COLIFORMES FECAIS, ESTAFILOCOCOS COAGULASE
POSITIVA (ECP), Salmonella SPP. E Campylobacter SPP.
EM LINGÜIÇA FRESCAL*
Ana Lígia Lordello CORTEZ** Angela Cleusa de Fátima Banzatto de CARVALHO*** Luiz Augusto do AMARAL*** Bruna Maria SALOTTI** Ana Maria Centola VIDAL-MARTINS**
*Parte da Dissertação de Mestrado do primeiro autor, em 2003, no Curso de Mestrado em Medicina Veterinária, Faculdade de Ciência Agrária e Veterinárias FCAV / UNESP. Trabalho realizado com auxílio do CNPq sob a forma de bolsa de pesquisa.
**Aluna do programa de pós-graduação em Medicina Veterinária, doutoranda - FCAV/UNESP- 14884-900 -SP - Brasil. ***Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Reprodução Animal - FCAV/UNESP - 14884-900 -SP - Brasil.
RESUMO: Lingüiça frescal faz parte dos alimentos ex-postos à contaminações e constitue um excelente meio para desenvolvimento e multiplicação de microrganismos. Assim, a presente pesquisa teve como objetivo verificar a qualidade microbiológica de 106 amostras de lingüiça frescal de carne de frango, mista (carne bovina e suína) e de carne suína, fabricadas artesanalmente e sob inspeção, no município de Jaboticabal – SP, Brasil. Determinou-se o número mais provável de coliformes fecais por grama (NMP/g) do produto e a ocorrência de Escherichia coli, contagem de estafilococos coagulase-positiva (ECP), pesquisa de
Salmonella spp. e Campylobacter spp.. Foram
utilizados métodos microbiológicos convencionais a fim de detectar, isolar e identificar estas bactérias, comparando os resultados obtidos com os limites estabelecidos pela legislação brasileira. Das 106 amostras analisadas, 78 (73,6%) demonstraram a presença de coliformes fecais, 41 (38,7%) de
Escherichia coli, 18 (17%) de ECP e 8 (7,5%) de Salmonella spp.. Nenhuma amostra foi positiva para Campylobacter spp.. Os testes da PCR multiplex rfb,
stx1, stx2, eae O157, O113, O111 das amostras de E.
coli foram negativos. Em decorrência dos resultados
obtidos pode-se concluir que se faz necessária melhoria nas condições higiênico-sanitárias desse tipo de produto. PALAVRAS-CHAVE: Embutido; Escherichia coli; coli-formes fecais; Salmonella spp.; estafilococos coagulase-positiva; Campylobacter spp.
Introdução
A manipulação incorreta dos alimentos favorece a contaminação por agentes bacterianos patogênicos que, em números elevados, podem ocasionar problemas à saúde dos
consumidores 20, assim sendo a higiene correta dos alimentos é necessária para garantir a segurança e a salubridade dos mesmos em todos os estágios de sua elaboração.
Dentre os alimentos envolvidos com maior freqüência como veiculadores de enfermidades no ser humano encontram-se as carnes bovina e de frango 16, bem como a lingüiça 23. Ressalta-se que a lingüiça frescal é um alimento exposto à contaminação e representa um excelente meio para desenvolvimento e multiplicação de microrganismos 4, 27. As prováveis fontes de contaminação para esses produtos compreendem as carnes, os envoltórios, os temperos ou condimentos, bem como a água utilizada em todas as operações de limpeza e manutenção, manipulação, máquinas e utensílios 25.
Os coliformes fecais indicam contaminação de origem fecal recente do produto 24, sendo que a detecção de elevado número destas bactérias em um alimento, inclusive nos processados, é interpretada como possível presença de patógenos intestinais, visto que a população desse grupo é constituída de uma alta proporção de Escherichia coli 29.
Os portadores e os manipuladores de alimentos infectados com Staphylococcus aureus são importantes fontes de contaminação dos alimentos 19. Neste contexto, o aquecimento do alimento após sua manipulação torna-se relevante na prevenção de toxinfecções, contudo a toxina do S. aureus é termoresistente. Por isso, os cuidados como a refrigeração devem ser tomados após o aquecimento, caso contrário, o microrganismo poderá multiplicar-se e produzir toxina 24.
