UNIVERSIDADE ESTADUAL DE FEIRA DE SANTANA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA

JAQUELINE FAGUNDES PEREIRA

ANÁLISE DE POLIMORFISMOS DE INSERÇÃO ALU COMO

MARCADORES DE ANCESTRALIDADE EM ESTUDO

CASO-CONTROLE DE CORONARIOPATAS DO ESTADO DA

BAHIA

Feira de Santana, BA. 2010

ANÁLISE DE POLIMORFISMOS DE INSERÇÃO ALU COMO

MARCADORES DE ANCESTRALIDADE EM ESTUDO

CASO-CONTROLE DE CORONARIOPATAS DO ESTADO DA

BAHIA

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Biotecnologia, da Universidade Estadual de Feira de Santana como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Biotecnologia.

Orientador: Prof. Dr. Domingos Lázaro Souza Rios Co-orientadora: Prof.ª. Dra. Sandra Mara Bispo Sousa

Feira de Santana, BA. 2010

Pelo incentivo ao estudo, enfatizando sempre que o conhecimento é a maior riqueza entre os seres humanos, pelo carinho, dedicação, amor e apoio incondicional.

A Deus, pela minha vida e por toda força renovada nos momentos de fraqueza.

Ao meu orientador, Prof. Dr. Domingos Lázaro Souza Rios pela confiança em mim depositada, pelos ensinamentos, pelo apoio, e paciência.

A Prof.ª Dr.ª Sandra Mara Bispo Sousa, que sempre está disponível em me ajudar e por todos os ensinamentos compartilhados.

A Prof.ª Dr.ª Ana Angélica Leal Barbosa que tornou possível a execução deste trabalho, por está sempre presente, muito obrigada!

A Prof.ª Dr.ª Kiyoko Abé Sandes por fazer parte da banca examinadora e pela disponibilidade em avaliar esse trabalho.

Aos meus pais Arnaldo e Elizabete, as pessoas mais importantes da minha vida, que mesmo sem entender muito bem o que eu faço (rsrs...), me apóiam de forma incondicional.

Á Luciana Araújo, pela amizade, por dividir comigo a rotina no laboratório, as disciplinas, as viagens (que foram muitas... rsrs!), as angústias, incertezas e as alegrias desses dois anos.

Ao meu amigo Getúlio Bomfim por ser tão prestativo e companheiro, obrigada por tudo!

Ao meu amigo Ricardo Brito, pela amizade sincera, e mesmo estando distante torce por mim.

Aos colegas do Laboratório de Genética Molecular da UESB, Elder, Bruno, Dani, Caio, Jamile Oliveira, pelas horas de descontração.

A UEFS que através do programa de Pós-graduação em Biotecnologia, permitiu a realização deste trabalho.

A Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia pela oportunidade de realização dos trabalhos práticos.

melhor na nossa curiosa herança.

Os polimorfismos de seqüência Alu podem ser usados para estimar ancestralidade, pois apresentam alelos com freqüências muito diferentes entre grupos populacionais etnicamente distintos. A análise destes polimorfismos foi realizada com intuito de quantificar a mistura étnica em amostras casos-controles visando verificar a presença de estruturação populacional. 30 marcadores foram analisados em 539 pacientes coronariopatas (364 euro-brasileiros e 175 afro-brasileiros) e em 302 controles (164 euro-brasileiros e 138 afro-afro-brasileiros). O DNA genômico foi amplificado utilizando-se o método de PCR-multiplex. Os fragmentos amplificados foram separados em PAGE 8% não desnaturante/coloração por Nitrato de Prata. As análises estatísticas foram realizadas com o uso dos programas GENEPOP, ADMIX2, FSTAT 2.8, DISPAN. Dos 30 loci analisados, sete apresentaram freqüência alélica similar às encontradas em populações africanas em todas as amostras deste estudo. Foram observados desvios significativos para o equilíbrio de Hardy-Weinberg em todas as amostras analisadas sendo que a maioria pode ser explicada por déficit de heterozigotos. Nas associações alélicas par-a-par, a amostra casos euro-brasileiros apresentou associações significativas. A diversidade gênica intrapopulacional variou de 0,415 nos casos afro-brasileiros no

locus Ya5_541F a 0,503 em casos afro-brasileiros no locus Ya5ACA866. A

estimativa de mistura foi consistente para o modelo di-hibrído (Afro-americanos e Europeus). Em todas as amostras a contribuição afro-americana foi maior, o que era esperado devido à história de formação da população baiana. Porém essa contribuição foi similar em todas as amostras, não diferenciando afro-brasileiros de euro-brasileiros.

Palavras-chaves: Polimorfismos, sequência Alu, ancestralidade, estruturação populacional.

The polymorphisms of Alu sequence can be used estimate ancestry, therefore they present alleles with very different frequencies between ethnicity distinct population groups. The analysis of polymorphisms of Alu insertion was carried through with intention to quantify the ethnic mixture in samples case-control being aimed at to verify the presence of population stratification. 30 markers were analyzed in 539 patients with coronary artery disease (364 Euro-Brazilians and 175 african-Brazilians) and 302 controls (164 Euro-Brazilians and 138 african-Brazilians). Genomic DNA was amplified using the PCR-multiplex. The amplified fragments were separated on 8% PAGE not denaturing / color by Silver Nitrate. Statistical analysis was performed using the programs GENEPOP, ADMIX2, FSTAT 2.8, DISPAN. Of the 30 loci examined, seven showed allele frequencies similar to those found in African populations in all samples in this study. Significant deviations were observed for the Hardy-Weinberg equilibrium in all samples analyzed and most can be explained by a deficit of heterozygotes. Allelic associations in pair-the-pair, the sample cases Euro-Brazilians showed significant associations. The intrapopulation diversity ranged from 0.415 in cases african-Brazilians in Ya5_541F locus to 0.503 in cases african-Brazilians in Ya5ACA866 locus. The estimated mixture was consistent with the model di-hybrid (African-Americans and Europeans). In all samples the african-American contribution was higher, which was expected due to the formation history of the Bahian population. But this contribution was similar in all samples, not differing african-Brazilian of the Euro-Brazilians.

LISTA DE TABELAS...10 LISTA DE FIGURAS...11 1 INTRODUÇÃO...12 2 REVISÃO DA LITERATURA...13 2.1 POPULAÇÃO BRASILEIRA...13 2.2 POLIMORFISMOS GENÉTICOS ...15

2.3 ORIGEM E EVOLUÇÃO DAS INSERÇÕES ALU...18

2.4 DOENÇA ATEROSCLERÓTICA CORONARIANA...19

2.5 ESTUDOS DE ASSOCIAÇÃO DO TIPO CASO-CONTROLE...21

2.6 ESTRUTURA POPULACIONAL ...22 3 OBJETIVO...25 3.1 OBJETIVO GERAL...25 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS...25 4 MATERIAL E MÉTODOS...26 4.1 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA...26 4.2 POLIMORFISMOS ESTUDADOS...26 4.3 ANÁLISE LABORATORIAL...28 4.3.1 Extração de DNA...28

4.3.2 Reação em Cadeia de Polimerase (PCR)...28

4.3.3 Análise do Produto Amplificado...31

4.3.4 Coloração com Nitrato de Prata e Secagem do Gel...31

4.4 ANÁLISES ESTATÍSTICAS...33

4.4.1 Frequências Alélicas e Equilíbrio de Hardy-Weinberg...33

4.4.2 Associação Par-a-Par entre Loci...34

4.4.3 Diferenciação genética das populações...34

4.4.4 Diversidade gênica...35

4.4.5 Mistura Étnica...35

5 RESULTADOS...36

5.1 FREQÜÊNCIAS ALÉLICAS ...36

5.2 EQUILÍBRIO DE HARDY-WEINBERG...44

5.3 ASSOCIAÇÕES ALÉLICAS PAR-A-PAR ...46

5.4 DIFERENCIAÇÃO GENÉTICA ENTRE POPULAÇÕES...47

5.5 DIVERSIDADE INTRAPOPULACIONAL (HS)...50

5.6 MISTURA ÉTNICA...51

6 DISCUSSÃO...53

6.1 FREQÜÊNCIAS ALÉLICAS ...53

6.2 EQUILÍBRIO DE HARDY-WEINBERG...54

6.3 ASSOCIAÇÕES ALÉLICAS PAR-A-PAR ...55

8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...62

ANEXO I...69

ANEXO II...72

Tabela 1 - Loci genéticos, sequência dos iniciadores, localização cromossômica e tamanho do fragmento dos polimorfismos que foram estudados...27 Tabela 2 - Componentes da mistura de reação de PCR...29 Tabela 3 - Programa utilizado para amplificação das sequências Alu...30 Tabela 4 - Frequências alélicas dos 30 polimorfismos de inserção Alu analisados em casos e controles e nas populações parentais...37 Tabela 5 - Probabilidades obtidas com o teste exato para a verificação da aderência ao Equilíbrio de Hardy-Weinberg nas amostras analisadas...45 Tabela 6 - Probabilidades obtidas com o teste do Equilíbrio de Hardy-Weinberg para verificar o déficit de heterozigotos...46 Tabela 7- Diferenciação gênica baseada nos 30 loci entre as quatro populações, caso euro-brasileiros (CEB), caso afro-brasileiros (CAB), controle euro-brasileiros (COEB) e controle afro-brasileiros (COAB)...48 Tabela 8 - Diferenciação genotípica baseada nos 30 loci entre as quatro populações, caso euro-brasileiros (CEB), caso afro-brasileiros (CAB), controle euro-brasileiros (COEB) e controle afro-brasileiros (COAB)...50 Tabela 9 - Diversidade gênica (HS) dos loci nas populações analisadas...51 Tabela 10 - Estimativa de mistura étnica nas amostras analisadas, segundo o método de identidade gênica, considerando os 30 polimorfismos analisados...52

