RELATÓRIO 1 - Purificação do Lisozima da clara do ovo por cromatografia de troca iónica

Texto

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Bioquímica Experimental I

Departamento de Química e Bioquímica

Licenciatura em Bioquímica

26 e 27 de Setembro de 2011

Ano Lectivo 2011/2012

Lisozima da

clara do ovo por

cromatografia de

troca iónica

Docente:

Carla Real Afonso

Trabalho realizado por:

Alexandra Salvado, nº 40267

Andreia Sousa, nº 40261

Telmo Paiva, nº 40243

PL 3

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Índice

Resumo ………... 3 Material é Métodos………. 4 Material ………. 4 Métodos ……….. 5 Resultados e Discussão ……….. 12 Conclusão ………... 33 Bibliografia ………. 35 Anexos ……… I

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Resumo

Este trabalho laboratorial teve como principal objectivo exemplificar um processo de purificação enzimática através da realização da purificação parcial do lisozima da clara do ovo por cromatografia de troca catiónica. Posteriormente à purificação realizaram-se outros objectivos, tais como: a determinação do grau de purificação do enzima (através de uma electroforese SDS-PAGE), a determinação da actividade enzimática de algumas fracções recolhidas durante a cromatografia e, por último, o cálculo do rendimento deste processo.

Na cromatografia de troca iónica efectuada foi utilizada uma resina de troca catiónica, ou seja, uma resina com carga negativa que liga os catiões do meio. Nesta cromatografia usou-se como fase estacionária um permutador catiónico fraco, o CM-Sephadex G-25 e como fase móvel utilizaram-se dois tipos de tampão com diferentes valores de pH. O primeiro tampão utilizado, o tampão Tris (pH 8,2) foi usado para a lavagem da coluna e para as proteínas de pI inferior a 10 serem eluídas. O segundo tampão, o tampão Carbonatos de Sódio (pH 10,5), foi usado para a eluição das proteínas com pI superior a 10. A lisozima apresenta um pI de 10,7 pelo que foi eluída com o segundo tampão, assim como a avidina, que apresenta um pI de 10.

Como também já foi referido, neste trabalho realizou-se também uma electroforese unidimensional em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) com o propósito de determinar a pureza do lisozima recolhido, por comparação com um padrão do enzima puro. Como será possível ver mais à frente, nota-se umas marcas de arrastamento no poço do lisozima recolhido, pelo que é sinal da existência de impurezas (nomeadamente outras proteínas).

Por fim, é de notar que nas fracções onde as actividades enzimáticas foram superiores é de suspeitar a existência do enzima. O rendimento associado à cromatografia de troca iónica foi de 112,2%e o grau de purificação obtido foi de 2002,7 vezes, os quais são incomportáveis com o esperado, pois foi usada uma absorvância de PCO de outro grupo, visto terem sido os únicos a medi-la.

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Material e Métodos

Material

Cromatografia de troca iónica

 Coluna Cromatográfica 40 x 2,6 cm  Bomba peristáltica  Cronómetro  Espectrofotómetro UV-Vis  Cuvettes de quartzo  Aparelho medidor de pH  Gaze

 Material corrente de laboratório

Doseamento da actividade enzimática

 Homogeneizador de Potter-Elvejam  Cuvettes de plástico

 Pipeta automática  Pipeta graduada de 5mL

SDS-PAGE

 Sistema de polimerização de géis

 Placas de vidro para electroforese (mini)  Tina de electroforese vertical (mini)  Espaçadores (0,75mm) e pentes (0,75mm)  Fonte de alimentação (500V/150mA)  Pipetas automáticas

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Métodos

Cromatografia de troca iónica

 Montagem da Coluna

Num Kitasato, deixar sair o ar durante 15-30 min antes de introduzir o gel na coluna

• Guardar num recipiente com rolha a 4oC

Decantar a maior parte do tampão (75% gel sedimentado e 25% tampão sobrenadante)

Montar a coluna na vertical e ver se está bem fechada

Encher a coluna com Tampão Tris-HCl (pH 8,2) 0,05 M com NaCl 0,05 M

• Manter a sua saída fechada

Abrir a válvula para a entrada do tampão e introduzir cerca de 5-10 mL do tampão anterior.

Verter a mistura do gel em tampão na coluna, com a ajuda de um funil e de uma vareta de vidro, até encher completamente

Abrir a válvula de saída da coluna, mantendo um caudal de tampão Tris constante (1,6 - 1,8 mL/min

• ATENÇÃO: Nunca deixar secar o topo da coluna

Medir o fluxo de tampão através da coluna, medindo o volume eluído em 2 min.

