Universidade de São Paulo – USP
Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto – FFCLRP Departamento de Química
Bioquímica Industrial Experimental
Prática 11: Eletroforese em Gel de Agarose
Discentes
Ana Lívia Vezzoso N° USP: 10392118
Larissa Beitum N° USP: 10408278 Maisa Mitiko Nº USP: 10293494
Ribeirão Preto 2020
I. Introdução
A eletroforese em gel é uma técnica utilizada para a separação de moléculas de proteínas, RNA e DNA de acordo com seu tamanho, onde as amostras de DNA são carregadas nas cavidades (ou poços) que estão localizados em uma das extremidades de um gel, nesse caso o de agarose (utilizado para fragmentos entre 100pb a 12mil pares de bases), e uma corrente elétrica é aplicada para que ocorra o avanço da mesma pelo gel.
Esses fragmentos de DNA estão carregados negativamente, movendo-se na direção do eletrodo carregado positivamente. Além disso, esses fragmentos tem a mesma quantidade de carga por massa, sendo assim, os menores atravessam o gel mais rapidamente do que os maiores.
A velocidade com que as moléculas migram assim como o poder de resolução de um gel, depende de alguns parâmetros, como o tamanho e forma da molécula, voltagem aplicada, concentração do gel e tampão de corrida.
Quando se utiliza um corante para pigmentação do gel, ele se liga ao DNA, os quais podem ser vistos como bandas, onde cada uma representa um grupo de fragmentos de DNA de mesmo tamanho.
II. Objetivos
Esse experimento tem por objetivo visualizar o resultado da PCR realizada no experimento anterior em gel de agarose 1%.
III. Materiais e métodos
❖ Materiais por grupo: ✓ Placa molde
✓ Pipeta automática P1000 (1)
✓ Pipeta automática P200 ou P100 (1) ✓ Pipeta automática P10 (1)
✓ Ponteiras P1000, P200 e P10 autoclavadas ✓ Descarte para ponteiras (1)
❖ Materiais de uso geral:
✓ Cuba e demais acessórios para eletroforese horizontal ✓ Fonte para eletroforese
✓ Transluminador com luz UV
❖ Reagentes:
✓ Tampão TAE 50X o Triz-Base
o Ácido acético glacial
o Ácido etileno diamino tetracético (EDTA)
✓ Corante para DNA (nesta aula será utilizado o GelRedTM) ✓ Marcador de peso molecular de 1 Kb
✓ Tampão da amostra 6X (loading buffer) o 60mM EDTA
o 10mM Tris-HCl, pH 7.6
o Azul de bromofenol 0,25% (m/v) o Xileno cianol 0,25% (m/v)
❖ Métodos
• Preparo do gel e do equipamento: ➢ Solução tampão:
- Manter pH estável (H+ e OH- podem influenciar na carga líquida da molécula);
- Maior força iônica (carrega mais corrente que a água);
- Tris-Acetato e EDTA-TAE (melhor resolução para fragmentos maiores).
➢ Gel-Loading Buffer: utilizado para aumentar a densidade e a cor da amostra.
• Preparo do gel de agarose
➢ Mediu-se previamente o volume para aplicação do gel na placa molde, preparando uma quantidade suficiente para preenche-la. ➢ Fez-se uma solução 1% de agarose, em tampão TBE 1X em um
erlenmeyer, levando ao forno micro-ondas (potência média), por 1 minuto para derretimento do gel, agitando e repetindo o processo até dissolução completa do gel.
➢ Após esfriar um pouco, adicionou-se o corante de DNA (nesse caso, gel Red) despejando na placa molde, evitando a polimerização no frasco, em seguida adicionando o pente para a formação das canaletas.
➢ Aguardou-se a polimerização, para retirada do pente e introdução do gel na cuba. Adicionando tampão TBE 1X na cuba até cobrir todo o gel.
➢ Programou-se a fonte com a voltagem desejada, entre 1 a 5 V/cm, utilizando voltagem de 80 V.
➢ Adicionou-se 5 µL do tampão da amostra (loading buffer 6X) na reação de PCR, o qual é um marcador azul para visualização da corrida da amostra no gel (o azul de bromofenol migra juntamente com um fragmento de DNA de aproximadamente com 0,3kb e o xileno cianol com um fragmento de 4 kb em géis de agarose de 0,5 a 1,4% em TA).
➢ Aplicou-se 15 µL da reação de PCR com o loading buffer em uma canaleta do gel. Aplicando em seguida 5 µL do marcador de peso molecular em outra canaleta (1 Kb DNA ladder).
