PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
CARMEM JANE FERREIRA VILAR
EFEITO ANTIOXIDANTE E ANTI-INFLAMATÓRIO DA NANOPARTÍCULA DE OURO NA MUCOSITE ORAL
EXPERIMENTAL
Natal, RN 2020
EFEITO ANTIOXIDANTE E ANTI-INFLAMATÓRIO DA NANOPARTÍCULA DE OURO NA MUCOSITE ORAL
EXPERIMENTAL
Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Ciências Biológicas da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial necessário para obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas. Orientadora: Prof.ª Dra. Caroline Addison Carvalho Xavier de Medeiros.
Natal, RN 2020
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Prof. Leopoldo Nelson - -Centro de Biociências - CB
Vilar, Carmem Jane Ferreira.
Efeito antioxidante e anti-inflamatório da nanopartícula de ouro na mucosite oral experimental / Carmem Jane Ferreira Vilar. - Natal, 2020.
65 f.: il.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas.
Orientadora: Profa. Dra. Caroline Addison Carvalho Xavier de Medeiros.
1. Mucosite oral - Dissertação. 2. Antioxidante - Dissertação. 3. Anti-inflamatório - Dissertação. 4. 5-fluorouracil -
Dissertação. 5. Nanopartícula de ouro - Dissertação. I. Medeiros, Caroline Addison Carvalho Xavier de. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III. Título.
RN/UF/BSCB CDU 616.311
EFEITO ANTIOXIDANTE E ANTI-INFLAMATÓRIO DA NANOPARTÍCULA DE OURO NA MUCOSITE ORAL
EXPERIEMENTAL
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito parcial necessário para obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas.
Data de aprovação: 28/08/2020
BANCA EXAMINADORA:
Prof.ª Dra. Caroline Addison Carvalho Xavier de Medeiros (Orientadora) Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN
Presidente da Banca
Prof.ª Dra. Aurigena Antunes de Araújo
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN
Prof.ª Dra. Jozi Godoy Figueiredo
Dedico esse trabalho a minha família e em especial as minhas amadas e preciosas filhas Maria Clara e Ana Julia assim como a todos que contribuíram para a construção do mesmo.
jamais teria conseguido.
A todos os meus familiares, em especial a minha Mãe Rosilda Vilar, que cuidou da minha filha pra que eu realizasse mais uma missão, que sempre me incentivou a não parar de estudar, que nada e nem mesmo a minha recém-nascida seria motivo pra eu parar de estudar e guardo até hoje a frase que ele sempre me diz ― Querer é poder.
A minha irmã Josemária Vilar, que me deu todo apoio em cuidar das minhas filhas pra que eu pudesse estudar e me dedicar a esse trabalho, agradeço também a Cleany Veloso que juntamente com Josemária não mediram esforços pra me ajudar na formatação e construção desse trabalho.
A minha segunda mãe Joseany Vilar que sempre me disse que não seria fácil, mas era possível e que tudo iria dar certo e pôr fim a Carol que me ajudou cuidando das minhas filhas nessa reta final.
Agradeço também a minha amável orientadora Caroline Addison, que não poupou esforços em me orientar e esclarecer todas as minhas dúvidas, além de orientadora foi uma incentivadora do meu amor pela docência. E foi fundamental na construção desse trabalho e obtenção desse título de mestre.
A professora Dra. Aurigena e ao demais colaboradores que apoiaram o desenvolvimento dessa pesquisa contribuindo para a conclusão do mesmo. As colegas Suzana e Maisie pelas dúvidas esclarecidas e por todo apoio que a me foi dado e a assistência oferecida pelos técnicos.
Agradeço imensamente ao meu amigo Rodrigo Lucena que concedeu seu notebook pessoal pra que eu pudesse apresentar a dissertação e agradeço também a meu amigo Bruno Portyllo que cedeu o espaço da sua casa no qual me proporcioinou um ambiente tranquilio para realização da defesa,
Agradeço banca de qualificação as Professoras Dra.Vanessa e Dra.Vania que acrescentaram excelentes sugestões, assim como a banca de defesa composta pelas Professoras Dra. Aurigena e Dra. Jozi Godoy.
A Base de Pesquisa em Farmacologia do Departamento de Biofísica e Farmacologia da UFRN assim como os contribuintes do Departamento de Morfologia e Instituto de Química. A CAPES pelo apoio financeiro.
