UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO SEMI-ÁRIDO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL
AVALIAÇÃO HEMATOLÓGICA, BIOQUÍMICA E
HEMOGASOMÉTRICA DE SANGUE CAPRINO
ARMAZENADO EM BOLSAS CPDA-1 E CPD/SAG-M
MARCONDES DIAS TAVARES
Médico Veterinário
MOSSORÓ - RN - BRASIL
Novembro – 2013
MARCONDES DIAS TAVARES
AVALIAÇÃO HEMATOLÓGICA, BIOQUÍMICA E
HEMOGASOMÉTRICA DE SANGUE CAPRINO
ARMAZENADO EM BOLSAS CPDA-1 E CPD/SAG-M
Dissertação apresentada à Universidade Federal Rural do Semi-Árido – UFERSA, Campus de Mossoró, como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Ciência Animal.
Orientador: Prof. Dr. Raimundo Alves Barrêto Júnior
MOSSORÓ - RN - BRASIL
Novembro – 2013
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP) Biblioteca Central Orlando Teixeira (BCOT)
Setor de Informação e Referência
T192a Tavares, Marcondes Dias.
Avaliação hematológica, bioquímica e hemogasométrica de sangue caprino armazenado em bolsas CPDA-1 E CPD/SAG-M. / Marcondes Dias Tavares. -- Mossoró, 2013.
73f.: il.
Orientador: Prof. Dr. Raimundo Alves Barrêto Júnior
Dissertação (Mestrado em Ciência Animal: Área de concentração em Sanidade Animal) – Universidade Federal Rural do Semi-Árido. Pró-Reitoria de Pós-Graduação.
1. Caprino- Sangue. 2. Eritrócitos. 3. Hemoterapia. I. Título. RN/UFERSA/BCOT CDD: 636.39
Bibliotecária: Vanessa Christiane Alves de Souza Borba CRB-15/452
DADOS CURRICULARES DO AUTOR
MARCONDES DIAS TAVARES – Filho de Sinval Dias de Oliveira e Terezinha
Tavares de Oliveira Dias, nascido em 20 de outubro de 1984, na cidade de Olho D’água do Borges, estado do Rio Grande do Norte. Fez o ensino fundamental na Escola Estadual 20 de Setembro (em Olho D’água do Borges – RN, em 2000) e o ensino médio na Escola Agrícola de Jundiaí (em Macaíba – RN, em 2003), onde concluiu o curso Técnico em Agropecuária no mesmo ano. No ano de 2005 ingressou no curso de Zootecnia na Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), cursando o 1° semestre. Em 2006 ingressou no curso de Medicina Veterinária na Universidade Federal Rural do Semi-Árido (UFERSA), concluindo-o em 2011 na mesma universidade. Durante a graduação foi bolsista de Iniciação Científica por um ano, atuando sempre na área de Medicina Interna Veterinária, especificamente com hematologia de grandes animais. Ainda no ano de 2011 ingressou no Programa de Pós-graduação em Ciência Animal da UFERSA, sob orientação do professor Doutor Raimundo Alves Barrêto Júnior. Participou durante a graduação e pós-graduação de congressos importantes. Por fim, em novembro de 2013 defendeu a dissertação para obtenção do título de mestre.
Aos meus familiares
A vocês, amados membros da minha aliança mais fiel, unidos a mim por laços de sangue e que não mediram esforços em dispor-me tudo o que precisei para obter este título. Dedico esta conquista com o mais puro sentimento de gratidão e asseguro que a mesma lhes pertence tanto quanto a mim.
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus, primeiramente por ter me mostrado a certeza de sua presença ao meu lado, e depois, por ter sido o tempo inteiro fonte de inspiração para que eu obtivesse êxito em meus propósitos. Agradeço-te Deus, por ter me encorajado a superar as dificuldades surgidas, especialmente a labuta e as limitações impostas pela vida estudantil.
Ao meu orientador Raimundo Alves Barrêto Júnior (Barretinho) por suas valiosas observações e orientações, por ter me dado um lugar na sua seleta equipe desde o “berço” da iniciação científica até este glorioso momento. Meus amigos me perguntavam como andava o batidão e os trabalhos com o “pai Barrêto”; isso representa a seriedade, liderança e compromisso com que ele trata das atividades de pesquisa, e ao mesmo tempo reflete o dom de divertir e o trato íntimo com nós orientados. Seu lado humano entende as dificuldades da vida e o levou a compreender minhas decisões, por mais distante que elas tenham me levado. Quero reafirmar minha admiração e gratidão por você Barretin, obrigado por tudo amigo. À minha família, em especial a minha mãe (Terezinha Tavares) e meu pai (Sinval Dias) por serem incansáveis em dispor-me tudo o que precisei para alcançar este feito. O amor e exemplo que deles obtive sempre foi o impulso que precisei pra persistir e continuar lutando pelos meus objetivos. Agradeço ao meu amado irmão Marcos por apoiar-me, por doutrinar-me e incentivar-doutrinar-me nas horas e circunstâncias mais necessárias. Não dá pra te agradecer apenas com palavras mano. Agradeço a minha amada Cínthia pela companhia, cuidados e carinho que me foram doados nos momentos de crise e pelas alegrias compartilhadas até hoje. Ao meu tio Aderson pelo incentivo e infinito referencial, Tia Raimunda Tavares por seu incentivo e apoio quase maternal; Gledson, Luciana e Breno (“Meio-irmãos”) pelo companheirismo e incentivo; Tio Joaquim Tavares (in memorian) pelo referencial e exemplo de virtudes; Tio Pedro e Luziarte pelo incentivo e referencial. Aos demais tios e tias por terem me mostrado um modelo de paz, humildade e dignidade, capazes de influenciar-me no modo de conduzir a vida.
Aos colaboradores da UFERSA e da USP, que no dia a dia contribuíram com minha formação, Erinaldo do laboratório que se dispôs na medida do possível. À professora Valéria Veras pela parceira contínua com nosso grupo de pesquisa e por disponibilizar seu laboratório. Agradeço ao professor Jean Berg por disponibilizar seu laboratório para a microbiologia das bolsas. Agradeço a equipe Ortolani: Enrico, Carol, e Clara pelas análises bioquímicas e a Humberto Hamad que desde a graduação me auxilia com as análises estatísticas.
Aos colegas de pesquisa Isabella de Oliveira, minha amável conterrânea de ODB, pela amizade e orientação insubstituíveis, a doce Rejane (Rejana) pelo companheirismo e instruções laboratoriais que desde sempre contribuíram para minha formação, Nayanna Fonseca pelo apoio na hematologia, Leonardo Barreira pelas análises bioquímicas (diretamente da USP). Agradeço a Paulo Ricardo (pibiquinho), Jocélio (deputado), Jaqueline (Jaq), Jerson (vaqueiro), pela ajuda imprescindível e por tornarem nossos trabalhos divertidos
e estimulantes. Agradeço a Jucélio Gameleira pela boa amizade e alegria de dividir bons momentos sob o mesmo teto. Agradeço a Talita Lins (lá de nós) por ser tão prestativa, responsável e acima de tudo amiga; a Rociene, uma boa amiga e colaboradora, que cuidou com carinho da microbiologia das bolsas, repartindo o frango assado conosco e nos divertindo com os “informes” semanais. Ao amigo Thiago César pelo companheirismo insubstituível e pelas divertidas brincadeiras.
“Uma crise difícil pode ser mais prontamente suportada se tivermos a convicção de que a nossa existência traz consigo um propósito – uma causa para defender, uma pessoa para amar, um alvo para alcançar”.
AVALIAÇÃO HEMATOLÓGICA, BIOQUÍMICA E HEMOGASOMÉTRICA DE SANGUE CAPRINO ARMAZENADO EM BOLSAS CPDA-1 E CPD/SAG-M
TAVARES, Marcondes Dias. Avaliação hematológica, bioquímica e hemogasométrica de
sangue caprino armazenado em bolsas CPDA-1 e CPD/SAG-M. 2013. 73f. Dissertação
(Mestrado em Ciência Animal: Produção e Sanidade Animal) - Universidade Federal Rural do Semi-Árido (UFERSA), Mossoró-RN, 2013.
RESUMO: O presente trabalho objetivou fazer avaliação hematológica, bioquímica e
hemogasométrica do sangue caprino armazenado em bolsas CPDA-1 e CPD/SAG-M. Foram utilizados 7 caprinos machos, adultos, castrados, sem raça definida, pesando em média 45kg. O sangue foi coletado em duas bolsas plásticas, uma contendo CPDA-1 e outra CPD/SAG-M, sendo armazenadas durante 42 dias. Realizou-se avaliações hematológicas (número de eritrócitos, volume globular, hemoglobina total e plasmática, grau de hemólise, volume corpuscular médio, leucócitos), variáveis bioquímicas (glicose, lactato, sódio, potássio, proteínas totais), variáveis hemogasométricas (pH, bicarbonato, pressão parcial de oxigênio e de dióxido de carbono, saturação de oxigênio, déficit de base, dióxido de carbono total) e microbiologia, em sete momentos (T), sendo T0 (imediatamente após a coleta), T7 (sete dias), T14 (quatorze dias), T21 (vinte e um dias), T28 (vinte e oito dias), T35 (trinta e cinco dias) e T42 (quarenta e dois dias após a coleta). Nas duas bolsas houve aumento da hemoglobina plasmática, grau de hemólise, lactato, pressão parcial de oxigênio, redução de hemoglobina total e pH. Nas bolsas não houve variação no número de eritrócitos, glicose, sódio, potássio e pressão parcial de dióxido de carbono. Na comparação com a CPDA-1, a bolsa CPD/SAG-M apresentou menores valores de eritrócitos, VG, hemoglobina total e sódio, e maiores valores de grau de hemólise e hemoglobina plasmática. As alterações observadas no sangue caprino armazenado durante 42 dias, em bolsas CPDA-1 e CPD/SAG-M, não foram suficientes para invalidar seu uso como recurso terapêutico.
