ENSAIO CLÍNICO RANDOMIZADO DO EFEITO DO TRANSPLANTE DE CÉLULAS
MONONUCLEARES DE MEDULA ÓSSEA NA MIOCARDIOPATIA DILATADA NÃO-ISQUÊMICA
INSTITUTO DE CARDIOLOGIA DO RIO GRANDE DO SUL FUNDAÇÃO UNIVERSITÁRIA DE CARDIOLOGIA Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde: Área de Concentração: Cardiologia e Ciências Cardiovasculares
ENSAIO CLÍNICO RANDOMIZADO DO EFEITO DO TRANSPLANTE DE CÉLULAS
MONONUCLEARES DE MEDULA ÓSSEA NA MIOCARDIOPATIA DILATADA NÃO-ISQUÊMICA
Autor: James Fracasso
Orientador: Renato Abdala Karam Kalil
Dissertação submetida como requisito para obtenção do grau de mestre ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, Área de Concentração: Cardiologia ou Ciências Cardiovasculares, da Fundação Universitária de Cardiologia / Instituto de Cardiologia do Rio Grande do Sul.
Porto Alegre 2011
AGRADECIMENTOS:
Renato Abdala Karam Kalil Roberto Tofani Sant´Anna Felipe Homem Valle Diego Caldieraro Morales Nance Beyer Nardi
Andrés Delgado Cañedo Paulo Afonso Salgado Filho Maurício Barreira Marques João Pedro Marques Pereira
Ao Instituto de Cardiologia do Rio Grande do Sul – Fundação Universitária de Cardiologia
SUMÁRIO:
1. DOENÇAS CARDÍACAS ...1
2. TERAPIA CELULAR ...6
2.1 CÉLULAS-TRONCO...10
2.1.1 Células-tronco Embrionárias...11
2.1.2 Células-tronco e Células Progenitoras Hematopoiéticas...12
3. CÉLULAS-TRONCO E CARDIOPATIA ISQUÊMICA ...13
4. CÉLULAS-TRONCO E MIOCARDIOPATIA DILATADA...20
5. EFEITOS COLATERAIS E EFICÁCIA DA TÉCNICA...28
6. OBJETIVOS ...30 7. MATERIAL E MÉTODO ...30 7.1 DELINEAMENTO DO ESTUDO ...30 7.2 PACIENTES ...30 7.3 MÉTODOS ...31 7.3.1 Avaliação de Inclusão ...32
7.3.2 Preparo das Células-tronco...33
7.3.3 Técnica Operatória ...36
7.4 ACOMPANHAMENTO...39
7.5 CRITÉRIOS DE AVALIAÇÃO...39
7.6 ANALISE ESTATÍSTICA ...40
7.7 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS ...41
8. RESUMO DA SISTEMATIZAÇÃO DO ESTUDO...43
8.1 FASE DE SELEÇÃO ...43
8.2 FASE DE TRANSPLANTE ...43
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...45
10. ARTIGO VERSÃO EM PORTUGUÊS...54
11. ARTIGO VERSÃO EM INGLÊS ...84
1. DOENÇAS CARDÍACAS:
A despeito do grande conhecimento acumulado sobre fatores de risco cardiovascular e enormes avanços no tratamento clínico, as doenças cardiovasculares ainda lideram as estatísticas como principal causa de óbito em todo o mundo1.
A cardiomiopatia dilatada (CMD) é uma cardiopatia primária caracterizada por dilatação ventricular esquerda, com disfunção sistólica e secundariamente diastólica. Ocasionalmente, doença ventricular direita associada2. Estima-se que dos 4,0 a 4,7 milhões de pacientes com insuficiência cardíaca (IC) nos Estados Unidos da América do Norte, 5 a 10% possa ser considerado portador de miocardiopatia primária. Sua incidência é de 3,5 a 8,5 por 100.000 indivíduos por ano e sua prevalência 36 por 100.000 indivíduos, e esta parece estar aumentando. No Brasil, segundo o DATASUS (2006), a IC gera mais de 400.000 internações/ano sendo a quarta maior causa de internação hospitalar. Este total representa cerca de 37% de todas as internações por doenças circulatórias, sendo que a mortalidade hospitalar foi de 6,39%. Os demais dados sugerem que o impacto epidemiológico e funcional da CMD no Brasil seja de magnitude similar àquela encontrada em outros países3.
A etiologia da cardiomiopatia dilatada é heterogênea, incluindo miocardites, toxidade por drogas (como a adriamicina), isquemia miocárdica, doença metabólica, alteração mitocondrial e anormalidades genéticas4,5. A doença reflete a soma da perda irreversível de miócitos com anormalidades secundárias, algumas talvez irreversíveis, no restante do miocárdio, que atua sob tensão. A compreensão maior dos processos que levam a insuficiência
cardíaca e, sobretudo, da contribuição genética, reduziu o número de casos sem etiologia conhecida. Contudo, mesmo após minuciosa avaliação, a maioria dos casos de cardiomiopatia dilatada é considerada idiopática (CDI)6. Uma causa genética de cardiomiopatia dilatada é identificada em aproximadamente 30-40% dos casos 7, sendo mais freqüente uma herança autossômica dominante para doença. A mutação encontrada na cardiomiopatia dilatada é mais freqüente nos genes que codificam para proteínas do citoesqueleto, mas já foram descritas diversas mutações em genes codificando para outras proteínas; desta forma, alguns autores defendem que há “uma via final comum” através da qual mutações levam a desestruturação do sarcolema/sarcômero, causando morte dos miócitos e CMD 5,6.
Contudo, a penetrância reduzida dessa cardiomiopatia, em conjunto com relatos recentes de que mutações em determinados genes (troponin I, TNNI3, por exemplo) podem levar a diferentes cardiomiopatias dentro de uma mesma família8,9 e o conhecimento da influência da sobrecarga hemodinâmica (volume, pressão) na progressão da doença10,11 através da apoptose12, leva a crer que a maioria das mutações não é capaz de determinar a cardiomiopatia dilatada.
O prognóstico dos pacientes com cardiomiopatia dilatada crônica é determinado pela estabilidade ou deterioração da função do ventrículo esquerdo (VE) e pela capacidade de compensação hemodinâmica. Em geral, o prognóstico está na dependência da classe funcional (CF) na qual o paciente pode ser mantido com terapia plena. Na doença avançada e de importante repercussão clínica apesar de tratamento agressivo a mortalidade
anual é alta, sendo estimada em 20 a 25% para doentes em CF III e em até 50% para aqueles que se mantém em classe funcional IV.
O tratamento farmacológico persiste como grande ferramenta no manejo do paciente portador de miocardiopatia dilatada atenuando os sintomas de insuficiência cardíaca e, dependendo da droga, utilizada aumentando a sobrevida e a qualidade de vida do paciente. Desde a década de 90 vários estudos científicos demonstraram a utilidade de diferentes classes de drogas no tratamento desses pacientes (Figura 1). Principalmente, os beta-bloqueadores (carvedilol, succinato de metoprolol, bisoprolol) e os inibidores da enzima de conversão da angiotensina desempenham papel importante na redução da mortalidade por insuficiência cardíaca. Outras drogas como diuréticos e digital também tem sua utilidade na redução de sintomas, internação hospitalar e melhora na qualidade de vida dos pacientes.