As bactérias do gênero Salmonella ocorrem geralmente nos animais, especialmente nas aves e nos suínos, estando presente também nos seres humanos, alimentos e meio ambiente, podendo ser patogênica para humanos e muitas espécies de animais 19. Destaca-se o papel especialmente importante das aves dentro da cadeia epidemiológica como reservatórios, pois podem ser portadoras e excretar continuamente salmonela nas fezes 2,
desta maneira contaminar a carcaça das aves.
As bactérias Campylobacter jejuni e Campylobacter
coli ocorrem freqüentemente no trato intestinal de aves
domésticas e suínos. Durante o abate estes microrganismos podem ser transferidos dos intestinos para a superfície da carne e dessa maneira pode atingir o consumidor 26.
A Agência Nacional de Vigilância Sanitária – Anvisa, na resolução RDC nº 12, de 2 de janeiro de 2001 8 estabelece número de coliformes fecais e estafilococos coagulase-positiva (ECP) por grama do produto e Salmonella spp. em 25g como indicadores de qualidade microbiológica para lingüiça frescal. Assim, o presente trabalho teve como objetivo verificar a qualidade microbiológica de amostras de lingüiça frescal de carne de ave, mista e suína fabricadas sob inspeção e artesanalmente comercializadas no município de Jaboticabal – SP, Brasil e comparar os resultados obtidos com os padrões microbiológicos estabelecidos pela legislação vigente para este tipo de alimento8.
Material e métodos
A coleta das amostras foi realizada semanalmente, nos períodos de 13 de agosto a 05 de novembro de 2001 e 18 de fevereiro a 22 de abril de 2002. Foram coletadas 21 amostras de lingüiça frescal de aves, 31 mistas e 54 de carnes suínas, sendo 54 fabricadas artesanalmente e 52 sob inspeção, totalizando 106 amostras, em 40 estabelecimentos comerciais que fabricavam e/ou comercializavam esses produtos cárneos no município de Jaboticabal – SP.
Determinação do número mais provável de coliformes fecais por grama (NMP/g)
A partir de 25g de amostra foram determinados os NMP/g de coliformes fecais, utilizando a técnica dos tubos múltiplos, com três repetições e nas diluições 10-3, 10-4, 10 -5 e 10-6, empregando-se caldo lauril sulfato triptose na etapa correspondente ao teste presuntivo e caldo EC na etapa confirmatória 5.
Pesquisa de Escherichia coli
Dos tubos com caldo EC positivos, semeou-se placas contendo ágar eosina-azul de metileno (EMB), incubadas a 37 C, por 24h. As colônias que apresentaram centro negro e com brilho verde metálico foram repicadas em ágar nutriente inclinado e após incubação a temperatura de 37 C por 24h foram mantidas sob refrigeração.
Técnica de reação em cadeia pela polimerase (PCR) para pesquisa de genes de virulência para E. coli
Posteriormente foram realizados testes de PCR multiplex rfb, stx1, stx2, eae O157, O113, O111 nas amostras positivas 28. A visualização do produto amplificado foi realizada em gel de agarose a 2,0% (p/v), utilizando-se
tampão de corrida TBE 0,5 X (0,04M tris acetato e 0,001M EDTA, pH 8,0), segundo Sambrook30.
Contagem de estafilococos coagulase-positiva (ECP)
Das diluições 10-1, 10-2 e 10-3 foi retirado 0,1mL e feita a semeadura em placa contendo ágar Baird-Parker. Após incubação a 37 C, por 24 a 48 horas, foram contadas colônias características de cor negra e 3 destas colônias foram semeadas em ágar nutriente inclinado. As cepas que, em esfregaços corados pelo método Gram, apresentavam-se como cocos Gram-positivos, agrupados em formas de cachos de uva, foram submetidas às provas de catalase e coagulase. O número de ECP em 25g foi obtido com base nos resultados dessas provas, proporcionalmente ao número de colônias características contadas no ágar Baird-Parker 5.
Pesquisa de Salmonella spp.