HEMATOLOGIC, BIOCHEMICAL AND HEMOGASOMETRIC EVALUATION OF CAPRINE BLOOD STORED IN CPDA-1 AND CPD/SAG–M BAGS
TAVARES, Marcondes Dias. Hematologic, biochemical and hemogasometric evaluation
of caprine blood stored in CPDA-1 and CPD/SAG–M bags. 2013. 73f. Dissertation
(Master in Animal Science: Animal Production and Health) - Federal Rural University of the Semi-Arid (UFERSA), Mossoró, RN, 2013.
ABSTRACT: The present study aimed to evaluate the hematological, biochemical and
hemogasometric changes in caprine blood stored in CPDA-1 and CPD/SAG-M bags. Seven male, adult, neutered, mixed breed goats weighing an average of 45kg were used. From each animal, 25% of the estimated total blood volume was collected into two plastic bags, one containing CPDA-1 and another with CPD/SAG-M; next they were stored for 42 days. Hematological (number of erythrocytes, packed cell volume, total and plasmatic hemoglobin, degree of hemolysis, mean cell volume, leukocytes), biochemical (glucose, lactate, sodium, potassium, total plasma protein), hemogasometric (pH, bicarbonate, partial pressure of oxygen, partial pressure of carbon dioxide, oxygen saturation, base deficit, total carbon dioxide) and microbiological evaluations were performed in seven moments (T), T0 (immediately after sampling), T7 (seven days), T14 (fourteen days), T21 (twenty-one days) , T28 (twenty-eight days), T35 (thirty-five days) and T42 (forty-two days after sampling). In the two bags there was an increase of plasmatic hemoglobin, degree of hemolysis, lactate, pO2 and a decrease of total hemoglobin and pH. In the bags there was no alteration in the erythrocyte count, glucose, sodium, potassium or partial pressure of carbon dioxide. In the comparison with the CPDA-1, the CPD/SAG-M bag had lower erythrocytes, packed cell volume, total hemoglobin and sodium, as well as higher levels of hemolysis and plasmatic hemoglobin. The changes observed in the caprine blood stored for 42 days in CPDA-1 and CPD/SAG-M bags were not sufficient to invalidate their use as a therapeutic resource, however, it has been found that it is preferable to use CPDA-1 bags for the conservation of caprine blood.
LISTA DE QUADROS
Quadro 1. Composição das bolsas plásticas tipo CPDA-1 e CPD/SAG-M, nas quais foi acondicionado o sangue total caprino. ... 35 Quadro 2. Tempos experimentais em que foram realizadas as análises das amostras do sangue total caprino armazenado. ... 36
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Valores médios (X) e desvios padrões (S) do Número de Eritrócitos (x106 µL) do sangue total caprino armazenado em bolsas CPDA-1 e SAG-M, nos momentos (T) analisados.. ... 39 Tabela 2. Valores médios (X) e desvios padrões (S) do Volume Globular (%) do sangue total caprino armazenado em bolsas CPDA-1 e SAG-M, nos momentos (T) analisados ... 40 Tabela 3. Valores médios (X) e desvios padrões (S) do Volume Corpuscular Médio (fL) do sangue total caprino armazenado em bolsas CPDA-1 e SAG-M, nos momentos (T) analisados.. ... 41 Tabela 4. Valores médios (X) e desvios padrões (S) da Concentração de Hemoglobina Total (g/dL) do sangue total caprino armazenado em bolsas CPDA-1 e SAG-M, nos momentos (T) analisados. ... 43 Tabela 5. Valores médios (X) e desvios padrões (S) da Concentração de Hemoglobina Plasmática (g/dL) do sangue total caprino armazenado em bolsas CPDA-1 e SAG-M, nos momentos (T) analisados. ... 44 Tabela 6. Valores médios (X) e desvios padrões (S) do Número de Leucócitos (x 103 µL) do sangue total caprino armazenado em bolsas CPDA-1 e SAG-M, nos momentos (T) analisados.. ... 45 Tabela 7. Valores médios (X) e desvios padrões (S) do Grau de Hemólise (%) do sangue total caprino armazenado em bolsas CPDA-1 e SAG-M, nos momentos (T) analisados. ... 46 Tabela 8. Valores médios (X) e desvios padrões (S) da Glicose Plasmática (mg/dL) do sangue total caprino armazenado em bolsas CPDA-1 e SAG-M, nos momentos (T) analisados ... 47 Tabela 9. Valores médios (X) e desvios padrões (S) do Lactato Plasmático (g/dL) do sangue total caprino armazenado em bolsas CPDA-1 e SAG-M, nos momentos (T) analisados ... 48 Tabela 10. Valores médios (X) e desvios padrões (S) do Sódio Plasmático (mEq/L) do sangue total caprino armazenado em bolsas CPDA-1 e SAG-M, nos momentos (T) analisados ... 49 Tabela 11. Valores médios (X) e desvios padrões (S) do Potássio Plasmático (mEq/L) do sangue total caprino armazenado em bolsas CPDA-1 e SAG-M, nos momentos (T) analisados.. ... 50 Tabela 12. Valores médios (X) e desvios padrões (S) das Proteínas Plasmáticas Totais (g/dL) do sangue total caprino armazenado em bolsas CPDA-1 e SAG-M, nos momentos (T) analisados ... 51 Tabela 13. Valores médios (X) e desvios padrões (S) do pH do sangue total caprino armazenado em bolsas CPDA-1 e SAG-M, nos momentos (T) analisados ... 52
Tabela 14. Valores médios (X) e desvios padrões (S) da Pressão Parcial de Dióxido de Carbono (mmol/L) do sangue total caprino armazenado em bolsas CPDA-1 e SAG-M, nos momentos (T) analisados ... 53 Tabela 15. Valores médios (X) e desvios padrões (S) de Pressão Parcial de Oxigênio (mmHg) do sangue total caprino armazenado em bolsas CPDA-1 e SAG-M, nos momentos (T) analisados ... 54 Tabela 16. Valores médios (X) e desvios padrões (S) do Bicarbonato Plasmático (mmol/L) do sangue total caprino armazenado em bolsas CPDA-1 e SAG-M, nos momentos (T) analisados.. ... 55 Tabela 17. Valores médios (X) e desvios padrões (S) do Dióxido de Carbono Total (mmol/L) do sangue total caprino armazenado em bolsas CPDA-1 e SAG-M, nos momentos (T) analisados.. ... 56 Tabela 18. Valores médios (X) e desvios padrões (S) da Saturação de Oxigênio (mmol/L) do sangue total caprino armazenado em bolsas CPDA-1 e SAG-M, nos momentos (T) analisados.. ... 57 Tabela 19. Valores médios (X) e desvios padrões (S) do Déficit de Base (mmol/L) do sangue total caprino armazenado em bolsas CPDA-1 e SAG-M, nos momentos (T) analisados ... 58
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Representação dos valores médios do Número de Eritrócitos (x106 µL) do sangue armazenado em bolsas CPDA-1 e CPD/SAG-M, nos dias analisados ... 40 Figura 2. Representação dos valores médios do Volume Globular (%) do sangue armazenado em bolsas CPDA-1 e CPD/SAG-M, nos dias analisados ... 41 Figura 3. Representação dos valores médios do Volume Corpuscular Médio (fentolitros) do sangue armazenado em bolsas CPDA-1 e CPD/SAG-M, nos dias analisados ... 42 Figura 4. Representação dos valores médios da Hemoglobina Total (g/dL) do sangue armazenado em bolsas CPDA-1 e CPD/SAG-M, nos dias analisados ... 43 Figura 5. Representação dos valores médios da Hemoglobina Plasmática (g/dL) do sangue armazenado em bolsas CPDA-1 e CPD/SAG-M, nos dias analisados ... 44 Figura 6. Representação dos valores médios do Número de Leucócitos Totais do sangue armazenado em bolsas CPDA-1 e CPD/SAG-M, nos dias analisados... ... 45 Figura 7. Representação dos valores médios do Grau de Hemólise (%) do sangue armazenado em bolsas CPDA-1 e CPD/SAG-M, nos dias analisados. ... 46 Figura 8. Representação dos valores médios da Concentração de Glicose Plasmática (mg/dL) do sangue armazenado em bolsas CPDA-1 e CPD/SAG-M, nos dias analisados ... 