UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO
NÚCLEO DE PESQUISAS EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS - NUPEB PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA
SÍNTESE E FUNCIONALIZAÇÃO DE
NANOPARTÍCULAS INALATÓRIAS E AVALIAÇÃO IN
VITRO PARA TRATAMENTO DE TUBERCULOSE
Simone Pinto Carneiro
Ouro Preto - MG 2018
SIMONE PINTO CARNEIRO
SÍNTESE E FUNCIONALIZAÇÃO DE
NANOPARTÍCULAS INALATÓRIAS E AVALIAÇÃO IN
VITRO PARA TRATAMENTO DE TUBERCULOSE
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia da Universidade Federal de Ouro Preto como requisito para a obtenção do grau de Doutor em Biotecnologia.
Orientador: Prof. Dr. Orlando David Henrique dos Santos
Co-orientador: Prof. Elias Fattal (Université Paris-Sud/France)
Ouro Preto - MG 2018
COLABORADORES Prof. Dr. Milton Hércules Guerra de Andrade (UFOP) Prof. Dr. Cláudia Martins Carneiro (UFOP)
Dr. Rodrigo Dian de Oliveira Aguiar Soares (UFOP) Prof. Dr. Maria Irene Yoshida (UFMG)
Prof. Dr. Rafael Silva Duarte (UFRJ) Dr. Laurence Moine (Université Paris-Sud) Dr. Valérie Nicolas (Université Paris-Sud)
DEDICATÓRIA
“A felicidade só é real se compartilhada”. Dedico este trabalho às minhas maiores inspirações da vida: mamãe, Nena, Rê e Rick, e à vovó, minha menina dos olhos e maior saudade.
AGRADECIMENTOS
Agradeço à Deus, por iluminar meu caminho e me conceder paz, saúde e fé para encarar todos os desafios da vida.
À minha amada família: Mamãe, Nena, Rê e Rick, por darem sentido aos meus sonhos e por me permitirem acreditar que o céu é o limite. Ao Smili, por compartilhar o amor comigo e fazer o mundo se tornar pequeno para nós dois. Aos meus amigos, sempre presentes na primeira fila da minha torcida.
Ao meu orientador Orlando, pela sua admirável qualidade de nunca perder a sensibilidade e humanidade em virtude dos prazos ou expectativas. Obrigada pelos ensinamentos, troca e ótima convivência durante todos esses anos de trabalho, pela confiança e apoio em todas as etapas.
Ao Prof. Milton Guerra pela disponibilidade e total dedicação para concretizarmos sua essencial colaboração neste trabalho.
Ao Dr. Rodrigo Dian, pela parceria, ensinamentos técnicos e total entrosamento com a minha pesquisa.
Ao Laboratório de Microscopia e Microanálises do DEGEO/UFOP – Laboratório integrante da RMIc, Rede de Microscopia e Microanálise de Minas Gerais – FAPEMIG, pelas imagens de microscopia.
Ao NUPLAM (Núcleo de Pesquisa em Alimentos e Medicamentos), da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, pela generosidade em ceder uma das matérias-primas, ao Prof. Rafael Duarte, da Universidade Federal do Rio de Janeiro, pela parceria.
Ao meus amigos e parceiros de laboratório, pela convivência tão agradável, leve e alegre. Guardo com carinho nosso dia-a-dia e o apoio que recebi de cada um. Em especial, à Karen, pela amizade, colaboração, congressos e tantos momentos especiais.
Ao Pr. Elias Fattal, por ter aberto as portas do seu laboratório para que eu realizasse meu maior sonho de integrar sua equipe na França. Obrigada por ter me recebido tão bem, por ter me ensinado tanto e me dado tantas oportunidades profissionais. Além de parceiro profissional, você é mais um amigo que agora tenho espalhado pelo mundo. Merci!
À Dr. Laurence Moine, minha co-orientadora na França, tão amável, presente e competente. Obrigada por ter estado ao meu lado todos os dias, me dando um suporte indispensável para meu crescimento na pesquisa.
Aos meus colegas de laboratório franceses e estrangeiros, por terem me feito sentir em casa, e por deixarem saudades dos nossos momentos especiais.
À Anne Beilvert, Emeline Servais, Audrey Solgadi, Valérie Nicolas, Nicolas Tsapis, Barbara Tessier, pelo suporte com experimentos, técnicas e conselhos científicos imprescindíveis em diferentes etapas do nosso trabalho.
À plataforma BioCis pelas análises de RMN e à Imagerie-Gif, pela microscopia. À Capes, pelo apoio financeiro.
Agradeço ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, à Escola de Farmácia da Universidade Federal de Ouro Preto, pela formação acadêmica, e a todos os professores, amigos e funcionários que contribuíram para a conclusão deste trabalho.
RESUMO
A tuberculose é uma doença bacteriana infecciosa considerada um grave problema de saúde pública, por ser classificada como a principal causa de morte no mundo por um único agente infeccioso. A OMS recomenda um protocolo de tratamento eficaz, porém, a terapia convencional requer a administração de altas doses diárias de cada medicamento pela via oral para uma resposta satisfatória do paciente, o que culmina na emergência de efeitos adversos graves, reduzindo a adesão à terapia. Neste contexto, o objetivo deste trabalho é sintetizar e funcionalizar nanopartículas inalatórias destinadas ao tratamento de tuberculose e avaliar, in vitro, suas propriedades físico-químicas, toxicidade e atividade biológica. O trabalho empregou estratégias distintas para o desenvolvimento de nanopartículas contendo fármacos antituberculosos. Uma das estratégias consistiu na aplicação de uma metodologia físico-química, em que carreadores lipídicos nanoestruturados de rifampicina foram obtidos pelo método da microemulsão. Esta nanoformulação foi funcionalizada com um peptídeo modificado baseado na sequência da tuftsina, o qual foi previamente sintetizado em fase sólida e, em seguida, acoplado à superfície das nanopartículas para vetorizar o carreador (NP-pRIF). As nanopartículas foram caracterizadas, confirmando a obtenção de um sistema de liberação monodisperso e estável. Os ensaios em cultura de células demonstraram que a NP-pRIF apresentou um potencial de internalização pelos macrófagos significativamente maior que as nanopartículas de rifampicina sem o peptídeo (NP-RIF). Os estudos de citotoxicidade constataram o potencial não-citotóxico de ambas as formulações (NP-pRIF e NP-RIF) em todas as concentrações testadas. Ainda, a eficácia da formulação foi testada frente ao Mycobacterium tuberculosis e apresentou uma concentração inibitória mínima 2 vezes menor que a requerida por uma solução do fármaco puro. Para viabilizar a administração pulmonar, as suspensões de nanopartículas foram acrescidas de manitol e submetidas à secagem por atomização por spray-drying, dando origem a um pó fino, fluido e caracterizado por microscopia eletrônica de varredura como micropartículas esféricas, com tamanho de partícula entre 2 – 10 μm. Os testes in vitro demonstraram o potencial de redispersão das micropartículas em água e liberação das nanopartículas alojadas em seu interior. A outra estratégia abordada neste trabalho envolveu o emprego de uma metodologia química para proceder à síntese de dois conjugados constituídos por um fármaco antituberculoso (rifampicina ou ácido pirazinoico) e o poli(ácido málico), através de reações de esterificação. Em seguida, os conjugados se auto-agregaram em água para a obtenção dos respectivos nanoconjugados (NC-RIF e NC-PA, respectivamente), confirmados pelas imagens de microscopia eletrônica de transmissão. Os testes em cultura de células demonstraram que ambos os nanoconjugados foram eficientemente internalizados pelos macrófagos e que as formulações não apresentaram potencial citotóxico para a maioria das concentrações testadas. Estas formulações serão futuramente secas em spray-drying para obtenção de micropartículas e viabilização da administração pulmonar. Em conclusão, ambas as estratégias empregadas neste trabalho foram eficientes na obtenção de nanocarreadores inovadores e com potencial para contribuição na otimização do tratamento da tuberculose.
Palavras-chave: tuberculose, nanopartículas funcionalizadas, micropartículas, nanoconjugados, rifampicina, ácido pirazinoico, poli(ácido málico).