➢ Ligou-se a cuba deixando correr até o primeiro tampão sair do gel, realizando a eletroforese das amostras durante 45 min a 120V. ➢ Desligou-se a cuba e transferiu-se o gel para um transluminador
IV. Resultados e Discussões
Os experimentos da segunda parte da disciplina se encerram neste último estudo sobre o processo de eletroforese em gel de agarose. Considerando a linha traçada até este momento, tivemos o preparo de uma célula competente (E. coli), a sua transformação com o plasmídeo contendo o inserto desejado, a extração e purificação do mesmo, seguindo para o processo de PCR, e por fim, a última análise através da eletroforese.
O processo em si e seus passos a serem seguidos já foram abordados nos itens I e III, respectivamente. Portanto nossa discussão se concentrará apenas na análise de um exemplo disponibilizado, mais uma vez, pela docente responsável.
Quando pensamos na eletroforese em si sabemos que ela é uma técnica usada para separar os fragmentos de DNA (ou ainda RNA e proteínas). Seguindo então a linha traçada nos últimos experimentos, simulamos agora que após o processo de PCR nosso objetivo é analisar se o resultado é positivo e conseguimos, portanto, ampliar o gene de interesse.
O gene de interesse da nossa simulação será o fragmento disponibilizado pela docente.
Observando o fragmento de interesse em vermelho, sabemos que o mesmo apresenta juntamente com os primers reverse e forward um total de 1369 pares de base. Portanto após o processo de eletroforese esperamos que a revelação do gel nos mostre a presença de fragmentos de DNA nesta faixa, garantindo assim que a nossa ampliação foi bem sucedida e nas nossas amostras estão presentes o gene de interesse amplificado.
Figura 2 - Revelação do gel da eletroforese corados com GelRed e brometo de etídeo (Imagem disponibilizada no encontro on-line)
Conforme podemos observar na figura acima, o resultado obtido pela eletroforese em gel corado com GelRed (gel da esquerda) apresenta bandas entre os valores de 1000 e 1500 pares de base, sabendo-se que o nosso gene de interesse contem 1369 pares de base como já mencionado, podemos apontar sua presença na amostra, visto que podemos estimar através da revelação do gel a presença de segmentos com aproximadamente esse tamanho.
Portanto o resultado deste experimento se mostra satisfatório, comprovando a presença do nosso gene de interesse através da medida de tamanho do segmento, o que nos leva a avaliar também o processo de PCR anterior como bem sucedido, que é o que queríamos comprovar através da técnica de eletroforese.
V. Questões
(Questão 1) Escreva a sequência do primer reverse do exemplo fornecido. R: O fragmento para exemplo fornecido se encontra na figura 1, no item “IV – Resultados e Discussões”. O fragmento em questão apresenta a sequência direta do primer forward e do inserto de interesse. Já para a sequência do primer reverse, é necessário se fazer a relação com a sequência complementar, assim, temos que a sequência desejada é:
GCCCGGG CAGCTGACGT CTCCGGACGT ACGTT
TTGCA TGCAGGCCTC TGCAGTCGAC GGGCCCG
5’ → 3’
(Questão 2) Por que foi feita a PCR? O que é o produto da PCR?
R: A PCR permite a amplificação de cópias de um segmento de DNA em várias ordens de grandeza (milhões ou até bilhões). Também, a partir de uma clonagem de DNA, em que ocorre a tentativa de inserir um gene em um plasmídeo de DNA circular, a técnica é caracterizada por sua rapidez e precisão em um tempo muito curto.
O produto de PCR deve então ser analisado por eletroforese em gel de agarose para verificar se há somente uma banda presente, o que pode indicar que o produto desejado foi amplificado e que posteriormente será purificado. Ou então, se há presença de mais bandas, indica que a PCR não está específica, e as condições da PCR deverão ser modificadas até que somente o produto desejado seja amplificado.
(Questão 3) Como funciona a eletroforese de DNA em gel de agarose? R: O uso da eletroforese para a análise de DNA é um dos métodos fundamentais nos laboratórios de pesquisa. O princípio se baseia no fato da molécula de DNA possuir carga negativa em seus grupos fosfatos, em valores
de pH neutro ou alcalino e desta forma, quando aplicado ou imerso em uma matriz de gel submetida a um campo elétrico, migra em direção ao polo positivo. Nas cubas padrões encontradas em laboratórios, a voltagem varia entre 50 e 110 V. A velocidade da migração dependerá do tamanho da molécula. Por isso, em um dado momento da eletroforese, moléculas de tamanhos distintos se encontram em diferentes pontos da matriz e torna possível sua separação.
O gel de agarose é preparado a partir da mistura de um tampão e agarose, não apresentando toxicidade. A polimerização é rápida e o gel, após seu uso, pode ser reciclado e reutilizado na elaboração de outros géis. Além disso, a eletroforese em gel de agarose pode ser usada como método analítico ou preparativo, isto é, quando o fragmento de DNA é recuperado e purificado a partir do gel.