47 Figura 9. Representação dos valores médios da Concentração do Lactato Plasmático (g/dL) do sangue armazenado em bolsas CPDA-1 e CPD/SAG-M, nos dias analisados ... 48 Figura 10. Representação dos valores médios da Concentração do Sódio Plasmático (mEq/L) do sangue armazenado em bolsas CPDA-1 e CPD/SAG-M, nos dias analisados ... 49 Figura 11. Representação dos valores médios da Concentração do Potássio Plasmático (mEq/L) do sangue armazenado em bolsas CPDA-1 e CPD/SAG-M, nos dias analisados .... 50 Figura 12. Representação dos valores médios das Proteínas Totais (g/dL) do sangue armazenado em bolsas CPDA-1 e CPD/SAG-M, nos dias analisados ... 51 Figura 13. Representação dos valores médios de pH do sangue armazenado em bolsas CPDA-1 e CPD/SAG-M, nos dias analisados ... 52 Figura 14. Representação dos valores médios da Pressão Parcial de Dióxido de Carbono (mmol/L) do sangue armazenado em bolsas CPDA-1 e CPD/SAG-M, nos dias analisados....53 Figura 15. Representação dos valores médios da Pressão Parcial de Oxigênio (mmHg) do sangue armazenado em bolsas CPDA-1 e CPD/SAG-M, nos dias analisados ... 54 Figura 16. Representação dos valores médios do Bicarbonato Plasmático (mmol/L) do sangue armazenado em bolsas CPDA-1 e CPD/SAG-M, nos dias analisados ... 55
Figura 17. Representação dos valores médios do Dióxido de Carbono Total (mmol/L) do sangue armazenado em bolsas CPDA-1 e CPD/SAG-M, nos dias analisados ... 56 Figura 18. Representação dos valores médios da Saturação de Oxigênio (mmol/L) do sangue armazenado em bolsas CPDA-1 e CPD/SAG-M, nos dias analisados ... 57 Figura 19. Representação dos valores médios do Déficit de Base (mmol/L) do sangue armazenado em bolsas CPDA-1 e CPD/SAG-M, nos dias analisados ... 58
LISTA DE ABREVIATURAS
°C Grau Celsius
µL Microlitros
µm3 Micrômetro cúbico
108 Cem milhões, 100000000
ACD Ácido citrato dextrose
CHGM Concentração de hemoglobina corpuscular média
CPDA-1 Citrato-fosfato-dextrose-adenina dL Decilitro g Grama L Litro mm3 Milímetro cúbico mmHg Milímetros de mercúrio mmol Milimol
PPT Proteínas plasmáticas totais
PVC Policloreto de vinila
SAG-M Salina, adenina, glicose, manitol
SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ... 17 2 OBJETIVOS ... 19 GERAL ... 19 ESPECÍFICOS ... 19 3 REVISÃO DE LITERATURA ... 20
3.1 SANGUE TOTAL ESTOCADO E SUA COMPOSIÇÃO ... 20
3.2 VARIÁVEIS-CONTROLE NO MONITORAMENTO DA QUALIDADE SANGUÍNEA.. ... 21
3.2.1 Hemograma ... 21
3.2.1.1 Contagem de Eritrócitos ... 21
3.2.1.2 Contagem Global de Leucócitos ... 22
3.2.1.3 Volume Globular (VG) e Volume Corpuscular Médio (VCM) ... 22
3.2.1.4 Concentração de Hemoglobina Total e Plasmática ... 23
3.2.1.5 Grau de Hemólise ... 24
3.2.2 Hemogasometria e Bioquímica ... 25
3.2.2.1 Potencial Hidrogeniônico ... 25
3.2.2.2 Dióxido de Carbono Total e Bicarbonato ... 26
3.2.2.3 Pressão Parcial de Dióxido de Carbono e Pressão Parcial de Oxigênio ... 26
3.2.2.4 Déficit de Base... 27
3.2.2.5 Potássio e Sódio plasmáticos ... 27
3.2.3 Microbiologia ... 29
3.3 BOLSAS PLÁSTICAS DE CONSERVAÇÃO SANGUÍNEA E REFRIGERAÇÃO ... 29
3.4 LESÕES ERITROCITÁRIAS DURANTE O ARMAZENAMENTO ... 31
3.5 VIABILIDADE TRANSFUSIONAL DO SANGUE ARMAZENADO ... 32
4 MATERIAL E MÉTODOS ... 34
4.1 COLETA E ARMAZENAMENTO DO SANGUE ... 34
4.2 AVALIAÇÃO DO SANGUE ARMAZENADO ... 35
4.2.1 Tempos experimentais ... 35
4.2.3 Avaliação bioquímica ... 37 4.2.4 Avaliação Hemogasométrica ... 37 4.2.5 Avaliação microbiológica ... 38 4.3 ANÁLISE ESTATÍSTICA ... 38 5 RESULTADOS ... 39 5.1 HEMOGRAMA ... 39 5.1.1 Contagem de Eritrócitos ... 39 5.1.2 Volume Globular ... 40
5.1.3 Volume Corpuscular Médio ... 41
5.1.4 Concentração de Hemoglobina Total ... 42
5.1.5 Concentração de Hemoglobina Plasmática ... 43
5.1.6 Contagem Global de Leucócitos ... 45
5.1.7 Grau de hemólise ... 46 5.2. AVALIAÇÃO BIOQUÍMICA ... 47 5.2.1 Glicose Plasmática ... 47 5.2.2 Lactato ... 48 5.2.3 Sódio Plasmático ... 49 5.2.4 Potássio Plasmático ... 50
5.2.5 Proteínas Plasmáticas Totais ... 51
5.3. AVALIAÇÃO HEMOGASOMÉTRICA ... 52
5.3.1 Potencial Hidrogeniônico ... 52
5.3.2 Pressão Parcial de Dióxido de Carbono ... 53
5.3.3 Pressão Parcial de Oxigênio... 54
5.3.4 Bicarbonato Plasmático ... 55
5.3.5 Dióxido de Carbono Total ... 56
5.3.6 Saturação de Oxigênio ... 57 5.3.7 Déficit de Base ... 58 5.4. AVALIAÇÃO MICROBIOLÓGICA ... 59 6 DISCUSSÃO ... 60 7 CONCLUSÃO ... 66 8 REFERÊNCIAS ... 67
1 INTRODUÇÃO
A hemoterapia é uma especialidade que desperta cada vez mais interesse em medicina veterinária, na clínica de pequenos animais e, gradativamente, na de grandes animais. Em humanos, métodos de conservação do sangue e seus componentes têm sido cada vez mais aprimorados, a fim de se obter uma melhor qualidade e maior tempo de estocagem. O sangue total estocado pode ser utilizado para fornecer eritrócitos, proteínas plasmáticas e fatores de coagulação estáveis como o fibrinogênio (REICHMANN; DEARO, 2001). Na prática, essa tecnologia pode ser útil para as cirurgias eletivas, por meio da conservação prévia do sangue do paciente e sua reinfusão no pós-cirúrgico, ou mesmo nas emergências, através de um banco de sangue.
A caprinocultura é uma atividade econômica explorada em todos os continentes, estando presente em áreas com diferentes características edafoclimáticas (CORDEIRO et al., 2008). A produção destes pequenos ruminantes se caracteriza como uma atividade de grande importância cultural, social e econômica para o Brasil, principalmente para a região nordeste, desempenhando um papel crucial no desenvolvimento da região (EMPARN, 2006). A produção de alimentos de alto valor biológico (leite, carne e vísceras), pele de excelente qualidade, além da adaptabilidade destes animais aos ecossistemas locais, permite à caprinocultura enquadrar-se como uma boa alternativa de trabalho e de renda (MORAES NETO, 2003).
Em revisão de literatura sobre a conservação de sangue e seus componentes em animais domésticos, identificaram-se estudos realizados com as espécies canina (COSTA JÚNIOR et al., 2006), felina (BERTOLETTI, 2011), equina (NIINISTÖ et al. 2008) e asinina (BARROS, 2011). Ribeiro Filho et al., (1994) utilizaram bolsas CPDA-1 para conservação de sangue total bovino, em que se observaram níveis adequados das variáveis, 35 dias após o início do armazenamento. Em ovinos foram estudadas as variáveis hematológicas, hemogasométricas e bioquímicas do sangue armazenado em CPDA-1, durante 35 dias (SOUSA et al., 2013). Após ampla revisão de literatura, observa-se que na espécie caprina não se conhece os efeitos do armazenamento sobre o sangue conservado, em quaisquer sistemas de armazenamento disponíveis até hoje.
18
A aplicação dos variados sistemas de conservação na medicina transfusional veterinária deve ser cuidadosamente avaliada, tornando-se indispensável o conhecimento de alterações durante o armazenamento, elucidando as particularidades de cada espécie, para permitir o adequado uso terapêutico do sangue e seus componentes. A importância expressiva da criação de caprinos, associada às perdas econômicas causadas pela mortalidade nos rebanhos, decorrente dos processos que levam a perdas sanguíneas, e a inexistência de informações que subsidiem o uso racional do sangue caprino armazenado, justificam a realização deste trabalho.
