Roteiro. Principais Tarefas. Biologia Computacional e Bioinformática. Motivação. Motivação. Biologia Molecular, IA e bioinformática

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Biologia Molecular, IA e Bioinformática

Ana Lúcia C. Bazzan

---Universidade Fed. do Rio Grande do Sul Instituto de Informática

{bazzan@inf.ufrgs.br}

Roteiro

• Biologia Computacional e Bioinformática

– características e principais objetivos • Biologia Molecular: uma introdução • Projetos Genoma

• Inteligência Artificial em Ferramentas de Bioinformática – sequenciamento

– anotação

Biologia Computacional e Bioinformática

• Bioinformática

– uso de computadores em aplicações da área de biologia (tecnologia e infra-estrutura computacional)

– análise de dados provenientes do genoma (elucidar processos biológicos complexos)

– diagnósticos de doenças, desenvolvimento de novos fármacos • Biologia computacional

– estudo de sistemas moleculares naturais e artificiais – novos paradigmas de computação baseada em DNA

Principais Tarefas

• Algumas tarefas associadas à bioinformática em projetos Genoma:

– receber e armazenar sequências – montar o genoma

– disponibilizar ferramentas para anotação do genoma – comunicação com repositórios de dados (incluindo envio) • Tarefas específicas para Inteligência Artificial

– auxiliar anotação – ...

Motivação

• encontrar mais rapidamente um fármaco para uma patologia específica; alguns aspectos do processo de descoberta científica e de desenvolvimento de fármacos migrarão para biologia in silico

• bioinformática tem o potencial de mudar a biologia e a medicina

• genoma sem bioinformática não conseguirá sobreviver face à concorrência, especialmente no mundo dos negócios associados à biotecnologia

Motivação

• volume de dados é de altíssima ordem

– Incyte Genomics: 20 milhões de pares de bases de DNA / dia – Celera Genomics: afirma possuir 50 terabytes de dados

armazenados (≈80 mil CDs)

– apenas os bancos de dados que armazenam sequências! – adicionalmente: expressões gênicas (quando e onde um gene

se expressa), diferenças genéticas entre indivíduos

(single-nucleotide polymorphismsou SNP), estruturas de proteínas,

interação de proteínas, referências a publicações científicas (artigos, revistas, livros, etc.).

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Uma Analogia

• genoma ≡livro • cromossomos ≡capítulos • genes ≡estórias • exons ≡parágrafos

(interrompidos por introns)

• codons ≡palavras

• bases ≡letras (A,C,G,T)

O Genoma Humano

• ~3 bilhões pares de bases (bp) • 30K - 60K genes

• ~1 gene/~30kbp • ~6 exons/gene • ~150 bp/exon

• genes: onde estão e como se parecem?

Seleção e Evolução

• busca em espaço de características possíveis para os organismos

• espaço precisamente definido

– 4 letras em uma dupla fita (2 sequências lineares) – tradução e transcrição: complexa

• genótipo x fenótipo: codificação genética x características físicas

• busca é sobre espaço do genótipo • seleção é sobre espaço do fenótipo

Biologia Molecular

• célula

– procariotos: sem núcleo ou outras organelas; DNA circular => bactérias

– eucariotos: núcleo e organelas (e.g. mitocôndria) => animais, plantas, leveduras, fungos

• célula somática: divisão em 4 fases; é especializada (e.g. 14 tipos em tecidos)

– questão em aberto: COMO, QUANDO??? • célula reprodutiva: divide-se via meiose

Biologia Molecular

• composição da célula: núcleo, citoplasma, material genético e mecanismos para sua tradução em proteínas, membrana

– membrana: lipídio (hidrofóbico) + grupo fosfatado (hidrofílico) – material genético: DNA ou RNA (carga negativa)

– proteína:

• molécula responsável por maioria das funções da célula • estrutura primária: sequência de amino-ácidos (20 tipos) • cadeia: até 4500 a.a. => espaço de busca = 204500

DNA e RNA

• ácidos nucléicos

• polímeros formados a partir de nucleotídeos: adenina, citosina, guanina, timina

• dupla fita, hélice dupla – A com T (U no RNA) – C com G

• cada fita: cabeça (5’) e cauda (3’)

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Proteínas

• funções: estrutura da célula, enzimas,

ativação/desativação de genes, sensores, atuadores, detectores (sistema imunológico)

• cada célula tem mesmo DNA; cada tipo de célula gera proteínas diferentes

• constituição: amino-ácidos

– átomo C + grupo amino (NH3) + grupo carboxil (COOH) + cadeia variável

Proteínas

• estrutura primária: cadeia de amino-ácidos

– 3 nucleotídeos formam um codon que especifica um amino-ácido (são 20 ao todo)

– 43_{= 64 => redundância}

• estrutura secundária: arranjos locais (alfa hélices, fita beta, coils etc.)