ABSTRACT
Tuberculosis is an infectious bacterial disease that is considered a public health concern as it is the leading cause of death from a single infectious agent worldwide. WHO recommends an efficient treatment protocol, however, conventional therapy demands high amounts of drugs daily administered by oral route to achieve a successful patient response, which leads to the emergence of severe adverse effects and decreases patient compliance. The goal of this work is to synthesize and functionalize inhaled nanoparticles for treating tuberculosis and to evaluate in vitro physicochemical properties, toxicity and biological activity. This study employed distinct strategies to develop nanoparticles loaded with anti-tuberculosis drugs. One of these strategies consisted on applying a physicochemical methodology to produce rifampicin nanostructured lipid carriers by microemulsion method. This nanoformulation was functionalized with a modified peptide based on tuftsin sequence, which was previously synthesized on solid phase and thus, attached on nanoparticles surface to vectorize the nanocarrier (NP-pRIF). Nanoparticles were characterized to confirm the production of a monodisperse and stable drug delivery system. Cell culture assays demonstrated that NP-pRIF was significantly more taken up by macrophages than naked rifampicin nanoparticles (NP-RIF). Cytotoxicity studies evidenced the non-toxic potential from both formulations (NP-pRIF and NP-RIF) in a wide range of concentrations. Moreover, nanoparticles efficacy was tested and revealed to be 2-fold more effective against Mycobacterium tuberculosis than free rifampicin. Nanoparticles suspension were added by mannitol and submitted to atomization drying process by spray-drying in order to enable pulmonary administration. The powder obtained was characterized as fine and fluid microparticles, which were further assessed by scanning electron microscopy as spherical shape with a range of particle size between 2 – 10 μm. In vitro tests evaluated the microparticles potential of redispersion in water and their further capacity of releasing nanoparticles stocked inside them. The other strategy employed in this work involved the use of a chemical methodology to synthesize two conjugates constituted by an anti-tuberculosis drug (rifampicin or pyrazinoic acid) and the poly(malic acid). Conjugates were synthesized by esterification reactions and they posteriorly self-assembled into nanoconjugates (NC-RIF e NC-PA, respectively), which was confirmed by transmission electron microscopy images. Cell culture assays proved that both nanoconjugates were successfully taken up by macrophages and that they did not present a cytotoxic potential for the most of concentrations evaluated. These nanoconjugates will be dried by spray-drying and entrapped into trojan microparticles in the future steps to ensure pulmonary administration. In conclusion, both strategies were successfully employed to produce innovative and promising nanocarriers to contribute with the management of tuberculosis.
Keywords: tuberculosis, functionalized nanoparticles, microparticles, nanoconjugates, rifampicin, pyrazinoic acid, poly(malic acid).
SUMÁRIO
RESUMO ... VII ABSTRACT ... VIII LISTA DE FIGURAS ... X LISTA DE TABELAS ... XIV LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIATURAS ... XVI
1 – INTRODUÇÃO ... 19
2 – REVISÃO DA LITERATURA ... 23
2.1. Tuberculose ... 23
2.1.1. Epidemiologia ... 25
2.1.2. Diagnóstico, prevenção e tratamento ... 26
2.1.3. Rifampicina ... 28
2.1.4. Pirazinamida...29
2.2. Otimização do tratamento da TB ... 30
2.3. Nanoformulações para tratamento da TB ... 34
2.3.1. Nanopartículas lipídicas sólidas e Carreadores lipídicos nanoestruturados .. 35
2.3.1.1. Funcionalização dos carreadores lipídicos nanoestruturados ... 36
2.3.2. Nanoconjugados...39
3 – OBJETIVOS ... 43
4 - CAPÍTULO I: ARTIGO 1...45
5 - CAPÍTULO II: OTIMIZAÇÃO DO PROCESSO DE SECAGEM DAS NANOPARTÍCULAS E OBTENÇÃO DAS MICROPARTÍCULAS ... 77
6 - CAPÍTULO III: ARTIGO 2 ... 97
7. DISCUSSÃO GERAL ... 124
8. CONCLUSÃO ... 129
9. REFERÊNCIAS ... 131
LISTA DE FIGURAS
Página Figura 1 Ilustração do mecanismo de ação da infecção pulmonar pelo
Mycobacterium tuberculosis (adaptado de RUSSELL et al., 2010)
24
Figura 2 Incidência estimada da TB em todo o mundo no ano de 2016 (adaptado de WHO, 2017)
25
Figura 3 Representação esquemática das nanopartículas lipídicas de primeira e segunda geração
36
CI-GA Graphical abstract 46
CI-Fig. 1 Structure of the tuftsin-modified peptide (pTUF-OA). Peptide is constituted of a RPKT sequence and an oleic acid molecule coupled to one of the amino acids. (A) shows peptide linked to resin, while (B) demonstrates the structure of ion of pTUF-OA after cleavage
55
CI-Fig. 2 Stability tests performed for NP-RIF and NP-pRIF stored at 4 ºC for 60 days, represented in terms of particle size, PDI and zeta potential. (A) Particle size and PDI (right Y axis) in function of time for NP-RIF and (B) for NP-pRIF. (C) Zeta potential in function of time for NP-RIF and NP-pRIF
60
CI-Fig. 3 In vitro RIF release profile from NP-RIF and NP-pRIF in PBS medium (pH = 7.4) as function of time, expressed as % of RIF released from each formulation. Data represent mean ± standard deviation; n = 3
63
CI-Fig. 4 Nanoparticles uptake by macrophages cells, expressed by means of macrophages fluorescence after incubation with NP-FITC (non-functionalized fluorescent nanoparticles) or NP-pFITC (fluorescent nanoparticles functionalized with the tuftsin-modified peptide) at 1.0 µg/ml; macrophages without nanoparticles treatment were used as negative control. (A) Represents mean
florescence intensity (MFI) over time. (***p<0.001: significant
difference between formulations at each time interval). Data represent mean ± standard deviation; n = 3. (B) Histogram representing fluorescence displacement emitted by macrophages after internalization of fluorescent nanoparticles incubated for 1h at 1.0 µg/ml (gray indicates control, green NP-FITC and orange NP-pFITC)
CI-Fig. 5 Cell viability of NP-RIF and NP-pRIF incubated on different doses (0.0625, 0.25, 1, 4 and 10 µg/ml) with J774 A.1 macrophages cell line for 24h. Pure RIF solution and macrophages without treatment were used as positive and negative control, respectively. (*p<0.05, +p<0.01, #p<0.001: statistically different from negative control). Data represent mean ± standard deviation; n =3.