2 OBJETIVOS
GERAL
Avaliar o sangue total de caprinos acondicionado em bolsas tipo CPDA - 1 e CPD/SAG – M.
ESPECÍFICOS
Avaliar hematologicamente, bioquimicamente e hemogasometricamente o sangue total caprino armazenado durante 42 dias em bolsas tipo CPDA-1 e CPD/SAG-M, sob-refrigeração entre 1º e 6º C.
Comparar a conservação de sangue total caprino em bolsas tipo CPDA-1 e CPD/SAG-M, durante 42 dias de estocagem, sob-refrigeração entre 1º e 6º C.
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3 REVISÃO DE LITERATURA
3.1 SANGUE TOTAL ESTOCADO E SUA COMPOSIÇÃO
O sangue é um tecido de consistência líquida, formado por um meio intercelular chamado plasma e por células de dois tipos: os glóbulos vermelhos ou eritrócitos, e os glóbulos brancos ou leucócitos (GARCIA-NAVARRO, 2005). O plasma é constituído por aproximadamente 91,5% de água, 7% de sólidos orgânicos e 1% de sólidos inorgânicos. O restante de 0,5% é um conjunto de substâncias nitrogenadas, gorduras neutras, colesterol, fosfolipídios, glicose, enzimas e hormônios. Os sólidos inorgânicos constituem-se de elementos como sódio (Na+), potássio (K+), magnésio, cálcio, fósforo, cobre, cloro e outros que podem encontrar-se na forma de sais ou íons (GARCIA-NAVARRO, 2005). A principal função do sangue é transportar diversos tipos de agentes, tais como: oxigênio, dióxido de carbono, lipídeos, carboidratos, vitaminas, sais minerais, resíduos e hormônios (POOMCOKRAK; NEATPISARNVANIT, 2008).
Historicamente, a terapia transfusional é baseada na utilização de sangue total, e tal uso continua a ser o meio mais prático de transfusão em muitas clínicas veterinárias. Sangue total fresco é o sangue de um doador saudável e apto, colhido adequadamente em um recipiente contendo solução anticoagulante/preservante quando mantido em condições ótimas de preservação, devendo ser colhido e transfundido ou processado em menos de seis horas, de maneira que todos os componentes se apresentem viáveis, uma vez que as plaquetas, em sangue total, não permanecem viáveis por um período de 6 horas ou mais após a coleta (CHIARAMONTE, 2004).
O termo “sangue total estocado” se refere ao sangue fresco total colhido com solução anticoagulante/preservante e armazenado a temperatura de 1 a 6ºC (REICHMANN; DEARO, 2001).
3.2 VARIÁVEIS-CONTROLE NO MONITORAMENTO DA QUALIDADE SANGUÍNEA
3.2.1 Hemograma
A estocagem de sangue em condições controladas visa primordialmente preservar os eritrócitos, que são as unidades fundamentais no transporte do oxigênio dos pulmões para os tecidos e de dióxido de carbono no sentido inverso (GARCIA-NAVARRO, 2005). Ao avaliarmos os eritrócitos, várias mensurações podem ser feitas. Estas podem ser combinadas para gerar mais informações, que descrevem a condição destas células (KERR et al., 2003).
3.2.1.1 Contagem de Eritrócitos
A contagem de eritrócitos é determinante para calcular os índices eritrocitários: volume Corpuscular médio (VCM) e concentração da hemoglobina Corpuscular média (CHCM).
O período de armazenamento promove uma série de alterações na membrana plasmática dos eritrócitos, como o aumento gradual da fragilidade osmótica e o surgimento de microvesículas, redução do tamanho celular e esferocitose progressiva, sendo que algumas sofrem lise, levando à diminuição no número destas células (WARDROP et al., 1994).
Caprinos e ovinos chegam a possuir mais que o dobro de eritrócitos circulantes que outros animais (GARCIA-NAVARRO, 2005). Quando o sangue é retirado da corrente sanguínea e mantido sob armazenamento, parece haver variações interespecíficas no tocante a manutenção do número destas células: no sangue ovino, armazenado em CPDA-1 por 35 dias, o número de eritrócitos tende a se manter estatisticamente igual (SOUSA et al., 2013), ocorrendo o mesmo no sangue canino armazenado por 41 dias em CPDA-1 e CPD/SAG-M (COSTA JÚNIOR et al., 2006). No sangue equino armazenado como um concentrado de eritrócitos, por 35 dias, há um aumento nesse número (NIINISTO et al., 2008). Já no sangue
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asinino, armazenado por 42 dias em CPDA-1 e CPD/SAG-M, o mesmo tende a diminuir (BARROS, 2011).
3.2.1.2 Contagem Global de Leucócitos
A presença de leucócitos em produtos sanguíneos armazenados tem sido causa de reações febris decorrente da liberação de citocinas, imunossupressão pela diminuição da atividade das células Natural Killer e da fagocitose e lesões pulmonares devido à presença de agregado leucocitário, na circulação pulmonar (EDER; CHAMBERS, 2007). Leucócitos coletados com sangue total podem se romper quando submetidos a baixas temperaturas, liberando proteases e lipases que danificam os eritrócitos durante o armazenamento. A remoção dos leucócitos, isto é, a leucorredução, pela remoção da camada leucoplaquetária ou por leucofiltração, pode previnir estes danos e permitir a recuperação dos eritrócitos, reduzindo a hemólise (HESS, 2006). A conservação de sangue total em bolsas CPDA-1 em ovinos (SOUSA et al., 2013) e ACD em equinos (LOPES et al., 1995) mostrou redução na leucometria global.
3.2.1.3 Volume Globular (VG) e Volume Corpuscular Médio (VCM)
O volume globular ou hematócrito é simplesmente uma mensuração da fração do volume sanguíneo que é ocupada pelos eritrócitos. É obtido por meio da estratificação do sangue através da centrifugação em três partes: eritrócitos, leucócitos mais plaquetas e uma última, o plasma, podendo ser expresso em porcentagem (KERR et al., 2003). Por isso, o VG está intimamente relacionado com o tamanho e o número dos eritrócitos (MATOS et al., 1995). A aparência do plasma nos tubos de microhematócrito pode fornecer informações importantes, tais como hemólise, icterícia e lipemia (REBAR et al., 2003). Os eritrócitos dos caprinos e ovinos tem um volume celular que vai de 16 a 40µm3, sendo relativamente menores do que os de outras espécies domésticas, quando comparados, por exemplo, ao cão,
cujos eritrócitos medem entre 60 e 77µm3 (GARCIA-NAVARRO, 2005). O tamanho destas células é representado pelo VCM, que é calculado conforme a fórmula abaixo.
VCM (fL) = Volume Globular (%)
N° eritrócitos (milhões/mm3) x10
(GONZÁLEZ et al., 2008).
Durante o armazenamento do sangue a temperaturas entre 2 e 4ºC, o VCM tende a aumentar, elevando também o VG nas espécies equina, asinina e ovina (NIINISTO et al., 2008; BARROS, 2011; SOUSA et al., 2013).
3.2.1.4 Concentração de Hemoglobina Total e Plasmática
A mensuração da concentração de hemoglobina total dá subsídios para se determinar o grau de hemólise e a CHGM. REIS et al., (2011) observaram que a concentração de hemoglobina total tendeu a reduzir no sangue bovino acondicionado em CPDA-1 durante 21 dias. No decorrer do armazenamento do sangue, ocorre sua liberação para o plasma devido à ruptura dos eritrócitos, onde a união entre a hemoglobina e o estroma eritrocitário quebra-se pela ação do agente hemolítico (GONZÁLEZ et al., 2008). O desprendimento de vesículas a partir da superfície eritrocitária, com hemoglobina em seu interior, também contribui para aumentar a concentração plasmática deste pigmento (HESS; GREENWALT, 2002).
Na medicina veterinária não existem parâmetros estabelecidos quanto ao grau de hemólise e o nível de hemoglobina plasmática admissível no sangue total ou no concentrado de hemácias, para as diferentes espécies. No entanto alguns trabalhos levam em consideração os parâmetros humanos (MUDGE, 2004; NIINISTO et al., 2008; BARROS, 2011).
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3.2.1.5 Grau de Hemólise
O grau de hemólise é descrito como o percentual de hemoglobina livre no plasma em relação à hemoglobina total, determinada pela fórmula abaixo:
Grau de hemólise (%) =(100 − Ht) x Hb Plasmática (g/dL) Hb Total (g/dL)
(MUDGE et al., 2004).
Pela fórmula, percebe-se que quanto mais eritrócitos se romperem, mais hemoglobina estará livre no plasma e, consequentemente, maior será o grau de hemólise do sangue armazenado (SOWEMIMO-COKER, 2002). A hemólise é um marcador fidedigno da falha de um sistema de conservação sanguínea e ocorre pela lise da membrana plasmática do eritrócito com consequente liberação de hemoglobina (HESS; GREENWALT, 2002).