Preparar uma coluna com cerca de 10-15 cm de altura

Equilibrar a coluna através da passagem de um volume de tampão inicial de eluição aproximadamente igual a 2-3 vezes o volume total da coluna preparada

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 Preparação da Amostra

 Aplicação da Amostra

Filtrar uma clara do ovo para um copo de 100 mL

Comprimir a gaze suavemente e o material que passar é o filtrado

Transferir 5 mL de filtrado para um copo de 100 mL

Diluir com 35 mL de Tampão Tris (pH 8,2) 0,05 M com NaCl 0,05 M (diluição 1/8)

• O nome do filtrado será Preparado da Claro do Ovo (PCO) Passar a mistura através de uma camada de lá de vidro colocada no interior duma seringa de 10 mL.

Manter o PCO a 4ºC, bem identificado até ao final do trabalho

Calibrar um aparelho medidor de pH

Ligar a bomba peristáltica e controlar o fluxo de entrada do tampão para 1,6 - 1,8 mL/min

Parar a eluição da coluna e colocar um tubo de ensaio na sua saída

Aplicar um volume de PCO na coluna igual a cerca de 8% do seu volume total

• Cuidado para não secar o gel!

Depois da amostra penetrar toda no gel, abrir a saída da coluna e iniciar a sua eluição.

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Página | 7 • Controlar o fluxo!

Recolher fracções de 15 mL em diferentes provetas até passar na coluna um volume total de tampão aproximadamente igual ao volume da coluna preparada.

Medir o volume de pH de cada fracção recolhida. Colocá-las, só depois, em gelo!

Proceder à eluição da coluna com tampão de carbonatos de sódio (pH 10,5) 0,2 M

Recolher fracções de 10 mL até registar um aumento brusco no seu valor de pH para 8,5

Reduzir, depois, o volume de cada fracção para 5 mL Parar a eluição da coluna quando o valor de pH das fracções estabilizar perto de 10,5

• Ler também as absorvências do tampão Tris e de carbonatos de sódio Realizar as leituras de absorvências das fracções a 280 nm (acertar o zero com água destilada).

Conservar as fracções bem identificadas

Lavar a coluna com um volume de tampão de carbonatos de sódio (pH 10,5) 0,2 M igual a , pelo menos, 2 vezes o volume da coluna Regenerar as condições iniciais passando 2 volumes de solução tampão de eluição Tris-HCl (pH 8,2) 0,05 M com NaCl 0,05 M e NaN3 0,02 % (m/v) através da coluna

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Doseamento da actividade enzimática

SDS-PAGE

Lavar muito bem as placas de vidro, os espaçadores e os pentes com etanol e secar

Colocar as placas de vidro em "sandwich": por cima da placa de vidro maior com os espaçadores colocar a placa de vidro mais pequena

Introduzir a "sandwich" na peça de suporte para a mesma

Apertar os parafusos e confirmar se não há fugas

Introduzir um pente na "sandwich" até ficarem totalmente inseridos entre as duas placas

Marcar com uma cante um traço 1,0 cm abaixo do nível inferior dos dentes do pente. Este será o nível até ao qual se introduzirá a solução de gel resolvente ou de separação

Ajustar o zero do espectrofotómetro a 450 nm com tampãio de fosfatos (pH 7,0) 0,1 M

Adicionar 2,9 mL de substrato de parede celular a uma célula de absorção

Adicionar 0,1 mL da fracção em estudo e misturar rapidamente por inversão, tapando o topo da célula com parafilm

Medir o decréscimo da absorvância a 450 nm da amostra durante um minuto

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 Preparação dos géis

Adicionar os agentes polimerizantes (TEMED e PSA) à solução de gel resolvente

Adicionar a solução do gel resolvente à "sandwich" com o auxílio de uma pipeta de Pasteur

• Evita a formação de uma superfície de polimerização irregular, que ocorreria se esta estivesse directamente exposta ao ar

Introduzir um pouco de água destilada

Deixar a caixa de polimerização em repouso até que o gel polimerize

Depois de polimerizado, inverter a caixa de polimerização de modo a escorrer toda a água da superfície do gel

Introduzir o pente na "sandwich" de modo a não criar bolhas de ar

Deixar a repousar para polimerizar

Marcar a posição dos poços do pente no gel

Quando o gel de concentração polimerizar, tirar o pente lentamente e com cuidado

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 Montagem da câmara electroforética

 Electroforese

Retirar a peça auxiliar de montagem da caixa de polimerização

Deitar na bancada a peça central da câmara de electroforese

Encaixar a montagem com o gel pronto a ser usado na peça central da câmara de electroforese

Introduzir a peça central no reservatório de tampão inferior da câmara de electroforese

Colocar a tampa da câmara electroforética

Ligar os eléctrodos à fonte de tensão (atenção à polaridade!)

