BÀI 14

(1)

1 TRẦN THANH TÙNG – MSSV: 10243221| GVHD: Thầy TRƯƠNG VÕ ANH DŨNG

BÁO CÁO THỰC HÀNH

ĐỊNH LƯỢNG TỔNG VI KHUẨN

HIẾU KHÍ TRONG THỰC PHẨM

BẰNG PHƯƠNG PHÁP

ĐẾM KHUẨN LẠC

I. NGUYÊN TẮC

Tổng số vi khuẩn hiếu khí là tổng số những vi khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn hiếu khí tồn tại trong môi trƣờng. Tổng số các nhóm vi khuẩn này trong thực phẩm có thể xác định bằng phƣơng pháp nuôi cấy trải lên bề mặt thạch hoặc bằng phƣơng pháp tạo hộp đổ. Thông qua số lƣợng khuẩn lạc đếm đƣợc trên các đĩa peptri cho phép xác định đƣợc lƣợng vi sinh vật còn có khả năng sinh trƣởng trong môi trƣờng trong mẫu ban đầu.

Để đếm kết quả chính xác thì số vi khuẩn trong đĩa phải trong giới hạn 25-250 khuẩn lạc. Nếu vƣợt quá giới hạn thì phải tiến hành pha loãng và chọn những độ pha loãng lớn hơn.

Chỉ tiêu tổng số vi sinh vật hiếu khí đƣợc dùng để đánh giá chất lƣợng của mẫu về vi sinh vật, nguy cơ hƣ hỏng, thời hạn bảo quản của sản phẩm, mức độ vệ sinh trong quá tr ìn h c h ế b iế n , b ả o q u ả n sả n p h ẩ m .

II. DỤNG CỤ, MÔI TRƯỜNG, HÓA CHẤT

Môi trƣờng sử dụng: Plate count agar (PCA), pH = 7.0 ± 0.2

 Casein peptone: 5.0g

 Cao nấm men: 2.5g

 Dextrose: 1.0g

 Agar: 15.0g

 Nƣớc cất đủ 1000ml

Môi trƣờng đƣợc nấu sôi cho tan agar, phân phối vào bình tam giác, hấp tiệt trùng ở 121oC/20 phút, để ấm (45 – 50oC) phân phối vào các đĩa petri.

(2)

 Nƣớc cất vô trùng.

 Cồn 96o.

 Nƣớc mía.

III. TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM

1. LẤY MẪU

Quy trình lấy mẫu có những yêu cầu sau:

 Lấy các mẫu có tính chất đại diện, lƣợng mẫu vừa đủ.

 Dụng cụ lấy mẫu, chứa mẫu phải vô trùng.

 Mẫu lấy xong, phải phân tích ngay, không đƣợc để quá 24h.

 Mẫu lấy phải có nhãn ghi ký hiệu đồng thời phải ghi vào sổ những đặc điểm của mẫu và nơi thu mẫu.

2. PHA LOÃNG MẪU

(3)

3 TRẦN THANH TÙNG – MSSV: 10243221| GVHD: Thầy TRƯƠNG VÕ ANH DŨNG 3. QUY TRÌNH Mẫu Đồng nhất Pha loãng Hộp đổ Hộp trải Ủ 37o_C (24 – 72h) Đếm khuẩn lạc ( 25 ≤ n ≤ 250 ) Tính kết quả

(4)

Hình 14.2 Quy trình tạo hộp đổ

4. CÁCH ĐẾM – CÔNG THỨC TÍNH 4.1. Cách đếm

(5)

 Lấy bút chì kẻ hai đƣờng vuông góc ở đáy hộp petri và đánh dấu thứ tự từng vùng I, II, III, IV.

 Đếm số lƣợng khuẩn lạc từng vùng. Nhớ đánh dấu các khuẩn lạc đã đếm. 4.2. Công thức tính:

N(CFU / g hay CFU / ml) =

) 1 1 ... (nvd nivdi C    Trong đó:

 N: số tế bào ( đơn vị hình thành khuẩn lạc ) vi khuẩn trong 1 g hay 1 ml mẫu (CFU: colony forming units);

 C: tổng số khuẩn lạc đếm đƣợc trên các hộp petri đã chọn (có số khuẩn lạc nằm trong khoãng từ 25 – 250 khuẩn lạc/đĩa);

 ni: số hộp petri cấy tại độ pha loãng thứ I;

 di: hệ số pha loãng tƣơng ứng;

 v: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa.

