Pró-Reitoria de Graduação
Curso de Biomedicina
Trabalho de Conclusão de Curso
Estudo Sobre Galleria mellonella como um modelo animal
alternativo para estudo da Paracoccidioidomicose.
Autora: Stefânia de Oliveira Frazão
Orientador: Prof. Dr. André Moraes Nicola
Coorientadora: Profª. Drª. Patrícia Albuquerque de Andrade Nicola
Brasília - DF
2014
STEFÂNIA DE OLIVEIRA FRAZÃO
Estudo Sobre Galleria mellonella como um modelo animal alternativo para
estudo da Paracoccidioidomicose.
Artigo apresentado ao curso de graduação em Biomedicina da Universidade Católica de Brasília, como requisito para obtenção do título de Bacharel em Biomedicina. Orientador: Prof. Dr. André Moraes Nicola Coorientadora: Profª. Drª. Patrícia Albuquerque de Andrade Nicola
Brasília-DF 2014
Artigo de autoria de Stefânia de Oliveira Frazão, intitulado “ESTUDO SOBRE
GALLERIA MELLONELLA COMO UM MODELO ANIMAL ALTERNATIVO PARA
ESTUDO DA PARACOCCIDIOIDOMICOSE”, apresentado como requisito para a obtenção do grau de Bacharel em Biomedicina da Universidade Católica de Brasília, em 14 de novembro de 2014, defendida e aprovada pela banca examinadora abaixo assinada:
____________________________________________________ Prof. Dr. André Moraes Nicola
Orientador
Professor e Pesquisador do Programa de Pós-Graduação em Ciências Genômicas e Biotecnologia da Universidade Católica de Brasília – UCB
_____________________________________________________ Prof. Msc Camila Guimarães de Freitas
Instituto Federal de Brasília- IFB
_____________________________________________________ Prof. Msc Stella Maris de Freitas Lima
Curso de Odontologia –Universidade Católica de Brasília- UCB
Brasília 2014
AGRADECIMENTOS
Primeiramente quero agradecer a Deus, pela vida e por nela sempre ter guiado os meus passos e ser meu protetor e minha fortaleza. Pelas conquistas, as pessoas especiais que estão e passaram na minha vida. Obrigada, Meu Deus!
Aos meus pais- Rosália e Hélio-, sem vocês eu não sou nada. Obrigada por abrirem mão de tudo por mim. Pelo carinho, por ensinar o caminho certo, repreender meus erros, por terem me estimulado a chegar até aqui. Gracias, Padresitos!
Ao meu esposo, Suelliton, obrigada pela paciência e por me entender nos momentos que não pude te dar atenção por estar estudando, por ter me dado forças nos momentos de desespero, pela atenção e amor que me dedica, por ser tão amigo e companheiro. Grazie, Amore Mio!
Aos amigos- Yarinha, Marlene, Gilberto, Tia Sara, Lisinha, Jeferson, Cadu, Thais- pelo carinho, por terem torcido por mim e em todos os momentos trazerem alegria a minha vida. Merci, Amis!
A Thais, novamente, a Roberta, Patty e a Alê, pela ajuda com os experimentos, por ficarem trabalhando comigo até tarde e no fim de semana, por me ajudar com os meios e a cuidar das Gallerias. Danke für die Hilfe!
Aos orientadores, Patty e André, por terem dedicado um tempo a me ensinar, pelos conhecimentos compartilhados, por terem compreendido quando tive algum problema, por escutarem as minhas angustias de não saber o que fazer quando terminar a graduação, me mostrarem algumas possibilidades... Thanks for everythings!
A professora Lídia, pelo auxilio tanto no TCC 1 quanto no TCC2 e pela disponibilidade e a boa vontade de ajudar. Multas gratias!
Aos colegas da UnB, que nos cederam o Paracoccidioides spp. Arigatoo! Ao CnPq pelo apoio financeiro. Dankon!
A todos que contribuíram diretamente ou indiretamente para o meu crescimento acadêmico e para que esse trabalho acontecesse. Kiitos!