A mucosite oral é um efeito colateral, frequente e debilitante em pacientes com câncer de cabeça e pescoço que são submetidos ao tratamento com a quimioterapia e radioterapia. Caracterizada por lesões ulcerativas na mucosa oral, essa patologia causa comprometimento do bem-estar do paciente assim como limita o tratamento antitumoral. Visto que há poucos protocolos que demonstraram eficácia na prevenção e tratamentoo desse efeito colateral, e sabendo-se que na literatura há diversos estudos que demontram o papel antioxidante e anti-inflamatório da nanopartícula de ouro (NpAu), esse estudo tem como objetivo avaliar o efeito da NpAu na mucosite oral induzida por 5-Flourouracil (5-FU), em hamsters estudando vias de sinalização. Nesse modelo experimental os animais foram submetidos no 1º e 2º dia a injeção intraperitoneal às respectivas doses de 40 e 60 mg/kg e a mucosa oral direita recebeu no 4 º dia ranhuras superficiais trauma mecânico (TM). Os animais foram eutanasiados no 10º dia do experimento e, as amostras da mucosa oral foram, em seguidas, coletadas. Os grupos experimentais são compostos por: polivinilpirrolidona (PVP), (TM) e (5-FU) (NpAu 62 ou 125 ou 250µg/kg). Os parâmetros avaliados foram: dosagens de interleucinas-1beta (IL-1β) e fator de necrose tumoral (TNF-α) realizadas por ELISA. Realizou-se a dosagem de glutationa (GSH) por espectrofotometria. Análises por imunohistoquímica para o Fator nuclear kappa B (NF-kB) e ciclooxigenase-2 (COX-2) e expressão gênica para NAD (P) H quinona desidrogenase (NQO1), heme oxigenasse 1 (HMOX1) e Proteína 1 associada a ECH Kelch (KEAP1) por RT-PCR. Os resultados estatisticamente significativos demonstraram que os níveis de citocinas pró-inflamatórias aumentaram no grupo de animais com mucosite oral não tratado 5-FU, quando comparados com o grupo PVP: IL-1β (p<0.0001 vs. 5-FU), no grupo de animais com MO tratados com a NpAu 250µg/kg os niveis destas citocinas foram reduzidas quando comparado com o grupo 5-FU: IL-1β (p<0,001 vs. 5-FU), TNF-α (p<0,0001vs. 5-FU) e no grupo de animais tratados com a NpAu 250µg/kg aumentou os níveis de GSH quando comparado com o grupo 5-FU (p<0,0001 vs 5-FU). Na munohistoquímca para o NF-kB o grupo que foi administrado a dose NpAu 250µg/kg demonstrou uma redução significativa da imunomarcação (pontuação 2) quando comparado com o grupo 5-FU (*p<0,05 vs. 5-FU) e para COX-2 FU o mesmo resultado (p<0,05 vs 5-FU). A análise da expressão gênica quando comparado com a dose NpAu 250µg/kg NQO1 (p<0,0001 vs, FU), HMOX1 (p<0,001 vs. 5-FU) e KEAP1(p<0,001) Dessa forma, a nanopartícula de ouro demonstrou um efeito antioxidante e anti-inflamatório na mucosite oral induzida por 5- FU em hamsters.
Palavras chave: Mucosite Oral; antioxidante; anti-inflamatório; 5-Fluorouracil; Nanopartícula de ouro.