National Vital Statistics Report. 1999; Cohn JN, et al. N Engl J Med. 2001; SOLVD Investigators. N Engl J Med. 1991; CohnJN, et al. N Engl J Med. 1986; Packer M, et al. N Engl J Med. 1996; Packer M, et al. NEngl J Med. 1991.
Figura 1. Mortalidade por insuficiência cardíaca nos principais estudos com tratamento farmacológico.
Outra alternativa a terapia farmacológica nos pacientes portadores de
insuficiência cardíaca e bloqueio de ramo esquerdo é a ressincronização miocárdica com implante de marcapasso ressincronizador com ou sem cardioversor. O estudo MIRACLE demonstrou melhora progressiva de parâmetros funcionais (IC-NYHA, tempo de caminhada de 6 minutos e qualidade de vida), além de redução do ventrículo esquerdo de pacientes com insuficiência cardíaca avançada submetidos a ressincronização cardíaca, sendo considerada nova terapêutica para insuficiência cardíaca em portadores de insuficiência cardíaca III e IV, refratários à terapêutica medicamentosa, com QRS >130 ms, diâmetro diastólico > 55 mm e fração de ejeção < 35 por cento. Bradley, em metanálise (CONTAK CD, InSync ICD, MIRACLE, MUSTIC) com 1.634 pacientes, registrou redução da mortalidade de 3,5 por cento no grupo controle para 1,7 por cento, com redução relativa de 51 por cento na mortalidade por insuficiência cardíaca, e redução de 29 por cento nas hospitalizações. Em relação à mortalidade global, ocorreu redução de 23 por cento no risco relativo pela ressincronização. O estudo COMPANION demonstrou redução da mortalidade global combinada e hospitalizações de 20 por cento no grupo de ressincronização com desfibrilador-cardioversor implantável ou isolada, em relação à terapêutica clínica, com taxa de mortalidade de 19 por cento no grupo controle, 15 por cento no grupo com ressincronizador apenas e 11 por cento com ressincronizador associado a desfibrilador-cardioversor implantável13.
Em casos avançados e refratários ao tratamento clínico ou que não são candidatos a ressincronização cardíaca, outros procedimentos cirúrgicos foram tentados tendo pouca ou nenhuma aplicabilidade. A cardiomioplastia dinâmica, pelo envolvimento ventricular mediante músculo grande dorsal estimulado para contração sinérgica, é uma alternativa complexa e traumática, estando associada a elevado risco operatório. A ventriculectomia esquerda (cirurgia de Batista), que consiste no remodelamento ventricular esquerdo cirúrgico, aguarda identificação dos critérios que possam indicar os pacientes potencialmente beneficiáveis. A assistência circulatória externa temporária pode ser útil como uma “ponte” ao transplante cardíaco, bem como o são os dispositivos implantáveis de assistência ventricular, mas complexidade e custo limitam o uso a situações muito especiais.
O transplante cardíaco é a única forma reconhecida de tratamento eficaz para miocardiopatia de grave repercussão e deve ser considerado em pacientes verdadeiramente refratários à terapêutica clínica, desde que outros estados mórbidos capazes de comprometer a sobrevida em longo prazo não estejam presentes. Contudo, fatores como os rígidos critérios na seleção do receptor, a falta de doadores, as complicações técnicas, o elevado custo do procedimento, o rigoroso regime de imunossupressão e observação necessários para os pacientes não permitem a aplicação ampla do transplante cardíaco. Assim, existe premente demanda para intervenção terapêutica aplicável a miocardiopatia dilatada, em especial se associada à descompensação clínica por insuficiência cardíaca.
2. TERAPIA CELULAR:
As CT se caracterizam por serem células indiferenciadas, capazes de se auto-regenerarem e de produzirem um grande número de células diferenciadas funcionais. As CT podem ter origem embrionária ou adulta.
De acordo com a sua capacidade de auto-renovação e diferenciação as CT podem ser classificadas como totipotentes, pluripotentes ou multipotentes:
- Células totipotentes têm a capacidade de gerarem sozinhas um novo embrião.
- Células pluripotentes podem proliferar-se indefinidamente in vitro sem se diferenciar, mas também podem diferenciar-se em diferentes linhagens celulares se as condições de cultivo das células forem modificadas. São tipicamente as células-tronco embrionárias (ES). Recentemente várias evidências indicam que algumas células-tronco adultas também possuem esta propriedade.
Células multipotentes têm capacidade mais reduzida para diferenciação, estando destinada a linhagens celulares específicas, como por exemplo as células progenitoras de linhagens específicas.
Vários são os locais e tipos celulares que podem ser utilizados como células multipotentes passíveis de exercer efeitos benéficos nas cardiomiopatias (figura 2).
Dimmeler, S; Zeiher, A. M and Schneider, M.D. The Journal of Clinical Investigation 2005
Figura 2 – Tipos de células totipotentes passíveis de administração cardíaca.
O uso das células-tronco na reparação cardíaca surge como uma das opções terapêuticas possíveis para aliviar os sintomas e prolongar a vida dos pacientes. As células-tronco poderão se tornar uma opção terapêutica visando reverter ou combater a perda celular e o declínio funcional que a acompanha através de mecanismos de angiogênese14 ou limitando a perda de miócitos pós-isquêmica15 e assim prevenir o surgimento de insuficiência
cardíaca secundária a doença isquêmica do coração ou atenuando a limitação funcional imposta pela miocardiopatia chagásica ou idiopática16. Estudos demonstrando melhora da função cardíaca em modelos experimentais de MCD pela utilização de fatores pró-angiogênicos14,15 indicam que pode haver relação entre miocardiopatia dilatada e isquemia em nível microvascular. Outros estudos, também realizados em modelos experimentais de MCD, evidenciam melhora da função cardíaca por transplante de células de músculo liso (CML), pelo estabelecimento de uma matriz extracelular mais organizada e mediante correção do desbalanço das metaloproteinases (MMPs)16. Este efeito decorre da capacidade das CML em promover a expressão das proteínas inibidoras teciduais endógenas das MMPs (TIMPs), assim restaurando o conteúdo de colágeno e limitando a dilatação ventricular, basicamente através da inibição da degradação da matriz extracelular. Pesquisas em modelos de MCD genética tratados pelo transplante de CMO e células de músculo estriado periféricas (CMEP) obtidas mediante cultura, tiveram achados semelhantes em termos de melhora de função cardíaca 17,18.
Estes resultados, além de contribuírem para explicar a fisiopatogenia da MCD sobre diversos aspectos, mostram como a função cardíaca pode ser melhorada através de alterações na expressão gênica promovidas pelo transplante celular e/ou terapia gênica. A utilização de células-tronco, além das possibilidades de ação semelhante, ainda teria a capacidade de cardiomiogênese completa, que possibilitaria restaurar áreas de necrose de miocárdio.