Vários fatores podem estar associados com a lise dos eritrócitos e podem ser de natureza mecânica, bioquímica ou pela presença de leucócitos. A manipulação do sangue requer cuidados especiais, tendo em vista a relativa fragilidade da membrana plasmática eritrocitária que pode romper com os choques mecânicos. Baixas concentrações de ATP (adenosina trifosfato) reduzem a capacidade de equilíbrio iônico pela bomba sódio/potássio e a célula pode vir a romper por turgescência demasiada. Além disso, com a depleção de ATP se perde a integridade do esqueleto ligado à bicamada lipídica, com perda da forma normal do eritrócito e liberação de hemoglobina na forma de microvesículas (HESS; GREENWALT, 2002).
3.2.2 Hemogasometria e Bioquímica
3.2.2.1 Potencial Hidrogeniônico (pH)
O pH sanguíneo dos animais está próximo da neutralidade com leve tendência à alcalinidade (aproximadamente 7.4) Em condições fisiológicas, as reações metabólicas tendem a desviar continuamente este pH para ácido ou alcalino (ALMOSNY, 2003). Com a retirada do sangue da circulação, o metabolismo das células continua, levando a uma redução do pH, principalmente devido à metabolização da glicose para lactato com consequente acúmulo de íons H+. Com o uso da refrigeração, em torno de 1 a 6º C, estas reações bioquímicas são retardadas, possibilitando um maior período de conservação do sangue dentro das bolsas (AUTHEMENT, 1986).
Sob variadas condições de estocagem o metabolismo eritrocitário começa rapidamente, mas, diminui com a queda do pH (HESS et al., 2001). Isso ocorre porque o pH ácido retarda a glicólise por inibir a fosfofrutoquinase (HESS, 2010) . Então, até certo ponto a queda de pH é desejável, pois a diminuição do metabolismo tende a manter viáveis os constituintes sanguíneos por mais tempo.
Segundo Hess, (2006) a coleta de sangue total em soluções preservantes, contendo citrato fosfato dextrose (CPD), normalmente já reduz o pH, e a adição de solução aditiva reduz ainda mais esta variável. No entanto, há um limite inferior de pH para que o ATP se mantenha em concentrações adequadas. Em humanos verificou-se que eritrócitos em suspensão em pH 6.6 mantiveram ativa a glicólise e mantiveram o ATP durante várias semanas, enquanto que aquelas a pH 6.2 produziram um pouco de lactato e as concentrações de ATP diminuíram rapidamente (HESS et al., 2001).
Como observação geral, o limite inferior de pH para o armazenamento de eritrócitos em humanos é de cerca de 6.2, estimado a partir de muitas amostras de sangue armazenadas em uma variedade de sistemas (HESS; GREENWALT, 2002).
A redução dos valores de pH em sangue armazenado é um achado frequente em estudos com espécies domésticas. Ribeiro Filho et al., (1994) trabalhando com sangue bovino
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conservado em CPDA-1 obtiveram valores de pH reduzidos após 35 dias de armazenamento. O mesmo relatou Sousa et al., (2013) ao trabalhar com sangue ovino nas mesmas condições.
3.2.2.2 Dióxido de Carbono Total (TCO2) e Bicarbonato (HCO3-)
O bicarbonato é uma base fraca responsável por mais de 50% da capacidade tamponante do meio extracelular. A redução nos valores sanguíneos do HCO3- pode ser em virtude de seu consumo no controle da acidez (LUNA, 2002). Em solução, o bicarbonato se combina com um próton H+ produzido pelo ácido carbônico, sendo em seguida convertido a dióxido de carbono e água pela anidrase carbônica presente nos eritrócitos (HESS, 2006). Por essa reação é possível observar que surge uma relação entre o TCO2 e a concentração de HCO3- existentes na solução.
Sempre que os distúrbios respiratórios podem ser eliminados, o componente metabólico do equilíbrio acidobase é indicado pela concentração de bicarbonato, e este é geralmente estimado pela determinação do TCO2, pois o HCO3- é responsável por aproximadamente 95% do TCO2 mensurado (KANEKO, 2008).
3.2.2.3 Pressão Parcial de Dióxido de Carbono (pCO2) e Pressão Parcial de Oxigênio (pO2)
Durante o armazenamento o CO2 é formado a partir da reação neutralizante do HCO3 -com os íons H+. Em seguida o CO2 se difunde para fora da bolsa plástica, removendo prótons efetivamente da solução e diminuindo a taxa de redução do pH (HESS, 2006). Trabalhando com sangue bovino armazenado em CPDA-1, Ribeiro Filho et al., (1994) observaram aumento dos níveis da pCO2 na primeira semana e redução após este período. Este mesmo achado foi descrito também por Laposy e Nogueira, (2011) que estudaram o sangue canino em bolsas CPDA-1.
A pO2 tende a aumentar no interior das bolsas, sendo observado aumento dessa variável no armazenamento de sangue bovino, canino, asinino e ovino (RIBEIRO FILHO et
al., 1994; COSTA JUNIOR et al., 2006; BARROS, 2011; SOUSA et al., 2013), comprovando que as bolsas plásticas utilizadas para o armazenamento do sangue são permeáveis ao CO2 e ao O2 (Ribeiro Filho et al., 1994).
Hashimoto, (1997) acondicionou sangue humano em seis tipos de bolsa, de diferentes fabricantes, e as manteve em temperatura de 22 ± 2°C, durante duas horas, e observou que a saída de CO2 foi menor do que a entrada de O2, em todos os tipos de bolsa.
3.2.2.4 Déficit de Base
O déficit de base, muitas vezes considerado como excesso de base, quando o valor é positivo, geralmente é considerado como uma indicação do desvio de bicarbonato do normal. Em um animal com acidose metabólica, por exemplo, o déficit de base calculado fornece um meio de estimar a quantidade de bicarbonato requerida para corrigir o balanço acidobase para o normal. Esta variável ainda não é tão usual na medicina veterinária, no entanto, pode ser fornecida na avaliação de rotina do equilíbrio acidobase em animais (CARLSON, 2008).
3.2.2.5 Potássio e Sódio plasmáticos (K+ e Na+)
No interior das células, o potássio tem função parecida com a do sódio no líquido extracelular, influenciando o equilíbrio acidobase e a pressão osmótica, incluindo a retenção de água. Concentrações elevadas de K+ intracelular são essenciais para várias funções metabólicas importantes, incluindo a biossíntese de proteínas pelos ribossomos. Mudanças na concentração de K+ que alteram a relação entre K+ intra e extracelular, alteram o potencial de membrana (CARLSON, 2008). Este potencial permite a geração do potencial de ação necessário para a função neural e muscular. Desse modo, tanto aumentos como reduções no nível de K+ plasmático podem desequilibrar a relação, provocando arritmias cardíacas e paralisia muscular (MOTTA, 2000).
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Em grande parte o K+ é um íon intracelular, com mais de 98% dos íons localizados intracelularmente. Assim como em humanos, outras espécies animais com alta concentração de K+ intracelular, como equinos, suínos e alguns ruminantes, tem uma bomba sódio/potássio (Na+/K+) responsável pelo equilíbrio iônico, que troca Na+ intracelular por K+ extracelular, por meio da hidrólise de ATP. Com a depleção da glicose e temperaturas de 2 a 6ºC, esse mecanismo é paralisado e o K+ intracelular deixa a célula, enquanto o Na+ entra (HARVEY, 2008).
A concentração de K+ extracelular aumenta no sobrenadante de sangue total e concentrado de eritrócitos com o decorrer do tempo de armazenamento a temperatura de 1 a 6°C com soluções preservativas anticoagulantes contendo CPDA-1 ou solução salina (AS) (MOORE et al., 1981; HEATON et al., 1984; BANSAL, 2007). Quando eritrócitos de diferentes animais são comparados, verifica-se uma forte correlação positiva entre a concentração de ATP e a relação K+/Na+ intracelular (MISETA et al., 1993). A depressão da bomba Na+/K+, em sangue preservado a 4°C, implica absorção de sódio e água nos eritrócitos com aumento significativo do seu volume (FINK, 1998).
O aumento do nível do potássio extracelular indica um dos primeiros eventos que se relacionam com a piora da qualidade das células vermelhas (KORTE; VERHOEVEN, 2004). Transfusões sanguíneas com altos níveis de potássio oferecem risco de arritmia e está presente principalmente com grandes volumes de transfusões em recém-nascidos e crianças, sendo relatado parada cardíaca letal (VAN DE WATERING, 2011). Sousa et al. (2013) trabalhando com sangue ovino em CPDA-1, observou aumento do K+ e redução do Na+ plasmáticos, ocorrendo o mesmo com sangue bovino conservado em CPDA-1 por 21 dias (REIS et al., 2011). Em contraste, outros experimentos com sangue bovino mostraram um progressivo aumento na concentração do Na+, sustentando dados de estudos com sangue humano, canino e equino, armazenados em bolsas CPDA-1 (HÖGMAN, 1999; RIBEIRO FILHO et al., 1994; BARTHEL, 1999; MUDGE, et al., 2004).