Colocar a voltagem nos 100 V

Registar a intensidade de corrente no início e no fim da electroforese

Deixar correr a electroforese até o azul de bromofenol atingir o final do gel resolvente (1h - 1h30)

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 Remoção do gel

Desligar a fonte de alimentação e despejar a solução de electroforese Deitar a peça central da câmara de electroforese na bancada e

remover a peça auxiliar de montagem Remover a "sandwich"

Puxar um dos separadores para fora, sem o remover totalmente Levantar o espaçador de modo a que a placa de vidro superior se separe do gel

Remover a placa

O gel ficará agarrado a uma das placas Cortar um dos cantos do gel

Medir o comprimento do gel e a distância migrada pelo azul de bromofenol

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Resultados e Discussão

Gráfico de eluição da cromatografia realizada apresentando a absorvância a 280 nm e valor de pH de cada fracção em função do volume eluído. Discussão do gráfico obtido face às propriedades da técnica cromatográfica

Na cromatografia de troca iónica efectuada foi utilizada uma resina de troca catiónica, ou seja, uma resina com carga negativa que liga os catiões do meio. Como a composição em resíduos de aminoácidos varia de proteína para proteína, a carga global destas apresenta valores diferentes para diferentes valores de pH. Assim:

 as proteínas que apresentam carga global positiva, ou seja, o valor de pH é inferior ao pI (ponto isoeléctrico), ligam-se a uma resina catiónica.

 as proteínas que apresentam carga global negativa, ou seja, o valor de pH é superior ao pI (ponto isoeléctrico), ligam-se a uma resina aniónica.

Como a resina é de troca catiónica, ligou as proteínas que apresentavam carga global positiva. As outras proteínas, como não se ligam à coluna foram eluídas com o tampão.

A proteína que se pretendeu purificar tem pI igual a 10,7, como a resina é de troca catiónica, para que esta adira à coluna, é necessário que tenha carga global positiva, logo, o pH da solução utilizada na preparação da PCO teve de ser inferior ao valor de pI da proteína, bem como o pH da solução com que se fez a lavagem da coluna. Assim, ao aplicar a PCO na coluna, a lisozima liga-se à coluna enquanto as restantes proteínas, por terem pI inferior ao pH, apresentam a carga global igual à da coluna e como tal não se ligam, sendo eluídas com a solução inicial. Ao aumentar o pH do tampão de eluição proteínas ligadas ficam com carga global diferente (negativa) e como tal são também eluídas com o tampão. Desta forma, obtêm-se as diferentes proteínas contidas na PCO variando o pH das soluções.

Se a variação do pH não for suficiente para eluir as proteínas da coluna, pode-se aumentar a força iónica do tampão, adicionando cloreto de sódio (NaCl) ou cloreto de potássio (KCl). Assim, a competição entre as partículas do sal e a proteína aumenta e o sal começa a ligar-se à coluna obrigando as proteínas a ser eluídas com o tampão.

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Quadro 1. Valores das absorvâncias (a 280 nm) e de pH das fracções recolhidas na eluição da coluna.

Volume de cada fracção Volume de eluição total Fracções Absorvância a 280 nm pH Diluição 15 mL 15 1 0,080 8,21 - 30 2 0,872 8,21 1:2 45 3 0,936 8,23 1:3 20 mL 65 4 0,098 8,18 - 10 mL 75 5 0,049 8,16 - 85 6 0,033 8,14 - 95 7 0,032 8,15 - 105 8 0,044 8,17 - 115 9 0,037 8,36 - 125 10 0,032 8,58 - 5 mL 130 11 0,031 8,63 - 135 12 0,040 8,65 - 140 13 0,032 8,67 - 145 14 0,042 8,69 - 150 15 0,041 8,69 - 155 16 0,189 8,89 - 160 17 0,291 9,52 - 165 18 0,270 9,95 - 170 19 0,275 10,16 - 175 20 0,108 10,35 - 180 21 0,078 10,45 - 185 22 0,056 10,5 -

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Figura 1. Gráfico de eluição da cromatografia realizada, sendo a absorvância (a 280 nm) e o valor de pH de cada

fracção em função do volume de eluição.

Como é visível no gráfico anterior (Figura 1), da fracção 1 à 4, ou seja, dos 15 aos 65 mL eluídos, é quando se observa maior absorvância; havendo um pico de absorvância quando o volume eluído é 45 mL, ou seja, na fracção 3. Como o pH do tampão inicial é de 8,2, todas as proteínas, à excepção da Lisozima e da Avidina, são eluídas juntamente com o tampão, pois não se ligam à coluna por terem carga negativa (como é visível no quadro abaixo – quadro 2). Ao alterar a solução tampão de eluição para uma com pH superior (pH 10,5), alterou-se a carga global das proteínas e como tal a sua ligação com a coluna. As fracções recolhidas começaram a ter valores de pH mais altos. A avidina que tem pI 10 ficou com carga negativa, sendo eluída com o tampão de eluição, seguindo-se o lisozima, o enzima que se pretendia separar, que ficou com carga nula. 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 1,1 1,2 15 30 45 65 75 85 95 105 115 125 130 135 140 145 150 155 160 165 170 175 180 185 pH Abs o rv â ncia a 2 8 0 nm Volume eluído /mL

Absorvância e valor de pH VS volume de

eluição

Absorvância pH

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Página | 15 Proteínas pI Ovalbumina 4,5 Ovotransferrina 6,05 Ovomucoide 4,1 Lisozima 10,7 Ovoinibidor 5,1 Ovomacroglobulina 4,5 Ovoglicoproteína 3,9 Avidina 10

Explicação da variação descontínua do valor de pH das diferentes fracções colectadas na cromatografia de troca iónica e a compactação reversível sofrida pelo gel na coluna durante este processo cromatográfico. Cálculo da força iónica das soluções tampão utilizadas.