ESTUDO SOBRE GALLERIA MELLONELLA COMO UM MODELO ANIMAL ALTERNATIVO PARA ESTUDO DA PARACOCCIDIOIDOMICOSE.
STEFÂNIA DE OLIVEIRA FRAZÃO
RESUMO
Paracoccidioides spp é o agente etiológico da paracoccidioidomicose (PCM), uma das
micoses sistêmicas mais frequentes na América Latina. Esse parasita intracelular facultativo apresenta-se sob a forma de micélio à temperatura ambiente e se diferencia para forma de levedura quando submetido à temperatura de 37°C (in vitro) ou durante a invasão aos tecidos de hospedeiros. Apesar de ter sido isolado pela primeira vez há mais de um século, ainda se sabe muito pouco sobre o habitat e ecologia desse fungo, uma vez que poucos isolados ambientais foram obtidos até o momento. No entanto, existem várias evidencias de que esse fungo apresente uma fase saprofítica no solo e/ou em vegetais, como é o caso de vários outros fungos de interesse médico, como Aspergillus spp e Cryptococcus spp. No presente estudo propusemos o estabelecimento de larvas do lepidóptero Galleria mellonella como um modelo experimental para PCM. Tais larvas têm sido utilizadas, com sucesso, para o estudo de outros fungos patogênicos e constituem uma potencial alternativa devido a facilidade de manuseio e menor custo, quando comparado com hospedeiros mamíferos. Ensaios de sobrevivência de
Paracoccidioides spp em modelos murinos duram aproximadamente entre 90 e 180 dias
dependendo da linhagem utilizada. Em nosso estudo, conseguimos obter resultados semelhantes com a infecção de G. mellonella em períodos de duas semanas. As diferentes linhagens de Paracoccidioides spp foram capazes de infectar as larvas e no experimento em que testamos os fármacos elas demonstraram resultados satisfatórios, mostrando que nossas larvas também respondem a terapia. Os fungos que utilizamos em nossos experimentos tem uma característica de perder a virulência quando cultivados por longos períodos in vitro. Ao fazermos passagens desses fungos nas lagartas e recuperá-los, verificamos que as passagens recuperaram a virulência dos fungos.
Palavras-chave: Paracoccidioides spp, modelo animal, Galleria mellonella,
Paracoccidioidomicose. INTRODUÇÃO
Paracoccidioides spp é um fungo dimórfico e patogênico ao homem e agente
etiológico da paracoccidioidomicose (Pbmicose). A Pbmicose é uma doença granulomatosa crônica, endêmica na América Latina, sendo que a maioria dos casos foi descrita no Brasil [1;2]. Essa micose acomete principalmente trabalhadores rurais ou pessoas que lidam diretamente com a terra. No entanto, a Pbmicose tem se tornado uma infecção emergente em
outras regiões em decorrência de perturbações ambientais e também tem sido descrita como uma infecção oportunista em portadores do vírus da imunodeficiência humana (HIV) [3;4].
O Paracoccidioides spp é um parasita intracelular facultativo apresenta-se sob a forma de micélio à temperatura ambiente, diferenciando-se em levedura quando submetido à temperatura de 37°C (in vitro) ou a partir da invasão aos tecidos de hospedeiros [5].
Apesar do fungo Paracoccidioides spp ter sido descrito pela primeira vez por Lutz, no início do século passado [6], o seu habitat natural ainda é uma incógnita. O fungo foi isolado apenas algumas vezes a partir de amostras de solo em áreas endêmicas. E os dados referentes ao seu ciclo biológico e habitat, a despeito de significantes progressos alcançados nos últimos anos, ainda são insuficientes para se determinar de maneira clara o seu nicho ecológico [7;8;9]. As informações acumuladas até o momento sugerem que o fungo apresente uma fase saprofítica no solo e/ou vegetais [8].