3.2.3 Microbiologia
O sangue armazenado pode ser um meio de cultura ideal para bactérias. Cerca de uma em cada duas mil unidades de sangue humano armazenadas é contaminada com bactérias no momento da coleta, a partir da pele do doador, ou por bactérias já presentes no sangue (HESS, 2010). A maioria das bactérias não sobrevive ao armazenamento a frio, mas as bactérias termotolerantes, como Aeromonas, Vibrio, e espécies de Serratia, podem sobreviver e crescer lentamente. Elas se dividem uma vez por dia, de modo que, normalmente, demoram pelo menos 19 dias para que uma bacteria se multiplique para as 108 bactérias que podem causar uma septicemia grave (HESS, 2010). A contaminação bacteriana pode mudar o pH do sangue, de modo que nos Estados Unidos a mensuração do pH é usada como indicador substituto da presença de bactéria no sangue total (BARKER et al., 2010). A formação de coágulos, alteração de cor, massas anormais no sangue, plasma opaco, presença de gás ou odor peculiar devem levantar a suspeita de que aquela unidade está contaminada (SOWEMIMO-COKER, 2002).
3.3 BOLSAS PLÁSTICAS DE CONSERVAÇÃO SANGUÍNEA E REFRIGERAÇÃO
O termo “bolsa plástica” é utilizado para definir o recipiente completo com o tubo de coleta e agulha, os tubos de saída, as soluções anticoagulantes e/ou preservadoras e os tubos de transferência e recipientes associados, quando existentes (ANVISA, 2004). Os filmes das bolsas de armazenamento de sangue são fabricados com uma mistura de PVC com alguns plastificantes que conferem a flexibilidade necessária ao material, além de influenciar no processamento e preservação dos componentes do sangue, por possuírem permeabilidade ao CO2 e O2 (HESS; GREENWALT, 2002; RIBEIRO FILHO et al., 1994).
Atualmente o mercado dispõe de diversos tipos de bolsas plásticas desenvolvidas para coleta e armazenamento do sangue, seja como sangue total ou hemocomponentes. São diversas opções que visam atender diferentes fins, podendo conter constituintes anticoagulantes diversos, além de soluções aditivas compostas por fatores nutricionais para
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eritrócitos. No Brasil são regulamentadas pelo Ministério da Saúde quatro soluções anticoagulantes e/ou preservadoras que compõem diferentes bolsas de armazenamento sanguíneo: ACD (Ácido, Citrato, Dextrose), CPD (Citrato, Fosfato, Dextrose), CPDA-1 (Citrato, Fosfato, Dextrose, Adenina), e CPD/SAG-M (Citrato, Fosfato, Dextrose / Salina, Adenina, Glicose, Manitol), sendo que as bolsas contendo CPDA-1 tem sido as mais utilizadas na medicina veterinária (LANEVSCHI e WARDROP, 2001).
As soluções anticoagulantes tradicionais ACD, CPD e CPDA foram desenvolvidas na década de 1960, quando o sangue total foi predominantemente utilizado na terapia transfusional (SCOTT, 2005). Estas soluções são aprovadas para armazenamento de sangue total até 35 dias (FRIDEY, 2003). À medida que as lesões de armazenamento tornaram-se um reconhecido fator de redução da viabilidade pós-transfusional eritrocitária, a suplementação de soluções aditivas de armazenamento foram progressivamente alteradas para melhorar a qualidade dos glóbulos vermelhos armazenados. A solução aditiva SAG-M foi desenvolvida e prolongou o período de armazenamento para 42 dias (HESS; GREENWALT, 2002). Originalmente, as soluções aditivas são adicionadas ao concentrado de hemácias, após a centrifugação do sangue total e separação do plasma. Pesquisas no campo da medicina veterinária tem utilizado essas soluções na conservação de sangue total (COSTA JÚNIOR et al., 2006; BERTOLETTI, 2011; BARROS, 2011).
Várias abordagens mostraram serem eficazes na redução da taxa de hemólise e redução de danos de membrana durante o armazenamento, em que as mais populares são a utilização de PVC com plastificantes e a adição de estabilizadores de membrana tais como manitol e citrato (HÖGMAN, 1998).
A preservação hipotérmica de eritrócitos baseia-se no princípio de que os eventos bioquímicos e reações moleculares podem ser suprimidos por uma redução da temperatura. No contexto da biopreservação, condições hipotérmicas são aquelas em que a temperatura é inferior a temperatura fisiológica normal, mas superior ao ponto de congelamento da solução de armazenamento (SCOTT, 2005). Como as taxas de reações bioquímicas são dependentes da temperatura, o armazenamento a temperaturas de 1°C a 6°C minimizam a degradação dos eritrócitos por reduzir seu metabolismo em até 40 vezes. (HÖGMAN, 1998).
3.4 LESÕES ERITROCITÁRIAS DURANTE O ARMAZENAMENTO
Durante o armazenamento in vitro, os eritrócitos passam por mudanças que afetam sua função e viabilidade, muitas vezes referidas coletivamente como "lesões de armazenamento". Estas mudanças aumentam a preocupação com a oferta de oxigênio adequada, com o aumento da adesão de eritrócitos ao endotélio e com a deformabilidade eritrocitária prejudicada, que é necessária para sua passagem através de pequenos capilares (VAN DE WATERING, 2011). As lesões de armazenamento vão desde modificações microscópicas das células vermelhas, que podem resultar em danos irreversíveis e redução da sobrevivência pós-transfusional, até o acúmulo de substâncias biorreativas que podem influenciar a qualidade do sangue transfundido e contribuir para reações pós-transfusionais (CHIN-YEE et al., 1997).
Acredita-se que as alterações que ocorrem durante o processo de armazenamento são responsáveis por muitos dos efeitos adversos, cada vez mais reconhecidos, associados com a transfusão de eritrócitos (KOR et al., 2009). As alterações bioquímicas sobre os eritrócitos armazenados são principalmente relacionadas à alterações no metabolismo energético, com depleção do ATP. Devido ao seu papel central no metabolismo celular, os níveis adequados de ATP são essenciais para inumeráveis processos celulares. Exemplos incluem a manutenção da atividade da bomba Na+/K+, estabilidade da membrana de eritrócitos, transporte de glicose, mecanismos de defesa do estresse oxidativo, distribuição de fosfolipídios de membrana e vasodilatação regional sob condições de hipóxia (ALMAC et al., 2007).
Notavelmente, as alterações biomecânicas vistas nos eritrócitos durante o processo de armazenamento incluem: alterações na forma corpuscular, deformabilidade, fragilidade osmótica e agregabilidade (ALMAC et al., 2007). Como o diâmetro dos capilares variam de 3-8µm, alterações sutis na deformabilidade do eritrócito pode ter um impacto substancial na sua capacidade de atravessar a microcirculação. Têm-se demonstrado que estas mudanças afetam o trânsito de eritrócitos através da microcirculação, resultando em decréscimo da oxigenação tecidual (MARIK et al., 1993). Mudanças específicas na morfologia eritrocitária incluem a transição de um disco bicôncavo deformável para equinócitos pouco deformáveis com protrusões, e posteriormente para esferoequinócitos não deformáveis (HESS; GREENWALT, 2002).
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3.5 VIABILIDADE TRANSFUSIONAL DO SANGUE ARMAZENADO
Dos eritrócitos transfundidos no final do tempo de armazenamento, 20 a 25% se tornam inviáveis e são removidos da circulação dentro de algumas horas. As células que sobrevivem após 24h mostram uma vida normal, independentemente da duração do armazenamento (LUTEN, 2008).
Enquanto a depleção de ATP pode resultar em mudanças de deformação características, observadas no armazenamento prolongado de eritrócitos, estas alterações morfológicas são visivelmente revertidas com a normalização dos níveis de ATP. É importante ressaltar que esses níveis normalizam rapidamente após a transfusão. Além disso, a redução gradual dos níveis de ATP intracelular parece não se correlacionar bem com essas mudanças morfológicas (KOR et al., 2009).
Ao longo dos anos, estudos tem mostrado que os leucócitos podem exercer efeitos deletérios indiretos sobre os eritrócitos armazenados por consumir a glicose da solução conservadora e por liberar substâncias biorreativas. Durante o armazenamento ocorre ruptura dos leucócitos, promovendo liberação de imunomoduladores inflamatórios como histamina, mieloperoxidase e proteína eosinofílica catiônica (HÖGMAN, 1998).
A presença de leucócitos em produtos sanguíneos armazenados tem sido causa de reações febris decorrente da liberação de citocinas, imunossupressão pela diminuição da atividade das células Natural Killer e da fagocitose e lesões pulmonares devido à presença de agregado leucocitário, na circulação pulmonar. Dessa forma, a transfusão de sangue armazenado sem leucorredução (redução mediante filtração) pode desencadear reação inflamatória no receptor e assim potencializar ou ser mascarada, por doença primária que o receptor pode ter (MCMICHAEL et al., 2010).
Durante o armazenamento, a presença de leucócitos juntamente com os eritrócitos acelera a hemólise e aumenta o potássio extracelular, portanto a conservação é melhor quando se elimina a camada leucoplaquetária (HÖGMAN et al., 2002). A hemólise intravascular representa uma condição patológica severa em vários sistemas vitais, incluindo gastrointestinal, cardiovascular, pulmonar, urogenital, anormalidades hematológicas e renais (ROTHER, 2005). A redução de 80 a 90% dos leucócitos tem demonstrado redução dos riscos de reação pós transfusional (HÖGMAN, 1998).