Oral mucositis is a side effect, frequent and debilitating in patients with head and neck cancer who are undergoing treatment with chemotherapy and radiotherapy. Characterized by ulcerative lesions in the oral mucosa, this pathology compromises the patient's well-being as well as limiting antitumor treatment. Since there are few protocols that have demonstrated effectiveness in preventing and treating this side effect, and knowing that in the literature there are several studies that demonstrate the antioxidant and anti-inflammatory role of the gold nanoparticle (NpAu), this study aims to evaluate the effect of NpAu on oral mucositis induced by 5-Flourouracil (5-FU), in hamsters studying signaling pathways. In this experimental model, the animals underwent intraperitoneal injection at the respective doses of 40 and 60 mg / kg on the 1st and 2nd days, and the right oral mucosa received mechanical trauma (TM) superficial grooves on the 4th day. The animals were euthanized on the 10th day of the experiment, and samples of the oral mucosa were subsequently collected. The experimental groups are composed of: polyvinylpyrrolidone (PVP), (TM) and (5-FU) (NpAu 62 or 125 or 250µg / kg). The parameters evaluated were: interleukin-1beta (IL-1β) and tumor necrosis factor (TNF-α) measurements performed by ELISA. Glutathione (GSH) was measured by spectrophotometry. Immunohistochemistry analyzes for nuclear factor kappa B (NF-kB) and cyclooxygenase-2 (COX-2) and gene expression for NAD (P) H quinone dehydrogenase (NQO1), heme oxygenase 1 (HMOX1) and ECH-associated protein 1 Kelch (KEAP1) by RT-PCR. The statistically significant results demonstrated that the levels of pro-inflammatory cytokines increased in the group of animals with untreated oral mucositis 5-FU, when compared with the group PVP: IL-1β (p <0.0001 vs. 5-FU), in the group of OM animals treated with 250µg / kg NpAu the levels of these cytokines were reduced when compared with the 5-FU group: IL-1β (p <0.001 vs. 5-FU), TNF-α (p <0.0001vs. 5-FU) and in the group of animals treated with NpAu 250µg / kg increased the levels of GSH when compared to the group 5-FU (p <0.0001 vs 5-FU). In immunohistochemistry for NF-kB, the group administered the 250 µg / kg NpAu dose demonstrated a significant reduction in immunostaining (score 2) when compared to the 5-FU group (* p <0.05 vs. 5-FU) and for COX-2 FU the same result (p <0.05 vs 5-FU). The analysis of gene expression of the NQO1, HMOX1 (p <0.0001 vs. 5-FU), and KEAP1 genes. Thus, it was demonstrated that the gold nanoparticle demonstrated an antioxidant and anti-inflammatory effect on oral mucositis induced by 5-FU in hamsters.
Keywords: Oral mucositis; antioxidant; anti-inflammatory; 5-Fluorouracil; Gold nanoparticle.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Lesões ulcerativas com formações pseudomembranosas na mucosite oral ... 3
Figura 2: Estrutura do epitélio normal da mucosa oral ... 7
Figura 3: Estrutura do epitélio normal da mucosa oral. ... 7
Figura 4: Mecanismo antioxidante pela via de sinalização do Nrf2/KEAP1. ... 9
Figura 5: Progressão da fisiopatologia da mucosite oral ... 15
Figura 6: Estrutura Química do 5- FU ... 16
Figura 7: Mecanismo de ação do 5-FU ... 18
Figura 8: Aplicações da Nanopartícula de Ouro ... 23
Figura 9: Síntese da Nanopartícula de Ouro. ... 26
Figura 10: Grupos Experimentais com da MO. ... 29
Figura 11: Avaliação Imunohistoquímica ... 36
Figura 12: Avaliação dos niveis de citocinas ... 38
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Utilização de escores para análise da Imuno-histoquímica. 30 Tabela 2: Sequência de primer para Expressão Gênica. 33
ARE Elemento de resposta antioxidante BCR Receptores de células B
COX-2 Ciclooxigenase 2
DNA Acido Desoxirribonucleico dUMP Monofosfato de desoxiuridina dTMP Monofosfato de Desoxitimidina
EFGR Receptor do fator de crescimento epidérmico FdUMP Monofosfato de fluorodeoxiuridina
FdUTP Trifosfato de Fluorodeoxiuridina FUDR Fluorouridina
FUMP Monosfosfato de fluoruridina FUTP Trifosto de fluorouridina g Grama
HCL Ácido Clorídrico
GADPH Gliceraldeido 3- fosfato desidrogenase GSH Glutationa
Gy Gray
HMOX1 Hemeoxigenase-1
INCA Instituto Nacional de Câncer
IRAK Quinase associada ao receptor de interleucina-1 i.p Intraperitoneal
ISSO Associação multicional de cuidados de suporte no câncer IkB Proteína inibitória do NF-kB
IL Interleucina
JNK c-JUN N-terminal quinase k Capa
KEAP1 Proteína 1 associada a ao ECH Kg Quilograma