A agarose é um polissacarídeo que forma uma estrutura de rede e permite a regulação da velocidade da migração das moléculas durante a separação. A quantidade adicionada, para a concentração final (% [w/v]), dependerá dos tamanhos de fragmentos que serão trabalhados na corrida. Quando ainda morna, é colocado um pente (o mesmo fica a 1 mm acima do fundo da forma) que servirá como molde para formar os poços no gel para reservarem as amostras de DNA que serão aplicadas. Ao esfriar e polimerizar, a agarose se torna turva e com resistência diretamente proporcional à concentração de agarose utilizada.
Assim, o principal parâmetro para condicionar a migração de DNA numa mesma eletroforese é o tamanho dos fragmentos. Para isso, é utilizado o marcador de número de pares de bases (pb), uma mistura de diversos fragmentos de DNA de tamanhos e concentrações conhecidas, o que permite uma estimativa visual do tamanho dos fragmentos de DNA de uma dada amostra.
(Questão 4) Por que foi feita a eletroforese?
(Questão 5) Porque usar um corante no gel? Cite outras opções de corantes e como estes atuam e suas vantagens e desvantagens.
R: A utilização do corante contribui para visualizar o resultado da corrida do DNA nos géis de agarose, sob a luz ultravioleta (UV). Anteriormente era muito empregado o corante brometo de etídeo (EtBr), pois este se intercala entre as bases dos ácidos nucléicos e, na presença de luz UV (entre 260 e 360nm), fluoresce e apresenta a coloração vermelho alaranjado (590nm), e assim é possível recortar as bandas de interesse. Este método possibilita a detecção de uma quantidade igual ou superior a 10 ng de DNA e a intensidade de fluorescência emitida é proporcional à concentração de DNA presente na amostra.
Seu uso ocorre por 3 diferentes formas: aplicado diretamente no gel, no tampão da amostra a ser aplicada, ou quando o gel é submergido em solução de EtBr após a corrida. Porém, a substância vem sendo substituída por outros corantes devido a sua toxicidade e, a mesma pode interferir no padrão de migração das diversas conformações que a molécula de DNA assume. Ainda, provocam a contaminação da cuba utilizada na corrida, além das vidrarias e utensílios usados na preparação do gel.
Deste modo, a melhor opção é realizar a substituição por corantes que sejam atóxicos, caracterizados por serem mais sensíveis e não mutagênicos. Dentre os produtos disponíveis, estão o Azul de Metileno, que apesar de pouco sensível, não apresenta potencial mutagênico e não requer luz U.V; também há o Sybr Safe®, corante fluorescente em DNA no gel de agarose e no gel de poliacrilamida, que exibe a mesma sensibilidade que o EtBr e é visualizado no transiluminador de luz azul; por último, o GelRed e o GelGreen podem ser ser adicionados antes da homogenização do gel e ambos são termoestáveis.
(Questão 6) Analisar o padrão de bandas no gel. Estimar o tamanho das bandas amplificadas. Como este tamanho se relaciona com o fragmento mostrado no slide 5. É o tamanho do fragmento de DNA esperado?
VI. Conclusão
Com a finalização deste último experimento, embora não tenha sido realizada a prática presencialmente de nenhum deles, foi possível complementar os conceitos teóricos envolvidos nas técnicas de preparação de uma célula competente, transformação com um vetor contendo um inserto de interesse, extração e purificação do mesmo, seguindo para a amplificação em PCR e por fim a análise em eletroforese de gel, técnicas estas que compõem um grande segmento da bioquímica industrial.
Nesta prática em si, a proposta de relembrar a teoria envolta de técnica de eletroforese em gel de agarose, evidencia essa como sendo um método simples e eficiente, que permite separação, identificação e purificação de moléculas de DNA.
Além da teoria, esta prática também possibilitou a simulação de um resultado de eletroforese para um fragmento desejado, o qual apresentou resultados dentro do esperado pelo grupo, o que mais uma vez nos leva a avaliar o procedimento de eletroforese como uma técnica válida por ser relativamente simples, barata e aplicável.
VII. Bibliografia
BORZANI, W.; LIMA, V. A.; AQUARONE, E. Biotecnologia: Engenharia Bioquímica. São Paulo. Ed. Edgard Blucher. 2001.
Conceitos básicos de técnicas em biologia molecular, por Liziane Maria de Lima; Campina Grande, 2008
Marques, Marilis do Valle. Biologia Molecular e Genética Bacteriana. Ribeirão Preto: Sociedade Brasileira de Genética, Editor Cubo. 2012.