A severidade da maioria das reações transfusionais é dose-dependente e seu reconhecimento precoce pode evitar maiores complicações. Assim, o paciente deve ser cuidadosamente monitorado, principalmente nos primeiros 30 minutos da transfusão. Quando se suspeitar de reações adversas, a transfusão deve ser interrompida imediatamente (por, no mínimo, 10 a 15 minutos) e o paciente avaliado. Deve-se verificar se a velocidade usada está correta. Sinais de febre leve ou de hipersensibilidade tipo I geralmente desaparecem e a transfusão pode ser reiniciada lentamente. Em grandes animais recomenda-se o tratamento de reações leves com administração de flunixin meglumine. A transfusão pode ser retomada em ritmo mais lento após 15 minutos. No caso de reações intensas, sugestivas de anafilaxia, é indicado o uso de drogas com ação adrenérgica, fluidoterapia intravenosa e glicocorticoides após a imediata interrupção da transfusão (GINGERICH, 1986; DURHAM, 1996; COLLATOS, 1997, STONEHAM, 1997; MORRIS, 1999).
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4 MATERIAL E MÉTODOS
O experimento foi conduzido nas dependências da Universidade Federal Rural do Semiárido – UFERSA. Todos os procedimentos, a que foram submetidos os animais, passaram por avaliação do Comitê de Ética da instituição, sendo aprovados sob parecer de número 59/2013.
Foram utilizados sete caprinos machos, adultos, castrados, sem raça definida, pesando em média 45 Kg. Eles passaram por um período de adaptação de sessenta dias, em que receberam capim Tanzânia (Panicum maximum) como volumoso, concentrado comercial para caprinos e sal mineral, sendo submetidos a exame parasitológico periodicamente, com administração de endoparasiticida1 e coccidiostático2.
4.1 COLETA E ARMAZENAMENTO DO SANGUE
O sangue coletado foi armazenado no Laboratório de Medicina Interna Veterinária - UFERSA, onde foram realizadas as análises em parceria com o Laboratório de Doenças Nutricionais e Metabólicas da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo (FMVZ/USP).
Antes da coleta realizou-se tricotomia e antissepsia da região jugular, sendo coletadas as duas bolsas simultaneamente por meio de venipunctura da veia jugular externa, ao mesmo tempo em que as mesmas eram homogeneizadas e pesadas em balança digital3. Para a pesagem considerou-se um mililitro de sangue sendo equivalente a um grama. De cada animal foram coletadas duas bolsas de sangue através da pesagem das mesmas, totalizando 900g de sangue, dividido em partes iguais. As bolsas plásticas continham solução anticoagulante/preservadora, sendo uma com citrato-fosfato-dextrose-adenina (CPDA-1)4 e
1 Endazol 10% cobalto, IRFA – Química e Biotecnologia Industrial LTDA. 2 Coccifin, Ouro Fino Produtos Veterinários.
3 Balança Comercial Coiman – Modelo BN, Coiman®, Comércio e Indústria de Madeiras e Metalúrgica São
Cristóvão, Dracena, Brasil.
outra contendo citrato-fosfato-dextrose/salina-glicose-manitol (CPD/SAG-M)1, conforme o quadro 1.
Quadro 1. Composição das bolsas plásticas tipo CPDA-1 e CPD/SAG-M, nas quais foi acondicionado o sangue total caprino.
COMPONENTE CPDA-1 CPD/SAG-M
Ácido Cítrico 0,229g 0,229g
Citrato de Sódio 2,63g 2,63g
Fosfato Diácido de Sódio 0,222g 0,222g
Glicose 3,19g 3,45g
Adenina 0,0275g 0,017g
Manitol nc 0,525g
Cloreto de Sódio nc 0,877g
Fonte: Fresenius hemocare. nc: não contém.
As bolsas foram armazenadas em refrigerador durante 42 dias e mantidas a temperatura média de 3ºC, sendo homogeneizadas uma vez ao dia. Durante esse período foram feitas avaliações semanais da qualidade do sangue armazenado por meio da mensuração de variáveis hematológicas, variáveis bioquímicas, variáveis hemogasométricas e microbiologia.
4.2 AVALIAÇÃO DO SANGUE ARMAZENADO
4.2.1 Tempos experimentais
A avaliação do sangue total caprino armazenado, por meio de análises hematológicas, bioquímicas, hemogasométricas e microbiologia, foi realizada em sete momentos, conforme demonstra o quadro 2.
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Quadro 2. Tempos experimentais em que foram realizadas as análises das amostras do sangue total caprino armazenado.
Tempos Momentos de avaliação
T0 Imediatamente após a coleta
T7 Sete dias após a coleta
T14 Quatorze dias após a coleta
T21 Vinte e um dias após a coleta
T28 Vinte e oito dias após a coleta
T35 Trinta e cinco dias após a coleta
T42 Quarenta e dois dias após a coleta
4.2.2 Hemograma
Foi utilizada uma alíquota do sangue armazenado de cada bolsa para contagem de eritrócitos, leucócitos, determinação do volume globular e determinação da hemoglobina total e plasmática.
A contagem de eritrócitos e leucócitos foi realizada pelo método manual em Câmara de Neubauer por macrodiluição seguindo os procedimentos de Hendrix (2005). A mensuração do volume globular foi obtida em centrífuga para microhematócrito, sendo utilizados tubos capilares de 75 mm, onde as amostras foram centrifugadas a uma força real de centrifugação de 12.500 g, por 15 minutos e, posteriormente, lidas em tabela de microhematócrito (KERR, 2003). As concentrações de hemoglobina plasmática e total foram determinadas pelo método da cianometahemoglobina, onde 10µL de plasma ou sangue eram diluídos em 2,5mL de solução de Drabkin, sendo realizada leitura posterior em espectrofotômetro, a 540nm conforme Hendrix (2005). O grau de hemólise foi calculado de acordo com Mudge et al., (2004), seguindo a fórmula abaixo:
Grau de hemólise (%)=(100-Ht) x Hb Plasmática (g/dL) Hb Total (g/dL)
4.2.3 Avaliação bioquímica
As variáveis bioquímicas mensuradas foram glicose, lactato, sódio, potássio e proteínas plasmáticas. Para isso foram coletadas alíquotas de sangue armazenado nas bolsas em tubo de ensaio, centrifugadas para obtenção do plasma, congelado a -20ºC e, posteriormente, descongeladas a temperatura ambiente para mensuração das variáveis. As concentrações de glicose, lactato e proteínas plasmáticas totais foram determinadas em analisador bioquímico automatizado1 utilizando kits comerciais. A concentração plasmática de sódio e potássio foi determinada por fotometria de chama, sendo as amostras diluídas em água deionizada (1:200) e posteriormente lidas em fotômetro2.
4.2.4 Avaliação Hemogasométrica
Em cada tempo experimental foram retiradas alíquotas de meio mililitro de sangue de cada bolsa em seringa tipo insulina, sendo hermeticamente fechada e acondicionada em caixa isotérmica com gelo e água para determinação das variáveis hemogasométricas do sangue armazenado, por meio de aparelho de gasometria portátil3, utilizando cartuchos comerciais específicos4. As variáveis mensuradas foram pH, pressão parcial de oxigênio (pO2), pressão parcial de Dióxido de Carbono (pCO2), saturação de oxigênio (sO2), bicarbonato (HCO3), déficit de base (BE) e Dióxido de Carbono total (TCO2).
1 Modelo RX Daytona, Randox®. 2 Fotômetro CELM®.
3 Equipamento portátil de análise sanguínea, modelo i – STAT, Abbott Point Care®. 4 Cartucho para teste diagnóstico rápido CG4+, Abbott Point Care®.
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4.2.5 Avaliação microbiológica
Foram retiradas alíquotas de meio mililitro de sangue de cada bolsa em seringa estéril, hermeticamente fechadas e enviadas ao Laboratório de Inspeção de Produtos de Origem Animal (LIPOA) da UFERSA. Em placas de Petri esterilizadas colocou-se aproximadamente 15 mL do meio ágar sangue (Blood Ágar Base adicionado com 5% de sangue de carneiro) e após a solidificação semeou-se uma alíquota de sangue com auxílio da alça de Drigalski em placa de Petri devidamente identificada com os números das amostras. Em seguida, as placas foram colocadas em estufa a 36°C por 48 horas. Após este período, realizou-se leitura com auxílio de contador de colônias. Todo este procedimento foi realizado em fluxo laminar.
4.3 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Para se conhecer a distribuição dos dados obtidos nas diversas variáveis estudadas os mesmos foram submetidos ao teste de Kolmogorov e Smirvov. Como os dados in totum apresentaram distribuição normal, os mesmos foram submetidos inicialmente à análise de variância de medidas repetidas de duas vias (Two-way repeted mensure ANOVA) seguidas de teste de comparação de média de Bonferoni, considerando o efeito do tipo de bolsa (CPDA-1 ou SAG-M) e o efeito do tempo (diferentes momentos de coletas). Foi utilizado software estatístico GraphPad Prisma para execução das análises sendo considerado um nível de significância de 5%.
