Estudo da estabilidade de bicamadas lipidicas em presença de tensoativos

\

Universidade Estadual de Campinas Faculdade de Engenharia Química

Área de Concentração:

Desenvolvimento de Processos Químicos

ESTUDO DA ESTABILIDADE

DE BICAMADAS LIPÍDICAS

EM PRESENÇA DE TENSOATIVOS

Alessandro Marra Ribas Autor

ProP. Dra. Maria Helena Andrade Santana Orientadora

Dissertação submetida à Comissão de Pós Graduação da Faculdade de Engenharia Química da UNICAMP como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em Engenharia Química

Campinas - SP Agosto, 1997

Dissertação defendida e aprovada em 8 de agosto'de 1997 pela banca examinadora constituída pelos professores:

Esta versão corresponde à redação final da Tese de Mestrado defendida por Alessandro Marra Ribas e aprovada pela comissão julgadora em 08/08/97.

Mais ágil que todo o movimento é a sabedoria: ela atravessa e penetra tudo, graças a sua pureza. Ela é um sopro do poder de Deus, uma irradiação límpida da glória do Todo-poderoso; assim nenhuma mancha pode insinuar-se nela. Ela é uma efusão da luz eterna, um espelho sem mancha da atividade de Deus, e uma imagem de sua bondade. Embora única, tudo pode imutável em si mesma, renova todas as coisas

Salomão

Com amor, a meus pais Luiz e Maria Aparecida e irmãos Vinicius e Andrea

AGRADECIMENTOS

À Prol" Dra. Maria Helena Andrade Santana, pela amizade, pela orientação segura, pelas sugestões e incentivo em todas as etapas do trabalho.

À Sônia Campos, pela amizade, e apmo fundamental prestado dnrante a execução do trabalho experimental.

Aos meus f~mili~res, pelo amor, pelo apoio e pela compreensão.

Aos grandes amigos pelo companheirismo e agradável convivio em todos os momentos.

A todos os professores que através das aulas, sugestões e permissão do uso de laboratórios e equipamentos contribuíram para minha aprendizagem e bom andamento do trabalho.

LISTA DE FIGURAS LISTA DE TABELAS LISTA DE ABREVIAÇÕES NOMENCLATURA RESUMO ABSTRACT 1.0- INTRODUÇÃO

SUMÁRIO

2.0- REVISÃO DA LITERATURA

2.1 - Considerações Gerais sobre Lipossomas 2.2 - Constituição dos Lipossomas

2.3 -Estrutura dos Agregados Anfifilicos

2.4 - Determinação do Parâmetro de Ordem dos Agregados por Ressonância Paramagnética Eletrônica

2.5- Preparação de Lipossomas

2.6- Estabilidade de Lipossomas em Fluidos Biológicos 2. 7 - Modificações na Superficie de Lipossomas

2.8- Estabilidade de Lipossomas em Presença de Tensoativos

3.0- MATERIAL E MÉTODOS 3.1- Síntese do DMPE-PEG

3 .1.1 - Primeira Etapa - Formação do Intermediário 3.1.2- SegliDdaEtapa- Preparação do DMPE-PEG 3.2- Purificação do DMPE-PEG 3.3 -Caracterização do DMPE-PEG i lV Vlll lX X Xl Xll 1 4 4 5 7 10 16 18 20 24 34 35 37 38 39 42

3. 3.1 - Cromatografia de Camada Delgada

3.3.2 - Medida de Tensão Superficial e Determinação da Concentração Micelar Critica

3. 4 - Preparação de Lipossomas 3.5 - Caracterização das Vesículas

3.5.1 -Determinação do Teor Total de Fosfato

3.5.2- Determinação do Raio Hidrodinâmico e Distribuição de Tamanho das Vesículas

3.6- Ensaios de Estabilidade de Lipossomas

3. 7 - Espectros de Ressonância Paramagnética Eletrônica

4.0- RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 - Síntese, Purificação e Caracterização de DMPE-PEG 4.2 - Preparação e Caracterização dos Lipossomas

4.2.1 -Determinação do Teor Total de Fosfolipídios 4.2.2 - Determinação da Pressão de Extrusão

4.2.3 -Avaliação de Espectros de Ressonância Paramagnética Eletrônica de Vesículas Multilamelares

4.3- Influência da Porcentagem de DMPE-PEG2000 na

Estabilidade das Vesículas Unilamelares

4.4 - Influência do Tamanho da Cadeia de PEG na Estabilidade das Vesículas Unilamelares

4.5 - Perfis de Estabilidade dos Lipossomas em Presença dos Tensoativos da Série C,Ey. Influência do HLB na Estabilidade das Vesículas Unilamelares

5.0- CONCLUSÕES ü 42 43 44

47

47

48 49 52 54 54

64

64

65 70 71

77

79 85

iii

6.0- SUGESTÕES 88

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Representação esquemática de lipossomas como veículos para encapsulamento de compostos hidrofilicos no interior do cerne aquoso (representados pela cor amarela), ou ligados a superficie interna/externa (lilás), hidrofóbicos no interior da bicamada (azul)

iv

ou de natureza an:fifilica (verde) (adaptado de Lasic, 1993). 5 Figura 2 - Estrutura da molécula de fosfolipídio. 7 Figura 3 - Modelos geométricos de empacotamento (adaptado de

Israelachvili, et al., 1980 e Lasic, 1993 ). 9

Figura 4 - Representação esquemática do empacotamento da

bicamada em diferentes fases (adaptado de New, 1990). 10 Figura 5: (A) Espectro de absorção RPE de um radical livre

nitróxido isolado, mostrando o desdobramento hiperfino devido à interação com o dipolo nuclear 1

"N

(1=1). (B) Primeira derivada do espectro de absorção, representando o espectro de um equipamento

de detecção de RPE (adaptado de Warren, 1987). 12 Figura 6. Molécula de marcador de spin ácido 5-doxil esteárico

(5-SASL). 13

Figura 7. Estrutura do radical nitróxido (A). Sistema de coordenadas

atribuídas ao radical nitróxido (B). 14

Figura 8. Espectro do marcador 5-SASL em micelas de tensoativo C12E5, indicando a medida dos extremos externos e internos (2A// e

2Al.).

Figura 9. Representação esquemática da interação de lipossomas convencional e Stealth com lipoproteínas e opsoninas (adaptado de Lasic, 1993).

16

v

Figura 1 O. Representação esquemática das pontes de hidrogênio

entre moléculas de tensoativo e a água (adaptado de Schick:, 1987). 25 Figura 11 - Perfil de estabilidade de lipossomas convencionais

(DSPC:DMPE:COL/33:20:47 moi%, linM) sonicados em função da concentração de tensoativo C12E5 (Santana, 1993).

Figura 12. Perfil de estabilidade de lipossomas sonicados convencionais e com PEG2ooo em função da porcentagem de C12E5

27

(adaptado de Santana, 1993). 31

Figura 13. Perfil das configurações de equilíbrio na forma esférica

(Pamplona e Santana, 1996). 33

Figura 14. Rota de síntese do DMPE-PEG 36

Figura 15 - Esquema da extrusora destacando: entrada (E) e saída (S) da amostra; válvulas de entrada de N2 (Ve), de conexão (Vc) e de alívio (Va); entrada (Eb) e saída (Sb) do banho termostatizado e

suporte da membrana (Su). 46

Figura 16 - Representação esquemática e disposição das amostras

em placa do tipo ELISA 51

Figura 17. Espectro original do marcador em membrana (A), espectro do marcador em água (B) e espectro resultante da subtração do espectro original do espectro do marcador em água (C).

Figura 18 - Cromatografia de camada delgada em fase reversa, com eluição do PEGsooo e DMPE-PEG5000 sintetizado e purificado neste

53

trabalho utilizando gradiente 3 (A) e de referência (B). 55 Figura 19 - Cromatografia de camada delgada em fase reversa, com

eluição do PEG2ooo e DMPE-PEG2000 sintetizado e purificado neste

Figura 20 - Cromatografia de camada delgada em fase reversa, com eluição do PEG1so e DMPE-PEG1so sintetizado e purificado neste

vi

trabalho utilizando gradiente 4. 57

Figura 21 - Cromatografia de camada delgada em fase reversa, com eluição do PEGsooo e DMPE-PEGsooo sintetizado neste trabalho

purificado com gradiente 1 (A) e gradiente 2 (B). 60 Figura 22 - Curvas de determinação de CMC pela medida da tensão

superficial para o DMPE-PEGsooo.