A reparo fisiológico usual é um processo complexo que envolve uma interação entre células de resposta inflamatória, citocinas, proteínas da matriz extracelular e o desenvolvimento de novos capilares19. Como os mecanismos de reparo normais são sobrepujados quando ocorre uma injúria miocárdica clinicamente significativa, seria lógico amplificar parte da resposta que é estimulada pela área de injúria. Vários caminhos já foram propostos experimentalmente para amplificar esta resposta e eles incluem utilização de fatores pró-angiogênicos (VEGF, FGF), utilização de citocinas para maior recrutamento (“homing”) de células células tronco visando aumento da resposta terapêutica demandada e injeção direta de células da medula óssea no local da lesão ou por via arterial coronária. Considerando-se a ampla gama de fatores angiogênicos existentes (mais de 50 conhecidos), o grande número de citocinas com potencial de promover os diversos tipos de células-tronco do organismo e as diferentes formas pelas quais elas podem ser obtidas e, ainda a possibilidade de utilizar diferentes estratégias de associação, teríamos um número quase infinito de possibilidades com base teórica sustentável para obter angiogênese e regeneração miocárdica.
Diversos estudos experimentais recentes demonstraram o potencial das células pluripotentes em se diferenciar em cardiomiócitos e células endoteliais20,21. Pela facilidade de obtenção e os estudos experimentais iniciais bem-sucedidos, as células mononucleares da medula óssea estão entre as mais estudadas. Evidências de estudos experimentais in-vivo confirmaram a capacidade que as células pluripotenciais, contidas na fração mononuclear da medula óssea, têm em aumentar a função e perfusão do miocárdio em presença de doença cardíaca isquêmica. Além disso,
publicações recentes demonstraram os efeitos benéficos da infusão de células mononucleares da medula óssea no pós-infarto imediato em humanos22.
2.1 CÉLULAS-TRONCO:
Células-tronco adultas (CT) são células intrínsecas a vários tipos de tecidos, e definidas classicamente como células capazes de manter, gerar e repor células de diferenciação terminal dentro de seu próprio tecido, como conseqüência de “turn-over” fisiológico ou dano tecidual23. É fundamental distinguir as células-tronco embrionárias das células progenitoras hematopoiéticas e células-tronco adultas.
2.1.1 Células-tronco Embrionárias (CTE):
A pluripotencialidade e a capacidade de proliferação tornam este tipo de célula uma referência absoluta para estudos de diferenciação celular e regeneração tecidual. Limites de natureza ética e entraves dogmáticos, porém limitam o uso de células humanas, estando nosso conhecimento embasado em células obtidas de camundongos. Essas células derivam de embriões de mamíferos ainda no estágio de blastocisto e podem gerar qualquer célula de diferenciação terminal do organismo24. Células embrionárias humanas apresentam características semelhantes às do camundongo, porém possuem maior capacidade de proliferação25. Células embrionárias humanas usadas em animais atímicos para recuperação cardíaca pós-infarto levaram a diferenciação histológica e aparecimento de
focos ectópicos de condução eletrofisiológica nos locais de injeção sugerindo a integração funcional, mas despertando temor de arritmias26.
2.1.2 Células-tronco e Células Progenitoras Hematopoiéticas
As Células-tronco hematopoiéticas são as células-tronco melhor caracterizadas em seres humanos. Estudos mais recentes demonstram que células-tronco podem gerar células de diferenciação terminal além de seu limite tecidual, num processo chamado de “plasticidade de desenvolvimento”27
.
Estudos iniciais in vivo utilizando células não selecionadas derivadas da medula óssea e marcadas para identificação posterior, demonstraram que após seu transplante em animais nos quais havia sido induzido algum tipo de patologia (p.ex, cardiopatia isquêmica através da ligadura de uma coronária), determinavam formação de um tecido não linfohematopoiético, como fibras musculares28, hepatócitos29, e tecido neuronal30, em concordância com as necessidades do tecido lesado. Para provar que células-tronco da medula óssea são capazes de formar tecidos de órgãos-sólidos, CT purificadas com marcadores específicos tiveram que ser transplantadas e demonstradas gerando células funcionais específicas de diferentes tipos de tecidos investigados31.
O mecanismo molecular que leva a troca de linhagem celular já foi extensamente estudado32, mas os mecanismos que determinam esta mudança no destino das células permanecem mal-compreendidos.
A habilidade de células progenitoras derivadas da medula óssea de gerar tecido não linfohematopoiético foi estudada em transplante alogênico
com doador e receptor de sexos diferentes. Os estudos iniciais foram feitos por Horwitz et al, que demonstraram que células-tronco da medula óssea levavam à melhora da osteogênese em crianças com osteogenesis imperfecta33. Subseqüentemente, foram observadas células de doadores que eram positivas para o cromossomo Y no fígado após transplante de medula óssea de homem-para-mulher e de fígado de mulher-para-homem29. Essa miscigenação é chamada de quimerismo e seu achado nestas circunstâncias contribui para a compreensão da capacidade que as células-tronco da medula óssea mostram em gerar tecido não linfohematopoiético.
3. CÉLULAS-TRONCO E CARDIOPATIA ISQUÊMICA
As CTE são células pluripotentes que trazem a vantagem de serem propagadas in vitro por tempo ilimitado que permitiria sua utilização para regeneração de qualquer órgão ou tecido do corpo humano34,35. Contudo, sua aplicação prática é mais limitada. Em primeiro lugar, questões ético-legais restringem sua ampla utilização. Em segundo, como sua plasticidade é quase ilimitada, elas são capazes de imitar tanto ambientes fisiológicos quanto patológicos, o que poderia levar a amplificação de uma área de fibrose se elas fossem aplicadas no pós-infarto, por exemplo. Em terceiro, diante dos métodos disponíveis que mostram característica de transplante homólogo, implicariam no uso de imunossupressão quando da terapêutica em ambiente clínico.
As células da medula óssea (CMO) trazem a vantagem de permitir transplante autólogo, condição aceita do ponto de vista ético-legal. As CMO em conjunto formam uma população celular heterogênea, que inclui: células-tronco hematopoiéticas da medula óssea (HSC), células tronco mesenquimais (MSC), bem como células progenitoras de diferentes tecidos. A habilidade de restaurar a miogênese e a cardiomiogênese pode ser atribuída a ambos tipos de CT36.
As células-tronco de reservatório tecidual são também outros alvos de estudos interessantes para regeneração, uma vez que têm plasticidade limitada. Cardiomiócitos, fibroblastos e mioblastos já foram utilizados buscando regeneração cardíaca pós-infarto. Como elas são células mais diferenciadas, teoricamente teriam efeito mais previsível e resultando na utilização mais segura. Contudo, algumas observações demonstram que
estas células não são capazes de criar “gap junctions” com células miocárdicas nativas, de modo que não conseguem manter uma contração sincrônica e podem resultar em focos de arritmia cardíaca. Portanto, seus efeitos estariam mais relacionados ao reforço da cicatriz pós-infarto, prevenindo o remodelamento.