Figura 1 - Principais origens e destinos de tráfico de escravos para o Brasil...13 Figura 2 – Diagrama esquemático da evolução da integração recente de subfamílias

Alu...19

Figura 3 - Comparação gráfica das frequências alélicas da amostra Casos Euro-brasileiros obtidas no presente estudo com as frequências das populações parentais, Afro-americanos, Europeus e Asiáticos...40 Figura 4 - Comparação gráfica das frequências alélicas da amostra Casos Afro-brasileiros obtidas no presente estudo com as frequências das populações parentais, Afro-americanos, Europeus e Asiáticos...41 Figura 5 - Comparação gráfica das frequências alélicas da amostra Controles Euro-brasileiros obtidas no presente estudo com as frequências das populações parentais, Afro-americanos, Europeus e Asiáticos...42 Figura 6 - Comparação gráfica das frequências alélicas da amostra Controles Afro-brasileiros obtidas no presente estudo com as frequências das populações parentais, Afro-americanos, Europeus e Asiáticos...43 Figura 7 - Estimativas de mistura étnica, africana e européia, a partir dos 30 loci nas amostras CEB (casos euro-brasileiros), CAB (casos afro-brasileiros) COEB (controles euro-brasileiros) COAB (controles afro-brasileiros)...52

A população brasileira se caracteriza por apresentar alta heterogeneidade genética, formada a partir de diversos grupos étnicos diversificados entre si. Os estudos casos-controles que investigam a associação entre polimorfismos em genes candidatos e doenças têm sido amplamente empregados. Entretanto, em populações miscigenadas como a brasileira, a existência de estruturação populacional pode levar a resultados espúrios. Tornando o controle deste fator, um passo imprescindível nestes estudos populacionais.

O estado da Bahia é caracterizado por uma população tri – híbrida com forte ascendência africana tornando de fundamental importância caracterizar a sua estrutura populacional.

A estrutura genética de amostras de casos e controles para doença aterosclerótica coronariana foi examinada usando um conjunto de polimorfismos de seqüências Alu para avaliar as contribuições africana, européia e ameríndia em indivíduos desta amostra. Estas sequências Alu são excelentes marcadores étnicos, que investigam a composição genética de diferentes populações e poderão ser utilizados para controle da estruturação populacional em estudos genéticos utilizando a metodologia caso-controle.

2.1 POPULAÇÃO BRASILEIRA

A população brasileira é bastante peculiar em relação a outras populações do mundo por ter sido formada a partir da miscigenação de vários povos que passaram a co-habitar o Brasil desde 1500, especialmente ameríndios, africanos e europeus (CALLEGARI-JACQUES e SALZANO, 1999). Na época da chegada dos portugueses, o Brasil era habitado por vários povos indígenas, que se distribuíam ao longo de toda a costa. Devida a drástica diminuição da população indígena, provocada pelo extermínio, epidemias e o trabalho escravo, foi necessário à utilização de uma nova mão-de-obra escrava, os africanos.

A origem dos africanos que foram trazidos para o Brasil foi bastante variada, tendo envolvido pessoas vindas do ocidente, oriente e sudoeste da África, bem como da região do atual Moçambique (em número bem menor), sendo que a maioria originou-se das regiões dos atuais, Congo e Angola (KLEIN, 2002). As cidades Salvador, Recife e Rio de Janeiro constituíam na época os principais destinos dos africanos que foram trazidos para cá (GATTÁS et al., 2004), conforme pode ser observado na figura 1.

Além dos africanos, ameríndios e portugueses, a população brasileira recebeu também influência de outros povos na sua formação. Durante o século XIX e início do século XX, outros imigrantes vieram juntar-se aos grupos já existentes, como italianos, espanhóis e alemães, além dos japoneses e chineses (CALLEGARI-JACQUES e SALZANO, 1999). A população brasileira é, assim, caracterizada por grande diversidade étnica e intensa miscigenação.

Em 1800, os negros constituíam 47% da população brasileira, contra 30% de mulatos e 23% de brancos (IBGE, 2000). Fatores como, por exemplo, a proibição do tráfico de escravos (1850), a elevada mortalidade da população negra, o forte estímulo à imigração européia (expansão cafeeira), além da intensa miscigenação entre brancos e negros, alteraram profundamente a composição étnica da população brasileira. Em 1880, os negros estavam reduzidos a 20% da população, contra 42% de mulatos e 38% de brancos.

Assim como o Brasil, a Bahia foi à primeira área de colonização deste país e possui uma população altamente heterogênea, baseada em três grupos principais, ameríndios, africanos e europeus. No entanto, este estado teve uma miscigenação mais intensa por parte de africanos e europeus. A chegada dos negros na Bahia se confunde com a história dos mesmos no Brasil, tendo em vista que o porto de Salvador foi um dos mais importantes do início até o fim do tráfico escravo (TAVARES, 2001).

Nos dias atuais a população baiana consiste de 75% de indivíduos de origem Africana (GATTÁS et al., 2004), constituindo-se assim uma das populações que melhor caracterizam os afro-descendentes no Brasil.

Recentemente, Callegari-Jacques et al. (2003) analisaram mais de mil indivíduos pertencentes às cinco regiões brasileiras. A contribuição européia foi maior na região Sul (81%) e menor na região Nordeste (68%). Ao contrário, na região Sul, a contribuição africana é menor (11%), enquanto os maiores valores foram encontrados nas regiões Sudeste e Centro-Oeste (18%). E por fim, a contribuição ameríndia foi menor no Sul e Sudeste do país (7%) e maior para a região Nordeste (17%). Portanto, foi observado um gradiente crescente, norte-sul de contribuição Européia em concordância com a história da formação da população brasileira (PEDROSA, 2006).

Dados de marcadores genéticos autossômicos e uniparentais em populações especiais, afro-descendentes remanescentes de quilombos, mostram

grande contribuição africana 53% a 81% nas amostras analisadas de São Gonçalo, Bananal e Barra (SOUSA, 2001; ABE-SANDES, 2002 e BARBOSA et al., 2006). No entanto não há dados com marcadores moleculares em amostras representativas do estado da Bahia.

2.2 POLIMORFISMOS GENÉTICOS

Um polimorfismo genético refere-se à variação em um gene, cromossomo, ou proteína resultando na existência de duas ou mais formas, cada uma das quais tem freqüência maior que a que poderia ser mantida apenas por mutação recorrente.

Como primeiro passo para associar etnia e herança genética, é necessário agrupar as populações humanas de acordo com suas respectivas ancestralidades (BAMSHAD, 2003). Para determinar diferenças entre grupos populacionais utilizam-se pequenas variações no DNA, ou polimorfismos que utilizam-se caracterizam por representar uma seqüência de DNA localizada num determinado locus cromossômico, que difere de indivíduo para indivíduo, e cujo alelo menos comum possui freqüência de pelo menos 1%.

A variabilidade de marcadores polimórficos de DNA é bem maior do que a encontrada em seus produtos e estão distribuídos por todo genoma, sendo utilizados para estudos populacionais e na identificação individual (CAVALLI-SFORZA, 1994).

Grande parte dos loci marcadores que apresentam alelos com freqüências muito diferentes entre grupos populacionais definidos geográfica e/ ou etnicamente, os quais se configuram como ótimos marcadores de individualidade, são denominados de PSAs (do inglês Population Specific Alleles, SHRIVER, et al., 1997). Estes marcadores apresentam elevado potencial para discriminar grupos populacionais e são, portanto, ferramentas eficientes quando se quer estabelecer o grau de mistura entre as populações a serem estudadas.