A variação descontínua do valor de pH das diferentes fracções colectadas na cromatografia de troca iónica deve-se a terem sido utilizados dois tampões diferentes:

 Tampão Tris-HCl (pH 8,2) 0,05 M com NaCl 0,05 M (utilizado nas primeiras 4 fracções – volume equivalente ao volume da coluna - ver anexos – I)

 Tampão Carbonatos de Sódio (pH 10,5) 0,2 M (restantes fracções)

Se o tampão de eluição utilizado não tivesse sido trocado, aumentando-se o seu pH gradualmente, a variação que se veria nas fracções seria contínua, e não descontínua como foi o caso.

A utilização de dois tampões de eluição diferentes influenciou a altura da coluna inicial (11 cm) devido às diferentes forças iónicas dos dois tampões.

A força iónica (I) é a medida do campo eléctrico devido aos iões presentes em solução. Assim, está relacionada com a concentração de electrólitos, catiões e aniões. A forção iónica das soluções tampão utilizadas podem ser calculadas através da seguinte expressão:

Onde é a concentração da espécie com carga e é a carga da respectiva espécie.

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Força Iónica do Tampão Tris-HCl (pH 8,2) 0,05 M com NaCl 0,05 M As equações que representam o equilíbrio do tampão são:

1. Cálculo das concentrações de todas as espécies e respectiva carga

Através da equação de Henderson-Hasselbalch, obtém-se:

2. Cálculo da força iónica

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Página | 17 As equações que representam o equilíbrio do tampão são:

1. Cálculo das concentrações de todas as espécies e respectiva carga

Através da equação de Henderson-Hasselbalch, obtém-se:

2. Cálculo da força iónica

Visto que a força iónica do segundo tampão é maior que a do primeiro, o segundo tampão causa o compactamento da coluna. As partículas de gel carregadas negativamente, unem-se mais aos iões Na+ do tampão de carbonatos de sódio por a concentração destes catiões ser superior neste tampão, o que em conjunto com outros iões presentes em solução aumenta a força iónica causando a compactação da coluna. Este processo de compactação é reversível – basta adicionar um tampão com menor força iónica para que a coluna descompacte.

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Cálculo da concentração proteica de cada fracção e do PCO usando as leituras de Absorvância a 280 nm

Para o cálculo da concentração das fracções foram utilizados dois valores de coeficiente de absorção molar.

(mistura de proteínas) (lisozima)

Nas fracções em que se suspeita que exista lisozima (fracções 17 – 19) utilizou-se o utilizou-segundo valor apreutilizou-sentado anteriormente, nas restantes, em que existe uma mistura de proteínas (fracções 1 – 16 e 20 – 22), utilizou-se o primeiro valor. Exemplificando:

Fracção 1 (mistura de proteínas) (mistura de proteínas) Fracção 17 (lisozima) (lisozima)

No caso em que existiu diluição das soluções para a obtenção de uma absorvância mais rigorosa, deve multiplicar-se a concentração obtida pelo factor da diluição. Por exemplo, a fracção 2:

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Como a solução foi diluída com factor 2, a concentração real da fracção é:

Quadro 3. Resumo dos valores obtidos durante o processo de doseamento proteico.

Doseamento Proteico Amostra Volume da Fracção (mL) Volume de eluição Total (mL) pH Abs280nm Diluição do ensaio [Prot] (mg/mL) PCO - - 8,3 1,487 1:12 17,844 1 15 15 8,21 0,080 - 0,080 2 15 30 8,21 0,872 1:2 1,744 3 15 45 8,23 0,936 1:3 2,808 4 20 65 8,18 0,093 - 0,093 5 10 75 8,16 0,049 - 0,049 6 10 85 8,14 0,033 - 0,033 7 10 95 8,15 0,032 - 0,032 8 10 105 8,17 0,044 - 0,044 9 10 115 8,36 0,037 - 0,037 10 10 125 8,58 0,032 - 0,032 11 5 130 8,63 0,031 - 0,031 12 5 135 8,65 0,040 - 0,040 13 5 140 8,67 0,032 - 0,032 14 5 145 8,69 0,042 - 0,042 15 5 150 8,69 0,041 - 0,041 16 5 155 8,89 0,189 - 0,189 17 5 160 9,52 0,291 - 0,012 18 5 165 9,95 0,270 - 0,017 19 5 170 10,16 0,275 - 0,014 20 5 175 10,35 0,108 - 0,108 21 5 180 10,45 0,078 - 0,078 22 5 185 10,5 0,056 - 0,056

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Discussão das aproximações realizadas nos cálculos anteriores. Sugestão de um método mais rigoroso para a determinação proteica de cada amostra.