Figura 23 - Curvas de determinação de CMC pela medida da tensão superficial para o DMPE -PEGzooo.

Figura 24 - Curvas de determinação de CMC pela medida da tensão superficial para o DMPE-PEG1so.

Figura 25 - Curva de calibração típica do ensaio fosfato.

Figura 26 - Diâmetro médio e distribuição de tamanho de vesículas convencionais extrudadas à pressão de 10 Kgf/cm2 à concentração de2,5 mM

Figura 27 - Diâmetro médio e distribuição de tamanho de vesículas convencionais extrudadas à pressão de 20 Kgf/cm2 à concentração de2,5mM.

Figura 28 - Perfil de estabilidade de lipossomas convenciOnais (1mM) extrudados 15 vezes à pressão de 10 e 20 Kgf/cm2 em

61 62 62 65 67 68 presença de C₁₂E_5. 69

Figura 29. Espectros típicos do marcador 5-SASL em água (A), em micela (100% de tensoativo C12E5, 24 mM) (B) e em bicamada

lipídica (1 mM) (C). 72

Figura 30. Variação de A// em misturas de vesículas- tensoativo em

Figura 31 - Perfis de estabilidade de lipossomas convencional e contendo PEG2ooo (1mM), em função da concentração do tensoativo C12E5, paralipossomas com 3, 6 e 9% de PEG na superficie.

Figura 32. Perfis de estabilidade de lipossomas convencional e com PEG2000 na superficie (lmM) contendo 1% de marcador de

vii

76

membrana 5-SASL. 77

Figura 33 - Efeito do tamanho da cadeia de PEG na estabilidade de

lipossomas (1mM). Teor de 3% de PEG. 79

Figura 34 - Perfis de estabilidade de lipossomas convencwmus (1mM) em presença dos tensoativos C12Es, C12Es, C1~s e Ctt;Es em

função da concentração dos tensoativos. 81

Figura 35- Perfis de estabilidade de lipossomas com 3% de PEG2000 (1mM) em presença dos tensoativos C12Es, C12E8, C1~s e C1t;Es em

função da concentração dos tensoativos.

82

Figura 36 - Perfis de estabilidade de lipossomas com 6% de PEG2000 (lmM) em presença dos tensoativos C12E5, C12E8, C1~s e C1t;Es em

função da concentração dos tensoativos. 83

Figura 37- Perfis de estabilidade de lipossomas com 9% de PEG2000 (1mM) em presença dos tensoativos C12Es, C12E8, C1~s e C1t;Es em

viü

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Gradiente de solventes usados na purificação do

DMPE-PEG2ooo (gradiente 1). 39

Tabela 2 - Gradiente de solventes usados na purificação do

DMPE-PEG5000 (gradiente 2). 40

Tabela 3 - Gradiente de solventes usados na purificação do

DMPE-PEG5000 (gradiente 3). 40

Tabela 4 - Gradiente de solventes usados na purificação do

DMPE-PEG750 (gradiente 4). 41

Tabela 5 - Composição dos lipossomas. 44

Tabela 6 - Tensoativos da série CxEy e suas propriedades 50 Tabela 7 - Alturas relativas médias de eluição em placas de

cromatografia de camada delgada em fase reversa do DMPE-PEG. 58 Tabela 8 - Resultados quantitativos das derivatizações do DMPE

com PEG de pesos moleculares 750, 2000 e 5000. 61 Tabela 9 - CMC dos fosfolipídios derivatizados com PEG 64 Tabela 10. Valores de A paralelo (AI!) de vesículas multilamelares. 71 Tabela 1 L Parâmetros de ordem (S) e desdobramento hiperfino

LISTA DE ABREVIAÇÕES

5-SASL: ácido 5-doxil esteárico C₁₂E_5: polioxietileno 5 lauril éter C12Es: polioxietileno 8 lauril éter

cl~8: polioxietileno 8 miristil éter C1

6E

8: polioxietileno 8 palmitil éter

CxEy: surfatantes não-iônicos do tipo polioxietileno CD: 1,1 - carbonil diimidazol

CMC: concentração micelar critica COL: colesterol

Da: dalton

DMPE: dimiristoil fosfatidil etanolamina

DMPE-PEG: dimiristoil fosfatidil etanolamina- polietilenoglicol DSPC: distearoil fostatidil colina

G: gauss

GM1: monossianogangliosídio

HEPES: N-[2-hidroxietil]piperazina-N' -[2- ácido etanosulfônico] HLB: balanço hidrofilico-hidrofóbico

HSPI: fosfatidil inositol hidrogenado de soja PC: fosfatidil colina

PEG: polietilenoglicol metil éter POE: polioxietileno

RPE: ressonância paramagnética eletrônica SRE: sistema reticuloendotelial

Te: temperatura de transição de fases TEA: trietilamina

TLC: cromatografia de camada delgada VUP: vesículas unilamelares pequenas

NO:MENCLATURA

a: área transversal da porção hidrofilica do lipídio

Ax: absorbância média em x% de tensoativo subtraído o efeito do branco A0: absorbância média em 0% de tensoativo subtraído o efeito do branco

.A:

tensor de desdobramento hiperfino

X

AI/: desdobramento hiperfino referente a orientação do eixo longo molecular do marcador paralelo ao campo magnético externo.

A.l: desdobramento hiperfino referente a orientação do eixo longo molecular do marcador perpendicular ao campo magnético externo.

br0 : branco em 0% de tensoativo

brx: branco em O% de tensoativo

13.:

magnêton eletrônico l3N: magnêton nuclear

D: coeficiente de difusão das partículas

%Ey: porcentagem do peso molecular da porção hidrofilica

g:

fator de desdobramento eletrônico

gw:

fator Zeeman de desdobramento nuclear

y: ângulo do cone dentro do qual o eixo longo molecular executa um caminho aleatório

H0: campo magnético externo

Htroc•:

interações spin eletrônico - spin eletrônico

Hdipolu: interações spin intermoleculares

J: spin nuclear

I:

operador de momento angular de spin nuclear k: constante de Boltzmann

l: comprimento da cadeia polimérica do lipídio

mH: massa molecular da porção hidrofilica da molécula de tensoativo mL: massa molecular da porção lipofilica da molécula de tensoativo p*: pressão osmótica adimencional

P: parâmetro de empacotamento R: raio da vesícula

Ro:

raio inicial da vesícula

R*: raio da vesícula normalizado Rd: altura relativa

Rh: raio hidrodinâmico S: parâmetro de ordem

s:

operador de momento angular despindo elétron T: temperatura absoluta

u: viscosidade do solvente

xi

RESUMO

Lipossomas ou vesículas lipídicas, são estruturas nas quaís os fosfolipídios agreg31n-se em bicamadas, formando partículas capazes de encapsular compostos de natureza tanto hidrofilica quanto hidrofóbica. Essas características fazem dos lipossomas um sístema muito atrativo para diversas aplicações, dentre as quaís o encapsulamento e hõeração controlada de medicamentos.

Um dos principais problemas associados com as aplicações de lipossomas "in vivo" é a perda de estabilidade da bicamada lipídica em presença de fluidos biológicos. As interações com proteinas ou com outras substâncias que apresentam atividade de superficie desestruturam a bicamada, provocando a liberação indesejável do composto encapsulado.

Neste trabalho, estudou-se a estabilidade de lipossomas convencionais e com a superficie modificada com polietilenoglicol (PEG) na presença de tensoativos. A estabilidade das vesículas foi avaliada em função do balanço hidrofilico-hidrofóbico (HLB) da molécula de tensoativo, e do tamanho da cadeia de PEG. Foram usados tensoativos não iônicos do tipo polioxietileno (POE, série CxEy) com HLB na faixa de

11,67 a 13, 71, e PEG com pesos moleculares de 750, 2000 e 5000 Da.

