Identificação e avaliação de propriedades de polissacarídeos sulfatados de diferentes fontes naturais que possibilitem sua aplicabilidade biotecnológica

Texto

(1)MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE. IDENTIFICAÇÃO E AVALIAÇÃO DE PROPRIEDADES DE POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DE DIFERENTES FONTES NATURAIS QUE POSSIBILITEM SUA APLICABILIDADE BIOTECNOLÓGICA. NEDNALDO DANTAS DOS SANTOS. Natal/RN 2012.

(2) NEDNALDO DANTAS DOS SANTOS. IDENTIFICAÇÃO E AVALIAÇÃO DE PROPRIEDADES DE POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DE DIFERENTES FONTES NATURAIS QUE POSSIBILITEM SUA APLICABILIDADE BIOTECNOLÓGICA. Tese. apresentada. à. Coordenação. do. Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial para a obtenção do título de Doutor em Ciências da Saúde.. Orientador: Prof. Dr. Hugo Alexandre de Oliveira Rocha.. NATAL/RN 2012.

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(4) MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE. Coordenadora do Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde: Profa. Dra. Ivonete Batista de Araujo.

(5) NEDNALDO DANTAS DOS SANTOS. IDENTIFICAÇÃO E AVALIAÇÃO DE PROPRIEDADES DE POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DE DIFERENTES FONTES NATURAIS QUE POSSIBILITEM SUA APLICABILIDADE BIOTECNOLÓGICA. Aprovado em: 19 de Março de 2012 Banca Examinadora:. Presidente da Banca: Prof. Dr. Hugo Alexandre de Oliveira Rocha (UFRN). Membros da Banca: Prof. Dra Giulianna Paiva Viana de Andrade Souza (UFRN) Prof. Dra Valeria Soraya de Farias Sales (UFRN) Prof. Dr Danilo José Ayres de Menezes (UFCG) Prof. Dr Eduardo Henrique Cunha de Farias (UNIFESP).

(6) AGRADECIMENTOS. Primeiramente, a Deus, por ter me dado força para continuar seguindo em frente mesmo diante das dificuldades. Aos meus pais, Nilo (homenagem póstuma) e Sueli, por ficarem felizes com minhas vitórias, por sempre estarem ao meu lado, me apoiando e incentivando. Amo muito vocês! Ao meu professor e meu orientador Dr. Hugo Alexandre, pelos ensinamentos, confiança, credibilidade e paciência para o desenvolvimento desse trabalho e, principalmente, por sua amizade durante esses anos. À Universidade Federal do Rio Grande do Norte e Universidade do Minho por fornecerem as condições necessárias para realização deste trabalho. Ao CNPq, CAPES e FCT por financiarem este trabalho. A todos os professores e funcionários do Departamento de Bioquímica, em especial, as Professoras Edda Lisboa e Luciana da Matta e ao professor Elizeu Antunes pelo convívio e ensinamentos desde a minha graduação. A todos os professores e funcionários do Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, em especial, a Professora Ivonete e aos professores Arthur Carriço e Sócrates Egito pelo convívio e ensinamentos no decorrer do doutorado. À Professora Dra. Kátia Scostecci, por nossas conversas, pelo estágio no grupo de Plantas permitindo que trabalhasse com. Biológia Molécular e por me permitir. colaborar com seu grupo no transcorrer destes anos. Ao BIOPOL, minha segunda casa, e a todos que fazem parte deste grupo: Prof. Hugo (por ter me dado a oportunidade de fazer parte dessa caminhada de aprendizado), Ivan e Leandro (por terem me acolhido e por terem me ensinado muito do que hoje eu sei), Sara e Mariana (minhas grandes amigas e irmãs no laboratório e.