Para a determinação da concentração proteica de cada fracção obtida na cromatografia de troca iónica, foi medida a absorvância de cada uma delas e seguidamente calculou-se a concentração utilizando a lei de Lambert-Beer ( ). O método utilizado pode induzir em erro, visto que a concentração medida não foi apenas das proteínas mas sim de todo o conteúdo existente nas fracções.

Assim, para a determinação mais correcta da concentração proteica deveria ter sido utilizado um método específico de doseamento de proteínas, por exemplo o método de Lowry. O princípio do método de Lowry baseia-se numa mistura contendo o reagente de Folin-Ciocalteau que sofre uma redução quando reage com proteínas, na presença do catalisador cobre (II).A sua principal vantagem é a de apresentar uma alta sensibilidade na determinação das concentrações das mesmas. No entanto, apesar do método de Lowry apresentar uma grande sensibilidade para as proteínas, o mesmo possui algumas desvantagens, como por exemplo estar sujeito a muitos tipos de interferentes. Estes interferentes causam, normalmente, o aumento da absorvância do branco, diminuição da absortividade específica ou formação de precipitados.

Outro método que poderia ser utilizado na determinação proteica é o método do Biureto (ver anexos – II). No entanto, para além deste método ser muito menos sensível que o método apresentado anteriormente, seria afectado pelo tampão Tris-HCl, já que este é um dos poucos interferentes para este método (porque reage com o Cu2+ presente na mistura).

Representação da actividade enzimática em função da concentração de proteína para as diferentes diluições da PCO e ainda para a fracção que apresentava maior actividade enzimática. Resumir os cálculos num quadro.

Em condições adequadas, a velocidade da reacção medida é proporcional à quantidade de enzima presente no extracto (neste caso, PCO). No entanto, como muitas enzimas não são encontradas puras, não é possível quantificá-las, pelo que os resultados são expressos em termos de unidades de actividade (UA), que são definidas

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Página | 21 absorvância por minuto.

Relativamente à lisozima, a unidade enzimática é dada pela quantidade de centros catalíticos que conduz a uma variação de absorvância a 450nm de 0,001 unidades por minuto.

Para se fazer o cálculo das unidades enzimáticas é utilizada uma fórmula que relaciona a variação de absorvância (∆Abs) e a variação do tempo (∆t). Para calcular

, fez-se uma regressão linear das rectas obtidas na realização dos ensaios enzimáticos, onde

representa o declive dessas rectas. Nesta fórmula o tempo vem em minutos, mas como o espectrofotómetro apresentou o tempo medido em segundos (60 segundos), foi necessário converter-se esse valor para variação de absorvância por minuto. Estes valores foram também divididos por 0,001, de modo a obter-se o número de unidades enzimáticas.

Assim, a fórmula para calcular o número de unidades enzimáticas é: , em que a unidade é U, sendo este U = µmol.min-1

Nos ensaios enzimáticos realizados, só a PCO e a fracção 17 foram diluídas, pois são as que se espera registar maior actividade enzimática. Ainda assim mediu-se a actividade enzimática para outros picos de absorvância (Figura 1) para concluir se tinham a lisozima ou não. Para exemplificar os cálculos efectuados tome-se como modelo os seguintes cálculos:

PCO diluição 1:5

O valor de |∆Abs450nm/∆t| é obtido através do módulo do declive (m) do gráfico (ver

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Como o volume da fracção colocado na cuvette foi de 0,1 mL, a actividade é dada por:

Fracção 17 diluição 3:5

O valor de |∆Abs450nm/∆t| é obtido através do módulo do declive (m) do gráfico (ver

Anexos – III, Figura IX). Neste caso, . O número de unidades enzimáticas é:

Como o volume da fracção colocado na cuvette foi de 0,1 mL, a actividade é dada por:

Fracção 2

O valor de |∆Abs450nm/∆t| é obtido através do módulo do declive (m) do gráfico (ver

Anexos – III, Figura XII). Neste caso, .