Os resultados obtidos mostram que a estabilidade dos lipossomas decresce quando o HLB do tensoativo varia de 12,42 para 11,67, sofrendo poucas alterações na faixa de 12,42 a 13, 71. A estabilidade cresce com o aumento da concentração de PEG na snperficie das vesículas, e com o aumento do seu peso molecular de 750 a 2000 Da. Polietilenoglicol de peso molecnlar 5000 Da produz uma estabilidade nas vesículas semelhante à obtida com 750 Da.

Os perfis de estabilidade obtidos caracterizam as interações entre lipossomas e tensoativos, e delineiam regiões operacionais em função da concentração de tensoativo, que são informações úteis para aplicações que envolvem o uso de lipossomas in vivo, e

xii

ABSTRACT

Liposomes or lipids vesicles, are structures in which the phospholipids agregate in bilayers, forming particles able to encapsulate compounds with both hydrophilic and hydrophobic character. This feature make liposomes a very attractive system for severa! applications, such as drug encapsulation for controlled delivery.

One ofthe main problerns associated with liposomes aplications "in vivo" is the lack of lipid bilayer stability in presence of biological fluids. The interaction with proteins or other substances which have surface activity desestructure the bilayer, causing the undesirable delivery ofthe encapsulated compound.

In this work, studies were performed for the stability of conventional and surface modified liposomes containing polyethyleneglicol in the presence of surfactants. Vesicle stability was evaluated in function of surfactant molecule hidrophilic lipofilic balance (HLB), and of the PEG chain lenght. The non-ionic surfactants polyoxyethylenes (POE, CxEy series) with HLB ranging from 11.67 to 13.71 were used, as well as PEG with the molecular weights 750, 2000 and 5000 Da.

Onr results shows that liposomes stability decreases when surfactant HLB changes from 12.42 to 11.67, showing few variations in the range of 12.42 to 13.71. The stability grows with the increase of PEG concentration on vesicles surface, and with increase of the molecular weight of PEG from 750 to 2000 Da. The use of polyethyleneglycols of 5000 and 750 Da resulted in similar vesicle stability.

The stability profiles observed characterizes the interation between liposomes and surfactants, and show operational regions in function of surfactant concentration. This information is very useful for applications involving the use of liposomes in vivo,

Capítulo I - Introdução 1

1.0-INTRODUÇÃO

Os lipossomas, ao lado de outros veículos usados para o encapsulamento de medicamentos, tais como emulsões e géis, fazem parte dos dispositivos para administração controlada de medicamentos na medicina moderna, de grande importância especialmente para terapias nas quais um alvo específico para a liberação da droga deve ser atingido (Kreuter, 1994).

Os avanços obtidos na pesquisa com lipossomas tornam disponiveis um grande número de dados experimentais na literatura, com a aplicação dos lipossomas nos mais diversos campos. Resultados obtidos in vivo e in vitro demonstram a eficácia dos lipossomas na terapia de várias doenças, e também apresentam as limitações envolvidas em suas aplicações. Os maiores problemas associados com a veiculação de drogas em lipossomas para uso in vivo, estão associados com a estabilidade das vesículas em fluidos biológicos, ao lado da esterilização e do aumento de escala. Esses problemas são referidos na literatura como "Triple S" (Stability, Sterility and Scale-up) (Lasic, 1993).

No metabolismo de compostos exógenos, a partícula estranha ao organismo humano é desestabilizada e rapidamente eliminada da circulação. A desestabilização de grandes partículas como lipossomas resulta principalmente da adsorção de lipoproteínas, que fragilizam a membrana, e de opsoninas, um tipo de proteína cuja função é a de acionar os macrófagos do sistema imunológico (Woodle e Lasic, 1992). No entanto, não somente as moléculas grandes como as de proteínas são responsáveis pela desestabilização das vesículas (Lasic, 1993). Moléculas pequenas, principalmente as de tensoativos, também interagem com a bicamada lipídica, e em certas condições solubilizam as vesículas em micelas. O grau de

Capítulo I -Introdução 2

desestruturação depende do tamanho, carga e do balanço hidrofilico-hidrofóbico (HLB), que expressa a porcentagem de grupos hidrofilicos na molécula de tensoativo. A resistência oferecida pelas vesículas à penetração do tensoativo é uma função do empacotamento da bicamada e das modificações na sua superficie.

O estudo da estabilidade de lipossomas em presença de tensoativos é de particular interesse para aplicações que envolvem o uso de lipossomas in vivo, tais como a obtenção de imagens por ressonância magnética nuclear, a terapia de captura de nêutrons e o tratamento de neoplasias, bem como aplicações in vitro como imunodiagnóstico e estudos de solubilização e reconstituição de membranas funcionais. Os perfis de estabilidade em função da concentração de tensoativo determinam regiões operacionais úteis para cada aplicação.

A busca de preparações mais estáveis levou ao desenvolvimento de lipossomas com a superficie modificada através da conjugação covalente de cadeias de polietilenoglicol (PEG), denominados lipossomas "Stealth" ou PEG-lipossomas. "Stealth", é uma marca registrada da "Liposome Teclmology Inc., CA", para designar este tipo de lipossoma Lipossomas modificados com PEG são capazes de evitar a captura pelo sistema reticuloendotelial, e permanecerem na circulação por períodos de tempo maiores, comparados aos lipossomas convencionais (Allen et al., 1991; Blume e Ceve, 1990, 1992). Essa característica trouxe grandes beneficios, e vários estudos realizados in vitro e in vivo comprovam a estabilidade dessas vesículas em presença de macromoléculas.

Capítulo I - Introdução 3

Os mecanismos responsáveis por essa estabilização ainda não são bem conhecidos. Modelos qualitativos atribuem-na ao efeito estérico produzido pela mobilidade das cadeias de PEG na superficie das vesículas (Blume e Ceve, 1993; Lasic, 1991). A estabilidade de lipossomas em presença de tensoativos não tem sido muito estudada na literatura, principalmente para lipossomas com a superficie modificada com PEG.

Neste trabalho, fizemos um estudo da estabilidade de lipossomas convenCiomus e com a superficie modificada com PEG em presença de tensoativos não iônicos do tipo polioxietileno (POE) da série CxEy. Inicialmente foi feita a derivatização e purificação do fosfolipídio dimiristoil fosfatidil etanolamina, DMPE, com PEG de pesos moleculares 750, 2000 e 5000. Os fosfolipídios derivatizados, DMPE-PEG, foram caracterizados por cromatografia de camada delgada e pela determinação da sua concentração micelar critica, CMC. Lipossomas convencionais e com PEG, na forma de vesículas unilamelares pequenas obtidas por extrusão, foram preparados, caracterizados e tiveram sua estabilidade avaliada em presença dos tensoativos. Através dos perfis de estabilidade obtidos em toda a gama de concentrações de tensoativos, foram determinados os efeitos do comprimento da cadeia de PEG, da concentração de PEG nas vesículas, bem como a influência do balanço hidrofilico-hidrofóbico da molécula de tensoativo na estabilidade dos lipossomas.

Capítulo II - Revisão da Literatura 4

2.0- REVISÃO DA LITERATURA

2.1 - Considerações Gerais sobre Lipossomas

Lipossomas ou vesículas são estruturas esféricas formadas por bicamadas lipídicas que encapsulam parte do solvente em seu interior. Os lipossomas geralmente são biocompatíveis, biodegradáveis, não tóxicos e não provocam resposta imune pois na maioria das vezes são constituídos de compostos semelhantes aos das membranas celulares. Estas caracteristicas, fazem dos lipossomas veículos muito importantes para encapsulamento e liberação controlada de medicamentos. Os lipossomas são também úteis para os casos em que a droga na forma livre é altamente tóxica e deve ter sua atividade direcionada para órgãos específicos, reduzindo os efeitos colaterais (Lasic, 1993).

O caráter anfifilico das moléculas da bicamada lipídica que constituem a estrutura esférica dos lipossomas permite o encapsulamento de substâncias hidrofilicas no interior do cerne aquoso, ou ligadas quimicamente nas partes internas ou externas da superficie da bicamada. Substâncias com caráter hidrofóbico localizam-se no interior da bicamada, e substâncias com caráter misto situam-se na interface das regiões polar e apoiar, intercaladas entre os lipídios da bicamada (Figura 1 ).