66
CI-Supp. Fig. 1
Identification of pTUF-OA peptide synthesized by solid-phase. Analysis were performed by HPLC, as described on Material and Methods section (item 2.2.2. Peptide purification and characterization). (A) Non-purified pTUF-OA chromatogram obtained after cleavage, identified on retention time of 21 minutes. (B) Tuftsin alone (not-linked to oleic acid) characterized at 3 minutes. (C) pTUF-OA chromatogram obtained after purification, confirming the cleaning peptide retention time at 21 minutes
71
CI-Supp. Fig. 2
Mass spectrum obtained for pTUF-OA peptide characterized by electrospray ionization mass spectrometry
73
CI-Supp. Fig. 3
Cumulative distribution in function of particle size for NP-pRIF obtained by AF4/MALLS detector. Green arrow indicates D90 for this sample
75
CII-Fig. 1 Demonstração da formação das nanopartículas através do método da microemulsão
CII-Fig. 2 Esquema representativo da secagem das nanopartículas de rifampicina (ou branca) pelo método de atomização por spray-drying para obtenção das micropartículas
80
CII-Fig. 3 Fotomicrografia das amostras de NP-BR submetidas à secagem por liofilização. A, B, C e D apresentam diferentes aumentos e campos de visualização da mesma amostra
85
CII-Fig. 4 Imagens por MEV das micropartículas obtidas após a secagem das amostras A1-NPRIF, A2-NPRIF e A3-NPRIF (A, B e C, respectivamente)
87
CII-Fig. 5 Amostra A4-NPRIF transformada em pellets após secagem por spray-drying
87
CII-Fig. 6 Imagens por MEV das micropartículas obtidas após a secagem da amostra A5-NPRIF. Em A, visão geral do campo de análise; em B, o contraste das nanopartículas encapsuladas nas micropartículas
88
CII-Fig. 7 Fotomicrografias obtidas por MEV após secagem das amostras A6-NPRIF (em A) e A7-NPBR (em B) por spray-drying
89
CII-Fig. 8 Curvas de DSC obtidas para os constituintes puros (em A): ácido esteárico (AE, em amarelo), lactose (LAC, em azul), manitol (MAN, em rosa) e rifampicina (RIF, em preto). Em B, a curva da RIF em escala ampliada
92
CII-Fig. 9 Curvas de DSC obtidas para as micropartículas: Mic NPRIF LAC (em vermelho), Mic NPRIF MAN (em azul escuro) e Mic NPBR MAN (em verde)
93
CIII-Fig. 1 Scheme of RIF and PA conjugate syntheses. (A) RIF conjugate (PMA:OCTA:RIF). (B) PA conjugate (PMA:Oct:PA)
104
CIII-Fig. 2 Synthesis route for pyrazinoic acid ester conjugate. (A) shows pyrazinoic acid and 1,8-octanediol coupling, while in (B) this intermediate product was conjugated to PMA to obtain the final PMA:Oct:PA conjugate product
CIII-Fig. 3 Representative TEM images from distinct batches of NC-RIF nanoconjugates
111
CIII-Fig. 4 TEM images of NC-PA nanoconjugates 112
CIII-Fig. 5 Stability tests performed for NC-PA stored at 4 and 37 ºC for 60 days, represented in terms of (A) particle size, (B) PDI and (C) zeta potential
113
CIII-Fig. 6 In vitro drug release of NC-PA in PBS buffer at 37 ºC 114 CIII-Fig. 7 Uptake kinetics of NC-RIFLU and NC-PAFLU incubated with
RAW 264.7 macrophages cell line at 10 µg/ml for different time intervals. (A) Control (cells without treatment), (B) 0.5 h, (C) 1.5 h, (D) 3 h, (E) 6 h
115
CIII-Fig. 8 Quantification of fluorescence inside cells after incubation with NC-RIFLU and NC-PAFLU at 10 µg/ml over a range of time points. Data represent mean ± standard deviation
116
CIII-Fig. 9 Percentage of cell viability over ranges of nanoparticles concentrations incubated with RAW 264.7 macrophages for 48h. Results express the cytotoxic profiles of (A) RIF and NC-RIF and (B) PA and NC-PA
118
CIII-Fig. S1
Percentage of cell viability over poly(malic acid) (PMA) concentrations incubated with RAW 264.7 macrophages for 24h (dark gray) and 48h (light gray)
LISTA DE TABELAS
Página Tabela 1 Regime de tratamento da TB preconizado pela OMS
(adaptado de du TOIT et al., 2006)
28
Tabela 2 Exemplos de nano e microformulações contendo fármacos antituberculosos obtidas como pó para inalação já descritas na literatura
32
CI-Table 1 Physicochemical characterization of NP-RIF and NP-pRIF 58 CI-Table 2 Particle size for NP-RIF and NP-pRIF determined by DLS
and AF4/MALLS
59
CI-Table 3 MIC results of RIF solution, unloaded nanoparticles, NP-RIF and NP-pRIF for H37RV RIF-susceptible M. tuberculosis
strain
67
CI-Supp. Table 1
Effects of molar ratio (nanoparticles: cold water) increase on nanoparticles formation and particle size. Lipids and surfactants concentrations were fixed
74
CI-Supp. Table 2
Effects of changes on lipids and surfactants concentrations on particle size and PDI. Molar ratio (nanoparticles: cold water) was fixed
74
CI-Supp. Table 3
Physicochemical characterization of fluorescent nanoparticles containing or not the peptide (NP-pFITC and NP-FITC, respectively)
75
CII-Tabela 1 Composição da microemulsão O/A 78
CII-Tabela 2 Otimização dos parâmetros de secagem da suspensão de nanopartículas
81
CII-Tabela 3 Valores de tamanho, IP e potencial zeta das nanopartículas branca (NP-BR) e de rifampicina (NP-RIF)
CII-Tabela 4 Tamanhos de partícula e IP das nanopartículas RIF e NP-pRIF obtidos antes do processo de secagem (TPs), após a redispersão do pó em água (TPr) e índice TPr/TPs
91
CIII-Table 1 Physicochemical characterization of nanoconjugates 111 CIII-Table S1 Physicochemical characterization from three batches of
NC-RIF
LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIATURAS
AE Ácido esteárico
AF4 Asymmetrical Flow Field–Flow Fractionation
AM Macrófagos alveolares
CLN / NLC Carreadores lipídicos nanoestruturados DCC Diciclohexilcarbodiimida
DIPC Diisopropilcarbodiimida
DL Drug loading
DLS Dynamic Light Scattering
DMAP 4-dimetilaminopiridina
DMF N,N,dimetilformamida
DSC Differential Scanning Calorimetry
EE Eficiência de encapsulação
ETB Etambutol
FITC Isotiocianato de fluoresceína Fmoc 9- fluorenilmetiloxicarbonila
INH Isoniazida
IP / PDI Índice de polidispersão
K Lisina
MALLS Multi Angle Laser Light Scattering
MTT Brometo de 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2, 5-difenil-2H-tetrazólio MEV Microscopia eletrônica de varredura
NC-PA Nanoconjugado de ácido pirazinoico
NC-PAFLU Nanoconjugado fluorescente de ácido pirazinoico NC-RIF Nanoconjugado de rifampicina
NC-RIFLU Nanoconjugado fluorescente de rifampicina NLS / SLN Nanopartículas lipídicas sólidas
NP-BR Nanopartículas brancas NP-FITC Nanopartículas fluorescentes
NP-pFITC Nanopartículas fluorescentes funcionalizadas com o pTUF-OA NP-pRIF Nanopartículas de rifampicina funcionalizadas com o peptídeo
pTUF-OA
NP-RIF Nanopartícula de rifampicina
OCTA 1-Octanol
P Prolina
PA / AP Ácido pirazinoico
PA:Oct Conjugado intermediário: ácido pirazinoico + 1,8-octanediol
PMA Poli(ácido málico)
PMA:PA:Oct Conjugado: poli(ácido málico) + ácido pirazinoico + 1,8-octanediol PMA:OCTA Conjugado intermediário: poli(ácido málico) + 1-octanol
PMA:OCTA:RIF Conjugado: poli(ácido málico) + octanol + rifampicina PPC Peptídeos de penetração celular
pTUF-OA Peptídeo tuftsina modificada com ácido oleico
PZA Pirazinamida
R Arginina
RIF Rifampicina
T Treonina
TB Tuberculose
TPr Tamanho das nanopartículas redispersas em água TPs Tamanho das nanopartículas antes da secagem
1 – INTRODUÇÃO
A tuberculose (TB) é uma doença bacteriana infecciosa causada pelo Mycobacterium tuberculosis que afeta mais comumente os pulmões. É transmitida entre os indivíduos a partir da inalação de gotículas contendo o bacilo expelidas pela tosse, fala ou espirro do doente com a doença respiratória ativa (WHO, 2017). A TB é considerada um grave problema de saúde pública devido aos altos indicadores de incidência e mortalidade ainda presentes em diversos países, inclusive no Brasil, que é um dos 30 países detentores dos maiores números de casos de TB no mundo (WHO, 2017).
A TB pode ser tratada com sucesso de acordo com o protocolo terapêutico recomendado pela Organização Mundial de Saúde (OMS), que compreende a associação de 4 antibióticos pelo período de 6 a 12 meses (du TOIT et al., 2006). Porém, o tratamento convencional requer a administração de altas doses diárias de cada medicamento pela via oral para uma resposta satisfatória do paciente, o que culmina na emergência de efeitos adversos de intensidade variada, reduzindo a adesão do paciente à terapia (ARBEX et al., 2010; KAUR e SINGH, 2014). Esta prática ainda contribui para o surgimento da TB com resistência multidroga, o que agrava o quadro do paciente e requer a introdução de fármacos de segunda-linha, consequentemente ainda mais tóxicos (MAARTENS e WILKINSON, 2007).
A rifampicina e a pirazinamida são dois fármacos de primeira linha indicados pela OMS para tratamento da TB (du TOIT et al., 2006). Apesar de ambos terem sua eficácia comprovada, a toxicidade destes fármacos expressa pelos inúmeros efeitos adversos relatados após o uso prolongado, deve ser investigada visando uma redução geral da dose empregada e da frequência de administração de cada fármaco. Neste contexto, a via de administração pulmonar tem sido apontada como alvo promissor no tratamento da doença, aliada ao emprego da nanotecnologia no desenvolvimento de formulações vetorizadas que apresentam maior poder de penetração nas vias aéreas, perfil de liberação controlada de fármacos e seletividade pelo local de ação (GELPERINA et al., 2005).
