UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO Stricto sensu EM CIÊNCIAS APLICADAS A PRODUTOS PARA SAÚDE (PPG-CAPS)
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO
DESENVOLVIMENTO DE PRODUTOS PARA SAÚDE
ESTUDO FITOQUÍMICO E BIOLÓGICO DA ESPÉCIE VEGETAL
Manilkara subsericea (Mart.) Dubard
Caio Pinho Fernandes
Orientador: Prof. Dr. Leandro Machado Rocha Niterói – RJ
II Caio Pinho Fernandes
Estudo fitoquímico e biológico da espécie vegetal Manilkara subsericea
(Mart.) Dubard
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências Aplicadas a Produtos para Saúde (PPG-CAPS) da Universidade Federal Fluminense, como parte dos pré-requisitos para obtenção do grau de mestre. Área de Concentração: Desenvolvimento de Produtos para Saúde
Orientador: Prof. Dr. Leandro Machado Rocha
Niterói – RJ 2011
F363 Fernandes, Caio Pinho
Estudo fitoquímico e biológico da espécie vegetal Manilkara
Subsericea (Mart.) Dubard) / Caio Pinho Fernandes. -- Niterói, 2011. 75f.
Orientador: Dr.Leandro Machado Rocha
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal Fluminense. Faculdade de Farmácia. Programa de Pós-Graduação em Ciências Aplicadas a Produtos para Saúde. – UFF, 2011. Bibliografia: f. 67-75
1.Química orgânica. 2.Estudo fitoquímico.
III FOLHA DE APROVAÇÃO
Caio Pinho Fernandes
Estudo fitoquímico e biológico da espécie vegetal Manilkara subsericea (Mart.) Dubard
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências Aplicadas a Produtos para Saúde (PPG-CAPS) da Universidade Federal Fluminense, como parte dos pré-requisitos para obtenção do grau de mestre. Área de Concentração: Desenvolvimento de Produtos para Saúde Aprovada em
_________________________________________ Prof. Dr. Leandro Machado Rocha – Orientador
Faculdade de Farmácia – UFF
____________________________________________ Prof. Dr. Adriana Cortadi
Universidad Nacional de Rosario – UNR (ARG)
____________________________________________ Prof. Dr. José Luiz Pinto Ferreira
Faculdade de Farmácia – UFF
____________________________________________ Prof. Dr. Ricardo Machado Kuster
IV Este trabalho foi realizado sob orientação do Prof. Dr. Leandro Machado Rocha
V Dedico este trabalho aos meus pais e a minha irmã, pelo apoio e suporte que me têm dado ao longo de toda a vida
VI Não há vegetal algum que não mereça ocupar a atenção de um verdadeiro sábio; nenhum há, por mais desprezível que pareça, de que não se possa esperar alguma utilidade.
VII AGRADECIMENTOS
Aos meus pais Luiz Carlos Fernandes e Luizaura Pinho Fernandes, pelo apoio irrestrito e amor incondicional.
À minha irmã Laís Pinho Fernandes, pelo caráter, amizade e exemplo que sempre demonstrou.
Às minhas vós Aurora e Lacy, minha tia Laurinha e demais familiares, por demonstrar o significado mais puro de uma família unida, tão presente em minha vida.
Ao meu orientador e grande amigo Prof. Leandro Machado Rocha, pelos valorosos ensinamentos científicos e amizade.
Aos amigos do Laboratório de Tecnologia de Produtos Naturais (LTPN-UFF), Jonathas, Rodrigo, Otávio, Henrique, José Carlos, Ricardo, Hildegardo, Iraí, Arthur, Luis Armando, Adriana, Raquel, Bárbara, Gisele, Mariana, Ana Clara, Fernanda, pelo apoio e amizade, além de contribuírem firmemente no meu caminho de aprendizado sobre as plantas.
Ao Prof Marcelo Guerra, pela amizade e grande ajuda durante as coletas na restinga.
Às Professoras Adriana Cortadi e Martha Gattuso, pelos ensinamentos e modo extremamente acolhedor com que me receberam em seu laboratório.
Ao Professor José Luis Pinto, pelos ensinamentos desde a época de graduação e por ser um exemplo de profissional.
À Professora Denise Feder e demais professores e alunos do Laboratório de Biologia de Insetos do GBG/UFF, pelo grande auxílio e ensinamentos.
Aos Professores e funcionários vinculados ao Programa de Pós Graduação em Ciências Aplicadas a Produtos para Saúde (PG-CAPS)e da Faculdade de Farmácia da UFF, em especial à coordenadora Profª Kátia Lima, pelo suporte dado ao longo do trabalho realizado.
À CAPES pelo suporte financeiro.
VIII
RESUMO
FERNANDES, Caio Pinho. Estudo fitoquímico e biológico da espécie vegetal Manilkara subsericea (Mart.) Dubard. Niterói, 2011. Dissertação (Mestrado em Ciências Aplicadas a Produtos para Saúde, Universidade Federal Fluminense.
Manilkara subsericea (Mart.) Dubard (Sapotaceae) é popularmente cohecida no Brasil
como “guracica”. Neste trabalho, é descrito o fracionamento bioguiado pelo ensaio para inibidores da acetilcolinesterase de uma mistura contendo acetato de beta-amirina e acetato de alfa-amirina e a obtenção de uma mistura de ácido ursólico e ácido oleanólico. Esta é a primeira vez que a atividade anticolinesterásica de uma mistura contendo acetato de beta amirina (76,3%) e acetato de alfa amirina (23,7%) é descrita. Também foi verificada a eficiência de extratos de polaridade distintas e da misturas dos acetatos de beta e alfa amirina no desenvolvimento de duas espécies de insetos (Oncopeltus fasciatus e Dysdercus peruvianus). O extrato etanólico de folhas e os extratos hexânico, diclorometânico, acetato de etila e butanólico provenientes da partição realizada com o extrato etanólico bruto de frutos foram capazes de induzir mortalidade, atraso no desenvolvimento e inibição da muda. Além disso, os extratos hexânico, diclorometânico e butanólico, causaram mal formação em insetos adultos. Estes resultados indicam que extratos de M. subsericea atuam como inibidores do crescimento de fitófagos e que o acetato de beta amirina e acetato de alfa amirina podem ser utilizados como potenciais marcadores químicos em possíveis formulações de produtos para controle de pragas agrícolas. Extratos e fração obtida de M. subsericea foram testados frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923 e Escherichia coli ATCC 25922. O extrato etanólico de folhas, extrato etanólico de caules, extrato hexânico de caules, extrato diclorometânico de caules, extrato acetato de etila de caules, extrato butanólico de caules, extrato hexânico de frutos, extrato diclorometânico de frutos e a mistura dos acetatos de beta e alfa amirina mostraram atividade frente a S. aureus. Somente o extrato etanólico de caules apresentou atividade frente a E. coli. Este é o primeiro estudo sobre atividade biológicas e fitoquímico de M. subsericea e esperamos com estes resultados, contruir para a valorização desta espécie.
Palavras-chave: Acetilcolinesterase, atividade antibacteriana, fitófagos, Manilkara subsericea, Restinga de Jurubatiba, triterpenos.
IX
ABSTRACT
FERNANDES, Caio Pinho. Phytochemical and biological study of the vegetal species Manilkara subsericea (Mart.) Dubard. Niterói, 2011. Dissertação (Mestrado em Ciências Aplicadas a Produtos para Saúde, Universidade Federal Fluminense.
Manilkara subsericea (Mart.) Dubard (Sapotaceae) is popularly known in Brazil as “guracica”. In the present study, it is reported the bioguided fractionation by the bioassay for anticholinesterase inhibitors of a mixture containing beta-amyrin acetate and alpha-amyrin acetate and the achievement of a mixture containing oleanolic acid and ursolic acid. This was the first time that the anticholinesterasic activity of a mixture containg the triterpenes beta-amyrin acetate (76.3%) and alpha-beta-amyrin acetate (23.7%) was described. We also evaluated the efficacy of extracts with distinct polarity and of the mixture of beta- and alpha-amyrin acetate from Manilkara subsericea on the development of two species of agricultural pest insects (Oncopeltus fasciatus and Dysdercus peruvianus). The etanolic extract from leaves, the hexanic extract, dichloromethanic extract, ethyl acetate extract and buthanolic extract from fruits were able to induce mortality, delay development and molt inhibition. These results indicate that M. subsericea extracts acts as a potent growth inhibitor of phytophagous hemipteran nymphs and indicates that beta- and alpha-amyrin acetate can be used as chemical markers for possible formulations of products to be used in control programs against crop pests. On the present study we tested M. subsericea extracts against Staphylococcus aureus ATCC 25923 e Escherichia coli ATCC 25922. The ethanolic extract from leaves, ethanolic extract from stems, hexanic extract from stems, dichloromethanic extract from stems, ethyl acetate extract from stems, buthanolic extract from stems, hexanic extract from fruits, dichloromethanic extract from fruits and a mixture of beta- and alpha amyrin acetates showed activity against S. aureus, with exception of the the ethyl acetate extract and buthanol extract from fruits. Only the ethanolic extract from stems showed activity against E. coli. This is the first contribution about phytochemistry and biological activities of M. subsericea and we hope that these results contribute for preservation of this species.