Capítulo II - Revisão da Literatura 5

Figura 1: Representação esquemática de lipossomas como veículos para encapsulamento de compostos hidrofílicos no interior do cerne aquoso (representados pela cor amarela), ou ligados a superfície interna/externa (lilás), hidrofóbicos no interior da bicamada (azul) ou de natureza anfífílica (verde) (adaptado de Lasic, 1993).

2.2 - Constituição dos Lipossomas

Lipossomas são constituídos basicamente de moléculas anfífílicas que se caracterizam pela presença, de um grupamento hidrofílico (cabeça polar) e outro grupamento hidrofóbico (cauda apoiar), em urna mesma molécula. Dentre esta classe de substâncias estão os lipídios polares, mais especificamente os fosfolipídios, que se encontram presentes na membrana citoplasmática da maioria das células animais e vegetais (Lasic, 1993).

As cabeças polares podem conter cargas positiva, negativa, possuírem caráter zwiteriônico ou serem neutras. O caráter polar é dado pelo grupo hidroxila, carboxila, amina ou fosfato. A parte hidrofóbica é constituída de urna ou duas cadeias de ácidos graxos que freqüentemente possuem de 14 a 18 carbonos e podem ser saturadas ou insaturadas. As cadeias completamente saturadas podem adquirir diversas conformações devido à liberdade de

Capítulo II- Revisão da Literatura 6

rotação das ligações simples. Esta liberdade de rotação é restringida para o caso de cadeias insaturadas sendo a conformação trans raramente encontrada entre os lipídios naturais. Estas características estruturais dos lipídios conferem aos lipossomas diferenças nos parâmetros fisicos tais como estabilidade, permeabilidade da bicamada e temperatura de transição de fases (Lasic, 1993).

As cadeias de hidrocarbonetos podem estar ligadas diretamente à cabeça hidrofilica como no caso dos lipídios polares de cadeia única ou ligados a uma molécula de glicerol ou esfingosina que atuam como uma espécie de espinha dorsal para os lipídios de uma ou duas cadeias. Os lipídios de cadeia dupla encontrados na natureza podem ser classificados em quatro principais categorias, segundo os grupos de cabeça polar (fosfato ou glicosídeos) e componente de ligação entre a cabeça e a cauda (glicerol ou esfingosina). Assim tem-se os esfingoglicolipídios, esfingofosfolipídios, gliceroglicolipídios e os glicerofosfolipídios. Os glicerofosfolipídios, mais comumente chamados de fosfolipídios, são os mais amplamente usados na preparação de lipossomas (Lasic, 1993 ).

Na Figura 2 é apresentada a estrutura da molécula de fosfolipídio onde Rl e R2 são ácidos graxos, saturados ou não, enquanto o grupamento R3 distingue os diversos fosfolipídios, como por exemplo fosfatidil colina (-CH2CH2N'(CH3)3), fosfatidil etanolamina (-CH2CH2NH3+), fosfatidil serina (-CH2CHNH3+COO') fosfatidil glicerol (-CH2CHOHCH20H), etc.

Capítulo li -Revisão da Literatura 7 R1-0-CH2

I

R2-o-cH 0-1

I

H2C-O-P-O-R3 11

o

Figura 2 -Estrutura da molécula de fosfolipídio.

A presença de colesterol na composição da membrana lipídica aumenta sua estabilidade, decresce a mobilidade interna de suas moléculas e reduz a permeabilidade na bicamada, em temperaturas abaixo da temperatura de transição (Te), melhorando assim as propriedades da vesícula Na fase líquido cristalina, a interação do colesterol com as cadeias de hidrocarbonetos fluidos aumenta a ordem e a densidade de empacotamento dentro da membrana Devido à esta interação, a presença de colesterol suprime a transição de fases e a membrana pode existir em uma ampla faixa de temperatura na fase líquida (Lasic, 1993).

2.3 - Estrutura dos Agregados Anfifilicos

Os lipossomas pertencem a uma classe especial de cristais líquidos, que são assim designados por possuírem caracteristicas tanto do estado líquido, como fluídez e tendência em formar bolhas, quanto do estado sólido, como anisotropia mecânica, óptica e elétrica Nos lipossomas, as moléculas de fosfolipídios agregam-se com diferentes tipos de ordem orientacional e posicional formando fases, as quais variam principalmente em função do tipo de molécula, da solubilidade, concentração, temperatura e ainda pH e força iônica para o caso de an:fifilicos iônicos (Lasic, 1993 ).

Capítulo li -Revisão CÚl Literatura 8

A agregação das moléculas anfífílicas começa a partir de uma concentração micelar critica (CMC) que é definida como a concentração minima necessária para formar um agregado. Na CMC os monômeros e os agregados se encontram em equilíbrio. Com o aumento da concentração de moléculas anfífílicas há a formação de agregados nas formas hexagonal, lamelar, cúbica ou de micelas. Os lipídios de cadeia dupla, em geral, não formam micelas devido ao grande volume das suas cadeias, agregando-se preferencialmente em bicamadas, formando estruturas lamelares (Lasic, 1993).

Para se predizer a forma do agregado, foi definido o parâmetro de empacotamento P (equação 1), que considera a forma do agregado em função da geometria do monômero (Israelachvili, 1994 ). Assim,

P=~

a·l (1)

onde v é o volume da molécula, a é a área transversal do grupo da cabeça polar e l é o comprimento das cadeias de hidrocarbonetos. Modelos geométricos de empacotamento para vários valores de P são apresentados na Figura 3. Para o caso de misturas, o cálculo de P deve levar em conta a contribuição de cada fração presente.

Capítulo II -Revisão da Literatura Forma Organização

I

v

P<l/3-2/3

Rü

P>l Fase Micelas Isotrópico hexagonal I Lamelar (Cúbico) Micelas reversas hexagonal II Lamelar 9

Figura 3 - Modelos geométricos de empacotamento (adaptado de lsraelachvili, et al.,1980 e Lasic, 1993).

Com o aumento da temperatura, as cadeias de hidrocarbonetos tendem a mudar de conformação e expandir a sua área ocupada, provocando a transição da fase gel, mais ordenada, para a fase de líquido cristalina, menos ordenada (New, 1990). A temperatura de transição (Te) caracteriza a mudança de fases. Uma representação, do empacotamento da bicamada nas fases gel e líquido cristalino é apresentada na Figura 4.

Capítulo II - Revisão da Literatura 1 O

~~---Cristal Liquido- Fluido T>Tc

Estado Gel- Sólido T <Te

Figura 4 - Representação esquemática do empacotamento da bicamada em diferentes fases (adaptado de New, 1990).

2.4 - Determinação do Parâmetro de Ordem dos Agregados por Ressonância Paramagnética Eletrônica

Os diferentes tipos de estruturas formadas pelas moléculas anfifllicas possuem graus variados de organização, que são característicos de cada estrutura agregada e portanto podem ser úteis em sua identificação. O parâmetro de ordem, designado por S, caracteriza o grau de organização de um agregado e seu valor varia de O (sistemas isotrópicos) a 1 (sistemas perfeitamente orientados). Em membranas, o grau de organização determina propriedades importantes tais como fluidez e estabilidade da estrutura. A determinação do parâmetro de ordem é portanto, de fundamental importância no estudo de interações entre lipossomas e tensoativos, para o entendimento dos mecanismos de transformação envolvidos, através da caracterização das estruturas agregadas formadas (Inoue et al., 1994 ).

~C~aip~índ~o~IT=--~R_e_v_~~ã~o~da=-L~z-·re~~~a~tu~~~a=---11

A Ressonância Paramagnética Eletrônica é um dos métodos mru.s usados para a determinação do parâmetro de ordem de agregados. Os fundamentos desse método são descritos abaixo.

Na maioria dos materiais, os elétrons dos átomos constituintes estão emparelhados e o momento magnético resultante é nulo. No entanto, há certas substâncias na qual os átomos possuem elétrons desemparelhados, os quais apresentam um momento magnético intrínseco. Na presença de um campo externo o alinhamento do vetor de momento magnético produz um aumento do campo, que caracteriza o fenômeno conhecido como paramagnetismo (Warren, 1987).