Com a caracterização dos PSAs tornou-se possível gerar estimativas mais precisas das proporções ancestrais de uma população miscigenada (PARRA et al., 1998; PARRA et al., 2001; SHRIVER et al., 2003). Esses marcadores são atualmente denominados de AIMs (do inglês Ancestry Informative Markers;

BONILLA et al., 2004). Os AIMs podem ser usados para estimar ancestralidade biogeográfica em nível de população, subgrupo e individual (SHRIVER et al., 2003).

Pequenos fragmentos do DNA conhecidos como polimorfismos de inserção

Alu são amplamente utilizados (BATZER & DEININGER, 2002). As inserções Alu

fazem parte da família de DNA repetitivo SINE (short interspersed nuclear elements) e são originárias de um retrotransposon. Ocasionalmente, as seqüências Alu replicam-se e as cópias resultantes se dispersam aleatoriamente para novas posições no cromossomo de origem, ou em outro cromossomo, geralmente em áreas que não provocam efeitos no funcionamento dos genes que estão próximos (BATZER & DEININGER, 2002). Segundo Batzer e Deininger (1994), se duas pessoas têm a mesma seqüência Alu no mesmo local do seu genoma, elas descendem de um antepassado comum que lhes forneceu aquele segmento específico de DNA. Isto porque, é improvável que o evento de inserção ocorra duas vezes em um mesmo locus.

Estas inserções poderiam ser excelentes marcadores étnicos e, então, de grande uso para estimar a composição étnica de populações híbridas como a população brasileira (MENDES – Jr. & SIMÕES, 2001). Estes polimorfismos são altamente informativos em estudos de genética de populações, permitindo sua utilização como instrumento de investigação para caracterizar a composição genética de diferentes povos, uma vez que possui freqüências diferenciadas para cada etnia (RAY et al., 2005).

Um estudo realizado com três marcadores de inserção Alu (TPA25, PV92 e APO) mostrou um grande diferencial de freqüências alélicas no locus PV92 entre Ameríndios/Africanos e Ameríndios/Europeus, e no locus APO entre Africanos/Europeus. O locus TPA25 foi o único que mostrou homogeneidade na distribuição das freqüências alélicas em todos os grupos analisados. As freqüências gênicas na amostra exibiram valores que são intermediários entre aqueles descritos para Europeus e Africanos refletindo a contribuição destes dois grupos étnicos na formação da população brasileira (MENDES – JR. & SIMÕES, 2001).

Cotrim et al. (2004) analisaram quatro loci polimórficos Alu (APO, ACE, TPA e FXIIIB), em uma amostra de indivíduos de seis populações derivadas de Africanos (remanescentes de quilombos) do Vale do Rio Ribeira, e uma amostra de indivíduos do estado de São Paulo. As quatro inserções Alu foram polimórficas em todas as populações. O número de heterozigotos observados e esperados foi maior nos

remanescentes de quilombos do que na amostra de indivíduos do Estado de São Paulo, segundo estes autores é possível que esta população tenha sofrido um significante grau de fluxo gênico. Para Silva - Jr. et al. (1999), a eventual diversidade perdida pelo isolamento pode ter sido compensada pela miscigenação de diferentes grupos étnicos (Africanos, Europeus e Ameríndios) no momento de fundação dos quilombos. Além da miscigenação dos três grupos étnicos formadores, outra possível explicação seria a diversidade de grupos Africanos que foram trazidos juntos em navios como escravos para o Brasil.

Com o objetivo de investigar a variação genética entre populações ameríndias foi analisada uma amostra composta por 193 indivíduos de quatro tribos Ameríndias, utilizando 12 polimorfismos de inserções Alu (cinco deles nunca estudados nestas populações) e um grupo de 22 proteínas sanguíneas. Os testes padrões de diferenciação intertribal e outros aspectos de sua variação foram congruentes nos dois grupos (Alu; grupo protéico). Considerando a heterozigose as inserções Alu e as proteínas sanguíneas mostram essencialmente o mesmo padrão com valores similares. A variabilidade total devido a diferenças inter-populacionais foram similares considerando os polimorfismos Alu e grupos protéicos (0,26; 8%; 0,23; 10%, respectivamente) (BATTILANA et al., 2002).

Estudos feitos utilizando os marcadores informativos de ancestralidade que apresentam um alto diferencial de freqüência alélica (maior que 45%) entre Africanos e Europeus mostraram que em nível populacional era possível estimar de forma precisa, o grau de mistura africana e européia em uma população norte americana (PARRA et al., 1998).

Com o objetivo de verificar se o grau da aparência física dos indivíduos está relacionado à sua ancestralidade genômica africana, PARRA et al. (2003) utilizaram o mesmo conjunto de AIMs descritos por PARRA et al. (1998) e descreveram o índice individual de ancestralidade genômica africana permitindo a estimativa de ancestralidade genômica africana em nível individual. Mostraram também que todas as estimativas em amostras brasileiras, baseadas em auto-classificação, apresentaram índice de ancestralidade africana (IAA) intermediário entre Europeus e Africanos (PARRA et al. 2003).

Os maiores valores de ancestralidade africana foram encontrados nas regiões Nordeste e Sudeste, entretanto as regiões Norte e Sul mostraram valores menores para o IAA. Os resultados obtidos para amostras de brasileiros brancos

das quatro regiões do país mostraram contribuição africana superior a 10% em mais de 75% da amostra de brancos das regiões do Norte, Nordeste ou Sudeste. No Sul, apesar da forte imigração européia o percentual de brancos com IAA acima de 10%, mostrou-se alto (49%). Em termos comparativos os dados fornecidos por Shriver et

al (2003) para brancos norte-americanos, apenas 11% deles apresentaram IAA

superior a 10%. A conclusão desse estudo é de que pelo menos 77 milhões de pessoas em nosso país apresentam mais de 90% de contribuição africana, sendo esta de enorme significância para a constituição da população brasileira.

Os polimorfismos de inserção Alu escolhidos neste trabalho apresentam poucos dados em populações mundiais (WANG et al., 2006, RAY et al., 2005), mas mostram um amplo diferencial de freqüência (>40%).

2.3 ORIGEM E EVOLUÇÃO DAS INSERÇÕES ALU

As subfamílias Alu originaram-se como um resultado de mutações que ocorreram na existência de elementos ‘master’ ou novos elementos de origem capazes de uma amplificação significante (ROY-ENGEL et al., 2001).

O termo 'elemento repetitivo' descreve várias seqüências de DNA que estão presentes em múltiplas cópias nos genomas em que eles se encontram. Sendo que as inserções Alu estão incluídas no grupo dos elementos repetitivos (BATZER e DEININGER, 2002).

Durante os últimos 65 milhões de anos, os elementos Alu têm propagado mais do que um milhão de cópias em genomas primatas, e isto tem resultado na geração de uma série de subfamílias Alu de diferentes idades (BATZER & DEININGER, 2002). Com isso, quase todas as subfamílias da recente integração dos elementos Alu dentro do genoma humano são chamadas de subfamílias “jovens”, são elas: Y, Yc1, Yc2, Ya5, Ya5a2, Ya8, Yb8 e Yb9, (compreendendo menos de 10% dos elementos Alu presente no genoma) a maioria existente são membros da subfamília Ya5 e Yb8 (ROY et al., 2000).

A recente integração dos elementos serve como marco temporal na evolução do genoma, e muitos deles provaram ser úteis no estudo da evolução humana e no estudo da história natural de diferentes regiões do genoma (CARROL et al., 2001).

As jovens subfamílias Alu são comumente ativas no que diz respeito à retrotransposição, diferentemente das velhas subfamílias Alu (Sx, J e Sg1). Ressalta-se que as velhas subfamílias compreendem a maioria dos elementos Alu presente no genoma (ROY et al., 2000).

A relação e a evolução das subfamílias Alu são apresentadas e descritas na figura 2.

Figura 2 – Diagrama esquemático da evolução da integração recente de subfamílias Alu. Todas as

origens das subfamílias Alu. Todas as origens das jovens subfamílias Yb9, Yc1 e Yc2 são mostradas depois a divergência das subfamílias Yb8 e Y, respectivamente. O tamanho da fonte é relativo ao número de elementos dentro de cada subfamília, o maior representante possui 100.000-200.00 cópias; o médio 1.000-2.000 cópias; e o menor 50-500 cópias. O número total de elementos de cada subfamília ligados à doença é indicado à direita. A proporção de elementos polimórficos dentro de cada família é representado por: ± elementos polimórficos raramente encontrados; +, baixa percentagem de elementos polimórficos; ++, 50% dos elementos são polimórficos; +++, quase todos elementos são polimórficos. (Adaptado de: ROY-ENGEL et al, 2001).