Keywords: Acetylcholinesterase, antibacterial activity, phytofagous, “Restinga de Jurubatiba”, triterpenes.
X LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1. Ilustração da localização do Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba 2
Figura 2. Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba 3
Figura 3. A) Ilustração de Manilkara subsericea 7
B) foto de caule, folhas e frutos coletados no Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba
Figura 4. Manilkara subsericea (Mart.) Dubard 8
Figura 5. Desenho botânico de Manilkara subsericea 10
Figura 6. Manilkara subsericea situada no Parque Nacional da restinga de Jurubatiba 11
Figura 7. Formato cabeça-cauda de unidade isoprênica 12
Figura 8. Rota biossintética de formação de terpenóides 13
Figura 9. Esquema de formação de terpenóides por encadeamento cabeça-cauda e
cauda-cauda 14
Figura 10. Exsicata de M. subsericea coletada na Restinga de Jurubatiba, RJ, Brasil em
janeiro de 2009 17
Figura 11. Esquema de partição dos extratos etanólicos de frutos e caules 19 Figura 12. Fracionamento do extrato hexânico resultante da partição do extrato 21
etanólico de frutos
Figura 13. Reação colorimétrica de formação da substância azólica (roxa) que ocorre 25 no ensaio anticolinesterásico qualitativo
Figura 14. Cromatografia em camada fina de extratos e fração obtida de M. subsericea. 27
Figura 15. Cromatografia em camada fina das frações FH1X e FH1Y obtidas do 28 extrato hexânico de frutos de M. subsericea.
Figura 16. Cromatografia em camada fina da fração FH2P obtida do extrato 29 hexânico de frutos de M. subserica.
Figura 17. Cromatograma obtido por CG-EM do extrato hexânico (FH) resultante da 30 partição efetuda no extrato etanólico de frutos de M. subsericea
XI Figura 18. Cromatograma obtido por CG-EM da fração FH1X obtida do extrato 34
hexânico (FH) resultante da partição efetuda no extrato etanólico de frutos de M. subsericea.
Figura 19. Espectro de massas de A + B (17 e 18). 35
Figura 20. Fragmentação característica de triterpenos pentacíclicos (série oleano) com 35 dupla ligação na posição C-12, via reação Retro-Dies-Alder
Figura 21. Fragmentação característica de triterpenos pentacíclicos (série ursano) com 36 dupla ligação na posição C-12, via reação Retro-Dies-Alder
Figura 22. Espectro de RMN 1H (Varian VNMRS; 300 MHz; CDCl3) de A+B (17 e 18) 38
Figura 23. Expansão δ (2,02-2,08) do espectro de RMN 1H (Varian VNMRS; 38 300 MHz; CDCl3) de A+B (17 e 18)
Figura 24. Expansão δ (4,40-4,60) do espectro de RMN 1H (Varian VNMRS; 39 300 MHz; CDCl3) de A+B (17 e 18)
Figura 25. Expansão δ (5,02-5,30) do espectro de RMN 1H (Varian VNMRS; 40 300 MHz; CDCl3) de A+B (17 e 18)
Figura 26. Espectro de RMN 13C (Varian VNMRS; 75 MHz; CDCl3) de A+B. 41
Figura 27. Expansão δ (121-145) do espectro de RMN 13C (Varian VNMRS; 43 75 MHz; CDCl3) de A+B (17 e 18)
XII Figura 28. Expansão δ (75-82) do espectro de RMN 13C (Varian VNMRS; 43
75 MHz; CDCl3) de A+B (17 e 18)
Figura 29. Expansão δ (164-176) do espectro de RMN 13C (Varian VNMRS; 44 75 MHz; CDCl3) de A+B (17 e 18)
Figura 30. Espectro de RMN 1H (Varian VNMRS; 500 MHz; CDCl3) de 47
C+D (19 e 20)
Figura 31. Espectro de RMN 13C (Varian VNMRS; 125 MHz; CDCl3) de 48
C+D (19 e 20)
Figura 32. Expansão δ (67-89 ) do espectro de RMN 13C (Varian VNMRS; 49 125 MHz; CDCl3) de C+D (19 e 20)
Figura 33. Expansão δ (121-145) do espectro de RMN 13C (Varian VNMRS; 50 125 MHz; CDCl3) de C+D (19 e 20)
Figura 34. Expansão δ (179-183) do espectro de RMN 13C (Varian VNMRS; 51 125 MHz; CDCl3) de C+D (19 e 20)
Figura 35: Avaliação da CMI de M. subsericea frente à S. aureus 25923. 53
Figura 36. Ensaio bioautográfico para inibidores da acetilcolinesterase 56
Figura 37. Limites de detecção no ensaio bioautográfico para inibidores 57 da acetilcolinesterase por uma mistura contendo 76,3% de
XIII Figura 38. Influência de fatores externos na produção de metabólitos secundários 59
Figura 39. A) D.peruvianus adulto saudável 60
B) D. peruvianus tratado com extrato hexânico de M. subsericea com mal formação na asa e cutícula enrugada (estágio adulto)
XIV LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Ácidos graxos e ésteres presentes no extrato hexânico 31 resultante da partição efetuda no extrato etanólico de frutos de M. subsericea
Tabela 2. Deslocamentos químicos de RMN 13C (ppm, CDCl3) característicos 42
dos átomos de carbono oxigenados dos triterpenos mais freqüentes
Tabela 3. Comparação de deslocamento químicos de 13C de A e B (17 e 18) 45 (Varian VNMRS; 75 MHz, CDCl3) obtidos defrutos de M. subsericea com acetato
de beta amirina e acetato de alfa amirina.