Por tais motivos, por muito tempo acreditou-se que o homem fosse o único hospedeiro desse parasita. Porém a presença deste parasita já foi detectada nas fezes de alguns animais silvestres tão diversos entre si, como morcegos e pinguins. E nas últimas décadas vários relatos na literatura sobre o nicho ecológico desse fungo registraram a presença dele em órgãos de tatus (Dasypus novemcinctus), capturados em áreas endêmicas da Pbmicose, tanto no Brasil quanto na Colômbia [10;11;12]. Tal fato, associado aos hábitos de vida do tatu, sugere que esse mamífero possa apresentar grande relevância na elucidação da ecologia do
Paracoccidioides spp, que pode ter encontrado nesse hospedeiro a proteção necessária contra
as adversidades naturais [8].
Como todas as dúvidas sobre o Paracoccidioides spp, existe a necessidade de realizar mais estudos, seja de ecologia ou interação patógeno-hospedeiro. E, para isso, existem modelos murinos, tanto suscetíveis quando resistentes, bem estabelecidos para estudos da Pbmicose [13]. No entanto, experimentos de cinética de sobrevivência em camundongos infectados por Paracoccidioides spp, fundamentais para se avaliar alterações na virulência de diferentes isolados (ou novas drogas antifúngicas) são longos. Eles podem durar, em média, de 100 a 200 dias [14;15;16]. Um modelo alternativo que pode ser usado para sobrepujar essa deficiência é Galleria mellonella ou traça da cera. Trata-se de uma lepidóptera da família Pyralidae, que é considerada uma peste para apicultores porque se alimenta de pólen, mel e cera de abelha, causando destruição da colmeia. Larvas dessa espécie vêm sendo amplamente empregadas em estudos de patogênese e virulência microbiana de bactérias e fungos, uma vez que possuem mecanismos de imunidade inata semelhantes aos presentes em mamíferos e, portanto, geram resultados semelhantes aos que foram previamente obtidos com mamíferos [17;18;19;20;21].
Em adição, as larvas de G. mellonella apresentam várias vantagens quando comparadas com outros modelos, especialmente camundongos, ratos e coelhos [22]. O seu uso é eticamente mais aceitável, o custo de manutenção é menor e o curso da infecção é mais rápido, durando em media 2 semanas [23]. O tamanho da larva permite que elas sejam inoculadas com quantidades específicas de microrganismos ou agentes antimicrobianos e facilita a manipulação e coleta de tecidos e hemolinfa, para estudos de patofisiologia [22]. Adicionalmente, as larvas podem ser incubadas em temperatura de 25ºC e 37 ºC, diferentemente de outros modelos alternativos permitindo uma melhor reprodução das
condições fisiológicas em que ocorrem as infecções humanas. Embora a semelhança entre humanos e modelos murinos seja certamente maior, as larvas se apresentam como uma alternativa barata e rápida para estudos de eficácia in vivo de agentes antimicrobianos, principalmente na fase de seleção de candidatos para estudos posteriores em modelos mamíferos. Mais importante que as vantagens de custo é a diminuição do uso de animais vertebrados. A partir de nossos estudos, o objetivo desse trabalho foi propor a Galleria
mellonella como um modelo animal para o estudo da interação Paracoccidioides spp-
hospedeiro, baseado em análises de curvas de sobrevivência de larvas infectadas com esse fungo e também tratadas com Anfotericina B e Itraconazol.
MATERIAIS E MÉTODOS
a. Linhagens fúngicas:
Paracoccidiodes brasiliensis isolados 18 e 265, P. lutzii (Pb01) foram cultivados em
meio Fava Netto a 37°C. Os repiques dos diferentes isolados foram realizados a cada 7 dias.
b. Meios de Cultura:
Fava Netto para Paracoccidioides spp: 3g de Proteose peptona, 10g de Peptona, 5g de Extrato de carne, 5g de Cloreto de sódio, 5g de Extrato de levedura, 40g de Dextrose, 18g de Ágar e 1000mL de Água destilada. Com pH entre 7,2 e 7,4.