Os carreadores lipídicos nanoestruturados são uma alternativa interessante no tratamento de doenças pulmonares, pois demonstram boa tolerabilidade pelas vias aéreas, devido à possibilidade de seleção de lipídeos e tensoativos biodegradáveis aprovados para uso inalatório (PILCER e AMIGHI, 2010), além de exibirem boa aderência na mucosa superficial dos pulmões por um período prolongado (PATLOLLA et al., 2010). Em
contrapartida, as nanopartículas isoladas não possuem propriedades aerodinâmicas compatíveis com a deposição alveolar (VERMA et al., 2011). Por este motivo, a estratégia de veiculação das nanopartículas em micropartículas é encorajadora, uma vez que confere ao sistema o tamanho de partícula adequado para alcance da região alveolar nos pulmões, com a consequente liberação das nanopartículas e execução da sua atividade contra a doença através das suas propriedades peculiares.
A tuftsina é um tetrapeptídeo constituído pela sequência de aminoácidos treonina, lisina, prolina e arginina (AGRAWAL e GUPTA, 2000). O peptídeo é conhecido por se ligar seletivamente a macrófagos e monócitos, tornando-se uma alternativa atraente para o direcionamento ou vetorização de fármacos para macrófagos alveolares (JAIN e AMIJI, 2012). Desta forma, a tuftsina pode ser usada como uma ferramenta para a funcionalização de carreadores lipídicos nanoestruturados através do seu acoplamento na superfície das nanopartículas, visando o sítio alvo da TB - os macrófagos alveolares e aumentando a internalização das nanopartículas nestas células.
Em paralelo, outra estratégia envolvendo o uso de nanoformulações para o tratamento da TB é a síntese e obtenção de nanoconjugados. Estes sistemas de liberação controlada são constituídos por conjugados, os quais são obtidos pela síntese entre um fármaco e um polímero, resultando num produto anfifílico cujas características físico-químicas permitem sua auto-agregação em nanopartículas em meio aquoso sem o uso de excipientes, contribuindo para a redução da toxicidade destes sistemas (LANZ-LANDÁZURI et al., 2012).
O poli(ácido málico) (PMA) é um polímero hidrofílico e não-tóxico de grande aplicabilidade farmacêutica, por ser biocompatível e biodegradável. O PMA possui inúmeros grupos carboxilas livres em toda a sua estrutura, o que o torna passível de modificação química para a inserção de fármacos, obtendo produtos com alta taxa de encapsulação (LOYER et al., 2014). A esterificação de fármacos antituberculosos com um polímero funcional biodegradável – o PMA, e consequente obtenção do nanoconjugado, é uma alternativa promissora para a encapsulação e liberação de fármacos diretamente nos pulmões. Assim, após a administração, o nanoconjugado é degradado por ação das esterases, liberando o fármaco para ação já no local desejado e o PMA é degradado em ácido málico, um composto não-tóxico e tolerável pelas células (HE et al., 2006). Logo, esta estratégia apresenta um carreador original e inovador, eficiente para o tratamento da TB com reais perspectivas de redução da toxicidade.
Portanto, diante deste cenário em que a TB tem demonstrado extensa agressividade e requerido novos esforços para a otimização do tratamento da doença, a proposta de duas estratégias distintas envolvendo o desenvolvimento de nanopartículas contendo fármacos antituberculosos para administração pulmonar traz perspectivas para a redução dos efeitos adversos dos fármacos e da resistência multidroga e contribui, a longo prazo, para o aprimoramento da farmacoterapia.
2 – REVISÃO DA LITERATURA 2.1. Tuberculose
A tuberculose (TB) é uma doença bacteriana infecciosa causada pelo bacilo Mycobacterium tuberculosis, que afeta mais comumente os pulmões (TB pulmonar), podendo também acometer outros sítios de ação (TB extrapulmonar). É transmitida a partir da inalação de núcleos secos de partículas contendo bacilos expelidos pela tosse, fala ou espirro do doente com tuberculose ativa (WHO, 2017). Os doentes bacilíferos, isto é, aqueles cuja baciloscopia do escarro é positiva, são a principal fonte de infecção, ao passo que os que apresentam baciloscopia negativa, mesmo que tenham resultado positivo à cultura, são muito menos eficientes como fontes de transmissão, embora isso possa ocorrer (BRASIL, 2011). As formas exclusivamente extrapulmonares não transmitem a doença.
A infecção pelo M. tuberculosis segue uma série de eventos já elucidados anteriormente (Figura 1). Ao serem inaladas, as gotículas do bacilo suficientemente pequenas para se manter nas vias aéreas por muitas horas, são fagocitadas por macrófagos alveolares. Como mecanismo de defesa e escape desenvolvido pelo M. tuberculosis, a estrutura de sua parede bacteriana produz amônia que alcaliniza o conteúdo dos lisossomas, impedindo sua ligação com o fagossoma, que por sua vez, permite seu crescimento livre dentro do macrófago (parasitismo intracelular facultativo), inibe a fusão lisossomal e impede novas fagocitoses (RAJA, 2004). Em seguida, os macrófagos invadem a camada epitelial adjacente e esse processo induz a uma resposta inflamatória localizada, que leva ao recrutamento de células mononucleares dos vasos sanguíneos vizinhos, fornecendo novas células hospedeiras para a expansão bacteriana. Estas células juntas produzem o granuloma, conhecido como a característica patológica da doença. Inicialmente, o granuloma é constituído por uma massa amorfa de macrófagos, monócitos e linfócitos, porém, os macrófagos se diferenciam em tipos celulares especializados, incluindo células gigantes multinucleadas, macrófagos espumosos e macrófagos epitelioides (VIA et al., 2008). Com o desenvolvimento de uma resposta imunológica adquirida, linfócitos são recrutados e também começam a integrar o granuloma, que adquire uma estrutura mais organizada e estratificada, devido à formação de uma bainha fibrosa que demarca a periferia da estrutura. O surgimento dos linfócitos específicos do M. tuberculosis, 2 ou 3 semanas pós-infecção, marca o final da fase de replicação rápida
da bactéria e o início da fase de contenção, em que a população bacteriana se mantém estável. Neste estágio, o granuloma é extensamente vascularizado e mais células são ativamente recrutadas para o local da infecção. Muitos granulomas de pacientes infectados persistem neste estado balanceado, porém, a progressão para a doença é caracterizada pela perda da vascularização, aumento da necrose e do número de macrófagos espumosos, que são responsáveis pelo aumento dos detritos de cáseo no centro do granuloma. Nesta fase final, a porção caseosa do granuloma torna-se hipóxica, uma condição que pode levar à não-replicação do M. tuberculosis. Por fim, o granuloma se rompe e libera milhares de bacilos infectantes viáveis no trato respiratório, o que resulta no desenvolvimento de uma tosse persistente, que facilita a propagação da bactéria (RUSSELL et al., 2009; 2010).
Figura 1: Ilustração do mecanismo de ação da infecção pulmonar pelo Mycobacterium tuberculosis (adaptado de RUSSELL et al., 2010)
2.1.1. Epidemiologia
A TB é considerada um grave problema de saúde e social, uma vez que é a primeira causa de morte por doença infecciosa no mundo, seguida pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV). Em 2016, de acordo com a OMS, estima-se que 10,4 milhões de pessoas adquiriram a doença, dentre os quais 9,4 milhões eram adultos e 6,8 milhões, pacientes do sexo masculino. No mesmo ano, a doença foi responsável pela morte de aproximadamente 2 milhões de pessoas em todo o mundo, dentre os quais 1,7 milhão eram indivíduos não-portadores de HIV e 374 mil eram HIV-positivos, demonstrando a agressividade da doença nos pacientes imunodeficientes (WHO, 2017). Além disso, dados apontam que um terço da população mundial está infectada com o micro-organismo na sua forma latente, e ainda, 10% deste número irá desenvolver a TB ao longo da vida (VILLEMAGNE et al., 2012).
A doença é altamente incidente principalmente nos países mais pobres da África e do sudeste asiático. Porém, dados da OMS de 2016 demonstram que a TB ainda afeta o mundo todo, em proporções variadas (Figura 2).