Tabela 4. Comparação de deslocamentos químicos de RMN de 13C de C+D (19 e 20) 52 (Varian VNMRS 125 MHz; CDCl3) obtidos de frutos de M. subsericea e comparação
com ácido ursólico e ácido oleanólico
Tabela 5. Atividade antibacteriana de extratos e fração obtida de M. 54 subsericea frente a S. aureus e E. coli
Tabela 6. Avaliação da atividade biológica de extratos de M. subsericea no 61 desenvolvimento de Dysdercus peruvianus
Tabela 7. Avaliação da atividade biológica de extratos de M. subsericea no 63 desenvolvimento de O. fasciatus
XV LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIATURAS
ATCC American Type Culture Collection CAE Extrato acetato de etila de caules CB Extrato butanólico de caules CCF Cromatografia em camada fina CD Extrato diclorometânico de caules CDCl3 Clorofórmio deuterado
CE Extrato etanólico de caules CE50 Concentração Efetiva Mediana
CG-EM Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de Massas CH Extrato hexânico de caules
CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute
cm Centímetro
CMI Concentração Mínima Inibitória
DMAPP Pirofosfato de dimetilalila (do inglês: Dimethylallyl pyrophosphate) DMSO Dimetilsulfóxido
DPPH 2,2- difenil-1-picril-hidrazila
eV Elétron-volt
FAE Extrato acetato de etila de frutos FB Extrato butanólico de frutos FD Extrato diclorometânico de frutos FDA U.S. Food and Drug Administration
XVI FE Extrato etanólico de folhas
FH Extrato hexânico de frutos
FH1 Fração obtida do extrato hexânico de frutos (FH) FH1X Fração obtida do extrato hexânico de frutos (FH) FH1Y Fração obtida do extrato hexânico de frutos (FH) FH2 Fração obtida do extrato hexânico de frutos (FH) FH2P Fração obtida do extrato hexânico de frutos (FH)
g Grama
h Hora
H2O Água
IBAMA Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis IPP Pirofosfato de isopentenila (do inglês: Isopentenyl pyrophosphate)
J Constante de acoplamento
kg Quilograma
m Metro
M Molar
mg Miligrama
MHA Ágar Mueller-Hinton
MHz MegaHertz
min Minuto
mL Mililitro
XVII
mm Milímetro
mM Milimolar
m/z relação massa/carga
NIST National Institute os Standards and Technology
p Para
PPM Parte por milhão
Rf Fator de retenção (do inglês: retention factor) RMN Ressonância Magnética Nuclear
RMN 1H Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio RMN 13C Ressonância Magnética Nuclear de Carbono
SISBIO Sistema de Autorização e Informação em Biodiversidade
TSA Trypticase soy Agar
TTC cloreto de trifenil tetrazolium
U Unidade
UFC Unidade formadora de colônia
v/v Volume por volume
μm Micrômetro μg Micrograma μL Microlitro α Alfa β Beta °C Graus celsius
XVIII
% Percentual
XIX SUMÁRIO 1 – INTRODUÇÃO 1 1.1 – O ecossistema de restinga 1 1.2 – O gênero Manilkara 3 1.2.1 - Atividades Biológicas 3 1.2.1.1 - Atividade antibacteriana 4 1.2.1.2 - Atividade antiparasitária 4 1.2.1.3 - Atividade antioxidante 5 1.2.1.4 - Atividade citotóxica 6
1.2.2 - Manilkara subsericea (Mart.) Dubard 7
1.3 – Triterpenos 12 2 – OBJETIVO 16 2.1 – Objetivo geral 16 2.2 Objetivos específicos 16 3 – MATERIAIS E MÉTODOS 17 3.1 - Material Vegetal 17 3.2 – Solventes 18 3.3 - Extratos e partições 18
XX
3.4 – Ensaios fitoquímicos 19
3.4.1 – Cromatografia em Camada Fina (CCF) 19
Escala analítica 19
Escala preparativa 19
3.4.2 – Reveladores 20
3.4.3 – Fracionamento do extrato hexânico de frutos 20
3.5 – Elucidação estrutural 21
3.5.1 - Cromatografia Gasosa acoplada à Espectrometria de Massas (CG-EM) 21
3.5.2 – Espectro de Ressonância Magnética Nuclear 22
3.6 - Atividade antibacteriana 22
Microrganismos 22
Preparação da suspensão bacteriana 22
3.6.1 - Método de difusão em disco 23
3.6.2 - Concentração Mínima Inibitória (CMI) 23
3.7. – Atividade anticolinesterásica 24
XXI
3.8 – Avaliação da atividade inseticida 25
3.8.1 – Colônias 25
3.8.2 – Bioensaio 26
4 – RESULTADOS E DISCUSSÂO 27
4.1 - Análise química dos extratos e substâncias isoladas 27
4.1.1 - Cromatografia em camada fina 27
4.2 - Elucidação estrutural 30
4.2.1 - Cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas 30
4.2.1.1 - Análise do extrato hexânico 30
4.2.1.2 - Análise de FH1X 34
4.2.2 – Ressonância Magnética Nuclear 36
4.2.2.1 – A+ B (17 e 18) 36 4.2.2.2 – C+D (19 e 20) 46 4.3 – Atividade antibacteriana 53 4.4 – Atividade anticolinesterásica 55 4.5 - Atividade inseticida 58 5 – CONCLUSÃO 65 6 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 67
1 1 – INTRODUÇÃO
1.1 – O ecossistema de restinga
O Estado do Rio de Janeiro é caracterizado por uma grande diversidade de ecossistemas. A parte litorânea apresenta costas rochosas, mangues, restingas e lagos, enquanto a parte continental apresenta uma vasta planície que se estende até uma área montanhosa composta pela Serra dos Órgãos, das Araras e da Mantiqueira. A vegetação que ocupa essas áreas é bem diversificada e inclui desde uma parte remanescente da Mata Atlântica até a vegetação típica de restinga (KELECOM et al., 2002).
As restingas são caracterizadas por se distribuírem ao longo dos cordões litorâneos, formados por sedimentos marinhos de origem quaternária ao longo da planície costeira (MARQUES & OLIVEIRA, 2004) e correspondem a 79% da área do litoral brasileiro (PESSOA et al., 2008). Estes ambientes são caracterizados por baixa disponibilidade de recursos, principalmente em função de seus solos arenosos que possuem baixa capacidade de retenção de água e nutrientes. A natureza das respostas das plantas à variação na disponibilidade de recursos e condições ambientais é em grande parte modulada por características morfológicas e fisiológicas (ROSADO & DE MATTOS, 2007), o que se torna especialmente interessante quando consideramos que diversos fatores podem coordenar ou alterar a taxa de produção de metabólitos especiais (GOBBO-NETO & LOPES, 2007).
O Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba, criado em 29 de abril de 1998, está situado entre as coordenadas 22º e 22º23‟S e 41º15‟ e 41º45‟W (figura 1) e abrange três municípios: Macaé, Carapebus e Quissamã. A planície quaternária possui superfície relativamente plana, com altitude máxima de aproximadamente 12 m e inclina-se suavemente rumo ao Oceano Atlântico. Entre as antigas cristas praiais, encontram-se áreas inundáveis. A distribuição das chuvas é fortemente sazonal, com mínima mensal no inverno (41 mm) e máxima no verão (189 mm) (SANTOS et al., 2004).
2 Figura 1. Ilustração da localização do Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba (SANTOS et al., 2004)
Segundo Henriques et al. (1986), a família Guttiferae, juntamente com as famílias Myrtaceae, Leguminosae, Apocynaceae, Malpighiaceae, Ericaceae, Erythroxylaceae, Bromeliaceae, Cactaceae, Humiriaceae e Sapotaceae são as mais representativas na Restinga de Carapebus. Um levantamento etnobotânico das espécies utilizadas pela população local, demonstrou o uso de 117 espécies, pertencentes a 99 gêneros e 47 famílias vegetais (SANTOS et al., 2009)
O manejo sustentável das espécies locais pode trazer benefícios significativos para a população e ao mesmo tempo preservar os recursos biológicos desta flora (GRIMES et al., 1994). Portanto, a valorização do conhecimento popular aliado ao conhecimento do potencial biotecnológico das espécies existentes no local, contribui para a preservação da biodiversidade existente no Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba (figura 2).
3 Figura 2. Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba (Fonte:Próprio autor)
1.2 – O gênero Manilkara
A família Sapotaceae é composta por aproximadamente 55 gêneros e 800 espécies, dos quais podemos citar: Chrysophyllum, Pouteria, Sideroxylon e Manilkara (WATSON & DALLWITZ, 1992). As espécies desta família são caracterizadas por apresentar uma variedade de classes de substâncias, como triterpenos, esteróides, saponinas, polifenóis, além de alcalóides, carotenóides, compostos cianogênicos e ácidos graxos (BELTRÃO, 2000; PERFEITO et al., 2005; MONTENEGRO et al., 2006; BARBOSA-FILHO et al., 2008).
O gênero Manilkara é constituído por aproximadamente 35 espécies de hábito arbóreo e arbustivo, distribuídas nas regiões tropicais e subtropicais (GOMES et al., 2010). Estudos realizados com espécies deste gênero indicaram a presença de flavonóides, ácidos fenólicos, saponinas e triterpenos (MA et al., 2003; LAVAUD et al., 1996; MISRA & MITRA, 1969).
1.2.1 - Atividades Biológicas
Espécies do gênero Manilkara têm sido utilizadas popularmente como plantas medicinais no tratamento de inflamações, febre, hemorragia pós-parto, dores de estômago e como cicatrizante. Estudos realizados com espécies deste gênero demonstraram diversas atividades, como antibacteriana, antiparasitária, antitumoral e antioxidante (CÁCERES et al.,
4 1995; DESRIVOT et al., 2007; MA et al., 2003; EIBOND et al., 2004; LEONTI et al., 2002; COE, 2008). Os estudos de bioatividade geralmente são realizados com as frações e extratos brutos, porém muitos estudos são realizados com as substâncias puras, obtidas a partir do isolamento guiado pela atividade biológica.
1.2.1.1 - Atividade antibacteriana
Em um estudo realizado na Guatemala, extratos de diferentes plantas utilizadas popularmente no tratamento de doenças sexualmente transmissíveis foram avaliadas quanto às suas atividades in-vitro frente a Neisseria gonorrhoeae, visando a confirmação do uso popular. O extrato etanólico do caule da espécie Manilkara achras (Mill.) Fosberg [= Manilkara zapota (L.) P. Royen] apresentou um halo de inibição de 8,5 ± 0,1 mm quando testado frente a uma cepa de Neisseria gonorrhoeae resistente à penicilina e apresentou um espectro de inibição de 80 % quando testado frente a cinco cepas de Neisseria gonorrhoeae isoladas recentemente de pacientes clínicos (CÁCERES et al., 1995).