Meio BHI suplementado: O meio foi preparado de acordo com as instruções do fabricante (HIMEDIA, India) usando 37g por litro de água destilada. Ao meio foram adicionados 20g de Ágar bacteriológico, 4% de soro de cavalo, 6% de meio condicionado de
P. brasiliensis, Ampicilina (100µg/mL), Estreptomicina (30µg/mL) e Canamicina (20µg/mL).
As placas foram vertidas e armazenadas entre 2-8°C, ao abrigo da luz.
c. Criação e manutenção de G. mellonella:
As larvas foram mantidas em frascos de vidro em ambiente escuro em uma estufa a 30°C. Para manutenção da colônia, quantidades suficientes de dieta artificial foram adicionadas aos frascos pelo menos três vezes por semana. Larvas com peso entre 180 e 250 mg foram empregadas nos ensaios de sobrevivência.
d. Dieta artificial de G. mellonella.
As larvas foram alimentadas com dieta artificial cujos componentes são: 500 g de Cereal infantil, 100 g de Açúcar, 100 mL de Glicerina, 100 g de Mel e 100 mL de Água destilada. Essa dieta foi armazenada no freezer, em porções pequenas, que foram descongeladas apenas quando necessárias para a manutenção da colônia.
e. Modelo/ Procedimento de infecção.
Larvas com aproximadamente 250mg foram randomizadas em grupos de no mínimo 12 indivíduos. Todas as suspensões fúngicas usadas para infectar as larvas também continham ampicilina na concentração de 20mg/kg de Galleria mellonella para evitar infecção com bactérias que porventura estivessem na superfície das lagartas. Antes de inocular a suspensão no corpo das larvas, as cutículas foram limpas com álcool 70%. Depois da antissepsia, com o
auxilio de uma Seringa de Hamilton, foram injetados 10µL da suspensão a ser testada na última falsa pata da lagarta (do inglês proleg). Nos casos em que foi necessário injetar mais de uma vez o mesmo indivíduo, não utilizamos a mesma falsa pata, porém demos obrigatoriamente prioridade às ultimas. Os grupos de larvas infectadas foram colocados em placas de petri e incubados na estufa. Diariamente, observamos as larvas e as que haviam morrido foram contabilizadas.
f. Padronização da densidade de células fúngicas e tamanho das larvas a serem utilizadas nos ensaios de sobrevida.
A duranção do período larval da G. mellonella depende muito da situação a que ela está exposta. Quando passam por um período de injúria, por exemplo falta de alimento, tendem a diminuir a duração da fase de larva e passam para a forma adulta antecipadamente. Para padronizar nossos experimentos e estipular o melhor inóculo a ser utilizado, elegemos o Pb18 (a linhagem mais virulenta) e fizemos um ensaio com um grupo controle (PBS) e três diferentes inóculos (104, 105, 106), injetando sempre 10µL de suspensão em cada larva, para saber qual desses inóculos seria possível concluir os experimentos e fazer as analises necessárias com a G. mellonella ainda no período larval.
g. Ensaio de sobrevida com diferentes linhagens de Paracoccidioides spp.
Foram realizados experimentos para avaliar a sobrevivência de G. mellonella após a infecção com diferentes isolados de P. brasiliensis e P. lutzii usando-se diferentes inóculos iniciais e diferentes temperaturas de incubação pós-infecção. Essas larvas infectadas foram observadas diariamente para se tomar nota de quantas morreram. Nesses experimentos utilizamos grupos de no mínimo 12 larvas as quais foram inoculadas com 10 µL da suspensão de fungos, para os grupos em análise, e 10µL de PBS, para o grupo controle.
h. Ensaio de sobrevida da infecção com Paracoccidioides brasiliensis (Pb18) e diferentes fármacos antifúngicos.