(7) na minha vida), Jailma (pela amizade, caronas e por sempre me tirar do sufoco quando precisei), Dayanne (minha primeira IC que juntos acreditamos no potencial da Eichhornia), Popó (pelas coletas,. brincadeiras, ajuda e trocas de idéias sobre. cromatografia), Ruth e Rafael (pela alegria, pelas conversas, pelas coletas e pelas piadas que sempre me alegraram), Cinthia (uma menina de grande potencial), Edjane (pelo carinho que me tens), Leonardo (pelas palhaçadas e descontração), Gabriel e Arthur (por estarem sempre dispostos a ajudar), Rony (um jovem de espirito iluminado), Raniere, Fernando, Karol (pelo carinho), Ana Karina (primeira do grupo de fitoquimicos), Ingrid e Jessica (as nedetes),. Letícia, Moacir, Daniel, Max, Vinicius.. Enfim, obrigada a todos pelo auxílio nesses mais de dez anos, juntos crescemos como pesquisadores e como pessoas, sorrindo e chorando em alguns momentos. Obrigado por tudo! Nunca me esquecerei de vocês!!! À Jailma, Mariana, Dayanne e Mauricio por me ajudarem na finalização desta tese. À Ruth e Rafael meus queridos amigos pela ajuda nos experimentos e, além disso, pela sua amizade, carinho e apoio. Obrigado! À Mariana, minha amiga desde minha entrada no BIOPOL. Obrigado por sua amizade, por sempre me apoiar, pelo incentivo durante os obstáculos, pelas palavras de força nos momentos de tristezas, por se alegrar comigo e por estar comigo no hospital quando se fez preciso…rsrsrs... Adoro você minha amiga e irmã de coração!!! À Jailma por ser a pessoa critica mais que consegue ter um coração generoso, pela amizade, pelo carinho, pelo apoio, por estar sempre disposta a me ajudar, por compartilhar seus conhecimentos inúmeros sobre tantos assuntos e entre eles sobre nanopartículas. És muito especial para mim!!! Aos vários colegas de Departamento de Bioquímica pela convivência, pelos sorrisos e conversas nos corredores do DBQ, Cleysyvan, Marília, , Virgínia, Núbia,.

(8) Claúdio, Sergio, Tati, Gloria e aos antigos amigos Adeliana, Edurdo Farias, Fernanda, Celina, Ana... em especial a minha amiga Luciana (a safada!). Aos meus amigos Ana Maria e Adriano (por estarem sempre perto), a Pe Thiago Theyse (pelos incentivo para continuar estudando), Luiz Teixeira, Adriana e Edesio (pela amizade e disposição em sempre ajudar), Pe Silvio (pela confiança nas tarefas paroquiais), Fabiano e Terinalda (meus compadres) e Manuel Souza, obrigado pela amizade de vocês. A todos os meus amigos obrigado pela oportunidade de compartilhar os momentos de minha vida e por me ajudarem a conhecer cada vez mais a Deus. Amo vocês! Ao meu amigo Mauricio Alcântara, que foi um ponto de apoio em momentos difíceis nessa caminhada me estimulando e incentivando a continuar sempre firme em meus objetivos e por me acolher em sua família. E a todos que, por um acaso, tenham ficado fora dessa lista, que se sintam agradecidos da mesma forma, pois não estaria aqui sem que vocês me apoiassem..

(9) “Ninguém é suficientemente perfeito, que não possa aprender com o outro e, ninguém é totalmente destituído de valores que não possa ensinar algo ao seu irmão.”. São Francisco de Assis.