Asahara et al.37 e Kocher et al38. mostraram que células endoteliais progenitoras humanas mobilizadas com GCSF (granulocyte colony stimulating factor) ou cultivadas, quando injetadas na veia caudal de ratos após a ligadura da artéria coronária esquerda acarretavam diminuição da área de necrose em cerca de 30%, além de aumento da vascularização e conseqüente preservação da função ventricular20,39. Esses estudos obtiveram um ganho morfológico em torno de 60% de repovoamento celular e vascular da área lesada, sendo atribuído à plasticidade destas células em se diferenciarem em cardiomiócitos. Posteriormente, estes dados foram contestados em novos experimentos onde a plasticidade dessas células não pode ser observada in vivo40, atribuindo-se o ganho funcional à fusão celular na periferia das lesões (algo em torno de 5%) e a efeitos parácrinos com formação vascular local41.
Strauer et al estudaram os efeitos do transplante autólogo de células da medula óssea sobre o infarto agudo do miocárdio29. Dez pacientes, após receberem terapia convencional, receberam transplante de células mononucleares da medula óssea (CMMO) por via intracoronariana, através de angioplastia coronariana percutânea. Outros 10 pacientes que receberam somente terapia convencional constituíram um grupo controle. Após 3 meses, a região de infarto (avaliada por ventriculografia) havia diminuído
significativamente no grupo que recebeu CMMO (de 30 + 13 para 12 + 7%, P=0,005) e também foi significativamente menor quando comparada com o grupo controle (P=0,04). Exames cardíacos posteriores (ecocardiograma de stress com dobutamina, ventriculografia com radionucleotídeos) foram realizados para o grupo tratado com CMMO e demonstraram melhora significativa da função e perfusão cardíaca sob diversos parâmetros.
Stamm et al. fizeram o implante autólogo de células AC133+ da medula óssea na borda da zona infartada em 6 pacientes que foram submetidos à cirurgia de revascularização do miocárdio42. Três a nove meses após a cirurgia, todos os pacientes estavam vivos e clinicamente bem, sendo que quatro apresentavam melhora global da função sistólica e em cinco a perfusão do tecido infartado havia melhorado pronunciadamente. Os autores concluem que o implante de células AC133+ da medula óssea é seguro e pode induzir angiogênese, assim melhorando a perfusão miocárdica. Contudo, como o implante é realizado em conjunto com a cirurgia de revascularização do miocárdio, não é possível atribuir de forma inequívoca melhora funcional ao transplante celular.
Perin e col estudaram os efeitos da injeção transendocárdica de células CMMO em pacientes com doença cardíaca isquêmica terminal19. Vinte e um pacientes foram incluídos no estudo, sendo que 14 foram tratados e os outros sete serviram como controle. No grupo tratado, foram injetados 25,5+6,3X106 CMMO divididas em 15 pontos selecionados do miocárdio com auxílio do sistema NOGA, que permite mapear áreas viáveis do miocárdio. O grupo controle foi apenas acompanhado não invasivamente. Quatro meses após o tratamento, foi demonstrada uma redução significativa no defeito
reversível e melhora na função ventricular esquerda no grupo tratado quanto à avaliação de inicial e quanto ao observado para o grupo controle (que não apresentou melhora em relação ao exame de quatro meses antes), em estudos com tomografia emissora de pósitrons (SPECT) e ecocardiografia. Parâmetros clínicos, como quantidade de medicação utilizada, classe funcional e classe de angina também demonstraram benefício significativo no grupo tratado. Os autores concluíram que o transplante autólogo de células mononucleares em pacientes com insuficiência cardíaca severa é seguro e tem potencial para melhorar a perfusão miocárdica, resultando em benefício funcional e regional na função ventricular e do desempenho cardíaco.
De maneira geral, estes relatos acrescidos aos demais estudos clínicos e experimentais da literatura, demonstram segurança relativa do implante de células-tronco na cardiopatia isquêmica, sejam elas obtidas a partir da fração mononuclear ou populações celulares mais especificas, como as células AC133+. O implante de células-tronco está relacionado à melhora funcional do miocárdio, tanto regionalmente na zona de infarto/peri-infarto quanto globalmente, tanto no infarto agudo como crônico, bem como na cardiopatia isquêmica terminal. A melhora nos pacientes que recebem este tipo de implante poderia ser atribuída à capacidade das células-tronco em se diferenciar em cardiomiócitos, regenerando o miocárdio lesado e também pela sua capacidade angiogênica, revascularizando as áreas isquêmicas. Isto é referendado pelo estudo de Azevedo et al onde foi avaliada a distribuição de células autólogas mononucleares de medula óssea no tecido miocárdico infartado através de cintilografia marcada com tecnécio hexametil-propilenoaminaoxime. Os autores demonstraram uma taxa de fixação entre
10 a 20 % da população celular administrada via seio venoso no período entre 48 e 72 horas43. Outros estudos demonstram taxas inferiores de no máximo 10%.
Outro estudo experimental recente também corrobora o potencial das células-tronco no reparo miocárdico onde se demonstrou que o transplante CMMO em ratos Lewis com cardiopatia isquêmica induzida estava relacionado a maior expressão de mRNA de VEGF, HSP70 e HSP32, que são fatores relacionados a citoproteção e angiogênese, vista por PCR de transcriptase reversa, em relação a um grupo controle em que foram injetadas células de sangue periférico sobre o miocárdio44. Os autores concluíram que a melhora da função cardíaca promovida pelo transplante de CMMO se fazia em duas fases: na primeira, era baseada em angiogênese e citoproteção vista pela expressão aumentada em genes relacionados; a partir da segunda semana, as células-tronco começavam a se diferenciar em endotélio e cardiomiócitos, o que melhorava a função cardíaca ainda mais.
Mais recentemente, um dos primeiros estudos randomizados de terapia celular em cardiologia foi conduzido por Wollert et al, o BOOST trial, em 60 pacientes com infarto agudo do miocárdio submetidos a angioplastia, nos quais metade recebeu tratamento ótimo pós-intervenção e a outra metade, além deste tratamento, infusão intracoronária de células autólogas derivadas da medula óssea. Cerca de seis meses após o evento, o grupo terapia celular apresentou melhora na fração de ejeção do ventrículo esquerdo, devido ao aumento da contratilidade nos segmentos adjacentes à zona de infarto45. O seguimento do BOOST Trial, na análise de 18 meses
mostrou não haver diferença entre os grupos na fração de ejeção, situação contrária a observada aos 6 meses46.
Outros estudos avaliaram a segurança e a factibilidade da injeção intracoronária da fração mononuclear das células da medula-óssea nos pacientes com cardiomiopatia isquêmica aguda ou crônica. Um estudo incluiu 15 pacientes que haviam sido submetidos a angioplastia coronariana percutânea que apresentaram vaso patente. Estes receberam transplante de células via cateter balão no vaso culpado. Ao seguimento de 6, 12 e 18 meses foram avaliados a fração de ejeção, a redução da hipoperfusão e consumo de oxigênio pelo miocárdio: todos estes parâmetros apresentaram evolução estatisticamente significativa. Não ocorreu nenhuma complicação do procedimento47.