O número de unidades enzimáticas é:

Como o volume da fracção colocado na cuvette foi de 0,1 mL, a actividade é dada por:

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Quadro 4. Resumo dos ensaios da actividade do lisozima da clara do ovo na PCO e nas fracções correspondes aos

picos do gráfico 1. Amostra Diluição realizada [Prot] (mg/mL) |∆Abs450nm/∆t| (UA/min) Actividade (U/mL) PCO 1:1 17,844 0,0007 420 1:2 8,922 0,0006 360 1:5 3,5688 0,0004 240 1:10 1,7844 0,0002 120 1:20 0,8922 0,0002 120 1:40 0,4461 0,0002 120 Fracção 17 1:1 0,012 0,0008 480 4:5 0,0096 0,0008 480 3:5 0,0072 0,0007 420 2:5 0,0048 0,0006 360 1:5 0,0024 0,0004 240 Fracção 2 1:1 1,744 1,8 Fracção 3 1:1 2,808 0,36 Fracção 8 1:1 0,044 48 Fracção 18 1:1 0,017 0,0002 120 Fracção 19 1:1 0,014 0,0001 60

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Figura 2. Gráfico da função enzimática em função da concentração de proteína para as diferentes diluições de PCO.

Figura 3. Gráfico da função enzimática em função da concentração de proteína para as diferentes diluições da

fracção 17. 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 0,4461 0,8922 1,7844 3,5688 8,922 17,844 Act iv ida de E nzim á tica ( U/m L ) Concentração de Proteína (mg/mL)

Actividade Enzimática em função da

concentração de proteína para as

diferentes diluições de PCO

Actividade Enzimática 0 100 200 300 400 500 600 0,0024 0,0048 0,0072 0,0096 0,012 Act iv ida de E nzim á tica ( U/m L ) Concentração de Proteína (mg/mL)

Actividade Enzimática em função da

concentração de proteína para as

diferentes diluições da fracção 17

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Determinação da actividade específica (SA) da PCO e de cada fracção eluída da coluna

A actividade específica de um enzima (SA) corresponde ao nº de moles de substrato ou produto convertidos por unidade de tempo e por unidade de massa de enzima. Por outras palavras podemos dizer que é igual à actividade enzimática por unidade de massa de enzima usada no ensaio.

Assim, para a actividade específica da PCO e de cada fracção eluída, tem-se que: , onde as unidades enzimáticas são dadas por U.mg-1. Durante a actividade experimental apenas se mediu a absorvância a 450 manómetros durante 1 minuto para as fracções que apresentavam maior concentração proteica. Desta forma, apenas foi possível calcular a actividade enzimática e a actividade específica para estas fracções. Em seguida demonstra-se um exemplo do cálculo da actividade específica para uma das fracções:

Fracção 8

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Quadro 5. Resumo da purificação do lisozima da clara do ovo por cromatografia de troca iónica

Doseamento Proteico Doseamento da actividade enzimática Am ostr a Volu m e d a Fr ac ção (m L ) Volu m e d e elu ição T ot al (m L ) pH Abs 2 8 0 n m Dilu ição do en saio [P rot ] (m g/mL) (U A/min ) Ac tivid ad e (U /mL) SA (U /mg) PCO - - 8,30 1,487 1:12 17,844 0,0007 420 23,54 1 15 15 8,21 0,080 - 0,080 2 15 30 8,21 0,872 1:2 1,744 1,8 1,03 3 15 45 8,23 0,936 1:3 2,808 0,36 0,13 4 20 65 8,18 0,093 - 0,093 5 10 75 8,16 0,049 - 0,049 6 10 85 8,14 0,033 - 0,033 7 10 95 8,15 0,032 - 0,032 8 10 105 8,17 0,044 - 0,044 12 272,73 9 10 115 8,36 0,037 - 0,037 10 10 125 8,58 0,032 - 0,032 11 5 130 8,63 0,031 - 0,031 12 5 135 8,65 0,040 - 0,040 13 5 140 8,67 0,032 - 0,032 14 5 145 8,69 0,042 - 0,042 15 5 150 8,69 0,041 - 0,041 16 5 155 8,89 0,189 - 0,189 17 5 160 9,52 0,291 - 0,012 0,0008 480 40000 18 5 165 9,95 0,270 - 0,017 0,0002 120 7058,82 19 5 170 10,16 0,275 - 0,014 0,0001 60 4285,71 20 5 175 10,35 0,108 - 0,108 21 5 180 10,45 0,078 - 0,078 22 5 185 10,50 0,056 - 0,056

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proteína e SA de cada fracção em função do volume de eluição. Discussão dos resultados obtidos.

Figura 4. Gráfico representativo da concentração de proteína e SA em função do volume de eluição.

Como é visível no gráfico anterior (Figura 4), a actividade específica é maior onde a concentração proteica é menor. Apesar de haver uma maior concentração proteica na primeira parte do gráfico (volume de eluição de 20 a 105), a enzima não está presente, ou está presente em muito pouca quantidade, pois estas foram as primeiras fracções a serem recolhidas e só as proteínas com carga negativa foram eluídas, ou seja, todas as que tem pI inferior a 8,2, que não é o caso do lisozima, enzima do qual se está a calcular a actividade específica.

Este gráfico mostra então que a separação da lisozima da clara do ovo por cromatografia de troca iónica foi eficiente, já que nas fracções em que se esperava obter o enzima, existe actividade enzimática.