Lagartas de G. mellonella foram infectadas com os respectivos fungos e inoculadas com antifúngicos (Anfotericina B (1,5mg/kg) e o Fluconazol (14mg/kg).). O efeito dos peptídeos antimicrobianos na sobrevivência das lagartas foi avaliado por testes estatísticos utilizando-se as ferramentas do programa GraphPad Prism 6.04 (San Diego, Califórnia, EUA). Esses ensaios contaram com grupos de 12 larvas cada e os seguintes grupos controle – PBS, PBS e solução de cada antifúngico na ausência de infecção para avaliarmos a toxicidade desses para as larvas.
i. Ensaio de recuperação de células fúngicas de larvas previamente infectadas.
Larvas mortas foram recolhidas e injetou-se 250 µL de PBS, que após recuperação, foram inoculados em placas de Brain Heart Infusion (BHI) para avaliação do número de unidades formadoras de colônia e viabilidade do fungo após a interação. Após o crescimento em placa as colônias características de Paracoccidioides spp foram analisadas microscopicamente.
j. Análise dos efeitos da interação de P. brasiliensis com G. mellonella na virulência do fungo pelo ensaio de sobrevida após múltiplas passagens pelo modelo animal proposto.
Colônias do fungo recuperadas das lagartas foram utilizadas em novos ensaios de infecção em G. mellonella para avaliarmos se ocorre alguma alteração na virulência do fungo
após sua interação com o inseto. Uma característica importante desse fungo é a perda da sua virulência após cultivo prolongado in vitro, que cria a necessidade de passagens das linhagens em modelos murinos para manter a sua virulência. Inoculamos cinco larvas com o fungo, com o objetivo de recuperá-los das larvas para uma posterior infecção com os microrganismos passados várias vezes em G. mellonella. Após a morte das lagartas, estas foram maceradas e as amostras inoculadas em meio BHI suplementado. Após crescimento, os fungos recuperados foram novamente inoculados em G. mellonella e após múltiplas passagens verificamos os efeitos dessas passagens na infecção de novas lagartas de G. mellonella para avaliarmos se esse modelo de infecção poderá eventualmente substituir camundongos para fins de recuperação da virulência do fungo após cultivo prolongado.
RESULTADOS
a. Curva de sobrevivência de G. mellonella infectadas com diferentes inóculos de
Paracoccidioides brasiliensis.
Para iniciar os testes da interação entre o Paracoccidioides spp e a G. mellonella avaliamos qual inóculo seria o mais adequado para usar nos demais experimentos. Para isso fizemos o experimento com três diferentes densidades de células do fungo- 104, 105 e 106 células por larva- em grupos de doze larvas cada. A que ofereceu melhores resultados para os testes foi a densidade de 106 células. Observamos que as larvas de G. mellonella têm a sua fase larval adaptada às condições nas quais estão submetidas, e quando elas passam por alguma injúria tendem a diminuir o tempo dessa fase e empupam para passar para a fase adulta. As larvas que foram infectadas com inóculos menores chegaram a ficar doentes, mas a maioria virou pupa antes de terminarmos o experimento ou não morreu. As lagartas infectadas com a densidade de 106 células do fungo tenderam a morrer em até 15 dias. Com isso observamos que a quantidade de células foi inversamente proporcional ao tempo de sobrevida, ou seja, quanto maior a quantidade de fungo inoculado nas larvas, menor o tempo para a morte das lagartas.
b. Curva de sobrevida de G. mellonella infectadas com diferentes linhagens de
Paracoccidioides spp.
A fim de comparar a virulência das diferentes linhagens de Paracoccidioides spp elegemos quatro grupos de dezesseis larvas cada e inoculamos um grupo controle com PBS e cada um dos outros três com uma das linhagens de Paracoccidioides spp. Todas as linhagens de P. brasiliensis (Pb18 e Pb265) e P. lutzii (Pb 01) utilizadas foram capazes de matar G.
mellonella em intervalos de aproximadamente duas semanas (Figura 1). Não observamos uma
diferença significativa no tempo de sobrevivência das larvas após a infecção com as diferentes espécies e linhagens nas condições utilizadas, mas observamos diferença significativas das três linhagens em relação ao controle.