Figura 2: Incidência estimada da TB em todo o mundo no ano de 2016 (adaptado de WHO, 2017)
O Brasil ocupa o 20º lugar entre os 30 países prioritários para TB no mundo. A cada ano, são notificados aproximadamente 70 mil novos casos e ocorrem 4,6 mil mortes em decorrência da doença. O estado de São Paulo detém o maior número absoluto de casos e o estado do Amazonas apresenta o maior coeficiente de incidência, seguido pelo Rio de Janeiro (BRASIL, 2018). Dados divulgados pelo Ministério da Saúde do Brasil apontam que as taxas de incidência da doença no período de 2013 a 2017 mantiveram-se constantes, o que demonstra a necessidade de esforços para reduzir este indicativo. Este mesmo comportamento foi observado para o percentual de coinfecção TB-HIV entre os novos casos de TB no Brasil, partindo de 10,1% em 2013 para 9,2% em 2017, o que reafirma o potencial infectante da doença entre os pacientes imunocomprometidos (BRASIL, 2018).
Este documento também relata que a taxa de cura entre os novos casos de TB girou em torno de 70% no período de 2001 a 2016, sem mudanças significativas. Por outro lado, entre os casos de retratamento por tratamento não-observado, o percentual de cura foi de aproximadamente 50% entre 2009 a 2016, ressaltando uma expressiva queda na eficácia terapêutica nos casos de reinfecção, que pode estar associada à baixa adesão do paciente ao tratamento ou ao surgimento de TB com resistência multidroga, evidenciando a gravidade da situação (BRASIL, 2018).
2.1.2. Diagnóstico, prevenção e tratamento
A TB apresentada na forma pulmonar é a mais frequente e relevante para a saúde pública, pois a forma bacilífera é responsável pela manutenção da cadeia de transmissão da doença (du TOIT et al., 2006). Um dos métodos empregados para realizar o diagnóstico é a baciloscopia direta, que usa o escarro como material de pesquisa e permite detectar de 60 a 80% dos casos de TB pulmonar. Além deste, a cultura para micobactéria aumenta em até 30% o diagnóstico bacteriológico da doença, porém o crescimento bacteriano pode levar de 14 a 30 dias, o que restringe seu uso (FERRI et al., 2014). Outro método alternativo compreende um conjunto de testes rápidos baseados nas técnicas da biologia molecular. Dentre eles, o kit Expert® MTB/RIF desenvolvido recentemente e recomendado pela OMS e Anvisa, apresenta maior precisão e confiabilidade nos resultados, uma vez que num período de 2 horas permite a detecção do M. tuberculosis, a identificação de mutações que conferem resistência à rifampicina e ainda aumenta em até um terço a detecção de casos positivos em relação à baciloscopia (HOOG et al., 2013).
O exame radiológico também é realizado para complementar os resultados obtidos com qualquer metodologia anterior. Como o diagnóstico da doença ainda apresenta falhas e limitações, muitos estudos vêm sendo conduzidos no sentido de otimizar a detecção da TB e contribuir para sua erradicação (PIURI et al., 2009).
Como a TB é transmitida pelas gotículas infectadas expelidas na tosse, a prevenção da doença inclui principalmente evitar o contato com este tipo de secreção de pacientes infectados, além de não frequentar ambientes fechados, sem ventilação e mal iluminados. A OMS recomenda explicitamente a vacinação de neonatos contra a TB, através da vacina BCG (Bacille Calmette-Guérin), porém, a proteção só é garantida durante a infância e sua durabilidade é variável (MAARTENS e WILKINSON, 2007). Outro ponto questionável da vacina é em relação à sua eficácia parcial: a BCG confere proteção contra algumas formas da TB não-pulmonar (como a meningite tuberculosa, por exemplo), mas não é confiável contra a TB pulmonar de adultos, que é a forma mais perigosa da doença (WHO, 2018). Além disso, a vacina não influencia na redução da transmissão da TB, o que é considerada uma falha grave. Nesse sentido, muitas pesquisas têm sido desenvolvidas a fim de propor uma nova e mais eficaz alternativa para a prevenção da doença.
Uma outra esfera da TB alvo de muitas pesquisas é o tratamento da doença. A OMS recomenda que os pacientes diagnosticados se submetam ao tratamento com os fármacos antituberculosos de primeira linha, conhecidos como: rifampicina (RIF), isoniazida (INH), pirazinamida (PZA) e etambutol (ETB) (WHO, 2017). O regime terapêutico é longo, se estendendo por 6 a 12 meses e está sumarizado na Tabela 1. Os primeiros 2 meses envolvem uma terapia intensa a partir da combinação de quatro fármacos – RIF, INH, PZA e ETB (KAUR e SINGH, 2014). Esta carga elevada de medicamentos é indicada com o intuito de reduzir rapidamente a capacidade de replicação do bacilo. Em seguida, a terapia de manutenção é prescrita através da combinação de RIF e INH por pelo menos 4 meses, a fim de esterilizar as lesões contendo bacilos em menor quantidade e com o crescimento retardado (du TOIT et al., 2006).
Tabela 1: Regime de tratamento da TB preconizado pela OMS (adaptado de du TOIT et al., 2006)
Fase intensa – 2 meses Peso corporal
RIF/INH/PZA/ETB < 50 Kg > 50 Kg
Combinação de comprimidos de 120/60/300/200 mg diariamente - 5
dias/semana
4 comprimidos 5 comprimidos
Fase de manutenção – 4 meses RIF/INH
Combinação de comprimidos 150/100 mg 3 comprimidos
Combinação de comprimidos 300/150 mg 2 comprimidos
Devido ao longo regime de tratamento, muitos pacientes abandonam a terapia antes de finalizá-la, o que traz como principal consequência o surgimento da TB com resistência multidroga, na qual o paciente torna-se resistente à RIF ou INH, comprometendo diretamente a eficácia do tratamento (ISEMAN, 1993). Esta é uma grave condição que deve ser acompanhada com cautela para evitar ao máximo a propagação destas cepas. De acordo com a OMS, para tentar combater esses casos, são indicados os fármacos de segunda linha, tais como: etionamida, canamicina, terizidona, cicloserina, capreomicina, viomicina, ácido p-aminosalicílico e algumas fluoroquinolonas (PHAM et al., 2015). Muitos destes fármacos ainda estão em etapa de estudos, por isso, não há garantia de sucesso do tratamento e toda a terapia deve ser acompanhada pela equipe de saúde. Além disso, o uso dos medicamentos de segunda linha apresenta alto custo e seus efeitos adversos são mais severos e extensos (KAUR e SINGH, 2014).
2.1.3. Rifampicina
Um dos fármacos mais eficazes no tratamento da TB é a rifampicina, um antibiótico com ação bactericida, pertencente à classe dos macrolídeos. Fisicamente, é
um pó cristalino alaranjado, fracamente solúvel em água devido ao seu caráter levemente lipofílico (log P = 2,77) e solúvel em clorofórmio, metanol e dimetilsulfóxido (PUBCHEM, 2016). Seu ponto de fusão é igual a 183 °C e o fármaco é estável por até 2 anos, quando estocado em ambiente seco e protegido da luz (GOHEL e SARVAIYA, 2007).
RIF apresenta eficácia clínica contra uma ampla variedade de micro-organismos, incluindo bactérias gram-positivas, gram-negativas e fungos. Porém, seu uso disseminado está associado à rápida emergência de bactérias resistentes e, por este motivo, é utilizada estritamente para tratamento da TB. RIF exerce sua função bactericida através da inibição da transcrição gênica da micobactéria por bloqueio da RNA-polimerase DNA-dependente, o que impede a síntese de RNA mensageiro (RNAm) e de proteína pelo bacilo, levando à morte celular (RIFAMPIN, 2008; ARBEX et al., 2010). Durante o tratamento da TB, a RIF atua tanto na fase intensa, de crescimento e replicação do bacilo, quanto na estacionária, na qual possui a capacidade de erradicar a micobactéria tuberculosa que se encontra em estado de baixa atividade (ELLARD e FOURIE, 1999).
Apesar do seu potencial antituberculoso, o uso prolongado de medicamentos à base de RIF leva ao surgimento de inúmeros efeitos adversos de intensidade variada, que oscilam desde uma simples reação cutânea, passando por reações gastrointestinais e culminando em sintomas de hepatotoxicidade, podendo inclusive evoluir para a hepatite (ARBEX et al., 2010, KAUR e SINGH, 2014).
Portanto, novas estratégias que aliem o potencial antituberculoso da RIF com a redução dos seus efeitos adversos são necessárias para a otimização do tratamento da TB, o que consequentemente reflete no aumento da adesão do paciente ao tratamento e redução do surgimento de resistência multidroga.