O estudo REPAIR-AMI incluiu 204 pacientes com infarto agudo do miocárdio e que foram submetidos à angioplastia primária. Estes pacientes foram randomizados para receber placebo ou infusão de células tronco (células progenitoras derivadas da medula óssea). A infusão das células foi realizada entre 3 e 8 dias após angioplastia primária. Não houve diferença entre o grupo placebo e terapia celular no que diz respeito a fração de ejeção, volume sistólico final e volume diastólico final no momento da randomização. Ao final de 12 meses o efeito do tratamento com células progenitoras correspondeu a uma melhora absoluta de 2,8% na fração de ejeção (p=0,26), com menor progressão no volume diastólico final (efeito do tratamento=14ml, P=0,12). Nos pacientes com fração de ejeção inicial menor que a média (FE =48,9) a injeção de células tronco foi relacionada com uma melhora significativa na fração de ejeção (+6,6%, P=0,01), menor aumento do volume
diastólico final (efeito do tratamento de 29,1ml, P=0,02) e volume sistólico final (efeito do tratamento de 29,4ml, P=0,01)48.
4. CÉLULAS-TRONCO E MIOCARDIOPATIA DILATADA:
A MCD pode ser induzida experimentalmente por doxorubicina ou mediante um mecanismo de auto-imunidade, duas intervenções resultantes em disfunção que afeta globalmente o miocárdio e é caracterizada por diminuição da espessura da parede ventricular e queda da fração de ejeção entre 20 e 35%. O modelo de MCD induzida por doxorubicina tem o inconveniente da ação do quimioterápico sobre células da medula óssea, o que limita seu uso para estudo do transplante autólogo de células-tronco. Outra limitação ao estudo de transplante autólogo experimental é a utilização preferencial de células de camundongos geneticamente modificados com objetivo da expressão de marcadores capazes de possibilitar tardiamente a sua identificação, quando de estudos histopatológicos e imuno-genéticos 49.
Para estudo experimental podem ser ainda considerados hamsters BIO 53.58. Estes animais possuem uma distrofia das musculaturas lisa e estriada por uma deficiência gênica herdada de δ-sarcoglycan, igualmente determinante de miocardiopatia associada a dilatação da cavidade e diminuição de espessura da parede do ventrículo esquerdo. As alterações histopatológicas transparecem no animal com 10 semanas de vida e doença clinicamente aparente às 17 semanas.
Dois estudos relevantes utilizando transplante de CML e CMEP em hamsters BIO 53.58 já foram publicados18,50. Yoo et al avaliaram o efeito do autotransplante de células de músculo liso na morfometria e função cardíaca de 24 animais com 17 semanas de vida, divididos em 2 grupos, conforme a injeção feita na parede miocárdica: grupo controle, que recebeu meio de cultura, e grupo transplantado, que recebeu meio contendo CML. As CML
foram obtidas do ducto deferente na 13ª semana e postas em cultura por quatro semanas, até atingirem contagem de 4x106 células/ml. Estas células foram marcadas com 5-bromo-2’deoxyuridine antes do transplante. Quatro semanas após a injeção, a função cardíaca foi avaliada in vitro no aparato de Langendorff e os animais foram sacrificados para estudo histológico. O grupo transplantado apresentou corações menores (p<0,001) e desenvolveu maior pressão e maior taxa de aumento da pressão pelo VE (p<0,001). Os autores concluíram que o transplante de CMO previne a dilatação cardíaca e melhora a função ventricular em hamsters com miocardiopatia dilatada. O estudo histológico permitiu concluir que esta melhora decorreu da criação de tecido semelhante ao muscular, que cobriu 25 a 35% da parede livre do ventrículo esquerdo, a partir de uma injeção única. Como este tecido era desorganizado e provavelmente não contrátil, os autores atribuíram seu efeito benéfico a provável liberação de fatores de crescimento que promoveram a angiogênese, e resultaram na melhor perfusão e contração da região.
Em um modelo muito semelhante, Ohno et al estudaram o efeito do transplante de CML e CMEP, sendo as diferenciais deste estudo o transplante heterólogo (doadores foram hamsters BIO 53.58) e a composição do grupo controle por hamsters não-cardiomiopatas50. Os autores também estudaram os efeitos da criopreservação sobre a viabilidade celular pós-cultura. Os resultados obtidos foram semelhantes, demonstrando preservação da função miocárdica nos grupos que receberam CML e CMEP, sendo que o grupo que recebeu CMEP foi o que apresentou função miocárdica mais próxima ao grupo sem cardiomiopatia. Como os achados histopatológicos foram semelhantes, os autores atribuíram a melhora ao
mesmo efeito e ainda estipularam que a criação de um tecido muscular preservou a espessura da parede e evitou a dilatação mecanicamente, ao criar um ventrículo com parede mais espessa. Os autores acreditam que o fato de o transplante de células alogênicas combinado à imunossupressão ter sido bem sucedido torna o transplante autólogo ainda mais promissor em um cenário clínico.
Um estudo realizado posteriormente, utilizando CML em miocardiopatia induzida por doxorubicina em camundongos mostrou que a melhora pode ter outro mecanismo: o estabelecimento de uma matriz extracelular mais organizada51, pela correção do desequilíbrio das metaloproteinases (MMPs). Isto porque a utilização de CML promoveu a expressão das proteínas inibidoras teciduais endógenas das MMPs (TIMPs), o que restaurou o conteúdo de colágeno e limitou a dilatação ventricular, basicamente inibindo a degradação da matriz extracelular.
Os mecanismos que levaram a estas melhoras devem ser considerados em conjunto com os que contribuem para melhora da função cardíaca pelo uso de células-tronco na cardiopatia isquêmica. Além da diferenciação em células úteis para regeneração cardíaca, como endotélio e células musculares, os transplantes celulares parecem de alguma forma regular a expressão gênica favoravelmente, o que potencializa o processo de cura conforme a necessidade do “microambiente” em questão.
Diversos estudos em animais de pequeno porte já foram feitos, e as principais experiências são relatadas abaixo:
Nakajima et al estudaram os efeitos do transplante de CTH na função cardíaca de camundongos com MCD induzida por doxorubicina52. Quatro
semanas após a indução, 30 camundongos foram divididos em 3 grupos de 10, conforme o tipo de célula (derivadas de camundongos singênicos GFP) que foi injetada por via intravenosa (IV): Sca-1 + Lin -/ c-kit + (5 x 103 células; grupo HSC), Sca-1- Lin-/c-kit- (5x103; grupo não-HSC) ou PBS (grupo controle). Quatro semanas após o transplante, os animais tiveram seu ventrículo esquerdo avaliado por ecocardiograma e foram sacrificados para estudo histológico. O grupo HSC apresentou os menores diâmetros diastólico e sistólico do ventrículo esquerdo (ambos p<0,05), e também a maior relação entre espessura e diâmetro diastólico do ventrículo esquerdo. Histologicamente, apareceram células GFP positivas espalhadas difusamente sobre toda parede ventricular. Os autores concluíram que CTH melhora a função cardíaca na cardiomiopatia induzida por doxorubicina.