(10) RESUMO Os polissacarídeos sulfatados (PS) são amplamente distribuídos em animais e tecidos de algas. Estes polímeros têm sido estudados em função da importância de suas atividades farmacológicas, tais como: anticoagulante, antioxidante, antitumoral, anti-inflamatória e as propriedades antivirais. Contudo, o potencial dos PS para sintetizar biomateriais, tais como nanopartículas, ainda é pouco explorado. Até então, os PS só foram encontrados em seis plantas e todas habitam ambientes salino. Não havendo relatos de PS em plantas de água doce. O que nos levou aos seguintes questionamentos: Os PS extraidos de vegetais marinhos não apresentam atividades farmacológicas? Os vegetais de água doce realmente sintetizam PS? É possível sintetizar nanopartículas utilizando PS a partir de algas marinhas? Para melhor entender as questões, esta tese foi dividida em três capítulos. No primeiro capítulo, um polissacarídeo sulfatado (SPSG) foi isolado a partir de um vegetal marinho Halodule wrightii. Os dados aqui apresentados mostram que o SPSG é uma heterogalactana sulfatada de 11 kDa constituida de glucose e xilose. Os ensaios realizados sugerem que o SPSG possue propriedades antioxidantes notáveis em diferentes ensaios in vitro e uma excelente actividade anticoagulante de 2,5 vezes mais elevadas do que a de heparina Clexane ® no teste APTT. No capítulo seguinte, utilizando ferramentas diferentes, tais como análises químicas e histológicas, análise de dispersão de raios-X (EDXA), eletroforese em gel e espectroscopia de infra-vermelho,confirmamos, em primeira mão, a presença de polissacarídeos sulfatados em vegetais de água doce. Além de demonstrarmos que o PS extraído a partir da raiz de E. crassipes tem potencial como um composto anticoagulante.No último capítulo uma fucana, um polissacárido sulfatado, extraído a partir de uma alga marrom, foi quimicamente modificada por adição de hexadecilamina à cadeia principal do polímero hidrofílico. O material resultante (SNFuc) forneceu partículas nanométricas. O grau de substituição para as cadeias hidrofóbicas de 1H RMN foi de aproximadamente 93%. SNFuc em meios aquosos tinha um diâmetro médio de 123 nm e potencial zeta de -38,3 ± 0,74 mV. Os ensaios com células tumorais (HepG2, 786, H-S5) demonstrou a ocorrência de uma inibição que variou de 2,0-43,7% em concentrações diferentes de SNFuc (0,05-0,5 mg / mL) resultado semelhante foi obtido com a RAEC monstrando uma inibição entre 8,0-22,0%. Por outro lado, o nanogel estimulou a proliferação de linhagens celulares não tumorais como CHO e RAW nas mesmas concentrações. Análise por citometria de fluxo revelou que este nanogel de fucana inibiu a proliferação celular de 786 por mecanismos dependentes e independentes de caspases. Além disso, bloqueou a passagens da célula 786 na fase S e G2-M do ciclo celular. Palavras chaves: Polissacarídeos sulfatados. Capim do mar; macrófitas aquáticas; atividade anticoagulante; nanopartículas de fucana..

(11) ABREVIATURAS. ATCC. American Type Culture Collection. BIOPOL. Laboratório de Biotecnologia de Polímeros Naturais da UFRN. CS. Condroitim sulfato. Fuc A. Fucana A. Fuc B. Fucana B. Fuc C. Fucana C. GAGs. Glicosaminoglicanos. HS. Heparam sulfato. mg. miligrama. mL. Mililitro. MTT. 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide. nm. Nanômetro. PBS. Phosphate Buffer Saline. PDA. 1,3 diamino propano acetato. PGs. Proteoglicanos. PS. Polissacarídeos sulfatados. µg. Micrograma. µL. Microlitro.

(12) LISTA DE FIGURAS. Figura 1-Estrutura proposta por Aquino para a galactana sulfatada purificada de Ruppia marítima. Fonte: Aquino et al., 2005 …………………………………………………....... 18. Figura 2-Lâmina de eletroforese em gel de agarose das fucanas A, B e C da alga Spatoglossum schröederi. Foram aplicados 50 µg de cada fucana e apos a corrida elas foram coradas com azul de toluidina. Fuc A - fucana A; Fuc B - fucana B; Fuc C fucana C. Fonte: Hugo A O Rocha (Rocha, 2002) ……………………………………… 19.

(13) SUMÁRIO. 1 INTRODUÇÃO ……………………………………………………………….. 13. 2 REVISÃO DE LITERATURA ……………………………………………….. 16. 3 ANEXAÇÃO DOS ARTIGOS PUBLICADOS …………………………….. 22. 4 ANEXAÇÃO DO ARTIGO SUBMETIDO ………………………………….. 47. 5 COMENTÁRIOS FINAIS, CRÍTICAS E CONCLUSÕES ………………... 65. 6 REFERÊNCIAS ………………………………………………………………. 69. 7 ABSTRACT …………………………………………………………………... 79.

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