Um elétron desemparelhado pode sofrer ressonância magnética com uma frequência ressonante na região de microondas do espectro eletromagnético a qual produz transições de estados de spin eletrônico. A energia correspondente a estas transições é da ordem de grandeza daquela envolvida em movimentos translacionais, rotacionais e segmentares das moléculas, o que permite a análise destes movimentos através dos espectros de ressonância magnética. Esse fenômeno é usualmente conhecido como ressonância paramagnética eletrônica (RPE). Desvios da frequência ressonante causados pelo campo magnético local ocorrem primariamente devido ao núcleo do átomo de origem, o qual por si só apresenta características magnéticas. No átomo de nitrogênio a fonte mais comum de radical livre paramagnético é o núcleo 14N que possui spin nuclear, I= 1, e pode existir em três estados de spin. Como resultado os elétrons desemparelhados dos átomos, apresentam três ambientes magnéticos possíveis, nos quais o campo nuclear atua reforçando, se opondo ou não afetando o campo externo H0 . Desta forma três picos de ressonância são

~C~ap~ínu~o~IT

__

-_R_e_v_~_ã_o_da~L~l~·re~n~a~m~r~a~

____________________________ 12

observados na qual a separação é independente da intensidade do campo externo, um fenômeno conhecido como desdobramento hiperfino (Figura 5 (A)). Espectros de RPE são geralmente apresentados na forma derivada pois isto permite a determinação mais precisa dos parâmetros espectrais (Figura 5 (B)).

(B)

Figura 5: (A) Espectro de absorção RPE de um radical livre nitróxido isolado, mostrando o desdobramento hiper:fino devido à interação com o dipolo nuclear 1~ (J=l). (B) Primeira derivada do espectro de absorção, representando o espectro de um equipamento de detecção de RPE (adaptado de Warren, 1987).

O paramagnetismo natural de materiais biológicos é muito baixo, por isto é comum a introdução fisica de marcadores de spin intercalados entre as moléculas da membrana ou entre as moléculas de tensoativo das micelas. Os marcadores são geralmente compostos contendo radicais livres de nitróxido, um grupo quimicamente estável, relativamente não-reativo devido à proteção dos grupos metila Na Figura 6 é apresentado o marcador de spin ácido 5-doxil esteárico (5-SASL).

Capítulo ll - Revisão da Literatura 13

~~---OH

O N-0 O

5-SASL

y

Figura 6. Molécula de marcador de spin ácido 5-doxil esteárico (5-SASL).

O elétron desemparelhado do grupo nitróxido esta associado ao átomo de nitrogênio, e sua órbita é altamente anisotrópica, promovendo uma forte dependência entre a sua orientação e o espectro de RPE.

A função Harniltoniana de spm,

H,

descrevendo a energética das transições de spin, pode ser representada por (Carrington e McLauchlan, 1967):

(2) onde

fJ.

e

fJN

são os magnêtons eletrônico e nuclear, respectivamente,

gN

é o fator Zeeman de desdobramento nuclear, sé o operador de momento angular de spin do elétron,

J

é o operador de momento angular do spin do núcleo e

A

o tensor de desdobramento hiperfino. Nessa equação o primeiro termo representa as interações eletrônicas de Zeeman, o segundo termo as interações hiperfinas (entre spin eletrônico e spin nuclear), e o terceiro termo representa a interação entre o spin nuclear e o campo magnético (termo nuclear de Zeeman), que é desprezível nas condições usuais de uso de marcador de spins em RPE (Schreier et al., 1978). Os termos Htroca e Hdipolar referem-se às

interações spin eletrônico - spin eletrônico intermoleculares, que ocorrem em altas concentrações de radicais ou poliradicais respectivamente, que neste caso são desprezíveis pois os marcadores de spin são incorporados em baixa

~C~a~p~ínu==o~IT=--~R~e~v-~_ão

__

da~L~z~·re~~~a~tu~r~a~---14

concentração em membranas (1 - 2 moi%). Quando as interações

Ht:oca

e HctiJ>olar estão ausentes o espectro resultante mostra três transições possíveis separadas pela constante de desdobramento hiperfino (A).

O desdobramento hiperfino,

A,

e o fator

g

do elétron são propriedades tensoriais e, portanto, anisotrópicas, dependentes da orientação da amostra em relação ao campo Ho. Assim, os espectros de RPE dependem da orientação dos eixos principais da molécula em relação ao campo magnético externo. Pode-se estabelecer coordenadas cartesianas onde a direção x é paralela à ligação N-0, a direção y é perpendicular à ligação N-0 e se estende no plano da estrutura do anel, e a direção z é perpendicular à estrutura do anel (vide Figura 7). Esse sistema coincide com a direção dos principais componentes dos tensores

g

e

A (gxx, gY.V, gzz

e

Axx, AY.V

e Azz)(Wertz e Bolton, 1972). Para a maioria dos radicais nitróxidos, os valores de

g

e

A

variam em torno de:

gxx""'

2,0009,

gY.V""'

2,006,

gzz""'

2,002;

Axx""' AY.V""'

6G e

Azz""'

32G (Griffith et al., 1965; Schreier et al., 1978). O marcador de spin, ao ser intercalado na bicamada, orienta-se perfeitamente. Os marcadores do tipo 5-SASL orientam-se com o eixo z aproximadamente paralelo à normal da bicamada ~ (A) z I I

rt\

~ ,y \l)t~~-

••

-N 0:---x

Q)

I

••

(B)

Figura 7. Estrutura do radical nitróxido (A). Sistema de coordenadas atribuídas ao radical nitróxido (B).

Capítulo II- Revisão da Literatura 15

~L---O parâmetro de ordem em membranas, tem como base de cálculo a anísotropia dos fatores

g

e

A

e é definido pela equação 3 (Jost et al., 1971):

S = .!(cosy +cos2

y) (3)

2

onde y é o ângulo do cone dentro do qual o eixo longo molecular executa um caminho aleatório. O parâmetro de ordem, reflete a amplitude angular do movimento anísotrópico da molécula pois é uma medida da orientação da molécula em relação ao eixo diretor (normal à bicamada). O seu valor varia de O (sistemas isotrópicos) até 1 (sistemas perfeitamente orientados).

O parâmetro de ordem, pode ser experimentalmente determinado para marcadores cujo eixo longo molecular coincide com a direção do componente principal do tensor hiperfino Azz pela equação:

AI I -Al.

s

= =----=---=--- (4) Azz-( Axx+AY.Y)I 2

onde AI/, e Al. referem-se aos desdobramentos hiperfinos correspondentes aos marcadores orientados com seus eixos longos moleculares dispostos de forma paralela e perpendicular, em relação ao campo magnético. Considerando-se uma simetria cilíndrica ao redor do eixo longo molecular, esses valores representam as médias do movimento em relação a este eixo. Nestes casos onde o eixo z é paralelo ao eixo longo molecular o espectro apresenta extremos internos e extremos externos que podem ser usados para a determinação de AI! e Al. (Hubbel e McConnell, 1971). A Figura 8 mostra as medidas dos extremos internos e externos (2A// e 2Al.), no espectro do

Capítulo II- Revisão da Literatura 16

~~---marcador 5-SASL em micelas de tensoativo C12E5 usados para o cálculo de S segundo a equação 4. Quando a ordem do ambiente no qual o marcador está inserido é pequena, os extremos internos não são resolvidos e o parâmetro de ordem não pode ser determinado diretamente. O parâmetro 2A// é definido como a amplitude do campo magnético entre os dois picos que aparecem do movimento altamente anísotrópico do marcador de spin. Esse parâmetro é aproximadamente proporcional ao parâmetro de ordem S, de acordo com a equação 4, e é usado como uma medida convencional para avaliação da ordem do meio na qual o marcador está imerso. Quanto maior o valor de 2A// maior é a ordem da membrana, e conseqüentemente menor é a fluidez do meio (Inoue et al., 1994 a).

v

1,~

_:

\j ; i

I

:/

1~2k-1

2AII

Figura 8. Espectro do marcador 5-SASL em micelas de tensoativo C12E5, indicando a medida dos extremos externos e internos (2A// e 2A.L).