Os mesmos autores compararam os efeitos da mobilização de CT por G-CSF e do transplante de CMO, num modelo de miocardiopatia induzida por doxorubicina em camundongos53. Trinta camundongos C57BI/6 foram submetidos a transplante de medula óssea com células GFP-CMO (células-tronco da medula óssea GFP positivas) e à indução de miocardiopatia por doxorubicina. Quatro semanas após eles foram divididos em 3 grupos: 10 receberam por via subcutânea (SC) injeção de solução salina (grupo controle), 10 receberam injeção de G-CSF por cinco dias SC (grupo G-CSF) e 10 receberam LacZ+-CMO (heterólogas, 2x107 CMMO; grupo CMO). Quatro semanas após o transplante, os animais tiveram seu ventrículo esquerdo avaliado por ecocardiograma e foram sacrificados para estudo histológico. Tanto o grupo CMO quanto o G-CSF apresentaram maior FEVE e menor diâmetro diastólico do VE em relação ao grupo controle (p<0,0001),
sendo que o grupo CMO apresentou valores melhores nestes parâmetros em relação ao grupo G-CSF (p<0,05). Histologicamente apareceram mais células marcadas difusamente espalhadas pelo ventrículo esquerdo no grupo CMO.
Os autores buscaram avaliar os efeitos da utilização de células da medula óssea na miocardiopatia dilatada, tanto na fase aguda quanto na crônica, bem como qual a melhor forma de administração (intravenosa x direta intramiocárdica) para cada uma delas54. Para tal, em 60 camundongos C57BI/6 foi induzida MCD por doxorubicina. CMO (2 x 107) foram isoladas de camundongos GFP singênicos e injetadas diretamente no miocárdio (IM) ou por via intravenosa (IV). Essas injeções foram feitas logo após (agudo) ou 4 semanas depois da indução da cardiomiopatia (crônico). Desta forma, foram criados 4 grupos de 10 animais conforme o momento e a via de infusão das CMO: agudo-IV, agudo-IM, crônico-IV, crônico-IM. Os vinte animais restantes receberam PBS e foram utilizados como controle, divididos em dois grupos: agudo e crônico. Tanto na fase aguda quanto crônica, independente da via, os animais que receberam CMO apresentaram função ventricular significativamente melhor do que o grupo controle, evidenciada pela diminuição do DVEf por ecocardiograma.
O modelo canino de MCD tem uso limitado49. Toyoda et col desenvolveram um modelo experimental em cães infundindo doxorubicina na artéria coronária esquerda, por via intracoronária em cateterismo, em infusões de 0,7mg/kg semanais durante 5 semanas. Três meses após foi observada miocardiopatia com parâmetros de função cardíaca (fração de ejeção do ventrículo, pressão diastólica final, volume diastólico final) alterados significativamente e compatíveis com miocardiopatia dilatada.
Mudanças histológicas como atrofia de miofibrilas, vacuolização citoplasmática e fibrose intersticial foram verificadas predominantemente no ventrículo. Este modelo, além de tecnicamente complicado, gera uma morbidade significativa em animais, o que dificulta intervenções posteriores.
Na esfera dos estudos clínicos surgiram trabalhos corroborando os modelos animais. Patel et al realizou implante de células tronco através de toracoscopia em pacientes randomizados, portadores de insuficiência cardíaca de qualquer etiologia, mas que possuiam fração de ejeção menor que 35% e presença de sintomas classe III/IV NYHA. A avaliação mostrou que os pacientes tratados tiveram um incremento de 35% na fração de ejeção em comparação com 5% no grupo controle 55.
Mais recentemente, Arguero et al conduziu um estudo onde foram injetadas células-tronco de sangue perifério via toracotomia anterior esquerda. O estudo avaliou 39 pacientes, 34 possuiam cardiopatia isquêmica, 5 pacientes apresentavam miocardiopatia dilatada. A avaliação mostrou que 7 pacientes tiveram fibrilação ventricular durante o período perioperatório, 2 pacientes morreram por arritmia intratável no perioperatório. Vinte e sete pacientes completaram a avaliação apresentando incremento na FE do ventrículo esquerdo de 37,7 +/- 14,2 para 42,15 +/- 5,9 e destes 5 pacientes estavam em insuficiência cardíaca classe II e 15 pacientes em classe I, sendo que no início do trabalho 26 destes estavam em classe III 56 .
Os primeiros estudos em humanos com todos pacientes portadores de miocardiopatia dilatada foram realizados recentemente, por Fischer-Rosakatu, o ABCD trial (Autologous Bone Marrow Cells in Dilated Cardiomyopathy). Este estudo avaliou randomicamente 24 pacientes para implante de
células-tronco e 20 pacientes para grupo controle. Todos possuíam fração de ejeção ventricular esquerda menor que 35%. Os autores encontraram melhora na classe funcional da NYHA e da fração de ejeção do VE em 5,4%57. Os resultados estão na gráfico 1.
Gráfico 1 – Alteração da fração de ejeção (EF) após 6 meses de seguimento.
Reproduzido de Seth et al.
O gráfico abaixo mostra a evolução da fração de ejeção no estudo conduzido por Arom et al. que avaliou o implante, via toracotomia, de células-tronco progenitoras obtidas através de processo de expansão e isolamento e administradas em pacientes portadores de miocardiopatia dilatada não isquêmica. Apesar de ter detectado incremento contrátil em 71% dos pacientes submetidos ao tratamento, o aumento foi apenas de 4,4% com desvio padrão de 10,6% indicando uma substancial variação de resposta58.
Gráfico 2 - Variação da fração de ejeção pós transplante de células-tronco via toracotomia.
5. EFEITOS COLATERAIS E EFICÁCIA DA TÉCNICA:
Ainda que estudos tragam evidências favoráveis com vistas à utilização do transplante celular na MCD, algumas considerações devem ser feitas antes que a transposição seja feita sob um referencial teórico seguro.
Como a doença não cursa com um mecanismo de dano tecidual direto, como é o caso da cardiopatia isquêmica, o “microambiente” presente no momento em que é tentada a terapia pode não ser tão favorável para multiplicação e diferenciação das células-tronco em direção a regeneração tecidual. Este mecanismo pode ser em parte refutado pelos estudos experimentais que demonstraram incorporação e integração funcional de células-tronco com fibras miocárdicas, após auto-transplante em ratos sem nenhuma miocardiopatia59,60, na miocardiopatia dilatada61 e pelos estudos experimentais anteriormente citados.
Como os estudos nos quais se baseia a terapia são experimentais ou clínicos, compostos por número limitado de pacientes e com um curto seguimento, ainda se pode questionar quanto à utilidade da intervenção sob o ponto de vista de segurança para o paciente e preservação da função cardíaca em longo prazo. Em contraponto, excluindo-se os casos de arritmias relatados com freqüência em transplante celulares com mioblastos60, que tem explicação especifica, não há relatos de efeitos colaterais relacionados ao implante de células-tronco, quando foi feito por injeção intramiocárdica em seres humanos.