0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 40000 45000 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 30 45 105 160 165 170 Act iv ida de E specíf ica ( SA) ( U/m g ) Co ncent ra çã o da P ro teína (m g /m L ) Volume de Eluição (mL)

Concentração de Proteína e SA em função

do volume de eluição

[Prot] (mg/mL) SA (U/mg)

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pista. Relação do electroforama com os cromatogramas anteriores.

A electroforese realizada neste trabalho experimental foi uma electroforese unidimensional em gel de SDS- poliacrilamida (SDS-PAGE).

Foi utilizado o gel de poliacrilamida, pois este apresenta uma grande resolução originando, portanto, uma boa separação dos diferentes componentes de uma mistura. Estes géis também têm a vantagem de serem fáceis de preparar e corar, permitindo revelar e identificar facilmente os compostos separados.

Esta electroforese foi realizada sob condições desnaturantes (devido ao SDS, que é um detergente), que dissocia as cadeias e as ligações persulfureto, permitindo a identificação aproximada, por comparação, do tamanho da proteína

Figura 5. Electroforama obtido no SDS-PAGE.

Na realização do gel para a electroforese, foram preparados dois tipos de gel. O gel resolvente (a 12%) e o gel concentrador (a 5%). A camada superior, o gel concentrador, tem poros maiores, enquanto o gel resolvente, a camada inferior, tem poros mais pequenos. Desta forma, as proteínas maiores, com maior massa molecular

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Página | 29 para a camada inferior.

Em cada poço seria suposto colocar de proteína, podendo ter no máximo da solução proteica. Como algumas fracções possuem concentrações muito baixas, o volume a colocar nos poços era muito maior que 10 logo, na impossibilidade de colocar o volume calculado (ver Anexos - IV), colocou-se .

No electroforama obtido, a ordem de colocação das amostras nos poços é a seguinte:

1- Amostra de PCO; tampão e β-mercaptoetanol; aquecidos durante 5 minutos;

2- Amostra do pico 1 (Fracção 3); tampão e β-mercaptoetanol; aquecidos durante 5 minutos;

3- Amostra do pico 2 (Fracção 8); tampão e β-mercaptoetanol; aquecidos durante 5 minutos;

4- Amostra do pico 3 (Fracção 17); tampão e β-mercaptoetanol; aquecidos durante 5 minutos;

5- Amostra do lisozima; tampão e β-mercaptoetanol; aquecidos durante 5 minutos; 6- Marcador; tampão e β-mercaptoetanol;

7- Amostra de β-globulina; tampão e β-mercaptoetanol;

8- Amostra de β-globulina; tampão e β-mercaptoetanol; aquecidos durante 5 minutos: 9- Amostra de β-globulina; tampão de aplicação; aquecidos durante 5 minutos.

Através da comparação das bandas obtidas com as bandas do marcador (Quadro 6), cujas massas moleculares são conhecidas, é possível verificar se a fracção que se suspeita ter lisozima está pura.

Quadro 6. Proteínas que constituem o marcador.

Proteína Mr (KDa) Rf Erro

Fosforilase b 94 0,36 0,32-0,40 BSA 67 0,44 0,39-0,47 Ovalbumina 43 0,52 0,46-0,56 Anidrase carbonica 30 0,65 0,58-0,70 Inibidor de tripsina 20 0,75 0,66-0,80 α-lactalbumina 14,4 0,84 0,75-0,91

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Página | 30 amostras que contenham lisozima apresentem uma banda situada onde, em comparação com o marcador, a massa molecular é 14,4 KDa. Assim, é possível concluir que as amostras colocadas no poço 1, 2, 3, 4 e 5 contem uma percentagem notável de lisozima.

Nas restantes amostras, foi estudado o efeito do aumento de temperatura (9), o efeito do β-mercaptoetanol (7) e o efeito do β-mercaptoetanol e da temperatura conjugados (8) na β-globulina. A β-globulina é construída por 2 subunidades, quando fica sujeita à acção de agentes desnaturantes, as duas subunidades separam-se, mostrando no electroforama três bandas distintas. Uma banda para a proteína não desnaturada, e duas para cada uma das subunidades.

No caso em que foi estudado o efeito do β-mercaptoetanol (7), é possível observar várias bandas a diferentes massas moleculares, o que significa que o β-mercaptoetanol desnaturou a proteína de tal forma que para além das subunidades se separarem uma da outra, ainda se dividiram em fracções com tamanhos variáveis (desde 94 a 14,4 KDa). Na amostra aplicada ao poço 8, a proteína também desnaturou dando origem a 4 bandas distintas, ou seja, fracções com tamanhos variáveis. No caso em que se estudou o efeito do β-mercaptoetanol e da temperatura conjugados (8), obteve-se aproximadamente o mesmo resultado que no caso anterior, mas obteve-se menos bandas. No caso em que apenas se estudou o aumento da temperatura aconteceu o descrito anteriormente, o electroforama apresenta 3 bandas, uma banda para a proteína não desnaturada (a primeira banda), e duas para cada uma das subunidades (a subunidade de menor tamanho apresenta-se numa banda na parte inferior do electroforama).