A presença de Salmonella spp. foi pesquisada de acordo com a metodologia preconizada pela legislação brasileira 7. Pesou-se 25g da amostra, homogeneizados com 225mL de água peptonada 0,1% esterilizada e incubados por 18 a 24 horas a 42ºC. Alíquotas de 1mL dessa cultura pré-enriquecida foram transferidas para dois tubos, contendo cada um 10mL de caldo de enriquecimento seletivo, composto pelo caldo tetrationato e pelo caldo Rappaport Vassiliadis, e incubadas a 43ºC por 24h. A partir desses caldos, uma alíquota de cada tubo foi semeada em ágar verde-brilhante vermelho-de-fenol-lactose-sacarose (BPLS) adicionado de 0,1mL de solução de novobiocina a 4% para cada 100mL de meio básico, e outra em ágar MacConkey e incubadas a 35ºC por 24h. Do ágar BPLS selecionaram-se colônias incolores ou de cor rosada entre translúcida e ligeiramente opaca e cujo meio básico apresentava tom maravilha. Do ágar MacConkey selecionaram-se as colônias incolores e com meio básico na cor palha. Ambas foram semeadas em ágar tríplice açúcar ferro (TSI) e ágar ferro lisina (LIA), com incubação a 37ºC por 24h. As culturas com base ácida, produção de gás e bisel alcalino e com produção de H2S foram adicionadas de 2mL de solução salina a 0,85% e após foram homogeneizadas para teste de aglutinação com soros polivalentes contra os antígenos somáticos e flagelares de Salmonella spp. 7.
Pesquisa de Campylobacter spp.
Pesou-se 25g de cada uma das amostras, adicionou-se 225mL de água peptonada 0,1% esterilizada e incubou-se a uma temperatura de 42 C, por 24h. Duas alíquotas de 50mL desse líquido homogeneizado foram centrifugadas por 30 minutos, a 4°C, a 8000Xg. O sedimento somado a 2mL do sobrenadante foram homogeneizados e semeados em meio ágar Brucella adicionado de suplemento FBP (0,025% de sulfato ferroso, 0,025% de piruvirato de sódio e 0,025% de metabissulfito de sódio), acrescido de 2mL de uma mistura de antibióticos constituída por 10 g/mL de
vancomicina, 5 g/mL de trimethoprim, 2,5 UI/mL de polimixina, 5 g/mL de anfotericina B e 15 g/mL de cefalotina e adicionado de 7% de sangue desfibrinado de carneiro. Obteve-se um meio básico com pH final de 7,2 9. Os meios foram incubados por 48 h em temperatura de 42 C em jarras para cultivo em anaerobiose com atmosfera microaerófila. A identificação das colônias suspeitas do gênero Campylobacter foram submetidas ao exame de morfologia microscópica pela coloração de Gram, procurando-se bastonetes curvos, em forma de S e negativos para a coloração.
Análise estatística dos resultados
O teste de Fisher foi aplicado aos resultados das lingüiças de ave e mista. Para as lingüiças suínas utilizou-se o teste de Qui-Quadrado devido ao número de amostras ser maior 31. Em ambos os casos avaliou-se diferenças entre as lingüiças fabricadas artesanalmente e sob inspeção.
Resultados e discussão
A Tabela 1 mostra o número de amostras de lingüiça que estavam dentro e fora do padrão que estabelece para coliformes fecais no máximo 5,0 X 103 NMP/g, para estafilococos coagulase-positiva (ECP) 5,0 X 103 UFC/g e ausência de Salmonella spp. em 25g do produto, resolução RDC nº 12, de 2 de janeiro de 2001, da Agência Nacional de Vigilância Sanitária - Anvisa 8.
Levando em consideração a carne moída como matéria-prima da lingüiça, pode-se comparar este trabalho com a pesquisa realizada em São Luís do Maranhão que
após analisarem carne moída verificaram que 90% do total de amostras apresentavam-se contaminadas por coliformes fecais e destas 40% apresentaram contagens acima de 1,1 X 103 NMP/g 11, ou seja, valores muito próximos dos limites estabelecidos pela legislação. Entretanto em Campina Grande, PB foram analisadas 30 amostras de carne moída e encontraram 9 (30%) amostras com contagens acima de 1,0 X 104 NMP/g 14, enquadrando-as como fora do padrão da legislação vigente8 para coliformes fecais. Estes dois trabalhos apresentaram valores mais elevados do que os observados pela presente pesquisa em lingüiças mistas, cuja matéria-prima é a carne moída bovina.
Das 106 amostras analisadas 18 (17%) apresentaram estafilococos coagulase positiva (ECP), mas apenas uma (4,8%) amostra estava fora do padrão estabelecido pela legislação8. Dentre as amostras de lingüiças de aves uma foi positiva para ECP, porém encontrava-se dentro do padrão, nas lingüiças mistas cinco amostras estavam contaminadas por ECP e apenas uma (4,8%) estava fora do padrão.