2.4 DOENÇA ATEROSCLERÓTICA CORONARIANA

A amostra utilizada no presente estudo é constituída por pacientes que realizaram o exame de cineangiocoronariografia. A amostra foi dividida em amostras caso/controle de acordo com a presença da doença arterial coronariana.

Aterosclerose é um processo dinâmico, evolutivo, a partir de dano endotelial de origem multifatorial, com características de reparação tecidual. Entretanto, o

processo tem início numa idade bastante precoce, tanto assim que, ao atingir a idade adulta, a maioria dos homens (e as mulheres em menor escala) apresenta evidência de aterosclerose das artérias coronárias (BATISTA, 2000).

Os fatores de risco são capazes de predispor e/ou causar lesões diretamente no endotélio vascular levando a disfunção endotelial (ROSS, 2000). A partir do dano vascular, ocorre a expressão de moléculas de adesão que mediarão à entrada de monócitos em direção ao espaço intimal. Estes, por sua vez, englobarão lipoproteínas modificadas [predominantemente lipoproteínas de baixa densidade (LDL) oxidadas originando as células espumosas. Diferentes mediadores inflamatórios são liberados no espaço intimal, perpetuando e ampliando o processo, levando finalmente à formação da placa aterosclerótica (ROSS, 2000).

Durante os últimos 30 anos se tem presenciado um declínio razoável da mortalidade por causas cardiovasculares, em países desenvolvidos, enquanto que elevações relativamente rápidas e substanciais têm ocorrido em países em desenvolvimento, dentre os quais o Brasil é um dos representantes (SOCIEDADE BRASILEIRA DE CARDIOLOGIA, 1996). No Brasil, a doença aterosclerótica coronariana é uma das principais causas de morte (Serviço de Informação sobre Mortalidade – Ministério da Saúde, 2001).

De acordo com as projeções da Organização Mundial de Saúde, essa tendência de elevação na doença cardiovascular tende a persistir, agravando ainda mais o quadro de morbidade e mortalidade elevadas nos países em desenvolvimento.

O perfil lipídico desfavorável e elevação da pressão arterial, particularmente em conjunto a outros fatores de risco como a obesidade, diabetes e a predisposição genética estão associados ao maior desenvolvimento da aterosclerose (Ministério da Saúde, 2001).

A maioria das doenças humanas são poligênicas e multifatoriais, ou seja, são governadas por muitos genes e são causadas por um conjunto de fatores que agem conjunta e simultaneamente. Genes individuais têm papel sutil na expressão de qualquer patologia poligênica. Além disso, existem variáveis não genéticas, quer individuais (gênero, origem, etnia, entre outras.) ou ambientais (tabagismo, consumo de álcool, entre outras.) que são de grande importância nos estudos de associação entre fatores genéticos e o risco destas patologias (KATO, 2002).

Devido ao caráter tri – hibrido da população brasileira e da forte influência afro - descendente no estado da Bahia é de fundamental importância caracterizar a sua estrutura populacional, uma vez que estudos de associação realizados entre indivíduos não-aparentados em populações miscigenadas podem ser susceptíveis a erro devido à estratificação populacional. Nesses casos é necessário, quantificar o efeito da mistura recente na estrutura da população e fazer a correção utilizando modelos estatísticos populacionais (HINDS et al., 2004).

2.5 ESTUDOS DE ASSOCIAÇÃO DO TIPO CASO-CONTROLE

Estudos de Associação permitem determinar se uma variante genética específica é mais comum em pessoas com a doença do que em pessoas sem a doença. Muitos estudos de associação utilizam o tradicional método caso-controle em que a presença da variante genética é comparada entre as pessoas com a disordem (casos) e aquelas pessoas que não têm a disordem (controles).

Dependendo da característica sob investigação, os estudos de associação podem ser do tipo populacional ou baseado em famílias.

Estudo de associação baseado na população compara as diferenças das freqüências alélicas de genes candidatos entre indivíduos afetados e controles, não-afetados e não-relacionados (RISCH, 2000).

Já os estudos baseados em famílias levam em conta a transmissão da característica dos pais para um filho afetado, ou seja, os alelos não-transmitidos são usados como controle (CARDON & PALMER, 2003).

Segundo Pritchard e Rosenberg (1999), um dos maiores problemas dos estudos de associação é a estratificação genética que pode ocorrer devido à utilização de indivíduos miscigenados ou de diferentes grupos continentais.

A consequência seria a obtenção de resultados espúrios em estudos de associação genética. Em situações como esta, tem-se uma maior representação de indivíduos com ancestralidade para um determinado grupo entre os casos e, assim, alelos mais frequentes neste grupo populacional aparecerão espuriamente associados à doença em questão (KNOWLER et al., 1988). Na população brasileira

esse fato deve ser levado em consideração para os estudos de associação genética a fim de se evitar esse erro.

Entretanto, se casos e controles são adequadamente igualados para potenciais confundidores, tal como idade, sexo, etnia ou origem geográfica, e também outros fatores confundidores específicos de doenças, então é justo assumir que a estratificação populacional não é suficiente para explicar a associação observada (ARDLIE et al, 2002).

2.6 ESTRUTURA POPULACIONAL

Um modelo de população estratificada pode ser definido, como aquele que contém vários subgrupos que permaneceram, em sua maior parte, geneticamente distinto durante a evolução. Muitos distúrbios genéticos são caracterizados por mutações alélicas que variam em freqüência entre populações de diferentes grupos, provavelmente porque um pequeno número de mutações ancestrais tornou-se prevalecente em determinadas populações devido à estratificação (MARCHINI et

al., 2004).

A existência de variantes alélicas específicas de populações tem um significado para a compreensão das origens das doenças genéticas e também cria oportunidades para o diagnóstico de alelos específicos em uma população de risco. Estudos de associação têm sido amplamente utilizados para ajudar no entendimento da base genética de traços quantitativos, tal como a susceptibilidade para doenças complexas (ZEMBRZUSKI et al., 2006).

Entretanto, essas diferenças podem, muitas vezes, não ser detectadas. Assim, a não-detecção de estratificação populacional pode levar a associações espúrias entre um marcador candidato e um determinado fenótipo (RISCH, 2000; HINDS et al., 2004). Isto significa que tanto o distúrbio quanto o alelo aparentemente associados são comuns na população que está sendo estudada

A possibilidade de associações falsas deve-se, principalmente, à população amostrada, à característica em estudo e/ou ao marcador que está sendo testado (ZIV & BURCHARD, 2003). Talvez o fator mais importante que leva a tais associações esteja relacionado às características da população, principalmente a etnia (RISCH, 2000; SANTOS et al., 2002)

Diferenças sistemáticas na ancestralidade entre casos e controles podem ser encontradas quando subgrupos populacionais distintos geneticamente têm uma prevalência diferente do fenótipo alvo (HINDS et al., 2004).

Dez marcadores informativos de ancestralidade (AIMs) foram investigados em 101 pacientes com doença arterial coronariana e em 102 controles saudáveis de uma população da região sul do Brasil, a fim determinar a ocorrência de estratificação nesta população. O grau de miscigenação africana detectado nesta população foi estimado sendo maior que 6%, mas nenhuma diferença entre casos e controles foi observada. Usando o índice de ancestralidade africana (IAA) foi possível detectar níveis individuais de ancestralidade africana e remover da amostra aqueles indivíduos com evidencia de contribuição africana, pois este seria um fator confundidor. Conseqüentemente, mostrou-se que é possível controlar a estratificação da população escolhendo indivíduos, sem a perda do poder estatístico que ocorre com o uso de outros métodos do controle genômico (ZEMBRZUSKI et

al., 2006).

Um estudo realizado por Seldin et al. (2007) mostra a estrutura genética da população da Argentina examinada usando um conjunto de 78 AIMs para avaliar as contribuições européia, ameríndia e africana em 94 indivíduos desta população. O programa utilizado para os cálculos estatísticos foi o STRUCTURE, as contribuições médias européia, ameríndia e africana foram de respectivamente, 78%, 19,4% e 2,5%. Resultados similares foram encontrados quando se utilizou o método do quadrado médio: europeu, ameríndio e africano 80,2%, 8,1% e 1,7%, respectivamente. Consistente com os estudos anteriores os resultados atuais mostraram muito poucos indivíduos (quatro de 94) com miscigenação africana não superando 10%. Notavelmente, quando se utilizou o índice de miscigenação individual, os ameríndios e os europeus mostraram uma variação muito grande com uma contribuição individual de ameríndios que variou de 1,5 a 84,5% nos 94 indivíduos argentinos. Estes resultados indicam que índices de miscigenação devem ser considerados quando estudos casos-controle são realizados nestas populações. Além disso, o estudo atual mostra que um conjunto de SNPs informativos possam ser usados para verificar ou para controlar potenciais estruturações que estão ocultas. Além disso, a variação da miscigenação em indivíduos argentinos sugere que esta população é apropriada para futuros estudos de miscigenação.