IV. NHỮNG ĐIỂM CẦN LƯU Ý

 Khi tiến hành pha loãng mẫu, các dung dịch phải đƣợc hút đúng thể tích yêu cầu.

 Đối với phƣơng pháp tạo hộp đổ, môi trƣờng nuôi cấy sau khi hấp tiệt trùng phải đƣợc làm nguội đến 15 – 50oC trƣớc khi đổ vào đĩa petri chứa dung dịch vi sinh vật.

 Các đĩa petri nuôi cấy vi sinh vật phải đƣợc lật úp trƣớc khi nuôi ủ để tránh các khuẩn lạc ở bề mặt mọc loang.

 Trong quá trình đếm khuẩn lạc, không đƣợc mở hộp petri.

 Que trải thủy tinh dủng để trải dung dịch vi sinh vật đƣợc khử trùng bằng cách nhúng vào cồn 96o rồi đốt, không đƣợc hơ trực tiếp trên ngọn lửa đèn cồn.

V. BÁO CÁO THỰC TẬP

Trình bày phương pháp định lượng tổng vi khuẩn hiếu khí trong mẫu bằng phương pháp đếm khuẩn lạc.

CẤY THEO PHƢƠNG PHÁP TẠO HỘP ĐỔ:

 Pha loãng dịch huyền phù ở các nồng độ khác nhau: 10-3, 10-4, 10-5 để cấy mẫu.

 Ghi vào nắp đỉa petri có môi trƣờng thạch các thông tin: nồng độ pha loãng, ngày cấy.

(6)

 Dùng pipette đã vô trùng lấy 1 ml dịch huyền phù cho vào mỗi đỉa petri (đã vô trùng).

 Cho khoảng 15ml môi trƣờng PCA ở nhiệt độ khoảng 45oC vào hộp đĩa petri. Xoay chậm cho hỗn hợp trộn đều. Để yên cho nguội. Lật ngƣợc cho vào tủ ấm. Nuôi cấy ở 30oC trong 72h.

 Mỗi mẫu cấy ba nồng độ. Mỗi nồng độ cấy ba hộp petri.

 Sau đó lấy ra kiểm tra kết quả. PHƢƠNG PHÁP CẤY BỀ MẶT

 Dịch huyền phù đƣợc chuẩn bị tƣơng tự nhƣ phƣơng pháp tạo hộp đổ.

 Môi trƣờng PCA sau khi đƣợc hấp tiệt trùng, đƣợc làm nguội đến khoảng 50 – 60oC sau đó đổ vào đĩa petri vô trùng.

 Đĩa petri chứa môi trƣờng đƣợc làm khô bề mặt bằng cách sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 35oC hoặc chuẩn bị trƣớc 2 ngày.

 Dùng pipette vô trùng hút chính xác 0.1ml hoặc 0.3 ml nhỏ lên bề mặt môi trƣờng trong đĩa petri.

 Trải đều dung dịch vi sinh vật lê bề mặt môi trƣờng bằng que trải tam giác thủy tinh.

 Các đĩa petri đƣợc để để ở nhiệt độ phòng 15-20 phút cho khô bề mặt. Lật ngƣợc cho vào tủ ấm. Nuôi cấy ở 30o

C trong 72h.

 Mỗi mẫu cấy 3 nồng độ. Mỗi nồng độ cấy ba hộp petri.

 Sau đó lấy ra kiểm tra kết quả.

So sánh ưu và nhược điểm của phương pháp tạo hộp đổ và phương pháp cấy trải bề mặt.

Phƣơng pháp cấy trải:

 Ƣu điểm: độ đồng đều cao (khuẩn lạc mọc đều) nên dễ nhận dạng các khuẩn lạc đặc trƣng

 Nhƣợc điểm:

o Thời gian trải lâu o Thể tích mẫu cấy nhỏ o Dễ nhiễm

Phƣơng pháp tạo hộp đổ:

 Ƣu điểm: thể tích mẫu cấy lớn, mật độ vi sinh vật cao, thao tác nhanh, dễ dàng.

 Nhƣợc điểm:

o Dễ làm vi sinh vật chết nếu môi trƣờng chƣa hạ xuống nhiệt độ 450C.

(7)

o Khó đếm do khuẩn lạc chồng lặp.