Considerando os dados encontrados na literatura consultada relacionados com ECP em lingüiça frescal suína, Chaves et al. (2000) relataram 40%, El-Khateib 29,3% e Amaral et al. 12,5% das amostras positivas. Alves et al. analisando amostras de carne moída bovina observaram a presença de ECP em 7,6% das amostras analisadas, todas com contagem acima de 1,0 X 105 UFC/g.
Em relação ao isolamento de Salmonella spp., deve-se levar em consideração a contaminação da matéria-prima utilizada para a fabricação dos diferentes tipos de lingüiça. Resultados encontrados na literatura consultada demonstraram contaminação em 26,7% 18 e 54% 6 em carne
Tabela 1 - Tipo e número de amostras (n) de lingüiça frescal, dentro do padrão (DP) e fora do padrão (FP) para coliformes fecais, estafilococos coagulase-positiva (ECP) e Salmonella spp.; estipulado pela RDC 12 de 2/01/2001 (BRASIL, 2001), no período de 13 de agosto a 05 de novembro de 2001 e 18 de fevereiro a 22 de abril de 2002, no município de Jaboticabal – SP, Brasil.
Dentro do padrão Fora do padrão
CF
ECP
Salmonella spp. CFECP
Salmonella spp. Tipo deamostra
Total
de
amostras
n
%
n
%
n
%
n
%
n
%
n
%
Ave - A 22 100,0
2
100,0
2
100,0
0
0
0
0
0
0
I 1918
94,7
19
100,0
18
94,7
1
5,3
0
0
1
5,3
Mista - A
16
14
85,5
15
93,8
14
87,5
2
12,5
0
0
2
12,5
I
15
14
93,3
15
93,3
13
86,7
1
6,4
1
4,8
2
13,3
Suína - A
36
27
75,0
36
94,4
33
91,6
9
25,5
0
0
3
8,4
I 1816
88,9
18
100
17
94,4
2
11,1
0
0
1
5,6
Total 10691
85,8 105
99
97
95,5
15
14,2
1
0,9
9
8,5
de frango analisada; 26,7% das amostras de carne moída 2; 17,5% das amostras de carne suína; enquanto que na carne bovina 2,6% foram positivas para o mesmo agente 21. Um estudo de prevalência de Salmonella spp. realizado por Zhao et al. em amostras de carnes cruas vendidas no varejo, de um total de 825 amostras 25 (3%) eram positivas; sendo nove (36%) amostras de carne de frango, cinco (20%) de peru, sete (28%) de suína e quatro (16%) de bovina.
Comparando os resultados das análises bacteriológicas para coliformes fecais e Salmonella spp., verificou-se que sete amostras apresentaram-se positivas para Salmonella spp. e estavam dentro do padrão para coliformes fecais8. Esse resultado mostra a importância da pesquisa de Salmonella na rotina de controle microbiológico deste tipo de alimento. Entretanto, pode-se verificar que as lingüiças de carne suína fabricadas artesanalmente apresentaram o dobro de amostras fora do padrão do que as lingüiças do mesmo tipo fabricadas sob inspeção, o que evidencia a necessidade de sensibilizar os comerciantes e os consumidores da importância do serviço de inspeção permanente.
As amostras positivas de E. coli analisadas pelos testes de PCR não revelaram presença de E. coli O:157, O:111 e O:113. GETTY et al. (2000) citam vários fatores que influenciam a viabilidade das células de E. coli O157:H7 em salsichas e que poderiam explicar a ausência destes microrganismos em lingüiça frescal, tais como: tamanho do envoltório, pH, quantidade de sal e nitritos e meios utilizados para contagem.
No que se refere à diversidade de amostras sorotipadas para Salmonella spp., o presente trabalho identificou quatro sorotipos diferentes: nas lingüiças de ave foi identificada uma amostras com sorotipo S. Agona; nas lingüiças mista, uma com o sorotipo S. Enterica subsp. enterica 4,5,12:i, uma com o sorotipo S. Derby e duas
Salmonella spp.; e nas amostras de lingüiça suína, uma
com o sorotipo S. Enterica subsp. enterica 4,5,12:i, uma S. Rissen e duas Salmonella spp.