2.5 - Preparação de Lipossomas

Existem diversos métodos de preparação de lípossomas, os quru.s produzem vesículas com características específicas adequadas às diferentes

~C~a~p~ínu~o~IT~--R~e_v~~~ã~o~da~L~ire~r~a~tu~r~a~---17

aplicações (Lasic, 1993). De uma maneira geral, os lipossomas são formados mediante a introdução dos lipídios em meio aquoso, e adição .de energia ao sistema. Para que a hidratação seja eficiente é necessário aumentar a área superficial ocupada pelos lipídios. Isto pode ser feito através da obtenção de um filme seco de lipídios, pela dissolução e evaporação de solvente orgânico, por liofilização dos lipídios, ou ainda pela obtenção de pó fino de lipídios obtidos por pulverização por atomização de suas soluções em solventes orgânicos. Uma outra alternativa para introduzir os lipídios em ambiente aquoso, é fazê-lo diretamente de uma fase orgânica através de emulsificação, injeção, diálise do solvente e extração, que dependem da miscibilidade do solvente orgânico em água

As vesículas preparadas assim são multilamelares e heterogêneas. A transformação em vesículas unilamelares e aproximadamente homogêneas em tamanho, é feita por via mecânica, eletrostática ou química. Dentre os tratamentos mecânicos estão a extrusão, prensa francesa, microfluidização e sonicação. O método da extrusão é baseado em forçar a dispersão de vesículas multilamelares através de filtros com diâmetro de poros bem definidos sob pressão, exercida por um gás inerte. As células de extrusão podem ser encarnisadas para extrusão à temperatura controlada e usadas com membranas de diferentes diâmetros e tamanho de poros comercialmente disponíveis. Dentre as vantagens de se usar a extrusão estão a ausência de solventes orgânicos ou detergentes, as altas concentrações de lipídios que podem ser empregadas, alta eficiência de encapsulamento que pode ser alcançada, facilidade e rapidez de preparação, e a obtenção de vesículas com distribuição de tamanho homogêneas a partir de dez extrusões e com boa reprodutibilidade (Hope et al., 1985). A unilamelaridade e eficiência de encapsulamento podem ser significativamente aumentadas por sucessivas

~C~apLI=·nu~o~IT=--~R=e~v=~-ã_o_da~L=i=re~ra=t~u~ra~---18

etapas de congelamento e descongelamento das vesículas multilamelares antes da extrusão, que também tem a função de homogeneizar o conteúdo interno dos lipossomas (Mayer et al.; 1985, 1986). No entanto, Hope e colaboradores (1985), concluíram que a grande maioria das vesículas produzidas por repetidas extrusões de vesículas multilamelares grandes através de membranas com diâmetro de poro de 100 nm na ausência de congelamento/ descongelamento são unilamelares e portanto podem ser obtidas diretamente.

2.6 - Estabilidade de Lipossomas em Fluidos Biológicos

Lipossomas usados na administração controlada de medicamentos interagem com os vários componentes presentes nos fluídos biológicos, principalmente com proteínas. Estas interações podem ser do tipo carga-carga e/ou hidrofóbicas, que levam à adesão ou adsorção das proteínas na superfície das vesículas (Lasic, 1993). A adsorção juntamente com a troca de lipídios principalmente com lipoproteínas de alta densidade pode resultar na perda do material encapsulado, e também na desintegração dos lipossomas (Woodle e Lasic, 1992).

Quando os lipossomas entram no fluxo sangüíneo há predominantemente duas interações: com as lipoproteínas do sangue e com as opsoninas, proteínas cuja função é a de acionar os macrófagos do sistema imunológico (Woodle e Lasic, 1992). Diversos fatores tais como densidade de empacotamento da bicamada, hidrofilicidade e rede de cargas na superfície, bem como a própria proteína influenciam na interação entre as macromoléculas derivadas do plasma e as vesículas (Blume e Ceve, 1993). A interação com lipoproteínas envolve a troca de lipídios e conseqüentemente a desintegração dos lipossomas enquanto a adsorção das opsoninas, produz

~C~a~p~índ~o~IT_-_R~ev~z_sa_-o

__

da~L~i~re~~~a~tu~~~a

______________________________ 19

intercalação ou ligação eletrostática de macromoléculas marcadoras tais como imunoglobulinas, na superficie dos lipossomas, os quais ligando-se a receptores situados nos macrófagos produzem a eliminação dos lipossomas da corrente sangüínea.

A origem molecular da troca de lipídios e penetração na bicamada depende do estado fisico dos lipossomas. A presença de impurezas, surfatantes de cadeia simples, defeitos estruturais e alto raio de curvatura facilitam a desestruturação da bicamada. A adição de colesterol em concentrações na faixa de 30 a 50% elimina a transição de fases, aumenta a fluidez e a estabilidade dos lipossomas (Woodle e Lasic, 1992; Lasic, 1993). No entanto a presença de colesterol na bicamada lipídica pode interferir significativamente na incorporação de grandes quantidades de drogas lipofilicas dentro da bicamada. Isto ocorre devido a competição entre as moléculas liposolúveis e colesterol pelo posicionamento no interior da membrana hidrofóbica (Blume e Ceve, 1993).

Os macrófagos são células especializadas que representam os principais componentes do sistema imunológico dos seres vivos. Sua função mais simples é a de capturar partículas estranhas presentes na circulação sanguínea através do reconhecimento por meio de ligantes seletivos contidos em sua superficie. Células deste tipo são comumente referidas como componentes do sistema reticuloendotelial (SRE), e existem nas membranas receptoras do plasma no figado, baço, intestino, pulmão, pele ou podem circular no sangue como monócitos (Lasic, 1993).

As interações de lipossomas com as células ocorrem por troca de lipídios ou proteínas com as membranas celulares, por adsorção ou ligação

Capítulo II- Revisão da Literatura 20

--~---com

as

células, por endocitose ou fagocitose e por fusão com as membranas celulares (Lasic, 1993 ).

Estas considerações mostram que o sistema imunológico é alvo passivo e que os lipossomas podem ser excelentes veículos de compostos terapêuticos para doenças associadas ao SRE. O direcionamento para outros órgãos ou alvos ativos é feito através da modificação da superficie dos lipossomas com compostos que impedem a adsorção de macromoléculas e do reconhecimento molecular através da ligação de anticorpos na superficie das vesículas.

2.7- Modificações na Superficie de Lipossomas

As pnmeuas abordagens para a modificação da superficie de lipossomas para aumentar a sua estabilidade, foram feitas por métodos de recobrimento. Lipossomas foram cobertos através de ligações covalentes, com produtos naturais tais como proteínas, polissacarideos e polímeros anfipáticos (Woodle e Lasic,1992; Lasic, 1993). Apesar da proteção da superficie proporcionada por estes materiais, os lipossomas não apresentaram melhoramentos com relação à estabilidade biológica e tiveram a sua estabilidade fisica diminuída, o que não atendia às necessidades do seu uso para a liberação controlada de medicamentos (Lasic, 1993). Métodos envolvendo a co-mistura de moléculas anfipáticas com grupos especiais de cabeça polar tais como as de gangliosídios ou fosfatidil inositol hidrogenado de soja (HSPI), presentes a baixas razões molares na bicamada lipídica, representaram uma evolução em termos de estabilidade biológica Particularmente, o uso do monossianogangliosídio GM1, produziu lipossomas capazes de permanecer por um tempo mais prolongado na corrente sanguínea (Allen et al., 1985; 1987; 1989; Gabizon e Papahadjopoulos, 1992). Uma

Capítulo II -Revisão da Literatura 21

~~---limitação específica para o uso do gangliosídio GM1 é principalmente o seu custo. Na forma natural, é extraído em pequenas quantidades da massa cinzenta do cérebro, enquanto que a sua síntese é feita em várias etapas, com baixo rendimento. No caso do HSPI este lipídio tem uma solubilidade reduzida em diversos solventes dificultando a formação de lipossomas uniformes (Wodlle et al., 1992 a).