• estrutura terciária: depende da posição dos átomos após o folding

• estrutura quaternária: partes ativas / inativas

O Dogma Central

• DNA - mRNA - tRNA - proteína

– etapas:

• transcrição de uma porção de DNA (via promotores) em RNA mensageiro (ligação de uma RNA polimerase com uma parte da molécula de DNA)

• splicing: junta os exons; transporte para for a do núcleo • tradução: mRNA é usado como blueprint para produção de amino

ácidos (no ribosomo) que constituem as proteínas

• folding da proteína, transformações pós translacionais (elementos distintos podem mudar a forma e a atividade)

• transporte da proteína para onde ela exerce sua função

Tradução

protein sequence (primary)

Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 4

Intron 1 Intron 2 Intron 3

DNA

TRANSCRIPTION

5’

O Dogma Central

5’ 3’

D N A

Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 4

Intron 1 Intron 2 Intron 3

p o l y A s i g n a l Pyrimidine tract Branchpoint C T GAC S p l i c e s i t e C A G S p l i c e s i t e G G T G A G Translation Initiation A T G Stop c o d o n TAG/TGA/TAA Promoter T A T A

Sinais em Genes

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Genoma, Transcriptoma, Proteoma

• Genoma

– Sequenciar e montar o material genético (DNA) de um organismo

• Transcriptoma

– Encontrar os genes expressos (EST) • Proteoma

– Encontrar as proteínas sintetizadas

Genoma

Sequencing Labs DNA Sequences WWW Sequence Data Base Genome Assembly Annotation G e n e Identification

Function and Structure WWW WWW

fig. Kitajima, Unicamp/Fapesp)

G C A T

Genoma

• Sequenciamento

Fases de um Projeto Genoma

Montagem de um Genoma

Assembler: Phrap (www.phrap .org) Contigs

Gaps

Complete Genome

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Anotação Básica e Submissão

PDB SwissProt GenBank PIR C O G P F A M ...

Alignment program : BLAST/FASTA

G e n e Organism E-value

dnaA E. coli 1e-100 dnaA S.flexineri 1e-89 dnaA X.campestris 1e-50 ...

HS0998 Homo sapiens 4.0

Fases de um Projeto Genoma

Repositórios de Dados

• NCBI (

national center for biotechnology information):

criado em 1988

• responsável por:

– criar Bancos de Dados públicos

– conduzir pesquisas na área de biologia computacional – desenvolver ferramentas de software próprias para análise

de dados de genoma

– disseminar informações biomédicas

Genbank

• Banco de dados de sequências de nucleotídeos gerados a partir do sequenciamento de DNA

• Desde 1982 o número de bases dobra a cada 14 meses

Modelo de Dados

• Bancos de dados de seqüências e as ferramentas de acesso do NCBI foram construídos a partir de um Modelo de Dados particular

• Modelo de dados simples e poderoso o suficiente para agregar dados heterogêneos

– sequências de nucleotídeos e amino-ácidos – estruturas tridimensionais

– publicações (Medline)

Ferramentas para se Encontrar a

Estrutura de um Gene

• Porque algoritmos?

– mais rápido e limpo que bancada – poda possibilidades

– fornece pistas para bancada

• Encontrar similaridades: localização rápida e montagem das regiões conservadas e com similaridade

• Métodos não baseados em similaridade – nicho para Inteligência Artificial

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BLAST

• basic local alignment search tool

• BLAST é um algoritmo usado por uma família de cinco programas que procuram por similaridade

• Métodos estatísticos são utilizados para julgar se a similaridade é significante

• O resultados final da busca é apresentado por ordem de significância

Alinhamento por Similaridade

Exact matches of individual sequence letters are marked on the comparison graph. This alignment clearly shows the regions of identity between the two sequences

• Alinhar para encontrar pontos chave entre sequências • Por comparação: quanto melhor similaridade, maior o

escore A G G C T T G C C T A A A G G C T T G C C T A A Human sequence Human sequence Mouse sequence Mouse sequence C G G C C A T T G C G G C C A T T G A G G C T T G C C T A A A G G C T T G C C T A A Human sequence Human sequence Mouse sequence Mouse sequence C G G C C A T T G C G G C C A T T G The collected strips of identity can be

thought of as short local alignments within the global alignment. These local stretches form diagonals within the graph. A G G C T T G C C T A A A G G C T T G C C T A A Human sequence Human sequence Mouse sequence Mouse sequence C G G C C A T T G C G G C C A T T G If we cast the edges of these

diagonals towards each axis, we can easily depict the local alignment: Mouse:

Mouse: GCCGCC TTGTTG GCCGCC Human:

Human: GCCGCC TTGTTG GCCGCC The individual local alignments can be connected to form a global alignment. Some diagonals are excluded in favor of a better global alignment. A G G C T T G C C T A A A G G C T T G C C T A A Human sequence Human sequence Mouse sequence Mouse sequence C G G C C A T T G C G G C C A T T G

Complexidade

• predição envolve rearranjos no alinhamento

(substituição, inserção, deleção, duplicação, inversão de bases)

• alinhamento de sequências curtas: complexidade para atingir alinhamento ótimo é desprezível

• alinhamento de segmentos de cromossomos: deseja-se um resultado ótimo em período de 1 semana

Alinhamento Múltiplo

• motivação: bancos de dados de proteínas são

categorizados por famílias (Pfam, PDB, prosite, etc.) • construir um bom alinhamento que represente a família • método da soma dos pares (SP): valor para alinhamento

de k strings é dado pela soma de todos os alinhamentos

dois a dois com complexidade O((2n)k₎_!!!

• consensus string: a c c g t

-- c -- a g t g a - t c g a g a c - c g t g

Métodos não Baseados em Similaridade

• Codon bias

– vários codons codificam um amino-ácido – 1 codon aparece mais que os demais

• Sinais em sequências (podem levar a sobre estimação do número de genes se sinal for fraco)

• exemplo de utilização de hidden markov models (HMM) • aspectos positivos:

– flexível, processos probabilísticos

– não necessita de similaridades com genes conhecidos – melhores resultados em termos de sensibilidade e

especificidade • aspectos negativos:

– podem ser complicados, necessita treinamento – viés em relação ao conjunto de treinamento

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Modelo Oculto de Markov

• Autômato com probabilidades de transição e emissão • Modela um processo aleatório em um nr. finito de estados

• Hipótese de Markov: cadeia não tem memória; o estado corrente depende apenas do estado anterior • Modelar sequências de resíduos de forma aleatória • Treinar modelos a partir de dados reais

Xi Xi+1

Xi-1

Exemplo

ACTGCGTATTTGTGTTG ßsequência observada

IIIIIIEEEEEEEIIIIIIIIIIIIIII ßmodelo 1?

IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII ßmodelo 2?

IIIIEEEEEEEEEEIIIEEEEE ßmodelo 3?

..…

• aqui: I = intron e E = exon • I’s e E’s são os estados ocultos

Simple Hidden Markov Gene Model

A T G Exon A 0.25 C 0.25 G 0.25 T 0.25 A 0.9 C 0.03 G 0.04 T 0.03 1 0.9 0.1 0.1 0.9 T A A End Intron A 0.45 C 0.05 G 0.05 T 0.45 0.8 0.1 0.1

Busca de Sítios Conhecidos

• identificação de regiões funcionais em sequências • sítio = sequência (curta) contendo algum sinal • amostra A de sítios de compr. n

• amostra B de não sítios de compr. n

• dada uma seq. s de compr. n, qual a prob. de ser um sítio?

Busca de Sítios Conhecidos

• Exemplo

– cyclic AMP receptor protein (CRP): fator de transcrição na

E. Coli

– sítios de aprox. 22 nucleotídeos, sinal mais forte entre 3 e 9

– amostra de 23 sequências

Busca de Sítios Conhecidos

• Estatística

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Busca de Sítios Conhecidos

• Probabilidade para testar sítios

– seja t=t1t2…tnuma seq. aleatória de A

– Ar , j= Pr (tj= resíduo qualquer)ou seja Ar , jé a prob. de que o

j-ésimo resíduo da seq. t seja um dado resíduo, dado que t é uma seq. retirada aleatoriamente de A

– ex.: o resíduo na pos. 1 tem 35% de prob. de ser uma adenina, 17% de ser uma citosina etc.

Busca de Sítios Conhecidos

• Hipótese de independência:

– resíduo na pos. j independe dos resíduos que ocorrem nas demais posições (nem sempre válida!)