Quadro de purificação final do lisozima da clara do ovo

Para determinar o rendimento e a purificação do enzima seleccionaram-se as fracções com maior actividade específica, pois é nestas fracções que se encontra a maior parte do enzima que se pretendia purificar, o lisozima. As fracções seleccionadas foram a 17, 18 e 19, já que apresentam actividade específica 40 000, 7058,82 e 4285,71, respectivamente.

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Página | 31 procedeu-se a este cálculo para a fracção 17, sendo o cálculo para as outras fracções e para a PCO semelhante.

Fracção 17

Sendo a actividade total o somatório de todas as actividades totais de todas as fracções.

Sendo a actividade específica total o quociente entre a actividade total e a soma das massas totais de enzima purificado.

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Quadro 7. Resumo da purificação do lisozima da clara do ovo por cromatografia de troca catiónica.

Passo de Pu ri fi ca ção V ol ume T ot a l (m L ) [Prot ] (m g /m L ) Mas sa Prot ei ca tot al (m g ) A ct iv idad e (U /m L ) A ct iv idad e T ot al ( U ) SA ( U /m g ) R endim ent o (%) Pu ri fi ca ção (x) PCO 7*1 17,844 124,91 420 2 940 23,54 112,2 2002,7 Fracçõ es 17 5 0,012 0,06 480 2 400 40 000 18 5 0,017 0,085 120 600 7 058,8 19 5 0,014 0,07 60 300 4 285,7 Total 15 0,014*2 0,215 660 3 300 47 142,86*3

*1 O volume da PCO deveria ser 8 % do volume total da coluna. No entanto, colocou-se 7 mL. *2 O valor de concentração total é a média dos valores de concentração obtidos em cada fracção. *3

Como é visível no quadro anterior (Quadro 7) tanto o rendimento como a purificação dão valores bastante mais altos que o esperado. Durante a realização deste trabalho experimental não se mediu a absorvância da solução da PCO utilizada e como tal, para se obter um valor aproximado ao obtido se tivesse sido medido, foi utilizado o valor de absorvância registado por outro grupo. Desta forma o valor da concentração e consequente absorvância da PCO para a solução utilizada durante o trabalho, deveria ser maior que aquele que obtemos do outro grupo.

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Conclusão

Globalmente, este trabalho laboratorial foi constituído por quatro etapas principais:

 Cromatografia de troca iónica;

 Doseamento da concentração de proteína;

 Doseamento da actividade enzimática;

 Electroforese unidimensional em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). A cromatografia de troca iónica permitiu-nos separar diferentes fracções da amostra da clara de ovo (PCO) e, como tal, diferentes soluções constituídas por diferentes conjuntos de proteínas. Após a sua análise, ao serem medidas as absorvâncias das fracções, foi possível identificar aquelas que teriam o enzima pretendido (lisozima) na sua constituição. A partir daí foi possível analisá-las mais detalhadamente e avaliar diversos parâmetros que nos permitiram estimar a presença e o comportamento do lisozima.

Através da determinação da actividade enzimática de cada fracção, às quais se adicionou substrato de parede celular de células de M. luteus, foi possível medir o decréscimo da absorvência a 450 nm e, desta forma, verificar experimentalmente a actividade do lisozima sobre as paredes celulares da bactéria em questão. Calculou-se também a actividade enzimática e actividade específica das diferentes diluições da amostra da PCO e das fracções correspondentes a picos de absorvância.

Por fim, pela realização da electroforese unidimensional em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) conseguiu-se identificar as principais proteínas presentes em cada poço, nomeadamente, na amostra da PCO e nas amostras correspondentes aos três picos. Tendo-se utilizado um marcador de massa molecular conseguiu-se concluir que, de facto, o pico 3 (fracção 17) continha lisozima na sua constituição, enquanto que os restantes (eluídos inicialmente) continham outras proteínas que fazem parte da constituição da clara de ovo. Este método permitiu, assim, concluir que foi possível purificar o lisozima, tal como se esperava.

Através das fracções com maior actividade específica determinou-se o grau de purificação do lisozima bem como o rendimento de toda a actividade. Os valores

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Página | 34 obtidos para estes parâmetros não podem ser aceites como verdadeiros nem discutidos, uma vez que para efectuar os cálculos foi necessário recorrer ao valor de absorvância da PCO de outro grupo, não correspondendo à realidade daquilo que foi observado.

Em suma, apesar de não ter sido possível quantificar o rendimento nem o grau de pureza do lisozima obtido, foi possível verificar qualitativamente a sua presença e observar a sua actividade catalítica. Desta forma, pode fazer-se um balanço positivo relativamente a todo trabalho que teve como principal objectivo a purificação do lisozima da clara do ovo.

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Bibliografia

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Referências