Para Enoch et al. (2006), a probabilidade de detectar a estratificação aumenta com o número de marcadores analisados, visto a probabilidade que um marcador tem de variar entre duas populações que serão testadas.

3 OBJETIVO

3.1 OBJETIVO GERAL

Caracterizar as freqüências de 30 polimorfismos de inserção Alu em casos e controles de uma amostra populacional de coronariopatas do estado da Bahia.

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Estimar as freqüências alélicas e genotípicas dos marcadores estudados nestas amostras;

• Estimar parâmetros de diversidade genética intrapopulacional;

• Quantificar a mistura étnica;

• Verificar as associações alélicas par - a - par entre pares de loci não ligados;

• Investigar marcadores informativos de ancestralidade africana, ameríndia e européia nas amostras estudadas, no intuito de avaliar a possibilidade de estruturação da população.

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA

A amostra estudada foi previamente coletada pelo grupo do Prof. Domingos Lázaro Souza Rios no Centro de Pesquisa Gonçalo Moniz/ Fundação Osvaldo Cruz, Bahia. A amostra é composta de 841 indivíduos que procuraram o serviço de Hemodinâmica do Hospital Santa Izabel em Salvador – BA para a realização de cineangiocoronariografia devido a sintomas relacionados a doença arterial coronariana. Na época da coleta (2004-2005) este serviço era o único na Bahia a realizar este exame pelo Sistema Único de Saúde, recebendo a demanda de todo o estado. Da amostra coletada 500 indivíduos apresentaram lesões ateroscleróticas significantes (obstrução da luz arterial > 50%) em coronárias e 341 não apresentaram lesões visíveis no exame. Dos 841 indivíduos estudados 312 foram classificados como Afro-descendentes e 529 como Caucasóides de acordo com os critérios morfológicos descritos por Azevêdo (1980) com modificações. Foram considerado Euro-descendentes (brancos e mulatos claros) e Afro-descendentes (mulatos médios, mulatos escuros e negros). Então, as amostras foram consideradas casos (euro-brasileiros e afro-brasileiros) e controles (euro-brasileiros e afro-brasileiros).

O protocolo de pesquisa foi avaliado e liberado pelo comitê de Ética do Hospital Santa Isabel. Todos os pacientes foram informados dos riscos e benefícios potenciais da pesquisa e assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido (Anexo III).

4.2 POLIMORFISMOS ESTUDADOS

Foram estudados 30 polimorfismos de seqüência Alu (Tabela 1), estes foram escolhidos por apresentarem altos diferenciais de freqüências entre as

populações asiáticas, afro-americanas e européias

Tabela 1 - Loci genéticos, seqüência dos iniciadores, localização cromossômica e tamanho do

fragmento dos polimorfismos que foram estudados.

Loci Seqüência dos Iniciadores

Localização

cromossômica Tam. dos fragmentos (pb)_{Del / Ins}

Ya5ACA647 5’ACGTAAGCCTCAAAAAGGCA3’_{3’GGCACTGCAGATACAGTGTGA5’} 1p31.1 58 / 375

Ya5ACA733 5'TAGGGTAAGGAATATGTGCTGCTTTAG3’_{3'GTCTCTGAACGACTATGTGAGCAG5’} 1q24.2 175 / 500

Ya5NBC45 5'TATGGTTCTCAGCCATCACG3’_{3'ATTCTTCCCCAAAGGGAGTC5’} 20q11.23 265 / 591

Ya5ac1982 5'TCTGGGTTTCTCTGGTGGAC3’_{3'CTGGCAAATGCTACCCAAGT5’} 10q11.22 148 / 470

Ya5ACA917 5’TGGCCTGTTTTCACACCTTT3'_{3'CCAAAGCAACTTGCACCTTT5’} 2p13.1 171 / 500

Ya5ACA1400 5’TTCCTCTGAAAGGCTGGAAA3'_{3'AAACTGAAAATGCAGGTGCC5’} 5q31.1 379 / 677

Ya5ac2282 5’TGGAAAGCAGAGAAATGCTG3'_{3'GCTGTTATATGAAGTGTTCACCTTG5’} 13q14.2 167 / 498

Ya5ACA1441 5’CAAATGCAATTGGAGTGTTCA3'_{3'ATTGGGCTAAGCACAGGATG5’} 6q15 541 / 849

Ya5NBC132 5’CTCGTGATTCACAGAAGTGTTGTAAG3'_{3'CGGGGTTCATCCTTAATACATACAT5’} 6p22.2 228 / 458

Ya5ac2670 5’TGGGCAGAGTGAATATCCTTTAG3'_{3'GACCTTGGTCCTTATTGTCTTCC5’} 19p12 159 / 476

Ya5ACA1555 5’TTTGTTGATCCAGTTTTATATGGC3'_{3'CGGTTGGTTTCAATGTCCTT5’} 6q12 103 / 446

Yb8NBC157 5’TATGGTTCTCAGCCATCACG3'_{3'ATTCTTCCCCAAAGGGAGTC5’} 10p11.22 423 / 712

Ya5NBC150 5’AAATGGAGACACAGAGGTGTAAAGA3'_{3'CCCAAACTGCATATTTAAAGGGTAG5’} 19q13.41 169 / 491

Ya5ACA1002 5’GGGGTTGGAGAACCCTGTTA3'_{3'AAGGAGTAGATTGTGATGGCCT5’} 3p24.3 132 / 457

Ya5NBC327 5’AGGCAGGTTCAATGTTCAAA3'_{3'TTGTCTTATTGTGCTGGCTAGA5’} 6p12.3 339 / 668

Ya5ACA1242 5’GCGAGGGCCTTATAAAAGATG3'_{3'ATTGGGTTTCACATCCGTGT5’} 4q26 151 / 471

Ya5_531F 5’GCAAACACAGTGCCACAAGT3'_{3'TGGGGATGTGACCCAAGTAT5’} 16p12.1 195 / 502

Yb8NBC93 5’AAGTGAGTCCCAGGGCCTTCT3'_{3'CACACAGGCACTTGTTTGGT5’} 20p12.3 274 / 601

Ya5ACA928 5’TTTCATCTTTCTAGGCTTCACG3'_{3'TCCTAGCCATAAATCACAAATCA5’} 2q31.1 125 / 445

Ya5ACA1100 5’GCATCCTACAAAGCCATT3'_{3'GCCTGGGCAATAATTTTCAA5’} 3q25.2 170 / 492

H7_F_148 5’CATGCTTCAAGAGAACATCAGG3' _{3'TCTGGTTGCTTGCAGAGAGTAA5’} 7q34 630 / 1401

Ya5ACA1184 5’TGGCTCTAATGACCAAAAGGA3'_{3'CCCAGGTGATTCATTCCATC5’} 4p13 150 / 467

Loci Seqüência dos Iniciadores

Localização

cromossômica Tam. dos fragmentos (pb)_{Del / Ins} Ya5NBC241 5’GGTTCCAATAGAGAGCAACAGAA3'_{3'ACCTTAAGCTTTCCCCCAGA5’} 15q15.3

66 / 392

PV92 5’AACTGGGAAAATTTGAAGAAAGT3'_{3'TGAGTTCTCAACTCCTGTGTGTTAG5’} 16

122 / 437

Ya5_541F 5’GGATTGGGAAAGGTGTTGAA3'_{3'TGGCTGAGAAAACCTGCAAT5’} 10p11.21

141 / 471

Yb8NBC67 5’TCTCTACCCAGCTTTACCAA3'_{3'GAGGACCAGCTTAGTTTGTG5’} 6p22.2

375 / 503

Ya5ACA862 5’TCAGAGTAATGCACACAGATGCT3'_{3'TGCATTAAGTGCTCCAGAAGG5’} 2q11.2 149 / 485

Ya5NBC354 5’GTAGCTTGGCCTGTGCTCTT3'_{3'CCTCTGGGCTGAGAAACTCTT5’} 7q32.1

148 / 466

Ya5ACA1611 5’ TTTTGGTAAAGATGCCACAGAA3'_{3' TCCTAAACATAATACGTACAGGTGA5’} 7q31.1

184 / 496

4.3 ANÁLISE LABORATORIAL

4.3.1 Extração de DNA:

O DNA foi extraído no Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz/ Fundação Oswaldo Cruz, Bahia. A extração do DNA foi realizada com a técnica de salting-out (Anexo I), segundo Lahiri e Nurnberger (1991). O método de salting out utiliza solução saturada de cloreto de sódio para a precipitação de proteínas. Posteriormente as moléculas de DNA que se encontram no sobrenadante são precipitadas pela adição de etanol absoluto.