ALMEIDA et al. (2000) identificaram em amostras de carne os sorotipos S. Agona e S. Enterica subsp. Enterica. ESCARTÍN et al. (1995) que avaliaram amostras de carne suína crua, evidenciaram o isolamento dos sorotipos S. Agona e S. Derby, sendo ambos os resultados concordantes ao da presente pesquisa.
Apesar de isolada em vários tipos de carne a bactéria
Campylobacter spp. 6, 22, 26 não foi isolada no presente estudo em lingüiça frescal, podendo ser devido ao fato de sua sensibilidade a concentrações de cloreto de sódio superiores a 1,5% 19 e esse alimento além do sal tem outros condimentos que também podem ter influenciado no isolamento. Devido ao fato de C. jejuni não crescer abaixo de 30 C e ser sensível a concentrações normais de oxigênio na atmosfera somente pequenos números podem estar presentes nos alimentos, geralmente inferiores a 1,0 X 102 células/g 14. Pode ainda haver competição com a microbiota autóctone segundo FRANCO (1995) e como citam também VARNAM & EVANS (1991) a sobrevivência do Campylobacter spp. é
reduzida pela presença de outros microrganismos, podendo isso ser atribuído à redução do valor do pH e à produção de ácidos orgânicos.
A análise estatística não revelou diferença significativa entre as amostras de lingüiça frescal fora do padrão tanto para as fabricadas artesanalmente como para as inspecionadas, quando se aplicou o teste de Fisher, utilizado nas lingüiças de aves e mistas e o teste de Qui-Quadrado aplicado para as lingüiças suínas. Contudo, sob o ponto de vista de saúde pública deve-se considerar a imunidade individual, a patogenicidade e a quantidade do agente e/ou da toxina produzida por este, sendo importante o achado até mesmo de apenas uma amostra contaminada, pois dependendo dos fatores citados acima pode haver risco para a saúde do consumidor.
Nas condições em que o trabalho foi realizado, baseando-se no número de amostras analisadas, na metodologia utilizada e nos resultados obtidos pode-se concluir que: comparando a qualidade higiênico-sanitária entre os diferentes tipos de lingüiça frescal, as lingüiças suínas apresentaram pior qualidade sob o aspecto de risco à saúde pública, de acordo com a RDC n 12 da Anvisa 8. Um grande número de amostras apresentaram-se fora do padrão microbiológico, portanto em relação à qualidade microbiológica as lingüiças do tipo frescal podem colocar em risco a saúde do consumidor, devido às espécies de microrganismos encontradas e o número de amostras contaminadas.
CORTEZ, A.L.L.; CARVALHO, A.C.F.B.; AMARAL, L.A.; SALOTTI, B.M.; VIDAL-MARTINS, A.M.C. Fecal coliforms, coagulase positive staphylococci (CPS),
Salmonella spp. and Campylobacter spp. in fresh sausage.
Alim. Nutr., Araraquara, v. 15, n. 3, p. 215-220, 2004.
ABSTRACT: Fresh sausages are foods exposed to
con-taminations and they represent an excellent way for development and multiplication of microorganisms. Like this, the present research had as objective verifies the microbiological quality of 106 samples of fresh sausages made out of either chicken, pork, or a mixture of beef and pork meat, obtained from both licensed and unlicensed producers and commercialized in Jaboticabal – SP, Brazil. The occurrence of fecal coliforms, coagulase positive staphylococci (CPS), Salmonella spp. and
Campylobacter spp. was verified, and conventional
microbiological methods were used in order to detect, isolate and identify those bacteria, the results were comparied with the limits of brazilian legislation. Of the 106 analyzed samples, 78 (73,6%) demonstrated the presence of fecal coliformes, 41 (38,7%) presented suggestive colonies of Escherichia coli, 18 (17%) of CPS and 8 (7,5%) for Salmonella spp.. No sample was positive for Campylobacter spp.. The tests of PCR multiplex rfb, stx1, stx2, eae O157, O111, O113 of the samples of suggestive colonies of E. coli were negative. It was concluded that it is necessary an improvement in the hygienic-sanitary conditions of that sausage type.
KEYWORDS: Inlaid products; Escherichia coli; fecal
coliforms; Salmonella spp.; coagulase positive staphylococci; Campylobacter spp.
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