LPS Lipopolissacarídeo
MAPK Proteína quinase ativada por mitógenos
MAF Homólogo do oncogene fibrosarcoma musculoaponeurótico MASSCC Associação multicional de cuidados de suporte do câncer mg Miligramas
ml Milimetro
MMP Metaloproteinases de matriz MO Mucosite oral
MYD88 Fator de diferenciação mielóide 88 NAD(P)H NQO1 Quinona oxidorredutase 1
NaOH Hidróxido de Sódio
NF-kB Fator de transcrição nuclear kappa beta NIK Indutor de quinase
NpAu Nanopartícula de ouro
Nrf2 Fator nuclear eritroide 2 relacionado ao fator 2 ºC Celcius
PI3K Fosfatidilisonistol 3 quinase PNB Nanopartícula de ouro esférica
RNA Ácido ribonucleico
ROS Espécies reativas de oxigênio RPM Rotação por minuto
RT-PCR Reação em cadeia polimerase em tempo real RTNF Receptor do fator de necrose tumoral
TCR Receptor de células T
TGF-β Fator de crescimento transformante beta TYMP Timidilato fosforilase
TIRAP Proteína adaptadora contendo o domínio TIR TLR Receptor toll-like
TM Trauma mecânico
TNF-α Fator de necrose turmoral
TNRF Receptor do fator de necrose tumoral
TRAFs Fatores associado ao receptor do fator de necrose tumoral TS Timidilato sintase
TYK2 Proteina Treonina quinase TYMK Timidilato quinase
TYMK Timidilato sintese
UMPs Uridina Monofosfato sintetase UK Uridina quinase UV Ultravioleta α Alfa β Beta µl Microlitro 5-FU 5-Fluorouracil
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO --- 1
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA --- 3
2.1 Mucosite Oral (MO) --- 3
2.1.1 Fisiopatologia da Mucosite Oral --- 6
2.1.2 5-Fluorouracil --- 16
2.2 Tratamento da Mucosite Oral --- 19
2.3 Nanopartícula Metálicas --- 20
2.4 Nanotecnologia e a Nanopartícula de Ouro --- 21
3 JUSTIFICATIVA --- 24 4.OBJETIVOS --- 25 4.1 Objetivo Geral --- 25 4.2 Objetivos Específicos: --- 25 5 MATERIAIS E MÉTODOS --- 26 5.1 Considerações Éticas --- 26
5.2 Síntese da Nanopartícula de Ouro (NpAu) --- 26
5.3 Animais --- 27
5.4 Modelo de indução da mucosite oral por 5- Fluorouracil em hamsters --- 27
5.5 Grupos Experimentais --- 28
5.6 Administração da Nanopartícula de ouro --- 29
5.7 Parâmetros avaliados --- 29
5.7.1 Análise Imunohistoquímica --- 29
5.7.2 Quantificação de Citocinas (IL-1β) e (TNF-α) --- 30
5.7.3 Quantificação de Glutationa (GSH) --- 31
5.7.4 Avaliação da expressão gênica por RT-PCR --- 32
5.8 Análise Estatística --- 34
6 RESULTADOS --- 35
6.1 Efeito da modulação farmacológica --- 35
6.1.1 Análise Imunohistoquímica --- 35
6.1.2 Quantificação de Citocinas (IL-1β e TNF-α) e Glutationa (GSH) --- 37
6.1.3 Reação em Cadeia da Polimerase de Transcrição Reversa (RT-PCR) --- 39
7 DISCUSSÃO --- 41
8 CONCLUSÃO--- 44
REFERÊNCIAS: --- 45
1. INTRODUÇÃO
A mucosite oral (MO) é uma reação inflamatória, caracterizada por lesões ulcerativas e dolorosas na mucosa oral, é um efeito colateral, frequente em pacientes submetidos à quimioterapia e/ou radioterapia de câncer de cabeça e pescoço 85 a 100% (PENG et al., 2017). Ao qual interfere na qualidade de vida dos pacientes e pode interromper o tratamento contra o câncer. O tratamento quimioterápico associado à radioterapia resulta na toxicidade das células epiteliais da mucosa oral e mielossupressão, isso contribui de forma significativa para o desequilíbrio entre a proliferação e apoptose celular, resultando em um tecido epitelial extremamente inflamado e ulcerado (SILVERMAN, 2007).
As manifestações clínicas observadas nessa afecção são lesões ulcerativas pseudomembranosas, dor, edema, eritema e xerostomia. A leucopenia pode estar presente na maior parte dos pacientes, e está associada ao aumento da susceptibilidade a infecções bacterianas e fúngicas, que resulta em bacteremia e sepse (BUGLIONE et al., 2016). A dor intensa é umas das características mais marcantes da mucosite oral, no qual interfere no tratamento antitumoral e compromete a qualidade de vida destes pacientes, uma vez que apresentam a incapacidade de ingestão de alimentos e líquidos surge então à necessidade de um maior período de hospitalização (SONIS, 2004).
A fisiopatologia da mucosite oral é complexa e causam lesões e apoptose de células basais, resultando em atrofia, ulceração e perda da capacidade de renovação celular. As lesões podem se apresentar de forma mais branda, com eritema na mucosa ou na forma grave, onde há úlceras com formações pseudomembranosas que penetram profundamente na submucosa. Conforme descrita, ocorre em cinco fases: Iniciação, Resposta ao dano primário, Amplificação do sinal, Ulceração e Cicatrização (SONIS, 2007).