Na Índia, o caule de Manilkara zapota L. é utilizado como antibiótico e seu decocto indicado no tratamento da diarréia. A atividade antibacteriana frente a diferentes cepas de bactérias foi avaliada com extratos aquosos e etanólicos do caule desta espécie. Os extratos etanólicos se mostraram ativos frente à cepas de Staphylococcus aureus, S. epidermidis, S. subflava, Bacillus cereus, B. subtilis, B. megaterium, Micrococcus flavus, Pseudomonas testosteroni, P. aeruginosa, P. pseudoalcaligenes, Proteus vulgaris, P. mirabilis, P. morganii, Alcaligenes faecalis, Enterobacter aerogenes, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Citrobacter freundii enquanto os extratos aquosos apresentaram uma menor atividade (NAIR & CHANDA, 2008).
1.2.1.2 - Atividade antiparasitária
Um estudo realizado com diversas espécies vegetais para avaliação de atividade biológica frente a Leishmania donovani, Trypanosoma brucei brucei, Trichomonas vaginalis e Caenorhabditis elegans indicam que o extrato diclorometânico de Manilkara dissecta var. pancheri (Baillon) Maas foi ativo frente a Leishmania donovani, com uma concentração mínima inibitória de 13,4±1,1 μg / mL (DESRIVOT et al., 2007).
5 A Doença de Chagas é um problema de saúde pública em diversos países latino americanos. Seu tratamento hoje em dia ainda é um desafio, visto que os únicos dois medicamentos aprovados, nifurtimox e benzonidazol, possuem vários efeitos adversos. Em estudo realizado com diversas espécies vegetais latino americanas, o extrato aquoso do caule de Manilkara achras (Mill.) Fosberg [= Manilkara zapota (L.) P. Royen] apresentou um percentual de inibição de 78,8 % do crescimento de epimastigotos de Trypanosoma cruzi quando usado na concentração de 500 μg / mL (MUELAS-SERRANO et al., 2000).
1.2.1.3 - Atividade antioxidante
Nos últimos anos, uma quantidade substancial de evidências tem indicado o papel chave dos radicais livres e outros oxidantes como grandes responsáveis pelo envelhecimento e doenças degenerativas associadas, como câncer, doenças cardiovasculares,
catarata, declínio do sistema imune e disfunções cerebrais. Em função dos possíveis problemas provocados pelo consumo de antioxidantes sintéticos, as pesquisas têm-se voltado no sentido de encontrar produtos naturais com atividade antioxidante (SOUSA et al., 2007).
Em estudo realizado com diversas espécies comestíveis, os frutos de Manilkara zapota foram submetidos a extração exaustiva com metanol, concentrados a vácuo, ressuspendidos em água e posteriormente particionados com hexano e acetato de etila. Em seguida, a fração aquosa foi submetida ao fracionamento em coluna Diaion HP-20SS. A fração H2O:MeOH
obtida foi utilizada para determinação da atividade antioxidante através do ensaio com o radical livre 2,2- difenil-1-picril-hidrazila (DPPH). A quantidade necessária para decrescer a concentração inicial de DPPH em 50% (CE50) foi 50,8 ± 4,5 μg / mL (EIBOND et al., 2004).
Em outro estudo, frutos de M. zapota foram extraídos com metanol e em seguida particionados com hexano e acetato de etila. A fração obtida com acetato de etila apresentou elevada atividade no ensaio do DPPH e a mesma foi submetida ao fracionamento em coluna Sephadex LH-20. Duas novas substâncias derivadas do ácido clorogênico (1) foram isoladas e apresentaram elevada atividade antioxidante, sendo que o 4-O-galoilclorogenato de metila (2) apresentou CE50 = 12,9 μM e o ácido 4-O-galoilclorogênico (3) apresentou CE50 = 23,5 μM, o
que indica uma maior atividade antioxidante em relação a encontrada para o ácido clorogênico comercial CE50 = 39,5 μM) (MA et al., 2003).
6 OH OH O O OH O H COOH O H 1 OH O H OH O OH OH O O OH OR2 OH R1OOC R= R1 = CH3 R2 = R R1 = H R2 = R 1.2.1.4 - Atividade citotóxica
Foram realizados testes com 90.000 plantas terrestres e organismos marinhos para avaliação da atividade frente a linhagens tumorais leucêmicas. O gênero Manilkara não foi considerado entre os mais ativos, visto que apresentou menos de três espécies com atividade citotóxica maior que 50 % frente a linhagens de células tumorais HL60 e K562 (CRAGG et al., 2006).
Os derivados do ácido clorogênico galoilclorogenato de metila (2) e ácido 4-O-galoilclorogênico (3), isolados do fruto de Manilkara zapota, apresentaram atividade citotóxica frente às linhagens celulares de câncer de cólon HCT-116 e SW-480, apresentando respectivamente IC50 = 190 e 160 μM e IC50 = 154 e 135 μM (MA et al., 2003).
2 3
7 1.2.2 - Manilkara subsericea (Mart.) Dubard
Segundo o The Plant List (acessado em 25/07/2011), a espécie Manilkara subsericea (figura 3) apresenta as seguintes sinonímias científicas Mimusops subsericea Mart., Kaukenia floribunda (Mart.) Kuntze, Kaukenia subsericea (Mart.) Kuntze, Manilkara bella Monach., Manilkara floribunda (Mart.) Dubard, Mimusops floribunda Mart., Mimusops subsericea var. acmanthera Miq., Mimusops subsericea var. acuminata Pierre, Mimusops subsericea var. massaranduba Pierre, Synarrhena floribunda (Mart.) Fisch. & C. A. Mey. e Synarrhena subsericea (Mart.) Fisch. & C. A. Mey.
Figura 3. A) Ilustração de Manilkara subsericea (Disponível em
http://www.avidepa.org.br/plantas%20de%20restinga/maca.htm), acesso em: 30/06/2011. B) foto de caule, folhas e frutos coletados no Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba
A espécie Manilkara subsericea possui altura de 4-26 m, é muito lactescente, de copa ampla e ramos novos marrons, glabros ou pubérulos, com tronco ereto e cilíndrico, de 30-60 cm de diâmetro, com casca grossa e rugosa, acizentada, descamando em placas estreitas. Folhas concentradas no ápice dos ramos, com pecíolo de 0,7-2,4 cm, lâmina oblanceolada ou cuneiforme, de ápice obtuso, cuspidado a emarginado e base aguda ou atenuada, coriácea, glabra na face superior e inicialmente com pelos brancos e deitados na inferior, de 5-12 x 2,2-5,5 cm, com 12-16 pares de nervuras secundárias. Flores em número de 3-10 em fascículos axilares e nas axilas de flores já caídas, com pedicelo de 0,7-2,4 cm. Fruto elipsóide ou globoso, de polpa mucilaginosa, com 1-2 sementes achatadas (figura 4) (LORENZI, 2009).