2.1.4. Pirazinamida
A pirazinamida (PZA) é um dos fármacos de primeira linha recomendados pela OMS no tratamento da TB. Desde sua introdução na terapia da doença, o tempo de tratamento foi reduzido de 12 para 6 meses, devido potencialmente à habilidade exclusiva deste fármaco em penetrar no granuloma e exercer sua atividade nas condições ácida e hipóxica do ambiente, causando a morte de subpopulações da micobactéria em baixo estado metabólico (KRÁTKÝ et al., 2014; FERNANDES et al, 2014). Nestas condições,
os outros fármacos de primeira linha perdem sua atividade e não conseguem eliminar o bacilo.
O mecanismo de ação da PZA ainda não foi totalmente elucidado, porém Zhang e colaboradores obtiveram sucesso ao propor uma teoria em que a PZA é um pró-fármaco e, após entrar na micobactéria, é convertido em sua forma ativa, o ácido pirazinoico (PA) (ZHANG et al., 2003). Esta conversão é realizada pela enzima micobacteriana denominada pirazinamidase e casos de resistência à PZA estão associados à ausência ou mutação do gene pncA que codifica esta enzima, confirmando a necessidade de liberação da parte ativa da molécula para execução da ação bactericida (PETERSON et al., 2015).
Apesar de comprovadamente a parte ativa da PZA, o PA não deve ser administrado isoladamente em seu estado puro, uma vez que suas características físico-químicas inviabilizariam uma absorção e biodisponibilidade satisfatórias. Devido às propriedades de alto caráter hidrofílico, alto grau de ionização em pH fisiológico e, consequentemente, dificuldade na passagem pela parede celular da micobactéria, estudos demonstraram que o PA puro foi fracamente ativo em modelo murino de TB (CYNAMON et al., 1995).
Desta forma, uma alternativa para aliar o potencial ativo do fármaco com a possibilidade de combater os casos de resistência à PZA é a estratégia da modificação química através do desenvolvimento de novos conjugados de PA, contendo propriedades físico-químicas adequadas para penetração celular e eficácia contra a micobactéria.
2.2. Otimização do tratamento da TB
A TB é uma das doenças que mais causa mortes no mundo, apesar de curável. Como seu tratamento é muito extenso, desagradável e minucioso, um dos grandes desafios da comunidade acadêmica é desenvolver novas formulações mais eficazes e bem toleradas pelo paciente (du TOIT et al., 2006; PHAM et al., 2015). Além disso, nas últimas quatro décadas nenhum novo fármaco com potencial antituberculoso foi lançado no mercado, ainda que alguns candidatos direcionados especialmente no tratamento dos casos de resistência à TB estejam em fase clínica de estudos (LAGHARI et al., 2016). Porém, o tempo necessário para finalizar os estudos, regulamentar o uso e para que estes fármacos cheguem de fato ao mercado é muito longo, demonstrando a necessidade de investimento em pesquisa e busca por ações alternativas na terapia da TB. Neste contexto,
a nanotecnologia apresenta inúmeras opções de desenvolvimento de novos sistemas carreadores, visando o aprimoramento da farmacoterapia, performance e biodisponibilidade dos fármacos. As vantagens tecnológicas mais relevantes das nanopartículas como sistemas carreadores são a possibilidade de encapsulação de fármacos hidro ou lipofílicos, maior estabilidade, viabilidade para distintas vias de administração, alta estabilidade e redução da dose administrada (GELPERINA et al., 2005).
Muitos estudos já foram conduzidos com o intuito de projetar nanossistemas capazes de alcançar as células fagocíticas infectadas por patógenos intracelulares, como a micobactérica, por exemplo. Pandey et al. (2003) prepararam nanopartículas de poli(lático-co-glicólico) (PLG) contendo RIF, INH e PZA e demonstraram, após administração única por via oral em camundongos, que as concentrações terapêuticas nos tecidos foram mantidas por 9 até 11 dias, ao passo que os fármacos livres foram depurados do plasma entre 12 e 24h, validando o efeito de liberação controlada obtido com o nanocarreador. A título de comparação, um estudo posterior desenvolvido pelo mesmo grupo, em 2004, e com a mesma formulação, avaliou seu efeito subsequente a uma única administração subcutânea em camundongos e verificou que os fármacos foram detectados no plasma e nos tecidos por 32 até 36 dias, respectivamente, após administração das nanopartículas, enquanto os fármacos livres já não foram mais quantificados depois de 10 – 12h da administração no plasma, e 24 – 48h nos tecidos (PANDEY e KHULLER, 2004). Ambos os trabalhos culminaram numa redução significativa da carga de M. tuberculosis presente nos animais infectados, reafirmando o caráter promissor da formulação. Porém, as formulações não apresentaram seletividade pelo local de ação (o que não contribui na redução dos efeitos adversos) e estudos de toxicidade in vitro e in vivo não foram realizados, inviabilizando seu uso.
Apesar dos benefícios alcançados com o desenvolvimento de formulações para tratamento da TB por vias de administração distintas, a via pulmonar tem sido apontada como alvo promissor no tratamento da doença, aliada ao emprego da nanotecnologia no desenvolvimento de formulações vetorizadas que apresentam maior poder de penetração nas vias aéreas, perfil de liberação controlada de fármacos e seletividade pelo local de ação (GELPERINA et al., 2005). Além de se tratar de uma via de administração não-invasiva, apresenta notáveis vantagens como: redução da dose administrada e de sua frequência, o que diminui consideravelmente os efeitos adversos e aumenta a adesão do
paciente ao tratamento (PHAM et al., 2015); liberação do fármaco especificamente no local de ação, contribuindo para o aumento da eficácia e redução da toxicidade sistêmica (PANDEY e KHULLER, 2005); redução dos casos de resistência multidroga e do tempo de tratamento, ao proporcionar altas concentrações do fármaco no sítio de ação da doença (SUNG et al., 2007).
A via pulmonar permite que as nanopartículas sejam veiculadas tanto como uma suspensão via nebulização, quanto como pó para inalação, em que a suspensão obtida é submetida a um processo de secagem prévio à inalação. Porém, relatos na literatura demonstram que as formulações administradas em estado líquido através da nebulização apresentam baixa estabilidade devido à grande possibilidade de sedimentação, crescimento dos cristais e polimorfismo ao entrarem em contato com o ambiente úmido dos pulmões (PHAM et al., 2015). Hanif e Garcia-Contreras (2012) ainda destacam que a dose dos fármacos antituberculosos possível de veiculação via nebulização é baixa comparada à requerida para o tratamento da doença, o que inviabiliza seu uso. Por outro lado, a obtenção de nanopartículas como pó para inalação é promissora, uma vez que a partir da aerosolização são desenvolvidas partículas finas adequadas para a deposição pulmonar, com boa estabilidade (DAS et al., 2015). Além disso, as formulações contendo fármacos antituberculosos podem ser administradas como pó para inalação em quantidades suficientes para tratamento da TB, tornando seu uso ainda mais apropriado. A Tabela 2 sumariza algumas nano e micropartículas contendo fármacos antituberculosos, obtidas como pó para inalação, que já estão relatadas na literatura. Os principais resultados encontrados em cada trabalho foram destacados, com o objetivo de evidenciar os avanços conquistados com cada nova estratégia para tratamento da TB.