4.3.2 Reação em Cadeia de Polimerase (PCR)

O DNA genômico foi amplificado utilizando a técnica da PCR-multiplex, segundo as condições padronizadas no Laboratório de Genética Molecular da UESB. Em cada multiplex foram amplificados três marcadores simultaneamente. A reação da PCR foi feita utilizando um microtubo tipo eppendorf de 0,5 ml contendo os componentes descritos para cada locus (Tabela 2). Em seguida a mistura de PCR foi distribuída em microtubos para cada amostra de DNA, sendo estes

numerados corretamente. Por fim, 3µL de DNA genômico foi adicionado nos microtubos contendo a mistura da PCR.

Tabela 2- Componentes da mistura de reação de PCR

Loci Água deionizada Tampãoa _DNTPsb _{Primers (2,5 uM) MgCl}

2 (2,0 Mm) Taq Polimerase (1U/µL) Ya5ACA647 13,2µL 2,5µL _0,2µL 1,0µL 2,0µL 0,1µL Ya5ACA733 1,0µL Ya5NBC45 1,0µL Ya5ac1982 11,2µL 2,5µL 0,2µL 0,5µL 2,0µL 0,1µL Ya5ACA917 0,5µL Ya5ACA1400 0,5µL Ya5AC2282 11,2µL 2,5µL 0,2µL 1,0µL 2,0µL 0,1µL Ya5ACA1441 1,0µL Ya5NBC132 1,0µL Ya5AC2670 11,2µL 2,5µL _0,2µL 1,0µL 2,0µL 0,1µL Ya5ACA1555 _1,0µL Yb8NBC157 _1,0µL Ya5NBC150 11,2µL 2,5µL 0,2µL 1,0µL 2,0µL 0,1µL Ya5ACA1002 _1,0µL Ya5NBC327 _1,0µL Ya5ACA1242 11,1µL 2,5µL 0,2µL 1,0µL 2,0µL 0,2µL Ya5_531F _1,0µL Yb8NBC93 _1,0µL Ya5ACA928 11,2µL 2,5µL 0,2µL 1,0µL 2,0µL 0,1µL Ya5ACA1100 _1,0 µL H7_F_148 _1,0µL Ya5ACA1184 _1,0 µL Ya5ACA86 _1,0µL

Loci Água deionizada Tampãoa _DNTPsb _{Primers (2,5 uM) MgCl} 2 (2,0 Mm) Taq Polimerase (1U/µL) 9,1µL 9,1µL 2,5µL 2,5µL _0,2µL 0,2µL 2,0µL 2,0µL _0,2µL 0,2µL Ya5NBC241 _1,0 µL PV92 _1,0 µL Ya5_541F 11,1µL 2,5µL 0,2µL 1,0µL 2,0µL 0,2µL Yb8NBC67 _1,0 µL Ya5ACA862 _1,0 µL Ya5NBC354 11,1µL 2,5µL 0,2µL 1,0µL 2,0µL 0,2µL Ya5ACA1611 _1,0µL a _{Tris HCL 75 mM ph 9,0; KCL 50 mM; 20 mM (NH} 4)S04

b _{0,25 µL de solução (10 mM de cada base)}

A solução da PCR juntamente com o DNA genômico foram submetidos a um programa específico no termociclador para a realização da amplificação (Tabela 3).

Tabela 3- Programa utilizado para amplificação das seqüências Alu

Quantidade de ciclos Temperatura/ Tempo

1 ciclo 94º C por 5 minutos;

94º C por 30 segundos;

5 ciclos 58º C por 45 segundos;

72º C por 90 segundos; 94º C por 30 segundos;

5 ciclos 56º C por 45 segundos;

72º C por 90 segundos; 94º C por 30 segundos;

25 ciclos 54º C por 45 segundos;

72º C por 90 segundos;

1 ciclo _{72º C por 10 minutos}

4.3.3 Análise do Produto Amplificado

Depois do término da PCR, as amostras foram submetidas à eletroforese em gel não desnaturante de poliacrilamida a 8%. O preparo dos reagentes e soluções são descritos no Anexo II. Para a montagem do gel foi utilizado um tubo falcon, onde foi colocado primeiramente 5ml de poliacrilamida; 5ml de TBE 5x; 15ml de água.

Os catalisadores da reação de polimerização do gel, TEMED e persulfato de potássio foram adicionados à mistura do gel imediatamente antes de verter a mistura em um cassete previamente montado, composto de duas placas de vidro separadas por espaçadores de teflon e presas com grampos. Logo após a mistura de gel ter sido vertida, um pente de teflon foi colocado na borda superior, formando poços no gel, onde posteriormente foram aplicadas as amostras de DNA amplificado. Aguardou-se a polimerização por no mínimo 30 minutos.

Após a polimerização do gel o pente foi retirado e os poços foram lavados com água. O gel polimerizado foi montado em cuba de eletroforese vertical contendo tampão TBE, para cubas, em ambos os pólos (porção superior e inferior). Esta cuba foi conectada a uma fonte de voltagem, Amershan Pharmacia Biotech (EPS 1001), ajustada à voltagem ou corrente constante necessária para uma boa separação dos fragmentos amplificados e as amostras amplificadas foram aplicadas nos poços.

4.3.4 Coloração com Nitrato de Prata e Secagem do Gel

Reagentes e soluções:

Solução de nitrato de prata: 10 g nitrato de prata; 100 ml de H2O. Dissolver a prata em uma parte da água e depois completar com o restante, manter a solução ao abrigo da luz (volume final 100 ml).

Solução fixadora: 160 ml etanol (PA) e 7 ml de ácido acético glacial (PA); 833 ml de H2O (volume final 1l).

Solução reveladora: 22,5 g de NaOH; 1l de H2O. Dissolver em um agitador o hidróxido de sódio em uma parte da água e depois completar com o restante (volume final 1l). Na hora da coloração adicionar 1 ml de formaldeído para cada 100 ml da solução.

Procedimento:

A coloração do gel foi feita de acordo com protocolo adaptado de Sanguinetti

et al. (1994):

Fixação: Após a retirada das placas de vidro e dos espaçadores o gel foi colocado em um recipiente de vidro contendo 100 ml de solução fixadora. Impregnação com Nitrato de prata: Adicionou-se 2,0 ml de solução de

nitrato de prata, e agitou-se por 5 minutos. A solução foi então descartada e o gel lavado em água por cerca de 10 segundos, agitando levemente e, ao final, descartando a água.

Revelação: A solução reveladora foi despejada cuidadosamente no recipiente contendo o gel, que foi submetido à agitação por alguns minutos até que as bandas aparecessem nitidamente. Esta solução foi pré-aquecida em estufa, para facilitar a reação de coloração, que no frio fica mais lenta.

Bloqueio da reação: Após ter sido revelado, a solução reveladora foi descartada e a reação bloqueada com a lavagem direta do gel em 100 ml de solução fixadora. No caso de géis maiores (22 cm) adicionou-se o dobro das soluções.

Secagem do gel: Após a leitura, todos os géis passaram por um simples processo de secagem para que pudessem ser armazenados para análises e confirmações posteriores. Duas folhas de papel celofane foram molhadas; uma placa de vidro, com a área maior que a do gel, foi coberta com uma das folhas; o gel foi colocado sobre a placa com o celofane sem deixar bolhas; o gel foi então bem molhado e coberto com a outra folha de celofane, também com cuidado de não deixar bolhas; este gel foi deixado secando a temperatura ambiente por dois ou três dias até a secagem completa, sendo então devidamente identificado e arquivado.

4.4 ANÁLISES ESTATÍSTICAS

4.4.1 Freqüências Alélicas e Equilíbrio de Hardy-Weinberg

As freqüências alélicas foram obtidas por contagem gênica direta a partir da leitura dos géis de poliacrilamida, sendo então utilizadas para a estatística descritiva, utilizando o programa GENEPOP (RAYMOND e ROUSSET, 1995). A freqüência alélica é dada por:

n

nij

nii

Xi

2

2

₊

=

Xi= freqüência alélica;

nii e nij = correspondem ao número de homozigotos e heterozigotos para o alelo i;

n = número de indivíduos observados;

A aderência das freqüências genotípicas observadas às proporções teóricas de Hardy-Weinberg foi verificada com o emprego do programa GENEPOP (RAYMOND e ROUSSET, 1995b) versão 2.0 para Windows. Foram realizados três testes baseados na hipótese nula de união aleatória dos gametas: teste de probabilidade, teste para detecção da deficiência e para detecção do excesso de heterozigotos.

No teste de probabilidade, o valor de P corresponde à soma de probabilidades de todas as tabelas com probabilidade menor ou igual ao observado. O segundo e o terceiro são testes mais sensíveis do que o de probabilidade e utilizam uma hipótese alternativa (H1) de excesso ou de deficiência de

heterozigotos, respectivamente.