8 Figura 4. Manilkara subsericea (Mart.) Dubard (LORENZI, 2009)
Em estudo realizado recentemente, Gomes e colaboradores (2010) descreveram a biologia floral de Manilkara subsericea. Segundo estes autores, „„Manilkara subsericea tem flores creme-amareladas, com 9,2 mm de diâmetro e 7,3 mm de comprimento. O cálice é dialissépalo (figuras 5b-c), de cor verde claro, bisseriado, com três sépalas internas e três sépalas externas, cuculadas, com tricomas de cor marrom na superfície abaxial e 4,7 mm de comprimento. A corola é gamopétala, com seis pétalas, cada uma delas dividida em três segmentos: um mediano e dois laterais, aqui chamados de lacínios. Os seis lacínios medianos da corola posicionam-se internamente na flor, são eretos, lanceolados, apresentam 4,3 mm de comprimento e têm consistência crassa. Cada lacínio forma uma espécie de canaleta, voltada para o eixo floral, na qual um estame fica alojado sob tensão, constituindo este conjunto, lacínioestame, um dispositivo que tem que ser acionado para ocorrer a liberação explosiva de grãos de pólen. Cada flor apresenta, portanto, seis desses dispositivos (figuras 5d-f). Os 12 lacínios laterais, por sua vez, apresentam cerca de 4,0 mm de comprimento, são
9 membranáceos, cuculados e assumem uma posição externa e deflexa nas flores. Estes lacínios encontram-se posicionados sobre as sépalas – dois lacínios laterais sobre cada sépala – e alternados por um lacínio mediano (figuras 5d-e). O androceu possui seis estames alternados com seis estaminódios, é epipétalo e conato em sua parte basal (figura 5i), contribuindo para a formação de um pequeno tubo floral, com 3,7 mm de comprimento. Cada estame é constituído por um filete branco, com porção livre de 2 mm de comprimento e uma antera amarela, rimosa, versátil, dorsifixa e extrorsa (figuras 5f-h) que, mesmo deiscente, só dispersa seus grãos de pólen quando liberada do lacínio mediano que a envolve. Os estaminódios são petalóides, com ápice bi ou tripartido. Os grãos de pólen medem 38 μm (n = 10), são brancos, secos, apresentam exina pouco esculturada e uma viabilidade de 91% (n = 388 grãos de pólen). O conjunto lacínio-estame constitui um dispositivo semelhante a uma catapulta (figuras 5f-g), que depende de um fator físico para ser acionado, proporcionando a liberação dos grãos de forma explosiva. Quando o polinizador toca neste dispositivo e o impulsiona, o lacínio desloca-se para trás, acionando o dispositivo e ocasionando a explosão de uma nuvem de grãos de pólen. As observações no campo, utilizando-se tanto flores marcadas e disponíveis aos polinizadores quanto flores ensacadas, mostraram que: 1. as anteras, mesmo depois de deiscentes, não liberam os grãos de pólen antes que os dispositivos lacínios-estames sejam acionados; 2. a liberação dos grãos de pólen dá-se concomitantemente com o acionamento dos dispositivos; 3. cada dispositivo pode ser acionado isoladamente pelos polinizadores, de modo que não há simultaneidade na liberação do pólen pelos seis estames de cada flor; 4. a nuvem de grãos de pólen resultante de uma visita pode alcançar botões e flores vizinhas; 5. toda a carga de grãos de pólen é liberada no momento em que o polinizador aciona o dispositivo; 6. as flores não visitadas permanecem com seus seis dispositivos intactos, mas, ao final da antese, flores ensacadas em processo de senescência apresentam dispositivos acionados, independentemente das visitas; 7. em raras ocasiões, na presença de vento forte, pode ocorrer o acionamento dos dispositivos, independente do impulso decorrente de uma visita. O estigma é arredondado, lobulado, diminuto, com aproximadamente 0,36 mm de diâmetro (n = 10), do tipo papiloso e úmido. O canal estilar alcança a superfície estigmática, tem formato estrelar com seis a oito braços (n = 10) e apresenta lúmen pequeno e grande superfície. A epiderme que reveste o canal estilar é unisseriada e secretora, proporcionando um tecido de transmissão do tipo superficial. O exame de seções transversais do estigma e do estilete revela que o número de braços, seis a
10 oito, da superfície estigmática receptiva e do canal estilar é equivalente ao número de lóculos do ovário. O estilete tem cor esverdeada, possui 3,6 mm de comprimento (n = 10) e é persistente nos frutos. O ovário é súpero, com 2 mm de comprimento, com seis a oito lóculos e um óvulo por lóculo (figura 5k). O nectário tem formato anelar e localiza-se na base do ovário(figura 5j)”.
Figura 5. Desenho botânico de Manilkara subsericea. a. Ramo. b. Botão. c. Flor na fase feminina, com estilete exteriorizado. d. Flor na fase hermafrodita. e. Flor na fase hermafrodita com lacínios laterais (ll) deflexos e lacínios medianos (lm) com as anteras, notar a hercogamia. f-g. Acionamento do dispositivo lacínio-estame. h. Estame. i. Androceu. j. Gineceu. k. Ovário (corte transversal). (GOMES et al., 2010)
11 Esta espécie é popularmente conhecida como “guracica” e ocorre naturalmente na floresta pluvial atlântica de restinga (SANTOS et al., 2009), apresentando grande abundância e ampla distribuição no Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba (MONTEIRO et al., 2007). Foi possível observar que neste local a espécie Manilkara subsericea se apresenta sob forma de arbustos (figura 6), contrariando sua descrição arbórea (LORENZI, 2009). As condições rígidas do habitat de restinga podem explicar este menor desenvolvimento da espécie neste local. Seu período de frutificação é anual e regular, ocorrendo durante a estação com maior pluviosidade e temperaturas mais elevadas (GOMES et al., 2008).
Até o momento não foram realizados estudos biológicos e fitoquímicos referentes a esta espécie.
Figura 6. Manilkara subsericea situada no Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba (Fonte: próprio autor)
12 1.3 - Triterpenos
Os terpenóides compreendem o maior grupo de substâncias de origem natural, possuindo mais de 35000 moléculas conhecidas (DEWICK, 2009) derivadas de unidades do isopreno (4).
4
Alguns substâncias desta classe, como o geraniol (C10), farnesol (C15) e
geranilgeraniol (C20) são formadas através de um encadeamento denominado cabeça-cauda de
unidades isoprênicas (figura 7). As unidades bioquimicamente ativas do isopreno foram identificadas como os ésteres pirofosfato de dimetilalila (DMAPP) e o pirofosfato de isopentenila (IPP) (figura 8) (MISAWA, 2011).No caso do esqualeno (C30) e do fitoeno (C40)
as unidades isoprênicas se unem em uma formação cauda-cauda, unidas no centro das moléculas (figura 9).
13 OPP OPP (DMAPP) (C5) (IPP) (C5) C10 Monoterpenos (C10) C15 C20 C25 Sesquiterpenos (C15) Diterpenos (C20) Sesterterpenos (C25) C30 Triterpenos (C30) C40 Tetraterpenos (C40) Hemiterpenos (C5) IPP IPP IPP (C18 - C30) 2x 2x Iridóides Carotenóides Esteróides
14 Figura 9. Esquema de formação de terpenóides por encadeamento cabeça-cauda e
cauda-cauda (adaptado de DEWICK, 2009)
Os triterpenóides compreendem um grupo de substâncias de origem natural derivados predominantemente do esqualeno, um precursor acíclico com 30 átomos de carbono. Este grande grupo de produtos naturais reúne cerca de 100 esqueletos químicos distintos. Durante o processo bioquímico de formação dessas substâncias podem ocorrer diversas ciclizações, gerando moléculas complexas como os triterpenos tetracíclicos e pentacíclicos (XU et al., 2004).
Sob uma perspectiva biológica, normalmente as estruturas triterpênicas mais importantes tem como base os esqueletos oleano (5), ursano (6), lupano (7) e damarano (8). Estas estruturas policíclicas podem ocorrer como unidades triterpênicas livres ou na forma
15 glicosilada. Dentre as diversas atividades biológicas relatadas para triterpenos, podemos citar os efeitos antiinflamatórios, hepatoprotetores, analgésicos, antimicrobianos, antimicóticos, imunomodulatórios e tônicos (MUFFLER et al., 2011).
5 6
16 2 – OBJETIVO
2.1 – Objetivo geral
O objetivo deste trabalho é avaliar o potencial biotecnológico da espécie Manilkara subsericea (Mart.) Dubard, através da realização de testes de atividade biológica e do isolamento de suas subtâncias ativas, valorizando o potencial das espécies nativas do Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba.
2.2 Objetivos específicos
Efetuar a extração de folhas, caules e frutos de M. subsericea e particionar os extratos obtidos de caules e frutos com solventes de polaridade crescente.;
Efetuar testes para avaliar as atividades antibacteriana, anticolinesterásica e inseticida dos extratos e partições obtidos;
Realizar o isolamento bioguiado das substâncias responsáveis pela atividade apresentada nos ensaios de atividade anticolinesterásica e inseticida;
Elucidar as estruturas das substâncias isoladas e obter o perfil cromatográfico da partição hexânica de frutos por CG-EM
17 3 – MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 - Material Vegetal
Folhas, caules e frutos de M. subsericea foram coletados na Restinga de Jurubatiba, RJ, Brasil em janeiro de 2009. As coletas foram realizadas de acordo com a autorização 13659-2 do IBAMA/SISBIO para atividades com finalidade científica. A identificação da espécie foi realizada pelo botânico Marcelo Guerra Santos, professor adjunto da Universidade do Estado do Rio de Janeiro. A herborização do material vegetal foi realizada e a exsicata (figura 10) depositada no Herbário da Faculdade de Formação de Professores da Universidade do Estado do Rio de Janeiro (RFFP 13.416).