• Definição:

– dois eventos prob. E e F são independentes se as prob. de ambos ocorrerem for igual ao pord. das prob. de cada um ocorrer: P(E & F) = P(E) * P(F)

– prob. de uma seq. aleatoria r1r2r3…rné: Pr(t = r1r2r3…rn) = P_r(t₁=r₁& t₂=r₂&… t_n=r_n) = ÕP_r(t_j= r_j) = ÕA_{r , j}

Busca de Sítios Conhecidos

• Exemplo

– qual a prob. de uma CRP escolhida randomicamente ser a seq. TTGTGAC ?

– Pr(t = TTGTGAC ) = .35 * .87 * .78 * .91 * .83 * .83* .3 = 0.045

– notar que TTGTGAC é a seq. de maior prob. !

Busca de Sítios Conhecidos

• taxa de probabilidade (likelihood ratio)

– seja B uma amostra de não sítiosretirada aleatoriamente – usando A e B, pode-se dizer se uma seq. s tem mais prob. de

ser um sítio ou um não sítio [ denota-se LR(A,B,s) ] – dada a seq. s = s1s2… sn, LR ( A, B, s ) é definida:

∏

= = = = = = = = n j s j j s n j j s n j j s r r j j j j B A B A s t P s t P s B A LR 1 , , 1 , 1 , ) sítio não t | ( ) sítio t | ( ) , , (

Busca de Sítios Conhecidos

• exemplo

– seja B = {A,C,G,T}7o conj. de todas as seq. não sítios de

compr. 7

– uma amostra B tem Br , j= 0.25para qq. r e j

– assim, para s = TTGTGAC : – essa taxa é boa ou ruim??? – necessita um limiar L 732 ) 25 . 0 ( 045 . 0 ) , , ( 1 7 , , = = =

_∏

= n j s j j s j j B A s B A LR

Busca de Sítios Conhecidos

• normalmente se usa o log likelihood ratio (LLR) para

evitar problemas de overflow ou underflow numérico

∑ ∑ ∏ ∏ = = = = = = = n j j s n j s j j s n j j s n j j s j j j j j W B A B A s B A LR 1 , 1 , , 2 1 , 1 , 2 2 ( , , ) log log log

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Entropia

• Entropia:

– mede a quantidade de informação

• função de um conj. χ(p.ex. de letras) e X é uma var.

aleatória sobre χ • def.: ∑ ∈ ⋅ − = c x

x

p

x

p

X

H

(

)

(

)

log

(

)

Entropia

• exemplo

– apostar em cavalos (8 por páreo) – enviar msg. c/ aposta (+ curta possível) – 8 cavalos com igual probabilidade => 3 bits

Entropia

– se prob. a priori de cada cavalo é: 1/2 (c1), 1/4 (c2), 1/8 (c3), 1/16 (c4), 1/64 (c5 a c8)

– então H(x) sobre os 8 cavalos é: – H(x) = 2 bits (média dos bits necessários) – codificação: 0 (c1), 10 (c2), 110 (c3), 1110 (c4), etc. ∑ = ⋅ − = 8 1 ) ( log ) ( ) ( i i p i p X H

Entropia Relativa

• Br , jé dita distribuição de fundo (background distrib.) dos

resíduos r no genoma

• Br , jnem sempre é 0.25:

– M. jannaschii :

• BA , j= BT , j= 0.34

• BC , j= BG , j= 0.16

Entropia Relativa

• exemplo

– calcular o profile, LLR e a entropia relativa para os sítios: ATG, ATG, ATG, ATG, ATG, GTG, GTG, TTG (assumir Br , j= 0.25 )

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Entropia Relativa

• entropia relativa total é 4.7

• contribuição “informacional” de cada resíduo: – na segunda posição:

• toda contribuição vem do resíduo T: 2 bits de informação (o fato de que o resíduo é sempre T pode ser codificado com 2 bits)

– na primeira posição:

• entropia relativa é 0.7 ( 0.7 bits de informação): indica que nesta posição a distr. se aproxima mais da distr. de fundo

Entropia Relativa

• exemplo 2

– recalcular o profile, LLR e a entropia relativa para os sítios: ATG, ATG, ATG, ATG, ATG, GTG, GTG, TTG

(assumir agora BA , j= BT , j= 0.375e BC , j= BG , j= 0.125)

Entropia Relativa

• exemplo 3

– calcular o profile, LLR e a entropia relativa para a cyclic AMP

receptor protein(CRP)

Fases de um Projeto Genoma

Maiores Informações

• Sites “da moda” estão constantemente mudando • Populares

– www.ncbi.nlm.nih.gov – www.tigr.org

– www.fruitfly.org/~nomi/annotation-links.html • http://www.inf.ufrgs.br/~bazzan/bioinfo