A alternativa mais bem sucedida até agora para melhorar a estabilidade biológica de lipossomas in vivo é a modificação da superficie das vesículas com polietilenoglicol, PEG. Uma das vantagens da utilização de PEG é o seu baixo custo comparado ao GM1 e o fato de que seus derivados fosfolipídicos podem ser preparados facilmente com elevado grau de pureza, e bons rendimentos. Trabalhos recentes mostram que o uso de PEG melhora sensivelmente a estabilidade de lipossomas no sangue (Allen et al., 1991; Papahadjopoulos et al., 1991; Klibanov et al., 1990; 1991; Litzinger e Huang, 1992; Blume e Ceve, 1990; 1992). A presença de PEG na superficie das vesículas tem grande influência em sua distribuição nos tecidos, bem como um aumento na eficácia farmacológica de drogas antitumorais. Este efeito é muito superior comparado ao dos lipossomas convencionais, prolongando o tempo de circulação em mais de cinco vezes. reduzindo a captura em tecidos de órgãos tais como o figado e o baço e um correspondente aumento de acúmulo ao redor de tumores implantados (Papahadjopoulos et al., 1991). O prolongamento da permanência na circulação dos lipossomas modificados com PEG só é efetivamente observado para vesículas de diâmetros inferiores a 200 nm (Klibanov, 1991) tendo como valor ótimo 100 nm (Lasic, 1993). Woodle e Lasic (1992) abordaram em publicação o estado da arte dos lipossomas com a superficie modificada com PEG.

Capítulo ll -Revisão da Literatura 22

--~---Woodle e colaboradores (1992 a) ao estudarem a influência do comprimento da cadeia de PEG verificaram que para vesículas contendo 5 %

de PEG na superficie é necessário um peso molecular mínimo de 750 daltons, para que haja uma maior permanência dos lipossomas na circulação sanguínea e diminuição de captura pelo sistema reticuloendotelial. Os melhores resultados foram obtidos com PEG de peso molecular 2000 Da, não sendo observadas diferenças significativas com o aumento da cadeia de PEG para 5000Da

A estabilidade in vivo dos lipossomas derivatizados com PEG é independente da presença de colesterol, grau de saturação e carga dos lipídios, bem como a sua farmacocinética é independente da dose inicial aplicada, o que não ocorre para lipossomas convencionais que demonstram estreita dependência de captura pelo sistema mononuclear em função da dose lipídica ou presença de colesterol (Woodle et al., 1992 a; Blume e Ceve 1993).

De fato, a versatilidade obtida com essas novas formulações tem mostrado beneficios terapêuticos substanciais, e com isso as aplicações médicas dos lipossomas contendo PEG têm se tomado importantes. A despeito dos vários estudos, os mecanismos responsáveis pela estabilização desses lipossomas não estão ainda totalmente explicados. O potencial para a estabilização estética de colóides através da proteção com PEG foi proposto como a origem molecular da estabilidade de lipossomas em plasma. Nesse contexto, a estabilização resulta da concentração local de grupos altamente hidratados na superficie das vesículas, que esteticamente inibem as interações eletrostáticas e hidrofóbicas de componentes do plasma (Figura 9) (Lasic, 1991; 1993). Algumas evidências desse efeito foram obtidas através de medidas do potencial de superficie e mobilidade eletroforética (Woodle et al.,

Capítulo li -Revisão da Literatura 23

~~~~~~~~~~~---1992 b), e das forças de repulsão na bicamada (Needham et al., ~~~~~~~~~~~---1992), indicando que as cadeias de PEG acomodam-se em conformação estendida sobre a superficie das vesículas.

Figura 9. Representação esquemática da interação de lipossomas convencional e Stealth com lipoproteínas e opsoninas (adaptado de Lasic, 1993).

Blume e Ceve (1993) observaram que nem a hidrofilicidade da superficie das vesículas de lipídio nem o empacotamento compacto das cadeias de hidrocarbonetos são suficientes para prolongar o tempo de circulação dos lipossomas "in vivo". A presença de grupos que apresentam mobilidade significativa na superficie das vesículas, impedem a adsorção prolongada devido à permanente ruptura das ligações proteína lipídio pelas excitações térmicas da superficie. Portanto mobilidade, tamanho e concentração dos grupamentos ligados à superficie das vesículas, são de fundamental importância para a prevenção da adsorção de macromoléculas na superficie da bicamada.

Uma característica importante do PEG é que, quando utilizado na forma livre, este composto atua como agente fusogênico. A adição de concentrações relativamente baixas de PEG (P.M. 1000 e 6000) a soluções inicialmente claras de lipossomas sonicados produz um considerável aumento

Capítulo 1I - Revisão da Literatura 24

~~---na turbidez da solução. Análises por microscopia eletrônica destas soluções revelaram que o PEG induz primeiro uma agregação e posteriormente uma aparente fusão das vesículas, levando à formação de estruturas multilamelares grandes (Gofii e Alonso, 1986).

2.8 - Estabilidade de Lipossomas em Presença de Tensoativos

Tensoativos ou surfatantes são substâncias com atividade de superficie que possuem uma porção apoiar de hidrocarbonetos ligados a um grupamento polar ou iônico, formando tensoativos não-iônicos e iônicos respectivamente. O grau de atividade superficial dos tensoativos é resultante dos efeitos destas porções polar (hidrofilica) e apoiar (hidrofóbica). A hidrofilicidade pode ser quantificada através do parâmetro HLB da molécula e para tensoativos da série CxEy é calculado pela seguinte equação de definição (Schick, 1987):

HLB= %Er = 20·mH

5 mH +mL (5)

onde %Er é a porcentagem do peso molecular da porção hidrofilica (polioxietileno ), mH é a massa molecular da porção hidrofilica da molécula de tensoativo e mL a massa da porção lipofilica da molécula de tensoativo. O valor do HLB clássico de surfatantes não iônicos baseado na estrutura molecular original não leva em conta diversos fatores que afetam o desempenho do surfatante, tais como o efeito da temperatura e de substâncias presentes no meio (Schick, 1987). De acordo com a equação 5, o valor do HLB varia de zero a vinte, aumentando com a hidrofilicidade do tensoativo.

Capítulo II -Revisão da Literatura 25

~L---Um parâmetro importante de sistemas aquosos de tensoativos não iônicos e especialmente dos polioxietileno, é a temperatura na qual soluções micelares quando aquecidas se separam em duas fases, tornando a mistura turva Esta temperatura é comumente conhecida como ponto de turvação "cloud point", e possui uma leve dependência com a variação da concentração. Abaixo do ponto de turvação o surfatante está completamente dissolvido na água enquanto que acima desse ponto, há uma redução de solubilidade, resultando em um aumento de turbidez da mistura devido a formação de grandes agregados. A solubilidade dos tensoativos do tipo polioxietilenos é atribuida as pontes de hidrogênio entre os átomos de hidrogênio do solvente e os átomos de oxigênio do tensoativo, um processo que pode ser descrito pela Figura 1 O. A hidratação de uma unidade de oxietileno é um processo exotérmico. Com o aumento da temperatura uma solução de tensoativo recebe energia suficiente para quebrar estas ligações relativamente fracas causando a separação em duas fases. Quando isto ocorre a solução se torna turva e a temperatura na qual isto acontece é chamada de ponto de turvação (Schick, 1987).

~CH₂~CHr~~CHrCHz­

•

H~ O

'

H

Figura 10. Representação esquemática das pontes de hidrogênio entre moléculas de tensoativo e a água (adaptado de Schick, 1987).

A investigação do mecanismo de desestabilização dos lipossomas em presença de diferentes tensoativos permite a obtenção de informações que podem auxiliar no uso potencial das vesículas de fosfolipídios na administração controlada de medicamentos, uma vez que nestas aplicações, as vesículas entram em contato com tensoativos naturais que podem agir de

Capítulo II -Revisão da Literatura 26

~~~----~---~~---forma semelhante aos tensoativos sintéticos. A interação de lipossomas com tensoativos é importante também em estudos que envolvem a reconstituição de membranas protéicas ou preparação de proteolipossomas. A reconstituição é mn processo de incorporação de proteínas em mna bicamada lipídica para estudar a sua função nas membranas celulares.

Vários grupos de pesquisadores empregando as técnicas de medidas de turbidez de soluções (Urbaneja et al., 1988; Edwards et al., 1989; Alonso et al., 1987; 1992; Edwards e Almgren, 1990; 1991; 1992; Lash et al., 1990; Goíii e Alonso, 1986), de espalhamento quase-elástico de luz e liberação de agentes fluorescentes encapsulados (Maza et al., 1991; 1992 a, b; 1993, 1994), e de ressonância paramagnética eletrônica (Inoue et al., 1994 a, b) estudaram as interações entre tensoativos e lipossomas.