Figura 10. Exsicata de M. subsericea coletada na Restinga de Jurubatiba, RJ, Brasil em janeiro de 2009
18 3.2 – Solventes
Os solventes utilizados na preparação de reagentes, soluções, extração, partições e métodos cromatográficos apresentaram grau de análise (P.A.) e foram obtidos do fabricante VETEC® (RJ, Brasil).
Água destilada foi utilizada para a realização dos métodos cromatográficos ou demais procedimentos.
3.3 - Extratos e partições
Os frutos frescos (1.136 kg) foram triturados em turbilhonador e extraídos pela técnica de maceração em etanol 96 % (v/v) até completo esgotamento. Após este período o extrato obtido foi filtrado e concentrado em evaporador rotatório (Fisatom), obtendo-se o extrato etanólico dos frutos (170 g). Este extrato foi ressuspendido em etanol 90º (v/v) e particionado até completo esgotamento com hexano, obtendo o extrato hexânico de frutos (FH). Em seguida a fração hidroalcoólica foi evaporada até a secura, ressuspendida em água e posteriormente particionada até completo esgotamento com solventes de polaridade crescente (diclorometano, acetato de etila e butanol), fornecendo os seguintes extratos de frutos: diclorometânico (FD), acetato de etila (FAE) e butanólico (FB).
Folhas (1,94kg) e caules (0,96 kg) foram submetidos a processo de secagem em estufa com ventilação forçada (QUIMIS), com temperatura de aproximadamente 35°C pelo período de 2 dias e posteriormente moídos separadamente em moinho de facas e em seguida submetidos à extração por maceração em etanol 96 % (v/v) até completo esgotamento. Após este período, cada extrato obtido foi filtrado e concentrado em evaporador rotatório (Fisatom), obtendo-se o extrato etanólico de folhas (FE) (611,4g) e o extrato etanólico de caules (CE) (169,3g). Em seguida, o extrato bruto de caules foi ressuspendido em etanol 90º (v/v) e particionado até completo esgotamento com de hexano, obtendo-se o extrato hexânico de caules (CH). Posteriormente, a fração hidroalcoólica foi evaporada até a secura, ressuspendida em água e particionada até completo esgotamento com solventes de polaridade crescente( diclorometano, acetato de etila e butanol), fornecendo os seguintes extratos de caules: diclorometânico (CD), acetato de etila (CAE) e butanólico (CB). O esquema de partições e rendimentos de frutos e caules encontra-se ilustrado na figura 11.
19 Figura 11. Esquema de partição dos extratos etanólicos de frutos e caules (mfrutos / mcaules g)
de M. subsericea.
3.4 – Ensaios fitoquímicos
3.4.1 – Cromatografia em Camada Fina (CCF)
Escala analítica
Para a realização dos ensaios cromatográficos qualitativos, utilizou-se gel de Sílica G 60 de fase normal em cromatofolhas de alumínio ALUGRAM® SIL G/UV254 20 x 20 com
0,20 mm de espessura.
Escala preparativa
Para isolamento por cromatografia em camada fina, foi necessária a prévia preparação das placas cromatográficas. Para obtenção de quatro placas cromatográficas, foi preparada uma suspensão homogênea contendo 200 g de sílica gel 60 PF254 (Merck, Alemanha) e 520
20 vertida sobre placas de vidro com tamanho de 20 x 20 cm previamente lavadas e secas. Após 24h, as placas foram colocadas em estufa (100 ºC) para ativação.
3.4.2 – Reveladores
Solução de anisaldeído sulfúrico – solução de 0,5 mL de p-anisaldeído, 98% (Aldrich Chemical Company, Inc, Milwaukee, USA) em 10 mL de ácido acético glacial, seguida da adição de 85 mL de metanol e 5 mL de ácido sulfúrico concentrado (WAGNER & BLADT, 1996).
Solução de ácido sulfurico a 10 % em etanol (v/v) (WAGNER & BLADT, 1996).
3.4.3 – Fracionamento do extrato hexânico de frutos
O isolamento das substâncias do extrato hexânico de frutos (8,2 g) de M. subsericea foi realizado através de cromatografia de adsorção em coluna de vidro contendo gel de sílica 60 com partículas de 0,063-0,2 mm de diâmetro de fase normal como fase estacionária (VETEC®, RJ, Brasil) com fluxo contínuo e controlado. O extrato a ser fracionado foi dissolvido em quantidade mínima possível de diclorometano e em seguida adicionado de quantidade suficiente do adsorvente SiO2. A suspensão obtida foi levada para o evaporador
rotatório e o material resultante foi aplicado sob a forma de pastilha na parte superior da coluna de vidro, previamente empacotada com suspensão homogênea de sílica gel 60 em hexano. As amostras foram eluídas em um sistema gradiente com polaridade crescente, utilizando-se hexano, hexano:acetato de etila, acetato de etila, acetato de etila:metanol e metanol.
O fracionamento do extrato hexânico forneceu 2 frações principais: FH1 (n-hexano:acetato de etila, 98:2, v/v) e FH2 (n-(n-hexano:acetato de etila 90:10, v/v) (figura 12).
21 Figura 12. Fracionamento do extrato hexânico resultante da partição do extrato etanólico de frutos
A fração FH1 (0,460g) foi submetida a purificação por cromatografia em camada fina em escala preparativa (item 3.4.1) utilizando-se tolueno como eluente. Através desta técnica, foi possível observar duas manchas principais, que foram raspadas e extraídas com metanol. Após a evaporação, foram obtidos 460 mg de um sólido branco amorfo, denominado FH1X e 22 mg de um sólido branco amorfo, denominado FH1Y.
A fração FH2 (27mg) obtida do fracionamento do extrato hexânico foi submetida a lavagem com hexano e acetona, resultando após processo de centrifugação 13 mg de um sólido branco amorfo purificado, denominado FH2P.
3.5 – Elucidação estrutural
3.5.1 - Cromatografia Gasosa acoplada à Espectrometria de Massas (CG-EM)
Os cromatogramas e espectros de massas do extrato hexânico de frutos e de produtos do seu fracionamento foram obtidos em cromatógrafo gasoso acoplado à espectrômetro de
Extrato hexânico 8,2g FH1 (25-37) 1,23g FH2 (51-56) 0,027g FH1X 0,460g FH1Y 0,022g FH2P 0,013g
22 massas (GCMS-QP5000,SHIMADZU) equipado com detector por impacto de elétrons. As amostras foram solubilizadas na concentração de 1 µg/mL em clorofórmio e 1 µL desta solução foi injetado em coluna ZB-5MS (30m x 0,25 mm x 0,25 µm). As condições de análise foram: hélio como gás de arraste; fluxo com taxa de 1mL/min; injeção de split com taxa de 1:50; temperatura do injetor, 270°C; temperatura inicial da amostra 60ºC e final 290 ºC, com taxa de variação de 10º/min. As condições da EM foram: voltagem de ionização de 70eV e taxa de varredura 1 scan/s.
3.5.2 – Espectro de Ressonância Magnética Nuclear
Os espectros de RMN 1H e RMN 13C foram obtidos no equipamento Varian VNMRS com freqüência de 300 e 500 MHz 1H e 75 e 125 MHz para 13C. O solvente deuterado para obtenção dos espectros de RMN (CDCl3) foi obtido da Cambridge Isotope Laboratories
(USA). Os deslocamentos químicos (δ) foram expressos em partes por milhão (ppm). A edição dos espectros foi realizada utilizando-se os programas SpinWorks 3.1.5.0 (University of Manitoba, 2009) e MestReNova 6.0.2- 5475 (Mestrelab Research S.L., 2009)
3.6 - Atividade antibacteriana
Microrganismos
Cepas de referência da American Type Culture Collection (ATCC) foram utilizadas durante o estudo. Os microrganismos utilizados foram: Staphylococcus aureus ATCC 25923 e Escherichia coli ATCC 25922.
Preparação da suspensão bacteriana
As cepas bacterianas foram semeadas em placas de Petri contendo meio TSA (Difco). Os inóculos foram prepadados a partir da suspensão direta das colônias em solução salina, com 18-24h de crescimento e ajustados a escala 0,5 de Mc Farland (1-2 x 107-8 UFC/mL) (CLSI, 2002).