Figura 1: Curva de sobrevivência de G.mellonella infectada com diferentes linhagens de
Paracoccidioides spp.
As largas fora inoculadas com solução salina (PBS) ou com 106 células, de P. brasiliensis (Pb18 e Pb265) ou P.lutzii (Pb01), e incubadas a 37°C.
c. Curva de sobrevida de G. mellonella infectadas com P. brasiliensis recuperado de larvas previamente infectadas
Foi realizada a infecção em um grupo de cinco larvas com P. brasiliensis (Pb18). Essas foram observadas diariamente e no dia em que morreram recuperamos os fungos a partir dos tecidos de lagartas mortas que foram inoculados em uma placa de BHI. Repetimos esse mesmo procedimento utilizando Pb18 recuperado em outro grupo de cinco larvas. Recuperamos novamente o Pb18 iniciamos um novo experimento. Após a terceira passagem, infectamos lagartas que foram distribuídas nos seguintes grupos: grupo controle (PBS), Pb18-0- fungo cultivado in vitro- e Pb18-pós Galleria- células do fungo que foram recuperadas após a terceira passagem (Figura 2). Nesse experimento observamos que o Pb18-pós Galleria foi capaz de matar todas as lagartas infectadas em apenas uma semana, enquanto as que foram infectadas com Pb18-0, apesar de terem ficado debilitadas, não morreram durante o tempo estipulado para o experimento. Tal resultado nos sugere que durante a interação do
Paracoccidioides spp com G. mellonella ele é capaz de recuperar a virulência que havia sido
atenuada pelo cultivado in vitro prolongado. Observamos uma diferença significativa do Pb18- pós Galleria em relação ao PBS e o Pb18-0 com p<0,5.
Figura 2: curva de sobrevivência de G. mellonella infectada com a linhagem de P.
brasiliensis recuperada de lagarta doente.
As lagartas foram inoculadas com solução salina (PBS), com 106 células de P. brasiliensis cultivado por tempo prolongado in vitro (Pb18-0) ou recuperado de larvas infectada (Pb18-
pos Galleria) e incubadas a 37°C.
d. Curva de sobrevida de G. mellonella infectadas com P. brasiliensis e tratadas com fármacos antifúngicos.
Esse experimento contou com seis grupos de doze larvas cada, desses três eram controles (PBS, PBS+Anfotericina B e PBS+Itraconazol) e três grupos experimentais (Pb18, Pb18+Anfotericina B, Pb18+Fluconazol) e foram incubadas a 37°C.(Figura 3) A Anfotericina B e o Itraconazol foram escolhidos por terem caráter antifúngico conhecido e serem drogas de escolha para o tratamento de paracoccidioidomicose. No gráfico podemos observar que as larvas dos grupos controle não morreram por traumas da inoculação ou toxicidade dos fármacos, pois 100% das larvas do PBS e das inoculadas com Fluconazol permaneceram vivas durante todo o experimento e apenas uma do grupo inoculado com Anfotericina morreu. Os grupos de larvas que receberam o tratamento demoraram um tempo significantemente maior para morrer quando comparados com o grupo sem tratamento.
Figura 3: Curva de sobrevivência de G. mellonella infectadas com a linhagem de P.
brasiliensis (Pb18) e tratadas com antifúngicos.
As larvas foram inoculadas com solução salina (PBS), Anfotericina B (Anf), Fluconazol (Flu), ou 106 células de P. brasiliensis (Pb18) ou Pb18 com Anf ou Pb18 com Flu.
DISCUSSÃO
Esse estudo mostrou que a G. mellonella é um modelo animal promissor para os estudos da paracoccidioidomicose. Além do Paracoccidioides spp conseguir matar as larvas, mostramos que o curso da infecção é afetado de maneira significativa quando associados a tratamentos com fármacos, como previamente demonstrado para outros microrganismos, incluindo fungos como Cryptococcus neoformans (23) e Candida albicans (17).