Portanto, com a necessidade de novos estudos mais abrangentes, controlados, com maior número de pacientes e avaliando a resposta do transplante de células-tronco por um período maior, conduzimos o estudo
procurando responder tais questões. Além de estabelecer a minitoracotomia, para implante de células-tronco, como um procedimento seguro nos pacientes portadores de insuficiência cardíaca grave .
Portanto, após preparo das células foram estudadas as vias de administração que são evidenciadas na figura abaixo. Nós optamos pela aplicação de células-tronco diretamente no miocárdio através de minitoracotomia, técnica empregada com sucesso e com baixo risco em nosso estudo piloto e por outros autores.
Circulation. 2003;107:929-934
6. OBJETIVOS
6.1 GERAL
Avaliar o efeito da utilização de células-tronco por implante intramiocárdico para incrementar a função ventricular em pacientes com miocardiopatia dilatada não-isquêmica.
6.2 ESPECÍFICOS
Avaliar os efeitos do transplante autólogo de células-tronco sobre: 6.2.1 Função e remodelamento ventricular esquerdo, através de ecocardiograma bidimensional com Doppler.
6.2.2 Função e volumes das câmaras cardíacas, através de ressonância magnética com gadolínio.
6.2.3. Capacidade funcional, por teste de caminhada de 6 minutos. 6.2.4. Qualidade de vida, através do questionário de Minnesota.
7. MATERIAL E MÉTODOS
7.1 DELINEAMENTO DO ESTUDO
Ensaio clínico randomizado, não cego, não controlado com placebo.
7.2 PACIENTES
Durante o período de maio de 2005 até maio de 2008, foram avaliados 280 pacientes no ambulatório de Terapia Celular do IC/FUC atendidos através livre demanda, recrutamento em outros hospitais ou por encaminhamento médico, sendo que 30 foram incluídos no estudo com diagnóstico de miocardiopatia dilatada não-isquêmica, os quais preenchiam os seguintes critérios de inclusão: (1) Diagnóstico da doença há pelo menos um ano e sintomas / limitação clínica (classe funcional III ou IV) apesar de tratamento farmacológico pleno; (2) Fração de ejeção ventricular esquerda inferior a 35%, definida por método não invasivo; (3) Idade inferior a 65 anos, (4) Cineangiocoronariografia sem lesões ou obstruções nas artérias coronarianas.
Foram considerados critérios de exclusão: (1) Instabilidade elétrica ventricular (como episódios de taquicardia ou fibrilação ventricular); (2) Insuficiência valvar mitral ou outra valvopatia, de moderada a severa; (3) História pregressa ou diagnóstico atual de neoplasia; (4) Doença hematológica primária ou doença grave em outro sistema, como cirrose e insuficiência renal; (5) Intervenção cardíaca invasiva prévia (cirurgia cardíaca, implante de marcapasso, angioplastia corononariana transluminal percutânea).
Os candidatos incluídos no estudo foram randomizados através de software eletrônico em 2 grupos: grupo controle (n=10) que manteve o tratamento clínico convencional tendo sido acompanhado clinicamente e grupo intervenção (n=20) no qual os pacientes, além do tratamento clínico, foram submetidos ao transplante autólogo de células-tronco.
Todo o processo de avaliação, inclusão, intervenção e acompanhamento dos pacientes foi realizado no Instituto de Cardiologia do Rio Grande do Sul.
A inclusão dos pacientes e sua participação no estudo obedeceram a normas éticas descritas no item Considerações Éticas.
7.3 MÉTODOS
7.3.1 Avaliação de Inclusão
A avaliação consistiu, nos dois grupos, de anamnese detalhada, incluindo questionário de Minnesota, exame clínico minucioso, avaliação hematológica (hemograma, glicemia, eletrólitos, creatinina, peptídeo natriurético B, coagulograma), eletrocardiograma, Rx de tórax, teste da caminhada de 6 minutos, ecodopplercardiograma tissular e ventriculografia por ressonância magnética nuclear. Concluída investigação, pacientes do grupo controle foram mantidos em acompanhamento e os pacientes alocados no grupo tratado foram submetidos a internação hospitalar e preparo pré-operatório para o procedimento de implante de células-tronco, sendo que estas situações descritas para os dois grupos foram consideradas como momento de inclusão.
7.3.2 Preparo de Células-tronco
No dia da cirurgia, aproximadamente 4 horas antes da operação e com paciente sedado, era coletado material da medula óssea por punção aspirativa na crista ilíaca anterior (figura 4) e realizado o preparo de aspirado medular seletivo (em termos de células-mononucleares), para posterior implante na área miocárdica a ser tratada. Um volume de aspirado de 80 ml foi obtido e imerso em meio contendo anticoagulante preservativo, como EDTA.
As células mononucleares da medula óssea foram isoladas por centrifugação em gradiente de densidade Ficoll-Hypaque 1.077. Posteriormente eram coletadas, lavadas com solução salina heparinizada contendo 5% de soro autólogo e filtradas para remover os agregados celulares. As células foram ressuspendidas em solução salina com soro autólogo a 5% para injeção.
Abaixo a sequência do preparo da células com a separação da fração mononuclear.
Imagem dos autores.
Figura 4 – Centrífuga para separação da fração mononuclear.
Imagem dos autores.
Imagens dos autores
Figura 6 – Solução para enriquecida com a fração mononuclear de células-tronco pronta para aplicação.
Abaixo esquematização do processo de seleção da fração mononuclear de medula óssea através do método de Ficcol-Hipaque (1077).
Figura 7- Esquema do processo de preparo da fração mononuclear das células da medula-óssea.
Uma pequena fração da suspensão celular foi usada para teste de esterilidade (cultura bacteriana e fúngica), contagem celular e testes de viabilidade, sendo considerada aceitável uma viabililidade superior a 90%. Outra fração das células foi utilizada para imunofenotipagem por citometria de fluxo, visando à determinação das subpopulações componentes da amostra (CD34+, CD38+ e subpopulações de linfócitos e monócitos), e para análise funcional. A freqüência de células-tronco/progenitoras hematopoiéticas foi avaliada em ensaio clonogênico em meio semi-sólido (unidades formadoras de colônias hematopoiéticas). A freqüência de células- tronco progenitoras mesenquimais, por outro lado, foi analisada através do ensaio de unidades formadoras de colônias fibroblásticas (CFU-F) e por cultivo de longa duração de células aderentes isoladas desta fração celular.
7.3.3 Técnica Operatória
Para realização do implante de células-tronco, foram seguidos procedimentos e cuidados de rotina previstos para uma cirurgia com mini-toracotomia. Após indução anestésica e monitorização de eletrocardiograma, pressões arterial e venosa central e diurese, o paciente era colocado em posição supina com leve elevação anterior do tórax e afastamento do membro superior esquerdo.