23 3.6.1 - Método de difusão em disco
A análise qualitativa da atividade antibacteriana de Manilkara subsericea foi realizada seguindo os padrões internacionais (CLSI, 2006). Discos de papel de filtro Whatmann (n°3) foram impregnados com soluções dos extratos em uma concentração de 100 mg/mL. Após a evaporação total do solvente, os discos foram aplicados de maneira asséptica em placa de Petri contendo 20 mL de ágar Mueller-Hinton (MHA, Difco) inoculadas de maneira confluente com os microrganismos em análise. Em seguida, as placas foram incubadas a 37ºC por 24h. Foram usados como controle positivo do teste, discos de vancomicina (30µg) para Staphylococcus aureus ATCC25923 e ampicilina (30µg) para Escherichia coli ATCC36298. Os testes foram realizados em duplicata. A leitura foi realizada com a medição do diâmetro dos halos de inibição de crescimento.
3.6.2 - Concentração Mínima Inibitória (CMI)
A metodologia do teste de sensibilidade antimicrobiana por microdiluição em caldo foi realizada segundo recomendações do CLSI (2002). Em um tubo de 16x160 mm contendo 10 mL de caldo Mueller-Hilton, a cepa em questão foi inoculada e incubada a 37 °C durante 24 h. Após a incubação, a suspensão bacteriana foi ajustada de modo a se obter uma concentração final de 105 UFC/mL.
Em uma microplaca estéril de 96 orifícios ou poços, foram depositados 100 µL de caldo Muller Hinton, Na coluna 1 foram acrescentados 100 µL de cada extrato, de concentração conhecida (um extrato diferente para cada linha). A partir deste orifício foram feitas diluições sucessivas, rejeitando-se no final 100 µL da mistura, com o intuito de se obter as concentrações finais: 500, 250, 125, 64 e 32µg/mL. A seguir, 100 µL da cepa bacteriana foi acrescentada nos orifícios e a placa foi incubada a 37 °C por 24 h. Após este período foram acrescentados 50 µL de uma solução aquosa de TTC (cloreto de trifenil tetrazolium) à 2,5%, e a placa re-incubada por 3 horas na referida temperatura. A CMI foi definida como a menor concentração capaz de impedir o crescimento bacteriano, ou seja, impedir o aparecimento da coloração vermelha.
O controle negativo do experimento foi feito com meio de cultura inoculado com bactéria e solução salina e meio de cultura inoculado com bactéria e dimetilsulfóxido
24 (DMSO). Já o controle positivo foi feito com vancomicina nas concentrações de 10; 5; 2,5; 1,2 e 0,6µg/mL.
3.7. – Atividade anticolinesterásica
3.7.1 – Teste de Bioautografia
O ensaio para a identificação de inibidores da acetilcolinesterase foi realizado segundo o método qualitativo descrito por Marston e colaboradores (2002) utilizando-se a técnica de cromatografia em camada fina (CCF), com modificações. Neste ensaio 100 µg da partição hexânica de frutos e 100-6,25 µg das substâncias isoladas foram aplicados em placas cromatográficas (ALUGRAM® SIL G/UV254). Como controle positivo do ensaio, foi aplicado
1 µL de uma solução padrão de fisostigmina (5mM, Sigma) em metanol. Depois da evaporação do solvente, foi aplicada uma solução (6,67 U/mL) de acetilcolinesterase de peixe elétrico tipo VI-S (Sigma, C3389-2KU), contendo 0,0083% de albumina sérica bovina fração V (Sigma, A4503), diluída em tampão fosfato 0,1 M, pH=7,5. Em seguida, a placa foi incubada em estufa com ambiente úmido a 37 ºC por 20 min. Posteriormente, borrifou-se uma solução contendo 12,5 mg de acetato de α-naftila (Sigma) em 5 mL de etanol e 50 mg do sal Fast Blue B (Sigma) em 20 mL de água, preparadas e misturadas na hora. O substrato enzimático, acetato de α-naftila, sofre hidrólise catalizada pela enzima formando como produto o α-naftol, que reage com o agente colorimétrico, sal Fast Blue B, formando uma substâncias azólica de coloração roxa. A ausência de coloração roxa indica a presença de inibidor da enzima acetilcolinesterase (figura 13).
25 O O OH O OH O O N+ N N+ N n OH N N O O N N OH +
Sal Fast Blue B
Substância azólica (roxa) Acetato de alfa-naftila alfa-naftol
Figura 13. Reação colorimétrica de formação da substância azólica (roxa) que ocorre no ensaio anticolinesterásico qualitativo
3.8 – Avaliação da atividade inseticida
Os ensaios para avaliação de atividade inseticida foram realizados em colaboração com a Prof. Maria Denise Feder do Laboratório de Biologia de Insetos do GBG/UFF.
3.8.1 - Colônias
As colônias de Oncopeltus fasciatus e Dysdercus peruvianus foram mantidas em cubas de vidro fosco (de aproximadamente 19 cm de profundidade por 17 cm de diâmetro) em uma temperatura média entre 20-23 ºC para D. peruvianus (MILANO et al., 1999) e 19-30 ºC para O. fasciatus (FEIR, 1974), umidade relativa de 70-75% e ciclos de 16h (dia) e 8h (noite).
26 A abertura da cuba deve estar tampada com um pano (filó) para entrada de ar e os insetos tinham livre acesso a água. O. fasciatus e D. peruvianus foram, respectivamente, alimentados com sementes de girassol e sementes de algodão.
Dentro das cubas, foram utilizados dois pedaços de papel filtro: um cortado em circulo para ser depositado no fundo e outro retangular e sanfonado, depositado verticalmente, para aumentar a área de movimentação dos insetos. Um bebedouro ficava pendurado por um arame preso no topo da cuba, a fim de evitar vazamento no fundo da mesma. Placas de petri eram colocadas no fundo, contendo gazes ou algodão, para que os insetos realizassem as posturas.
3.8.2 - Bioensaio
Os extratos e partições avaliados foram solubilizados na concentração de 100 mg/mL e frações obtidas foram solubilizadas na concentração de 20 mg/mL, utilizando-se etanol como solvente.
Os testes foram realizados através de tratamento tópico, conforme descrito por Raguraman & Singh (1998). Ninfas do 4º estágio foram separadas em grupos de 20 indivíduos e após aplicação das amostras, foram colocadas em frascos pequenos de aproximadamente 7 cm de profundidade por 5 cm de diâmetro. Em seguida, iniciou-se a contagem diária, acompanhando o desenvolvimento dos insetos até atingirem o estágio adulto, copularem, depositarem os ovos e estes eclodirem, o que levou em média 30 dias. O controle negativo foi efetuado com aplicação de 1µL de etanol no dorso dos insetos, submetidos às mesmas condições do grupo experimental.
A significância dos resultados foi analisada utilizando-se programa ANOVA e teste de Turkey utilizando-se o programa Stats Direct Statistical Software, versão 2.2.7 (Windows 98). As diferenças entre os grupos testados e controle foram considerados estatisticamente sem significância para p>0,05. Todos os experimentos foram feitos em triplicata.
27 4 – RESULTADOS E DISCUSSÂO
4.1 - Análise química dos extratos e frações obtidas 4.1.1 - Cromatografia em camada fina
O extrato etanólico de folhas e os extratos hexânico e diclorometânico resultantes das partições efetuadas nos extratos etanólicos de caules e frutos foram avaliados utilizando técnica de cromatografia em cama fina (CCF) (figura 14). As amostras foram eluídas em tolueno e reveladas com solução de anisaldeído sulfúrico e apresentaram padrão cromatográfico bem similar, com coloração característica para terpenóides.
Figura 14. Cromatografia em camada fina de extratos e fração obtida de M. subsericea. FE (extrato etanólico de folhas); CD (extrato diclorometânico de caules); CH (extrato hexânico de caules); FD (extrato diclorometânico de frutos); FH (extrato hexânico de frutos); FH1X (fração obtida de FH). Fase estacionária silica gel ALUGRAM® SIL G/UV254 TLC (MACHEREY – NAGEL).Eluente: tolueno, revelador: anisaldeído sulfúrico.