O nível de significância foi estabelecido em 0,05, mas foram incluídos também os resultados da correção de Bonferroni, que consiste em dividir o α pretendido pelo número de testes independentes realizados (WEIR e

COCKERHAM, 1996). Considerando todos os loci analisados, o novo α (αBonf) foi

estabelecido em 0,05/31-1= 0,001.

4.4.2 Associação Par-a-Par entre Loci

A análise de associações par-a-par entre loci foi realizada utilizando-se o programa GENEPOP 2.0 (RAYMOND & ROUSSET, 1995b). A hipótese nula é de que a distribuição genotípica em um locus é independente da distribuição em outro

locus. Esta análise foi aplicada para verificar desvios do esperado pela regra de

multiplicação entre pares de loci localizados em diferentes cromossomos. A palavra “ligação” neste caso não está relacionada com associação física entre alelos de loci de um mesmo cromossomo.

Com a realização de múltiplos testes, no caso um para cada par de loci sendo testado, sob a mesma H0 utilizando os mesmos loci, aumentam as chances de se

cometer um erro do tipo I (Ha, 2008) e, com isso, um aumento no α real em aproximadamente o número de testes independentes realizados.

O nível de significância foi estabelecido em 0,05, mas foram incluídos também os resultados da correção de Bonferroni, que consiste em dividir o α pretendido pelo número de testes independentes realizados (WEIR e COCKERHAM, 1996). Para as quatros amostras analisadas, o novo α (αBonf) foi estabelecido em 0,05/465-1=

0,00018.

4.4.3 Diferenciação genética das populações

Os testes exatos para diferenciação populacional foram realizados com o uso do programa GENEPOP 2.0 (RAYMOND & ROUSSET, 1995b). Este utiliza tabelas de contingência RxC geradas automaticamente para cada locus, em que R é o número de populações e C é o número de alelos no locus.

Este procedimento compara cada locus em pares de populações, para determinar se existem diferenças nas freqüências alélicas observadas, onde a hipótese nula testada é a de que a distribuição alélica é idêntica entre as populações (RAYMOND & ROUSSET, 1995a) .

A diferenciação genotípica para os loci autossômicos foi realizada pelo teste exato G (GOUDET, 1996) que tem o mesmo princípio e testa a hipótese nula onde a distribuição genotípica é idêntica entre as populações.

4.4.4 Diversidade gênica

A análise de diversidade genética foi estimada usando o parâmetro HS (NEI,

1987) usando o programa FSTAT 2.8 (GOUDET, 1996).

Em que:

HS = a heterozigose média dentro das populações, ou diversidade gênica;

A diversidade gênica média

( )

para cada amostra utilizando o programa DISPAN (OTA, 1993) , conforme a equação 8.6 apresentada em Nei (1987).

4.4.5 Mistura Étnica

As estimativas de mistura étnica foram obtidas por meio do método de identidade gênica (CHARKRABORTY, 1985) com o auxílio do programa ADMIX2. O ajuste a este modelo é avaliado pelo coeficiente de correlação múltipla (R2) entre as

freqüências alélicas nas populações híbridas e aquelas das populações ancestrais (CHARKRABORTY, 1986).

Para o cálculo das estimativas de mistura étnica foram utilizadas as freqüências das populações parentais descritas na literatura (http://falcon.roswellpark.org:9090/) e estas se encontram disponíveis na tabela 4.

A utilização simultânea de diversos loci genéticos, no cálculo de mistura étnica, teve por objetivo minimizar os efeitos dos fatores limitantes, inerentes ao método de investigação, tais como desvios de amostragem, freqüências ancestrais representadas por médias ponderadas, forças microevolutivas atuando junto com a mistura (BORTOLINI, 1991)

5 RESULTADOS

5.1 FREQÜÊNCIAS ALÉLICAS

Todos os alelos identificados para estes loci foram encontrados na amostra do presente estudo (Tabela 4). Todos os marcadores utilizados são caracterizados como informativos de ancestralidade por apresentarem um alto diferencial de freqüência.

Os loci Ya5AC1982, Ya5ACA1400, Ya5ACA1441, Ya5ACA1555, Ya5ACA1184, Ya5_541F e Ya5NBC354 foram os que apresentaram maior freqüência alélica para ausência da inserção Alu em todas as amostras analisadas. Já o locus Ya5ACA733 apresentou menor freqüência para ausência da inserção nos controles euro-brasileiros (Figura 5). Os loci Ya5_541F, Ya5NBC354 estão com maior freqüência alélica nas amostras de controles afro-brasileiros (Figura 6). Os loci Ya5ACA647 e Ya5ACA1400 foram mais frequentes nos controles euro-brasileiros e os loci Ya5ACA1555 e Yb8NBC157 foram mais frequentes nos casos afro-brasileiros (Figura 4), enquanto que o locus Yb8NBC157 teve maior frequência alélica em controles afro-brasileiros (Figura 6).

Tabela 4 - Freqüências alélicas dos 30 polimorfismos de inserção Alu analisados em casos e

controles e nas populações parentais.

Inserções Alu

Casos Controles

Afro-americanos1 Europeus1 Asiáticos1

Euro-brasileiros brasileirosAfro- brasileirosEuro- brasileiros

Afro-Ya5ACA647 n 364 175 164 138 16 18 18 - 0, 576 0, 595 0, 678* _{0, 622* 0, 406 0, 833 1, 000} + 0, 424 0, 405 0, 322 0, 378 0, 594 0, 167 0, 000 Ya5ACA733 n 364 175 164 138 20 20 19 - 0, 454 0, 460 0, 397 0, 492 0, 775 0, 700 0, 158 + 0, 546 0, 540 0, 603 0, 508 0, 225 0, 300 0, 842 Ya5NBC45** n 364 175 164 138 20 20 20 - 0, 519 0, 555 0, 531 0, 489 0, 500 0, 950 1, 000 + 0, 481 0, 445 0, 469 0, 511 0, 500 0, 050 0, 000 Ya5AC1982 n 364 175 164 138 20 20 20 - 0, 615 0, 624 0, 644* 0, 643* 0, 225 0, 300 0, 725 + 0, 385 0, 376 0, 356 0, 357 0, 775 0, 700 0, 275 Ya5ACA917** n 364 175 164 138 20 20 20 - 0, 546 0, 590 0, 586 0, 590 0, 225 0, 700 0, 675 + 0, 454 0, 410 0, 414 0, 410 0, 775 0, 300 0, 325 Ya5ACA1400 n 364 175 164 138 19 14 12 - 0, 653* _{0, 636}* _{0, 663}* _{0, 545 0, 474 0, 893 0, 875} + 0, 347 0, 364 0, 337 0, 455 0, 526 0, 107 0, 125 Ya5AC2282 n 364 175 164 138 20 20 20 - 0, 533 0, 536 0, 509 0, 542 0, 300 0, 850 0, 900 + 0, 467 0, 464 0, 491 0, 458 0, 700 0, 150 0, 100 Ya5ACA1441** n 364 175 164 138 16 20 18 - 0, 625* _{0, 605 0, 595 0, 636}* _{0, 469 0, 850 0, 889} + 0, 375 0, 395 0, 405 0, 364 0, 531 0, 150 0, 111 Ya5NBC132** n 364 175 164 138 08 13 09 - 0, 517 0, 563 0, 479 0, 496 0, 500 1, 000 1, 000 + 0, 483 0, 437 0, 521 0, 504 0, 500 0, 000 0, 000 Ya5AC2670** n 364 175 164 138 17 13 13 - 0, 576 0, 599 0, 552 0, 534 0, 441 0, 000 0, 000 + 0, 424 0, 401 0, 448 0, 466 0, 559 1, 000 1, 000 Ya5ACA1555 n 364 175 164 138 15 16 17 - 0, 629 0, 683* _{0, 648}* _{0, 630 0, 467 0, 562 1, 000} + 0, 371 0, 317 0, 352 0, 370 0, 533 0, 438 0, 000