Tabela 2: Exemplos de nano e microformulações contendo fármacos antituberculosos obtidas como pó para inalação já descritas na literatura
Formulação Fármaco Principal resultado Referência
Microesferas de ácido (lático-co-glicólico)
(PLGA)
RIF
Concentração de RIF nos macrófagos alveolares foi até 10 vezes maior para a formulação comparada à uma solução do fármaco
Hirota et al., 2010
Micropartículas de PLGA RIF Parâmetros farmacocinéticos determinados após instilação da formulação demonstraram Tmáx = 48h, Cmáx = 0,43 µg/mL e
concentração da RIF nos pulmões após 60h igual a
612 µg/g de tecido Darbandi e Zandkarimi, 2012 Partículas porosas de capreomicina Sulfato de capreomicina Redução da carga bacteriana nos pulmões
dos animais infectados com TB após inalação da
formulação Garcia-Contreras et al., 2007 Microcristais de PLA/PLGA contendo rifampicina RIF di-hidratada Boas propriedades de aerosolização e ausência de degradação química da formulação, comparada aos cristais de RIF
di-hidratada sem os polímeros Son e McConville, 2012 Micropartículas de nanomicelas lipopoliméricas catiônicas RIF Propriedades aerodinâmicas adequadas para a inalação e liberação
de 85% do fármaco em 24h
Vadakkan et al., 2013
Apesar dos avanços alcançados com as micropartículas e lipossomas, as nanopartículas ainda são consideradas como primeira opção na otimização do tratamento de TB. Nanopartículas inalatórias apresentam maior eficiência de encapsulação dos
fármacos (KAUR e SINGH, 2014), melhor aderência na mucosa celular, aumentando a liberação de fármacos nos pulmões (PANDEY e KHULLER, 2005), além de serem eficientemente fagocitadas por macrófagos alveolares infectados pelo M. tuberculosis (HIROTA et al., 2010). Por outro lado, de acordo com a literatura, partículas de tamanho menor que 0,5 µm são exaladas durante o processo da inalação por não possuírem densidade suficiente para se depositar nas regiões mais profundas dos pulmões, enquanto partículas maiores que 5 µm se acumulam na região orofaríngea das vias aéreas superiores; já as partículas com tamanho médio aerodinâmico entre 1 a 5 µm apresentam as propriedades aerodinâmicas ideais para o alcance da região alveolar (VERMA et al., 2011), tornando esta característica uma condição indispensável para o desenvolvimento de novas formulações inalatórias para o tratamento da TB.
Portanto, o uso de nanopartículas veiculadas pela via pulmonar apresenta um potencial significativo e viável dentro do contexto de otimização da terapia da TB, ao possibilitar sua administração diretamente no local de ação da doença, o que permite a redução de doses, liberação controlada e aumento da penetração celular destes sistemas, e consequentemente contribui para a redução dos efeitos adversos do fármaco.
2.3. Nanoformulações para tratamento da TB
O universo das nanopartículas é muito amplo e engloba diversos sub-tipos de formulações, como: nanocápsulas, nanoesferas, nanopartículas lipídicas sólidas, carreadores lipídicos nanoestruturados, nanopartículas metálicas, dentre outras (KINGSLEY et al., 2006). Porém, nem todas podem ser administradas pela via pulmonar, uma vez que há uma enorme restrição dos excipientes permitidos para a inalação. Apenas os polímeros biocompatíveis e biodegradáveis, alguns lipídeos e tensoativos são aprovados como componentes das formulações de administração pulmonar, o que limita o uso de nanopartículas a poucos sub-tipos (PILCER e AMIGHI, 2010). Por este motivo, as nanopartículas lipídicas sólidas (NLS) e os carreadores lipídicos nanoestruturados (CLN) são extremamente interessantes para o tratamento de doenças pela via pulmonar, uma vez que são constituídos apenas por lipídeos e tensoativos, o que aumenta o leque de opções de escolha dos excipientes compatíveis com a via de administração, visando o desenvolvimento de uma formulação estável e com baixa toxicidade. Uma outra opção interessante inserida nestes requisitos são os nanoconjugados, compostos por pró-fármacos sintéticos acoplados covalentemente a polímeros biocompatíveis e
biodegradáveis e cujas principais vantagens são a baixa toxicidade, uma vez que não há a obrigatoriedade da adição de tensoativos para obtenção dos nanossistemas (LJUBIMOVA et al., 2008).
2.3.1. Nanopartículas lipídicas sólidas e Carreadores lipídicos nanoestruturados As NLS, conhecidas como nanopartículas lipídicas de primeira geração, foram desenvolvidas como um carreador alternativo às emulsões, lipossomas e nanopartículas poliméricas, e são preparadas através da substituição do lipídeo líquido (óleo) de uma emulsão O/A por um lipídeo sólido ou uma mistura de lipídeos sólidos à temperatura corporal e ambiente (PARDEIKE et al., 2009). A fase oleosa é, então, dispersa em água e estabilizada por tensoativos, produzindo nanopartículas de tamanho entre 40 a 1000 nm, com características de boa estabilidade, proteção do ativo contra degradação, baixa toxicidade e liberação controlada do fármaco (PARDESHI et al., 2012).
Porém, uma grande desvantagem associada a este nanocarreador está relacionada à baixa eficiência de encapsulação e ao fato de expulsar o fármaco encapsulado ao longo do tempo (WEBER et al., 2014). Isso ocorre porque, após a preparação das NLS, os lipídeos sólidos se organizam numa forma cristalina de alta energia. Porém, durante o estoque, essa organização se transforma em um estado cristalino mais ordenado e de baixa energia, conhecido como modificação β. Devido ao alto grau de ordem desta modificação, o número de imperfeições do cristal é reduzido, o que leva à expulsão do fármaco encapsulado (PARDEIKE et al., 2009). Assim, para transpor esta limitação, uma segunda geração de nanopartículas lipídicas foi desenvolvida, culminando nos carreadores lipídicos nanoestruturados, que consistem numa mistura de lipídeos, sendo um sólido e outro líquido à temperatura corporal e ambiente (IQBAL et al., 2012). A mistura de lipídeos em estados cristalinos distintos leva à obtenção de uma matriz lipídica menos organizada, oferecendo, portanto, maior espaço para a acomodação do fármaco. A Figura 3 ilustra a matriz lipídica de ambas as nanopartículas, comparando sua estrutura cristalina e demonstrando a maior encapsulação do fármaco no CLN.
Figura 3: Representação esquemática das nanopartículas lipídicas de primeira e segunda geração
Assim como as NLS, os CLN são aplicados em diversas áreas farmacêuticas, sendo amplamente usados desde a cosmética até o tratamento de doenças. Especificamente para a administração pulmonar, os CLN apresentam características vantajosas, como: boa tolerabilidade pelas vias aéreas, uma vez que há a possibilidade de selecionar lipídeos e tensoativos biodegradáveis aprovados para uso inalatório, culminando em efeitos não-tóxicos (PILCER e AMIGHI, 2010), boa aderência na mucosa superficial dos pulmões por um período prolongado (PATLOLLA et al., 2010), além da possibilidade de retenção, acúmulo e liberação controlada do fármaco, que podem levar a um efeito terapêutico sustentado, resultando num maior intervalo de tempo entre as doses, o que aumenta a adesão do paciente ao tratamento (WEBER et al., 2014).
2.3.1.1. Funcionalização dos carreadores lipídicos nanoestruturados
Apesar de apresentarem inúmeras vantagens para o tratamento de doenças pulmonares, os CLN não são seletivos para nenhum tipo celular. Assim, ao serem liberados das micropartículas na região alveolar para exercer sua função terapêutica, os CLN poderiam se ligar a qualquer célula presente no ambiente pulmonar e ainda, sofrer absorção, o que não contribuiria para a redução dos efeitos adversos do fármaco. Portanto,
a fim de otimizar o tratamento na TB, a funcionalização dos CLN é uma alternativa inovadora para garantir a seletividade da formulação pelo local de ação desejado.
Existem diversas maneiras de funcionalização das nanopartículas e a escolha da estratégia ideal depende do objetivo almejado (PATEL et al., 2015). No caso do tratamento da TB, em que se deseja aumentar a absorção do nanocarreador contendo fármaco pelos macrófagos alveolares, uma alternativa eficiente é a utilização dos peptídeos de penetração celular (PPC). Os PPC são peptídeos catiônicos ou anfipáticos, geralmente constituídos por uma pequena sequência de aminoácidos (entre 4 e 60, aproximadamente), que ganharam destaque por exercerem a função de vetores de liberação celular, devido à sua capacidade intrínseca de aumentar a penetração nas células e mediar a absorção de uma ampla variedade de substâncias macromoleculares, como genes, fármacos ou mesmo nanopartículas (FARKHANI et al., 2014). Além disso, os PPC também têm a habilidade de direcionar a carga acoplada para algum compartimento específico da célula, seja o núcleo ou alguma organela, por exemplo (MILLETTI, 2012). Muitos trabalhos já demonstraram os efeitos promissores dos PPC. Xia et al. (2012) desenvolveram nanopartículas de PLA-PEG funcionalizadas com um PPC, a penetratina, com o objetivo de aumentar a concentração das nanopartículas no cérebro, pois, quando administradas sem o PPC foram detectadas em pequenas quantidades no local desejado. Assim, os resultados indicaram que as nanopartículas com PPC foram significativamente mais absorvidas pelas células do cérebro e ainda, houve uma redução no acúmulo das nanopartículas nos tecidos não-alvo. Os PPC também já foram testados na otimização do tratamento do câncer, através da ligação de nanopartículas poliméricas com o V6K2, um PPC catiônico. Assim, a concentração de nanopartículas no tumor foi aumentada consideravelmente após a ligação eletrostática do carreador com o tecido (JIANG et al., 2011). Portanto, de acordo com a literatura, os PPC são aplicáveis nas mais diversas áreas da farmacoterapia, trazendo consideráveis benefícios no tratamento de muitas doenças, inclusive a TB.