FE CD CH FD FH FH1X Rf 1
28 O fracionamento do extrato hexânico de frutos forneceu uma fração denominada FH1 (n-hexano:acetato de etila, 98:2, v/v). Após o procedimento de purificação por cromatografia em camada fina (escala preparativa) as frações FH1X e FH1Y obtidas foram solubilizadas em diclorometano e submetidas a nova análise por cromatografia em camada fina utilizando-se relevador universal (ácido sulfúrico a 10% em etanol, v/v). Foi possível observar que a fração FH1X (Rf 0,43) estava aparentemente pura e a que a fração FH1Y apresentava duas manchas
em Rf 0,59 e 0,63 (Figura 15).
Figura 15. Cromatografia em camada fina das frações FH1X e FH1Y obtidas do extrato hexânico de frutos de M. subsericea. Fase estacionária: silica gel ALUGRAM® SIL G/UV254 TLC (MACHEREY – NAGEL).Eluente: tolueno, revelador: ácido sulfúrico 10% em etanol, v/v.
A fração FH1X (Rf 0,43, tolueno) foi avaliada em conjunto com os extratos e a
comparação do fator de retenção sugere uma ampla distribuição nos órgãos analisados e a revelação positiva com anisaldeído sulfúrico sugere seu caráter terpênico.(figura 14)
FH1Y FH1X
Rf 1
29 O fracionamento da partição hexânica de frutos também forneceu uma fração denominada FH2 (n-hexano:acetato de etila 90:10, v/v). Esta fração foi sucessivamente centrifugada com hexano e acetona, fornecendo um material branco amorfo (FH2P), pouco solúvel em diclorometano e solúvel em metanol. Este sólido foi então solubilizado em metanol e submetido a análise cromatográfica em camada fina (CCF). Após eluição com Hexano:Acetato de Etila (1:1), a placa foi revelada com anisaldeído sulfúrico e foi possível observar o surgimento de uma mancha de coloração rosa em Rf = 0,5 (figura 16), sugerindo se tratar de terpenóide. Uma nova placa foi preparada sob as mesmas condições descritas anteriormente, revelada com solução de ácido sulfúrico 10% em etanol (v/v) e aquecida. Não houve surgimento de manchas com Rf distinto do observado anteriormente.
Figura 16. Cromatografia em cama fina da fração FH2P obtida do extrato hexânico de frutos de M. subsericea. Fase estacionaria: silica gel ALUGRAM® SIL G/UV254 TLC (MACHEREY – NAGEL). Eluente: hexano:acetato de etila (1:1), revelador: anisaldeido sulfúrico
Rf 1
Rf 0
30 4.2 - Elucidação estrutural
4.2.1 - Cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas 4.2.1.1 - Análise do extrato hexânico
A análise do cromatograma do extrato hexânico resultante da partição efetuda no extrato etanólico de frutos de M. subsericea (figura 17) indicou que 20 substâncias eluíram e as substâncias com tempo de retenção (min) 34,63 (10,27%) e 36,15 (42,34%) foram as majoritárias. Essas duas substâncias totalizaram 52,61 % da composição relativa do extrato hexânico analisado.
Figura 17. Cromatograma obtido por CG-EM do extrato hexânico (FH) resultante da partição efetuda no extrato etanólico de frutos de M. subsericea. Aparelho GCMS-QP5000 (SHIMADZU); coluna ZB-5MS (30m x 0,25 mm x 0,25 µm); gás de arraste: hélio; fluxo de 1mL/min; injeção de split 1:50; temperatura do injetor: 270°C; temperatura inicial da amostra 60ºC e final 290 ºC; taxa de variação de 10º/min. Condições da EM: voltagem de ionização de 70eV e taxa de varredura 1 scan/s.
A comparação dos espectros de massas correspondentes aos tempos de retenção 16,84; 16,99; 18,71 e 18,94 com a base de dados da biblioteca NIST (National Institute os Standards and Technology), sugeriu a presença de ácidos graxos com alto índice de similaridade. Desta forma, foi possível identificar as seguintes substâncias presentes no extrato hexânico de frutos de M. subsericea: Ácido hexadecanóico (9), Hexadecanoato de etila (10), (E)-9-octadecenoato
31 de etila (11) e octadecanoato de etila (12). Os tempos de retenção correspondentes, pesos moleculares e a abundância relativa destes ácidos graxos encontram-se listados na tabela 1.
Tabela 1. Ácidos graxos e ésteres presentes no extrato hexânico resultante da partição efetuda no extrato etanólico de frutos de M. subsericea
Ácido graxo / Éster
Tempo de retenção
(min)
Peso molecular Abundância relativa (%) Ácido hexadecanóico (9) 16,84 256 5,41 Hexadecanoato de etila (10) 16,99 284 3,57 (E)-9-octadecenoato de etila (11) 18,71 310 3,95 Octadecanoato de etila (12) 18,94 312 1,45 OH O 9 O O 10 O O 11 O O 12
32 Os espectros de massas das substâncias correspondentes aos tempos de retenção 34,63 e 36,15 min foram bastante similares, diferindo basicamente na intensidade dos sinais. Foram observados sinais típicos de substâncias com esqueleto olean-12-eno (13) e ursan-12-eno (14) em m/z 218; 203 e 189.
13 14
. O padrão de fragmentação característico para triterpenos pentacíclicos que possuem ligação dupla na posição C-12, incluindo aqueles do tipo β-amirina (15) e α-amirina (16), ocorre via uma reação Retro-Diels-Alder. Uma diferença significativa nos espectros das duas substâncias foi a intensidade do pico em m/z 203, que encontra-se mais intenso para substâncias do tipo β-amirina em relação a substâncias do tipo α-amirina (ZANON et al, 2008). O H O H 15 16
33 Ambos os espectros apresentaram picos em m/z 468, correspondentes aos íons moleculares dos dois isômeros, e a comparação com a base de dados NIST indicou alto grau de similaridade para acetatos de amirina. Foi possível então sugerir que as substâncias com tempos de retenção 34,63 e 36,15 min são respectivamente, acetato de beta amirina (17) e acetato e alfa amirina (18).
O O O
O
17 18
As substâncias com tempos de retenção 53,31/56,55 min e 71,70/76,99 min apresentaram padrões de fragmentação característicos para pares de isômeros do tipo beta/alfa-amirina. Os sinais característicos para triterpenos do tipo amirina m/z 218; 203 e 189 foram visualizados, porém, a ausência do pico do íon molecular e o baixo percentual de similaridade das substâncias propostas pelo banco de dados NIST, não permitiram a elucidação de tais estruturas neste momento. Entretanto, foi observada a diferença característica na intensidade relativa do sinal em m/z 203 em ambos os pares, indicando que as substâncias com tempos de retenção 53,31 e 71,70 min possuem estrutura de derivados da beta-amirina e que as substâncias com tempos de retenção 56,65 e 76,99 min possuem estrutura de derivados da alfa-amirina.
A análise dos espectros de massas das substâncias presentes no extrato hexânico resultante da partição efetuda no extrato etanólico de frutos de M. subsericea, permitiu identificar estruturas fundamentais de triterpenos do tipo beta- e alfa- amirina. Estas substâncias totalizaram 72,81% da composição relativa deste extrato, sugerindo que ele pode ser utilizado como uma fonte rica de triterpenos do tipo amirina.
34 4.2.1.2 - Análise de FH1X
A análise de CG-EM indicou que a amostra FH1X obtida do extrato hexânico resultante da partição efetuda no extrato etanólico de frutos de M. subsericea é constituída por uma mistura de duas substâncias com tempo de retenção de 37,10 min (A) e 38,33 min (B) e com as respectivas proporções relativas de 76,3 % e 23,7 %. (figura 18).
Figura 18. Cromatograma obtido por CG-EM da fração FH1X obtida do extrato hexânico (FH) resultante da partição efetuda no extrato etanólico de frutos de M. subsericea. Aparelho GCMS-QP5000 (SHIMADZU); coluna ZB-5MS (30m x 0,25 mm x 0,25 µm); gás de arraste: hélio; fluxo de 1mL/min; injeção de split 1:50; temperatura do injetor: 270°C; temperatura inicial da amostra 60ºC e final 290 ºC; taxa de variação de 10º/min. Condições da EM: voltagem de ionização de 70eV e taxa de varredura 1 scan/s.
O espectro de massas de ambas as substâncias apresentou o sinal do íon molecular em m/z 468 e um pico em m/z 453, correspondente a perda de ácido acético. Também foi observada uma maior intensidade do pico em m/z 203 para a substância correspondente ao tempo de retenção de 37,10, típico para substâncias do tipo β-amirina, que apresentam este sinal mais intenso em relação à substâncias do tipo α-amirina (ZANON et al., 2008) (figura 19).