Inserções Alu

Casos Controles

Afro-americanos1 Europeus1 Asiáticos1

Euro-brasileiros Afro-brasileiros Euro-brasileiros Afro-brasileiros Yb8NBC157 n 364 175 164 138 20 18 12 - 0, 596 0, 665* _{0, 586 0, 664}* _{0, 950 0, 417 0, 708} + 0, 404 0, 335 0, 413 0, 336 0, 050 0, 583 0, 292 Ya5NBC150 n 364 175 164 138 17 20 18 - 0, 564 0, 509 0, 482 0, 470 1, 000 0, 950 0, 361 + 0, 436 0, 491 0, 518 0, 530 0, 000 0, 050 0, 639 Ya5ACA1002** n 364 175 164 138 20 21 20 - 0, 609* _{0, 623}* _{0, 561 0, 496 0, 000 0, 452 0, 575} + 0, 391 0, 377 0, 439 0, 504 1, 000 0, 548 0, 425 Ya5NBC327** n 364 175 164 138 20 19 20 - 0, 544 0, 553 0, 537 0, 615* _{0, 325 1, 000 0, 800} + 0, 456 0, 447 0, 463 0, 385 0, 675 0, 000 0, 200 Ya5ACA1242** n 364 175 164 138 16 11 15 - 0, 548* _{0, 586}* _{0, 562* 0, 578}* _{0, 668 0, 000 0, 167} + 0, 452 0, 414 0, 438 0, 422 0, 332 1, 000 0, 833 Ya5_531** n 364 175 164 138 07 20 15 - 0, 572 0, 633* _{0, 543 0, 574}* _{0, 286 1, 000 1, 000} + 0, 428 0, 367 0, 457 0, 426 0, 714 0, 000 0, 000 Yb8NBC93** n 364 175 164 138 14 14 14 - 0, 513 0, 491 0, 469 0, 515 0, 179 0, 571 0, 679 + 0, 487 0, 509 0, 531 0, 485 0, 821 0, 429 0, 321 Ya5ACA928 n 364 175 164 138 20 20 20 - 0, 551* _{0, 610}* _{0, 515}* _{0, 613}* _{0, 500 0, 425 0, 025} + 0, 449 0, 390 0, 485 0, 387 0, 500 0, 575 0, 975 Ya5ACA1100** n 364 175 164 138 20 18 20 - 0, 587 0, 567 0, 565 0, 564 0, 450 1, 000 0, 900 + 0, 413 0, 433 0, 435 0, 436 0, 550 0, 000 0, 100 H7_F_148 n 364 175 164 138 20 20 20 - 0, 607* _{0, 601}* _{0, 630}* _{0, 556 0, 425 0, 375 0, 000} + 0, 393 0, 399 0, 370 0, 444 0, 575 0, 625 1, 000 Ya5ACA1184** n 364 175 164 138 19 16 20 - 0, 581 0, 603* _{0, 619}* _{0, 632* 0, 158 0, 688 0, 950} + 0, 419 0, 397 0, 381 0, 368 0, 842 0, 312 0, 050 Ya5ACA866** n 364 175 164 138 20 20 20 - 0, 536* _{0, 539}* _{0, 575}* _{0, 496 0, 025 0, 700 0, 275}

Inserções Alu

Casos Controles

Afro-americanos1 Europeus1 Asiáticos1

Euro-brasileiros Afro-brasileiros Euro-brasileiros Afro-brasileiros + 0, 464 0, 461 0, 425 0, 504 0, 975 0, 300 0, 725 Ya5NBC241 n 364 175 164 138 17 18 19 - 0, 559* _{0, 536}* _{0, 506}* _{0, 541}* _{0, 441 0, 194 0, 605} + 0, 441 0, 464 0, 494 0, 459 0, 559 0, 806 0, 395 PV92 n 364 175 164 138 43 32 49 - 0, 524* _{0, 552}* _{0, 566}* _{0, 598}* _{0, 209 0, 141 0, 860} + 0, 476 0, 448 0, 434 0, 402 0, 791 0, 859 0, 140 Ya5_541F** n 364 175 164 138 17 20 19 - 0, 607* _{0, 593 0, 641}* _{0, 709}* _{0, 059 0, 550 0, 105} + 0, 393 0, 407 0, 359 0, 291 0, 941 0, 450 0, 895 Yb8NBC67 n 364 175 164 138 18 15 19 - 0, 600* _{0, 584 0, 591 0, 659}* _{0, 583 0, 933 0, 632} + 0, 400 0, 416 0, 409 0, 341 0, 417 0, 067 0, 368 Ya5ACA862** n 364 175 164 138 19 20 19 - 0, 574 0, 560 0, 578 0, 550 0, 711 0, 300 0, 132 + 0, 426 0, 440 0, 422 0, 450 0, 289 0, 700 0, 868 Ya5NBC354 n 364 175 164 138 20 19 18 - 0, 636* _{0, 618}* _{0, 601}* _{0, 663}* _{0, 700 0, 632 0, 278} + 0, 364 0, 382 0, 399 0, 337 0, 300 0, 368 0, 722 Ya5ACA1611** n 364 175 164 138 19 18 19 - 0, 473 0, 530 0, 585 0, 572 0, 211 0, 611 0, 737 + 0, 527 0, 470 0, 415 0, 428 0, 789 0, 389 0, 263

Nota: *_{alelos mais freqüentes.}

**_{Loci que diferenciam exclusivamente afro-americanos de europeus e asiáticos.}

1 _{(BENNETT et al. 2004; CARTER et al. 2004; MAMEDOV et al. 2005; OTIENO et al. 2004; RAY et al.} 2005; ROY et al. 2000; WANG et al. 2006; WATKINS et al. 2001).

Nas Figuras a seguir, podemos observar a comparação gráfica das amostras analisadas com as frequências das populações parentais, afro-americanos, europeus e asiáticos. Pode-se observar à alta frequência européia e asiática para a maioria dos loci analisados. Dos 30 loci analisados, apenas sete (Ya5ACA733, Yb8NBC157, Ya5NBC150, Ya5ACA1242, Yb8NBC67, Ya5ACA862 e Ya5NBC354) apresentam uma frequência maior que 50% para o componente afro-americano. Porém, do total de loci analisados, 16 diferenciam exclusivamente os afro-americanos dos europeus e asiáticos.

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 Ya5 AC A64 7 Ya5 AC A73 3 Ya5 NB C45 Ya5 AC 1982 Ya5 AC A91 7 Ya5 AC A14 00 Ya5 AC 2282 Ya5 AC A14 41 Ya5 NB C13 2 Ya5 AC 2670 Ya5 AC A15 55 Yb8 NB C15 7 Ya5 NB C15 0 Ya5 AC A10 02 Ya5 NB C32 7 Ya5 AC A12 42 Ya5 _531 Yb8 NB C93 Ya5 AC A92 8 Ya5 AC A11 00 H7_ F_14 8 Ya5 AC A11 84 Ya5 AC A86 6 Ya5 NB C24 1 PV9 2 Ya5 _541 F Yb8 NB C67 Ya5 AC A86 2 Ya5 NB C35 4 Ya5 AC A16 11 Casos Euro-brasileiros Afro-americanos Europeus Asiásticos

Figura 3 - Comparação gráfica das frequências alélicas da amostra Casos Euro-brasileiros obtidas no presente estudo com as frequências das populações

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 Ya5 AC A64 7 Ya5 AC A73 3 Ya5 NB C45 Ya5 AC 1982 Ya5 AC A91 7 Ya5 AC A14 00 Ya5 AC 2282 Ya5 AC A14 41 Ya5 NB C13 2 Ya5 AC 2670 Ya5 AC A15 55 Yb8 NB C15 7 Ya5 NB C15 0 Ya5 AC A10 02 Ya5 NB C32 7 Ya5 AC A12 42 Ya5 _531 Yb8 NB C93 Ya5 AC A92 8 Ya5 AC A11 00 H7_ F_14 8 Ya5 AC A11 84 Ya5 AC A86 6 Ya5 NB C24 1 PV9 2 Ya5 _541 F Yb8 NB C67 Ya5 AC A86 2 Ya5 NB C35 4 Ya5 AC A16 11 Casos Afro-brasileiros Afro-americanos Europeus Asiáticos

Figura 4 - Comparação gráfica das frequências alélicas da amostra Casos Afro-brasileiros obtidas no presente estudo com as frequências das populações

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 Ya5 AC A64 7 Ya5 AC A73 3 Ya5 NB C45 Ya5 AC 1982 Ya5 AC A91 7 Ya5 AC A14 00 Ya5 AC 2282 Ya5 AC A14 41 Ya5 NB C13 2 Ya5 AC 2670 Ya5 AC A15 55 Yb8N BC 157 Ya5 NB C15 0 Ya5 AC A10 02 Ya5 NB C32 7 Ya5 AC A12 42 Ya5 _531 Yb8N BC 93 Ya5 AC A92 8 Ya5 AC A11 00 H7_ F_14 8 Ya5 AC A11 84 Ya5 AC A86 6 Ya5 NB C24 1 PV 92 Ya5 _541 F Yb8N BC 67 Ya5 AC A86 2 Ya5 NB C35 4 Ya5 AC A16 11 Controles Euro-brasileiros Afro-americanos Europeus Asiáticos

Figura 5 - Comparação gráfica das frequências alélicas da amostra Controles Euro-brasileiros obtidas no presente estudo com as frequências das