Estudos recentes descrevem que a absorção das nanopartículas por macrófagos alveolares está diretamente associada às características físico-químicas e superficiais do nanocarreador (PATEL et al., 2015). Dentre elas, podem-se citar os tamanhos de partícula entre 100 e 300 nm e 1 e 5 µm, formato esférico, carga superficial altamente positiva ou negativa, dentre outras (CHONO et al., 2006). Além disso, a funcionalização das
nanopartículas com PPC também é considerada uma estratégia eficaz no aumento da absorção e seletividade pelas células.
A tuftsina é um PPC diretamente relacionado ao aumento da absorção e seletividade pelos macrófagos e monócitos (AGRAWAL e GUPTA, 2000). O peptídeo é constituído por 4 aminoácidos [treonina (T), lisina (K), prolina (P) e arginina (R)] e formado e liberado naturalmente após a clivagem enzimática da porção Fc da molécula de imunoglobulina (IgG), nos resíduos 289 – 292 (JAIN e AMIJI, 2012).
A tuftsina possui um amplo espectro de atividades relacionadas à função imune, como o aumento da fagocitose mediada por macrófagos, aumento do índice de migração de macrófagos e atividades tumoricida e bactericida (AGRAWAL e GUPTA, 2000). Além disso, apresenta baixa toxicidade, tornando-se um candidato promissor à imunoterapia. A tuftsina se liga especificamente aos macrófagos pelos receptores Fc e neuropilina-1(NP-1) (JAIN e AMIJI, 2012).
Bai et al. (2008) produziram um bioconjugado anticâncer composto por metotrexato (fármaco com atividade anticancerígena) acoplado à tuftsina modificada com um espaçador e também ligada às porções de direcionamento quimiotático, e verificaram que os bioconjugados foram rapidamente internalizados por células de monócitos humanos, além de terem provocado um efeito tóxico maior quando comparado ao fármaco livre, sugerindo que o carreador à base de tuftsina apresenta potencial atividade para a terapia do câncer. Um outro estudo antigo, porém, relevante, conduzido por Singhal et al. (1984), relatou o desenvolvimento de lipossomas incorporados à um derivado da tuftsina e constatou um aumento significativo da sua ligação pelos leucócitos. Paralelamente, foi avaliado o efeito da mesma formulação em condições idênticas, em eritrócitos e linfócitos e demonstrado que não houve aumento da ligação da formulação às células, atestando a seletividade da tuftsina pelas células do sistema monofagocitário nuclear.
Assim, diante de todas as informações descritas e do atual contexto da TB no mundo, uma nova estratégia de otimização do tratamento da doença através do desenvolvimento de micropartículas inalatórias contendo nanopartículas de rifampicina funcionalizadas com a tuftsina, proporciona perspectivas para uma contribuição significativa na redução do tempo de tratamento, dos efeitos adversos e da resistência multidroga, aumentando a adesão do paciente e eficácia do tratamento.
2.3.2. Nanoconjugados
Uma estratégia interessante para tratamento da TB é a utilização de nanoconjugados, definidos como múltiplas porções funcionais ligadas covalentemente, ao invés de encapsuladas no nanocarreador (LJUBIMOVA et al., 2008). Estas porções podem ser resultado da síntese entre fármaco e polímero, formando os conjugados. Os conjugados poliméricos foram primeiramente introduzidos por Ringsdorf, na década de 70. De acordo com o modelo proposto, um conjugado ideal deve ser formado por um suporte polimérico biocompatível com o veículo, e um agente bioativo, os quais são geralmente ligados entre si por um espaçador biologicamente responsivo (RINGSDORF, 1975). A eficiência terapêutica destas moléculas pode ser otimizada pela funcionalização, através da inserção de moléculas capazes de direcionar o conjugado para um sítio específico de interesse. Zhou et al. (2015) demonstraram em seu trabalho uma aplicação prática desta perspectiva, ao propor nanoconjugados poliméricos para liberação do fármaco doxorrubicina seletivamente no tumor, via inserção de grupos protetores pH-dependentes no conjugado, evitando a interação não-específica do conjugado com os tecidos saudáveis e proporcionando esta ligação apenas no tumor, devido ao microambiente local ácido.
Ao serem sintetizados e acoplados a um polímero, os conjugados apresentam propriedades físico-químicas diferentes das do fármaco original, agregando algumas vantagens, a saber: aumento da solubilidade de fármacos hidrofóbicos, liberação controlada do fármaco sob condições específicas (como pH ou ação de enzimas), melhora da biodisponibilidade e aumento do tempo de meia-vida plasmático, proteção contra a degradação do fármaco, alteração na biodistribuição e acúmulo em tecidos ou células-alvo específicos devido à possibilidade de funcionalização (PANG et al., 2013). Além disso, a modificação química pode conferir aos conjugados a característica anfifílica, o que os torna capazes de se auto-agregar em nanopartículas em soluções aquosas (LANZ-LANDÁZURI et al., 2012). Assim, os conjugados possibilitam a obtenção dos nanoconjugados sem a adição de excipientes, o que contribui significativamente para a redução da toxicidade destas formulações.
Durante a etapa de delineamento destes sistemas de liberação controlada, vários fatores devem ser levados em consideração para a garantia de um conjugado eficaz e com propriedades adequadas para alcance do sítio de interesse. A pré-seleção de polímeros compatíveis quimicamente com o fármaco, o tipo de reação de conjugação (direta ou
indireta) e a provável geração de resíduos (impurezas) ao final da reação, o espaçador com características físico-químicas ideais para possibilitar o acoplamento de ambas as moléculas (fármaco e polímero) e, principalmente, o mecanismo de liberação do fármaco no local de ação (pH dependente ou via ação de enzimas), são parâmetros essenciais e que devem estar harmonizados entre si para possibilitar a síntese bem-sucedida do conjugado (PANG et al., 2013).
O conjugado deve ainda ser projetado a partir de substâncias que confiram ao seu respectivo nanoconjugado duas propriedades fundamentais para a terapêutica: biodegradabilidade e ausência de imunogenicidade (LJUBIMOVA et al., 2008). Como estes nanocarreadores visam uma baixa toxicidade, é importante que sejam constituídos por polímeros que não se acumulem no organismo após sua metabolização e ainda, que não induzam uma resposta imune após administração.
Os conjugados poliméricos se tornaram uma alternativa em potencial para a melhoria da terapêutica, alcançando inclusive a etapa de testes clínicos para uma provável inserção no mercado (DUNCAN, 2006). No entanto, muitos deles foram reprovados nestes testes devido aos resultados negativos que poderiam ter sido evitados caso a etapa inicial de delineamento e proposição do conjugado fosse rigorosamente seguida. Danhauser-Riedl et al. (1993) publicaram um estudo clínico de fase I, em que a cadeia polimérica do dextrano foi modificada para permitir a conjugação com a doxorrubicina e consequente formação do conjugado polimérico AD-70. Porém, ao avançar para os testes clínicos, uma toxicidade inesperada e significativa do conjugado foi detectada, a qual foi, posteriormente, associada à modificação polimérica que causou a perda da biodegradabilidade do polímero e uma reação imunogênica exagerada, ausentes no polímero original.
A escolha cautelosa de um polímero cuja estrutura seja biodegradável é crucial para a obtenção de nanoconjugados com alta capacidade de se auto-agregar em nanopartículas e incorporar o máximo de fármaco possível. Neste contexto, o poli(ácido-málico) (PMA) apresenta um grande potencial para uso na terapêutica por ser biodegradável e biocompatível. O PMA é um polímero hidrofílico devido aos múltiplos grupos carboxilas livres presentes em sua estrutura. Esta mesma peculiaridade permite a modificação química do polímero através da derivatização ou inserção de moléculas de interesse nestas unidades funcionais, visando nanoconjugados com alta taxa de incorporação de fármacos (LOYER et al., 2014). Uma das estratégias de modificação do
