloliticas, apenas 7% de micro-organismos degradadores de celulose apresentaram um índice enzimático (IE) ≤ 2, estes dados estão presente na tabela 1. Queiroz et al., (2002) encontraram das 27 amostras isoladas da efluentes de fabricas de papel, 63% de bactérias celulolíticas de IE < 2, sendo estas designadas: BA-1 com índice 4,5; M-5 com índice 2,54 e T-2 com índice 2,65. Através dos dados obtidos nesta etapa de pré-seleção, os isolados foram selecionado para realização da cinética de produção do referido complexo enzimático em cultivos submersos sob agitação, sendo detectadas apenas atividades celuloliticas significativas na fermentação com o isolado bacteriano

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7 designado M5. Na figura 1 estão apresentados os valores de atividade CMCase em U/mL e U/mg de proteína em função do tempo de cultivo, apresentando um pico de produção com 48 horas de cultivos (0,0084 U/mL e 0,1228 U/mg de proteína).

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Micro-organismos Índice de degradação Carboximetilcelulase (IE=Diâmetro de

degradação / Diâmetro do halo da colônia) ± ao Desvio padrão. Degradação L-asparagina Teste qualitativo para L-asparaginase A-1 ND ND A-2 ND ND BA-1 ND ND BI-1 4,53 ± 1,272 ND BI-2 ND ND BI-3 ND ND BI-4 ND ND BI-5 ND ND BI-6 2,0 ± 0 ++ I-1 ND +++ I-2 ND ND I-3 ND +++ I-4 1,33 ± 0,106 ++ I-5 ND ND I-6 ND ND I-7 ND ND I-8 1,58 ± 0,381 ND I-9 ND ND I-10 ND ++ I-11 ND ND M-1 ND ND M-2 1,30 ± 0,155 ++ M-3 ND ND M-4 ND ++ M-5 2,54 ± 0,240 ++ M-6 ND ND M-7 ND + M-8 1,80 ± 0,275 ND M-9 1,89 ± 0,176 ++ M-10 ND ND M-11 ND ++ T-1 ND ND T-2 2,65 ± 0,502 ND T-3 ND ND T-4 ND ND T-5 ND ND T-6 1,35 ± 0,056 ++ T-7 ND + T-8 ND ND T-9 ND ND T-10 1,41 ± 0 ND T-11 ND ND T-12 ND ND T-13 ND ND T-14 ND ND T-15 ND ND T-16 ND ND T-17 ND ND

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9 No screening para os ensaios de L-asparaginase (Tabela 1), foram utilizadas as 47 linhagens isoladas da Catingueira destas 13 foram positivas para a produção de L-asparaginase quando comparadas a Escherichia coli, utilizada no referido trabalho como controle positivo. Das quais duas linhagens (I4 e I5) se destacaram, apresentando uma produção enzimática num período de 24 horas, superior ao controle positivo. Para avaliar o melhor tempo de cultivo para a excreção da enzima L-asparaginase, as referidas linhagens foram submetidas a fermentações liquidas sob agitação, estes dados estão presentes nas Figuras 2 e 3.

Figura 2: Cinetica de produção de L-asparaginase de I4 ND = Não degradou

+ = Baixo nível de degradação de L-asparagina em 24h. ++ = Médio nível de degradação da L-asparagina em 24h. +++ = Alto nível de degradação de L-asparagina em 24h.

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Figura 3: Cinetica de produção de L-asparaginase de I5

Segundo Tizzot et al ,2005 o crescimento máximo da bacteria Herbaspirillum Seropedicae estirpe Z78 é atingido em 22 horas de incubação, enquanto que a atividade específica aumenta de 0,35 para 0,55 U/mg de proteín no período compreendido entre 10 e 16 horas de incubação. No presente trabalho observa-se que a linhagem I4 apresentou um pico de produção com 48 horas de cultivo correspondente a 121,79 U/mL e 1487,93 U/mg de proteína com 72 horas de cultivo. Entretanto a linhagem I5 excretou 137,79 U/mL e 3476,091 U/mg de proteína com apenas 24 horas de cultivo. Portanto, os resultados obtidos no presente estudo indicam uma alta incidência de atividade asparaginásica, sugerindo que a maioria das linhagens produzem L–asparaginase tipo I, com alta afinidade pelo substrato L-asparagina.

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11 Com os dados obtidos no presente estudo, evidenciou um potencial biotecnológico e farmacológico dos micro-organismos isolados, bem como a importância sobre o estudo da microbiota dos diferentes ecossistemas. Evidenciando a necessidade da realização de experimentos quanto à produção e caracterização das referidas enzimas excretadas por bactérias isoladas da rizosfera da Catingueira no período de inverno.

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