5 RESULTADOS
5.1 HEMOGRAMA
5.1.1 Contagem de Eritrócitos
Não houve diferença (p>0,05) na manutenção do número de eritrócitos, na comparação entre os dois tipos de bolsa em estudo.
Na bolsa CPDA-1 não houve diferença (p>0,05) entre o tempo inicial (T0) e os demais. Na bolsa SAG-M se observou resultado semelhante em que as médias de cada momento não diferiram da média de T0, sendo menor (p<0,05) apenas no T14 (Tabela 1 e Figura 1).
Tabela 1. Valores médios (X) e desvios padrões (S) do Número de Eritrócitos (x106/µL) do sangue total caprino armazenado em bolsas CPDA-1 e SAG-M, nos momentos (T) analisados.
CPDA-1 T0 T7 T14 T21 T28 T35 T42 X 12,69 12,99 12,26 13,84 13,3 13,13 13,5 S 1,45 1,56 1,39 2,40 1,86 1,76 1,94 SAG-M X 12,6a 10,93ab 10,61b 11,41ab 10,99ab 11,24ab 11,63ab S 2,58 1,33 1,12 1,71 1,09 1,25 2,11
Médias seguidas de letras diferentes minúsculas na linha diferem entre si, segundo o teste de Bonferoni (p<0,05). Médias acompanhadas de letras diferentes maiúsculas na coluna diferem entre si, segundo análise de variância (ANOVA - Two–way) (p<0,05).
40
Figura 1. Representação dos valores médios do número de eritrócitos do sangue armazenado em bolsas CPDA-1 e CPD/SAG-M, nos dias analisados.
5.1.2 Volume Globular (VG)
A bolsa SAG-M apresentou valores de VG menores (p<0,05) do que a bolsa CPDA-1 do momento T7 até o momento final (T42) (Tabela 2).
Na comparação do T0 com os outros tempos, as médias do VG não diferiram (p>0,05) nos dois tipos de bolsa (Figura 2).
Tabela 2. Valores médios (X) e desvios padrões (S) do Volume Globular (%) do sangue total caprino armazenado em bolsas CPDA-1 e SAG-M, nos momentos (T) analisados.
CPDA-1 T0 T7 T14 T21 T28 T35 T42 X 20,29 A 21,00 A 20,86 A 21,29 A 20,71 A 21,86 A 21,43 A S 1,60 1,91 2,27 2,29 1,60 2,12 3,95 SAG-M X 18,29A 17,57B 17,14B 17,29 B 17,14 B 16,71 B 18,14 B S 3,45 1,90 1,46 1,38 1,46 1,50 1,77
Médias seguidas de letras diferentes minúsculas na linha diferem entre si, segundo o teste de Bonferoni (p<0,05). Médias acompanhadas de letras diferentes maiúsculas na coluna diferem entre si, segundo análise de variância (ANOVA - Two–way) (p<0,05). 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 0 7 14 21 28 35 42 Nú m er o d e E ritró cito s (x 1 0 6 /µL ) Tempo (dias) CPDA-1 SAG-M
Figura 2. Representação dos valores médios do Volume Globular (%) do sangue armazenado em bolsas CPDA-1 e CPD/SAG-M, nos dias analisados.
5.1.3 Volume Corpuscular Médio (VCM)
Comparando-se os dois tipos de bolsas em estudo, não se observou diferença (p>0,05) do VCM durante o experimento.
Na comparação entre os tempos, tanto na bolsa CPDA-1 como na SAG-M não se observou diferença (p>0,05) nos valores médios do volume corpuscular médio (Tabela 3 e Figura 3).
Tabela 3. Valores médios (X) e desvios padrões (S) do Volume Corpuscular Médio (fL) do sangue total caprino armazenado em bolsas CPDA-1 e SAG-M, nos momentos (T) analisados.
CPDA-1 T0 T7 T14 T21 T28 T35 T42 X 16,09 16,29 17,07 15,60 15,70 16,74 15,87 S 0,90 1,11 1,28 1,74 1,28 1,14 1,45 SAG-M X 15,23 16,39 16,34 15,51 15,90 15,00 15,99 S 2,89 2,66 2,24 2,65 2,05 2,21 3,40
Médias seguidas de letras diferentes minúsculas na linha diferem entre si, segundo o teste de Bonferoni (p<0,05). Médias acompanhadas de letras diferentes maiúsculas na coluna diferem entre si, segundo análise de variância (ANOVA - Two–way) (p<0,05). 0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 0 7 14 21 28 35 42 Vo lu m e Glo b u lar ( %) Tempo (dias) CPDA-1 SAG-M
42
Figura 3. Representação dos valores médios do Volume Corpuscular Médio (fentolitros) do sangue armazenado em bolsas CPDA-1 e CPD/SAG-M, nos dias analisados.
5.1.4 Concentração de Hemoglobina Total
Em todos os momentos os valores da concentração de hemoglobina total foram menores (p<0,05) na bolsa SAG-M quando comparados aos observados na bolsa CPDA-1 (Figura 4).
Já na comparação do momento inicial (T0) com os momentos seguintes a bolsa SAG-M manteve sem diferença (p>0,05) seus valores de hemoglobina total até o momento T21, e a partir do T28 se observou uma ligeira redução (p<0,05) até o momento final (T42). Na bolsa CPDA-1 ocorreu uma ligeira redução destes valores (p<0,05), mas, a partir do momento T21 (Tabela 4). 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 0 7 14 21 28 35 42 Vo lu m e C o rp u scu lar Mé d io ( fen to litro s) Tempo (dias) CPDA-1 SAG-M
Tabela 4. Valores médios (X) e desvios padrões (S) da Concentração de Hemoglobina Total (g/dL) do sangue total caprino armazenado em bolsas CPDA-1 e SAG-M, nos momentos (T) analisados.
CPDA-1 T0 T7 T14 T21 T28 T35 T42
X 7,73Aa 7,66 Aa 7,49 Aab 7,26 Abc 7,04 Ac 7,19 Abc 6,39 Ad
S 0,61 0,59 0,56 0,53 0,58 0,52 0,66
SAG-M
X 6,29Ba 6,29 Ba 6,17 Bab 6,07 Bab 5,93 Bbc 5,74 Bc 5,36 Bd
S 0,41 0,51 0,42 0,42 0,40 0,41 0,43
Médias seguidas de letras diferentes minúsculas na linha diferem entre si, segundo o teste de Bonferoni (p<0,05).
Médias acompanhadas de letras diferentes maiúsculas na coluna diferem entre si, segundo Análise de variância (ANOVA - Two–way) (p<0,05).
Figura 4. Representação dos valores médios da Hemoglobina Total (g/dL) do sangue armazenado em bolsas CPDA-1 e CPD/SAG-M, nos dias analisados.
5.1.5 Concentração de Hemoglobina Plasmática
Em todos os momentos os valores da concentração de hemoglobina plasmática foram menores (p<0,05) na bolsa CPDA-1 quando comparados aos observados na bolsa SAG-M (Figura 5). 0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00 0 7 14 21 28 35 42 Hem o g lo b in a T o tal (g /d L ) Tempo (dias) CPDA-1 SAG-M
44
Já na comparação do momento inicial (T0) com os momentos seguintes, a bolsa SAG-M manteve sem diferença (p>0,05) seus valores de hemoglobina plasmática até o momento T7, e a partir do T14 se observou aumento (p<0,05) até o momento final (T42). Na bolsa CPDA-1 também ocorreu aumento (p<0,05) destes valores, a partir do momento T7 (Tabela 5).
Tabela 5. Valores médios (X) e desvios padrões (S) da Concentração de Hemoglobina Plasmática (g/dL) do sangue total caprino armazenado em bolsas CPDA-1 e SAG-M, nos momentos (T) analisados. CPDA-1 T0 T7 T14 T21 T28 T35 T42 X 0,004Bf 0,005Be 0,006Bd 0,009Bc 0,011Bb 0,011Bb 0,012Ba S 0,0005 0,0011 0,0008 0,0015 0,0008 0,0007 0,0007 SAG-M X 0,011Ad 0,011Ad 0,012Ac 0,014Ab 0,014Ab 0,015Aa 0,015Aa S 0,0005 0,0008 0,0008 0,0005 0,0007 0,0005 0,0008
Médias seguidas de letras diferentes minúsculas na linha diferem entre si, segundo o teste de Bonferoni (p<0,05).
Médias acompanhadas de letras diferentes maiúsculas na coluna diferem entre si, segundo Análise de variância (ANOVA - Two–way) (p<0,05).
Figura 5. Representação dos valores médios da Hemoglobina Plasmática (g/dL) do sangue armazenado em bolsas CPDA-1 e CPD/SAG-M, nos dias analisados.
0,000 0,002 0,004 0,006 0,008 0,010 0,012 0,014 0,016 0 7 14 21 28 35 42 Hem o g lo b in a P lasm ática ( g /d L ) Tempo (dias) CPDA-1 SAG-M