De mna maneua geral, os perfis de estabilidade de lipossomas sonicados em presença de tensoativos não-iônicos, determinados através de medidas da variação da turbidez das soluções, possuem a forma mostrada na Figura 11. Esse modelo tem sido observado para várias combinações de lipídios e surfatantes (Santana, 1993; Edwards e Almgren, 1990; 1991; 1992; Lichtenberg, 1985; Lichtenberg et al., 1983; Urbaneja et al., 1988).

Capítulo II - Revisão da Literatura 27 ~~---5r---~ 4f- 3f-o ••

•

.---/

·-~.

;-·---·

----.

2 3

Figura 11 Perfil de estabilidade de lipossomas convenc10mus (DSPC:DMPE:COL I 33:20:47 mol%, 1mM) sonicados em função da concentração de tensoativo C12E5 (Santana, 1993).

O efeito da concentração de tensoativo sobre a absorbância das soluções é caracterizado pela presença de 3 regiões distintas. A primeira, na qual o tamanho das vesículas permanece aproximadamente igual ao inicial, é marcada pela pequena variação da absorbância das soluções. A segunda, representativa do início da desestabilização, é caracterizada pelo crescimento, seguido de fusão, e prolonga-se até a completa solubilização das vesículas com a formação de rnícelas na região 3 (Edwards e Almgren, 1990; 1992; Lichtenberg, 1985; Lichtenberg et al., 1983).

Urbaneja e colaboradores (1988) observaram que na interação de lipossomas sonicados com o tensoativo Triton X-100, o início do crescimento das vesículas e da liberação do marcador encapsulado (glicose) ocorrem concornítantemente, indicando que as vesículas são abertas no processo de

Capítulo II-Revisão da Literatura 28

~~~~~~~~~~~---crescimento e que com o aumento da concentração de tensoativo há o aparecírnento de vesículas multilamelares antes da completa solubilização. A estabilidade das vesículas de lecitina mostrou-se fortemente influenciada pelo tamanho do grupo polar do tensoativo (Edwards e Almgren, 1990; 1991; Alonso et al, 1987). Estudos cinéticos sobre as interações de lipossomas constituídos de fosfatidilcolina com Triton X-100 mostraram que a mudança de turbidez das soluções ocorre em duas etapas: a primeira muito rápida, associada com a incorporação do tensoativo na bicamada, e a segunda etapa muito mais lenta, envolvendo a fusão das vesículas (Edwards e Almgren,

1990; Alonso et al., 1987). A etapa de fusão ocorre apenas para concentrações de tensoativo acima da concentração micelar critica.

Edwards e Almgren (1992) usando a técnica de medida de turbidez de soluções analisaram a estabilidade de vesículas compostas de fosfatidil colina em presença de tensoativos da série CxEy. Verificaram que, com o aumento da cabeça polar de Es para E8 na molécula de tensoativo, há um deslocamento

do ponto de máxima turbidez para menores porcentagens de tensoativo, bem como um aumento na permeabilidade da bicamada. Este efeito é atribuído ao fato de que para menores grupamentos polares, mais moléculas de surfatante devem ser adicionados antes que as micelas mistas se formem. Para vesículas sonicadas de PC em concentrações 1 ,2 mM em presença dos tensoativos C12Es, C12E6 e C12Es à temperatura de 20 °C o maior aumento de turbidez foi observado a 82% de C12E5, em segundo a 70% de C12E6 e a 40% de C12Es.

Portanto com o aumento da cabeça polar o ponto de máxima absorbância ocorre a menores porcentagens de tensoativo, mas no entanto menores crescimentos de vesículas são observados.

Capítulo II - Revisão da Literatura 29

--~---Apesar das várias caracterizações das interações entre lipossomas e tensoatívos em solução, o mecanismo molecular de solubilização das vesículas em tensoatívos não-iônicos ainda não pode ser generalizado. Evidências mostram que a geometria, a fração e posição das porções hidrofilica e hidrofóbica na molécula de tensoatívos são parâmetros importantes na estabilidade de lipossomas (Lash et al., 1990).

Maza e colaboradores (1991; 1992a; 1992b; 1993; 1994) estudaram as mudanças de permeabilidade de vesículas de fosfolipídios causadas por tensoatívos. Os autores definiram um coeficiente de partição, como a razão entre a quantidade de tensoativo presente na bicamada e em solução, e determinaram a permeabilidade da membrana através da liberação de carboxifluoresceína encapsulada nos lipossomas. Foi observada uma boa correlação entre o coeficiente de partição e a habilidade de diferentes tensoativos para modificar a permeabilidade dos lipossomas. Os resultados sugerem que interações hidrofóbicas são as principais forças envolvidas na alteração da permeabilidade das bicamadas lipídicas, embora as forças eletrostáticas tenham um papel importante na modificação desse parâmetro. Para tensoativos não iônicos, as mudanças de permeabilidade mostraram uma forte correlação com o HLB dos tensoativos. Uma região de máxima mudança da permeabilidade foi observada quando o HLB da série octilfenol polietoxilato situou-se próximo à 13,7.

Gofii e Alonso (1986) observaram que a adição de quantidades crescentes de tensoativos tais como Triton X-100, dodecilsulfato de sódio e octilglucosídeo em lipossomas multilamelares de fosfatidil colina provoca uma redução da turbidez das soluções que é geralmente interpretada como um decréscimo no número destas vesículas multilamelares pela ação destes

Capítulo II - Revisão da Literatura 30

~~~---~---tensoativos. A situação é completamente diferente quando preparações de lipossomas sonicados são tratados com estes tensoativos. A turbidez da solução aumenta e alcança um máximo (na razão equimolar de surfatante/fosfolipídio para o Triton X-100). Atribui-se este aumento de turbidez na solução de lipossomas à provável agregação de vesículas, fusão ou aumento do tamanho devido à reorganização dos lipídios em estruturas maiores. Após este ponto máximo, há um rápido decréscimo de turbidez, até a solução se tornar opticamente transparente. Neste estudo, para todos os tensoativos e lipídios utilizados, os autores observaram o crescimento das vesículas apenas quando estas eram misturadas com os anfifilicos a temperaturas acima da Te do lipídio puro.

A estabilidade de lipossomas sonicados contendo PEG em presença de tensoativos foi estudada por Santana (1993) e usada como parâmetro de caracterização da integridade da bicamada lipídica de lipossomas encapsulando compostos de boro (Moraes, 1996). Os perfis obtidos por medidas de turbidez das soluções mostram um decréscimo de absorbância à concentrações menores que 25% de C12E5 e que a presença de PEG nas vesículas aumenta a sua estabilidade em relação aos lipossomas convencionais (vide Figura 12). A estabilidade aumenta com o aumento da concentração de PEG na superficie das vesículas como pode ser observado pelo menor crescimento das vesículas com o aumento da porcentagem de PEG.

Capítulo 11 -Revisão da Literatura 3,0 2,5 2,0 ~ 1,5 ~ 1,0

~

0,5

/-0~0

/ ~o o ' 0-0~ -o~-Conwncional - o - 6%PEG - A - - 9%PEG o - 12% PEG 31

Figura 12. Perfil de estabilidade de lipossomas sonicados convencionais e com PEG2000 em função da porcentagem de C12E5 (adaptado de Santana,

1993).

lnoue e colaboradores ( 1994 a, b) utilizaram técnicas de fluorescência e marcador de spin (RPE) para obtenção de informações mais detalhadas dos agregados moleculares formados entre vesículas de fosfatidilcolina e surfatantes não-iônicos do tipo polioxietileno (CxEv). Estes autores demonstraram que para quantidades relativamente baixas do tensoativo C10E7 componentes da bicamada lipídica foram parcialmente retidos dentro das micelas mistas. O espectro de RPE sugeriu também que os grandes agregados são compostos de fragmentos lamelares resultantes da destruição das vesículas. No ambiente interno dos grandes agregados é mantida a estrutura da bicartlada lipídica enquanto que o amhlente interno das micelas mistas é semelhante ao das rrticelas puras. Propuseram então um mecanismo provável para a transformação induzida pela temperatura entre as micelas mistas e vesículas, o qual báseou-se nas me~illl\s catiCteristicas observadas nas