Esse modelo animal conta com várias vantagens, entre eles a facilidade e o menor custo da manutenção da colônia de G. mellonella. Os resultados aqui mostrados em conjunto com a literatura sugerem que, em alguns casos, esse modelo pode substituir os estudos em mamíferos ou pelo menos diminuir significativamente o número deles em experimentos prospectivos. Além disso, o uso de larvas em detrimento de modelos mamíferos é eticamente mais aceitável. E por último, mas não menos importante, o curso de infecção é menor, visto que em G. mellonella o tempo de infecção geralmente é de duas semanas enquanto em murinos dura em média 180 dias.
Existem outros modelos animais de invertebrados que também já foram utilizados em experimentos com outros fungos e bactérias patogênicos, como Drosophila melanogaster,
Caenorhabditis elegans e Dictyostelium discoideum, que também tem apresentam as suas
vantagens como a G. mellonella. Mas uma outra vantagem e motivo de se escolher a G.
mellonella e não esses invertebrados é que elas podem ser incubadas em diversas
temperaturas, nos dando flexibilidade de fazer experimentos tanto a 37°C, quanto a 25°C, por exemplo, pois essas são as temperaturas de dimorfismo do Paracoccidioides spp. Além disso, conseguimos inocular as larvas com quantidades exatas do fungo, garantindo experimentos mais controlados. Em D. melanogaster, por exemplo, a infecção ocorre pela ingestão do patógeno, se garantia que todos os indivíduos do grupo tenham ingerido a mesma quantidade de células.
Visando uma aplicação prática dessas larvas como modelo animal em PCM, testamos a eficácia de fármacos no tratamento da infecção experimental. Sabemos muitos grupos pesquisam novas moléculas com potencial antimicrobiano. Analisando nosso experimento em que a larva respondeu de maneira positiva podemos supor que nossas larvas abrirão portas para estudos de novas drogas antimicrobianas, como por exemplo peptídeos antimicrobianos sendo desenvolvidos em nossa instituição.
Em nossos experimentos observamos que quando utilizamos larvas que ainda estão pequenas, essas sofriam mais após o trauma da inoculação, perdendo bastante hemolinfa e morrendo prematuramente. Essa é uma desvantagem do modelo, mas pode ser contornada escolhendo larvas maiores. E é uma desvantagem que não minimiza as várias vantagens que já citamos anteriormente. Com isso, consideramos as larvas de G. mellonella um modelo animal promissor para os estudos de interação Paracoccidiodes spp- hospedeiro.
Study of Galleria mellonella as an alternative animal model for study of Paracoccidioidomycosis
ABSTRACT
Paracoccidioides spp is the etiologic agent of Paracoccidioidomycosis (PCM), one of
the most frequent systemic mycoses in Latin America. This facultative intracellular parasite presents itself in the mycelium form at temperature and differentiates to yeast form when cultured at 37° C (in vitro) or during the invasion of host tissues. Although it has been isolated for the first time in over a century, little is known about the habitat and ecology of this fungus because few environmental isolates have been obtained so far. However, many evidences indicate that it has a saprophytic phase in soil and/or plants, as is the case of many other human pathogenic fungi.
In this study, we proposed to establish the larvae of the Lepidoptera Galleria
mellonella as an experimental model for PCM. This larvae have been successfully used with
other pathogenic fungus and are an interesting alternative due to ease of infections and lower cost when compared to mammalian hosts. Survival tests using mice infected with
Paracoccidioides spp usually last between 90 and 180 days depending on the strain used. We
have obtained similar results with the G. mellonella model in only in two weeks. In addition, as pathogenic organisms maintained in the laboratory for long periods tend to present an attenuation in virulence, we investigated if the interaction of P. Brasiliensis with G.
mellonella recovered fungal virulence. The positive results obtained in this experiment have
opened new research avenues that could help us better understand the mechanisms used by the fungus to cause disease.
Keywords: Paracoccidioides spp, animal model, Galleria mellonella,
Paracoccidioidomycosis.
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