A abordagem cirúrgica foi realizada por mini-toracotomia esquerda (incisão com aproximadamente de 4 cm ântero-lateral no 4o ou 5o espaço intercostal esquerdo), assistida por equipamento de videotoracoscopia, visando abordar o saco pericárdico, no qual era realizada incisão ampla e aspiração, se necessário, de líquido pericárdico. Definidas posições de
artérias coronárias, as injeções da suspensão celular eram realizadas diretamente no miocárdio da parede livre do VE, mediante agulha 21G modelo “butterfly” posicionada no epicárdio por pinças cirúrgicas e conectadas a seringa manejada pelo auxiliar cirúrgico. Foram administradas 20 injeções no miocárdio a uma profundidade calculada de 5 mm, nas faces anterior, lateral e apical do ventrículo esquerdo, em volume 5ml de solução salina com soro autólogo a 5%, contendo total estimado entre 30 e 90 x 107 de células. Revisada hemostasia através da janela pericárdica, a cavidade torácica era drenada e a parede suturada por planos.
Abaixo demonstramos sequência de administração das células mononucleares de medula-óssea
Imagem dos autores
Imagem dos autores.
Figura 10 – Aplicação intramiocárdica de CMMO.
Após o procedimento, pacientes foram mantidos em unidade de cuidados intensivos por 24 horas e posteriormente em unidade de internação clínico-cirúrgica.
7.4 ACOMPANHAMENTO
Pacientes do grupo controle e do grupo intervenção tiveram mesmo cronograma de atendimento e modo de investigação após inclusão no estudo.
Nas consultas de 3 e 6 meses era aplicado o questionário de Minnesota.
O ecodopplercardiograma foi repetido em 3, 6 meses após a inclusão no estudo. Ressonância nuclear magnética cardíaca foi realizada após 3 da inclusão no estudo. 9. Teste de caminhada de 6 min foi realizado aos 3 e 6 meses após a inclusão no estudo
A quantificação dos níveis séricos do peptídeo natriurético cerebral foi realizada no pré-operatório e em 6 meses após inclusão no estudo.
O efeito do tratamento sobre a sobrevida e freqüência de eventos cardíacos foi obtido através do acompanhamento periódico, nos períodos já citados.
7.5 CRITÉRIOS DE AVALIAÇÃO
- Anamnese (internações relacionadas à miocardiopatia; classe funcional).
- Qualidade de vida conforme questionário de Minnesota. - Exame clínico.
- Ecocardiograma bidimensional: Dimensões de cavidades cardíacas. Fração de ejeção ventricular esquerda. Contratilidade segmentar.
Todos exames foram realizados pelo mesmo examinador, o qual contudo era não-cego devido a cicatriz cirúrgica da minitoracotomia.
- Ressonância magnética:
Contratilidade global do coração. Dimensões de cavidades cardíacas.
Todos exames foram analisados pelo mesmo médico radiologista, este cego quanto ao grupo a que o paciente pertencia.
- Avaliação da capacidade funcional dos pacientes pelo teste de caminhada de 6 minutos.
- Avaliação dos níveis séricos do peptídeo natriurético cerebral. - Avaliação do número de eventos cardíacos e sobrevida.
7.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados obtidos foram registrados em ficha individual, distribuídos em tabelas do Excel e submetidos à análise estatística através do SPSS.
As variáveis contínuas são apresentados como média ± SD, se não for indicado o contrário. As variáveis categóricas foram comparadas pelo teste
de x2 ou Teste exato de Fisher. As comparações estatísticas entre os dados iniciais e de acompanhamento foram realizadas utilizando a método não-paramétrico de Wilcoxon signed rank test. Testes não não-paramétricos Mann-Whitney U e Kruskal-Wallis foram utilizados para comparar variáveis contínuas com categóricas, bem como comparar os resultados entre os diferentes grupos. Todos os testes foram realizados admitindo-se um nível de significância de 0,05.
7.7 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS
O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Instituto de Cardiologia e pelo Comite Nacional de Ética em Pesquisa (CONEP) sob o número: 10376. Cadastrado no Clinical Trials sob o código: NCT00743639.
Procedimentos médicos e de investigação foram norteados pela legislação vigente no território nacional, sob coordenação da Comissão Nacional de Ética em Pesquisa do Ministério da Saúde.
Como o estudo compreende pacientes com doença cardíaca severa, que implica em risco de vida, foram asseguradas salvaguardas que deveriam trazer resultados benéficos aos pacientes incluídos na pesquisa, tais como acompanhamento médico criterioso, pronto atendimento emergencial e garantia de atendimento médico e hospitalar em qualquer condição clínica apresentada pelo paciente, dentro da capacitação da equipe de pesquisadores e dos recursos do hospital .
Os pacientes com critérios de inclusão no estudo foram submetidos a entrevista, na qual eram explicados os objetivos do estudo, métodos que seriam utilizados, benefícios auferidos e eventuais riscos. Estes tópicos estao
incluídos no Termo de Consentimento Pós-Informação para o Estudo, que foi lido para cada paciente e avalizado pelo mesmo no período de inclusão ou de pré-operatório (na dependência de alocação).
Durante o acompanhamento dos pacientes tanto o grupo tratamento quanto o grupo controle teve suas medicações ajustadas conforme avaliação clínica no momento da consulta com acréscimos ou reduções dos fármacos utilizados, bem como, incorporação de terapêuticas novas aplicáveis aos seus casos.
Conforme citado, foi assegurado ao paciente atendimento médico preferencial durante o período de duração do estudo, além de mantido atendimento médico regular no Instituto de Cardiologia, conforme necessidade de sua doença. Foi assegurado atendimento médico cardiológico dentro dos recursos do hospital, após término da pesquisa.
8. RESUMO DA SISTEMATIZAÇÃO DO ESTUDO
8.1 FASE DE SELEÇÃO
- Pacientes com miocardiopatia dilatada de origem não isquêmica que estejam sintomáticos a despeito de tratamento clínico otimizado e obedecendo os demais critérios de inclusão foram convidados a serem selecionados para a inclusão neste estudo.
- Assinatura do termo de consentimento.
- Randomização : 20 pacientes alocados no grupo tratamento e 10 pacientes no grupo controle.
- Exames pre-operatórios adicionais.
Os examinadores não estavam cientes da randomização dos pacientes, ou seja, examinadores eram cegos para a alocação dos pacientes.
8.2 FASE DE TRANSPLANTE
Retirada das células-tronco da medula óssea do próprio paciente, preparo das mesmas e transplante através de infusão direta no miocárdio através de mini-toracotomia. Internação hospitalar em regime de UTI por 24 horas e alta hospitalar prevista para o 4º ou 5º dia de internação.
8.3 FASE DE ACOMPANHAMENTO APÓS ALTA HOSPITALAR
- Revisões clínicas trimestrais no primeiro ano e semestrais no segundo ano após randomização.
- Questionário de Minnesota e teste de caminhada de 6 minutos nos meses 3, 6 e 12.
- Revisões com ecocardiografia trans-torácica aos 3, 6 e 12 meses. - Revisões com ressonância nuclear magnética cardíaca aos 3 e 9 meses.
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