Alguns fatores de riscos estão relacionados com o desenvolvimento desta condição, tais como: má higiene bucal, presença de infecções anterior ao tratamento, trauma decorrente de má escovação bucal e prótese inapropriada, além de hábitos danosos à saúde como tabagismo e etilismo (LEVEDEG et al., 2007; PETERSON et al., 2006).
A terapia disponível para (MO) consiste em protocolos preventivos com pouca eficácia, são eles: higiene bucal, enxaguantes orais, anestésicos tópicos, anti-inflamatórios, analgésicos opióides, crioterapia (gelo) e terapia a laser de baixo nível (VADHAN-HAJ et al., 2010).
Estudo anterior de (SILVA, 2018) da base de pesquisa em farmacologia da UFRN, mostrou que a nanopartícula de ouro dose de 250µg/kg possui efeito protetor na mucosite oral experimental, evidenciado pela análise macroscópica e histopatológica.
Algumas pesquisas também demonstram que a nanopartícula de ouro possui atividade anti-inflamatória por diminuir importantes marcadores inflamatórios, tais como, a IL-1β e TNF-α (VICTOR et al, 2012); (SWAN, 1999; DANIEL; ASTRUC, 2004); (DOHNERT et al, 2012); NF-kB (PEREIRA et al, 2012); (TSAI et al, 2007); (SWAN, 1999; DANIEL; ASTRUC, 2004). A via NF-kB é uma via clássica envolvida na fisiopatologia da MO, pesquisas apontam que a nanopartícula de ouro (NpAu) atua sobre essa via clássica (PARK, 2016; NICOLAU et al., 2016) bloqueando a ativação do NF-kB por meio da interação com IKK-β e consequentemente inibindo a ativação de citocinas pro-inflamatórias como o TNF-α e IL-1β (MOLINA et al., 2010).
A literatura mostra que a nanopartícula de ouro pode estar envolvida na via regulatória da Proteína 1 associada ao ECH do tipo Kelch (KEAP-1), que por sua vez encontra-se ligada ao Fator nuclear eritróide relacionado ao fator 2 (NRF2) no qual é responsável por aumentar a expressão de enzimas antioxidantes tais como: heme oxigenase 1 (HMOX-1), NAD (P) H quinona oxidoredutase 1 (NQO1), resultando em uma resposta antioxidante (GOLDSTEIN et al., 2016; MIN et al., 2017; VILAR et al., 2020).
Há uma grande expectativa no uso da nanopartícula de ouro como uma nova alternativa para o tratamento da inflamação assim como um possível carreador de fármaco atuando de forma coadjuvante no tratamento de doenças de cunho inflamatório. (RONCHETTI et al.,2016; LANG et al.,2015).
Considerando-se as manifestações clinicas relatada por pacientes acometidos da mucosite oral versus os protocolos pouco eficazes e associado à falta de um estudo que esclareça seu efeito nessa patologia, a presente pesquisa tem como objetivo esclarecer os efeitos protetivos assim como, avaliar a via de sinalização antioxidante e o efeito anti- inflamatório da NpAu no modelo experimental da mucosite oral em hamsters.
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1. Mucosite Oral (MO)
A mucosite oral (MO) é um efeito colateral, e o mais comum na terapia citotóxica do câncer de cabeça e pescoço. Ocasionada por um intenso processo inflamatório no qual resulta em dano a mucosa orofaringe (SCULLY et al., 2006). É considerada umas das complicações sintomáticas mais frequentes e preocupantes desse tipo de terapia e está associada a altos índices de morbidade, mortalidade e custo na terapia do câncer, e que por fim, resulta no comprometimento da qualidade de vida dos pacientes submetidos ao tratamento antitumoral (SONIS, 2007).
As lesões orais são bastante dolorosas e podem apresentar-se de forma leve como uma estomatite eritematosa até a uma manifestação mais grave como a úlcera profunda. A intensa dor leva a perda da capacidade de deglutição de alimentos sólidos e líquidos e consequentemente o surgimento de um quadro clínico significativo de desnutrição e desidratação do paciente (RILEY et al., 2015). A maioria dos pacientes que apresentam granulocitopenia demonstra um maior risco de infecções sistêmicas podendo levar a óbito. Além disto, a MO pode ocasionar problemas psicossociais como depressão e ansiedade (SONIS et al., 2010). Estas lesões podem acometer diversas áreas da cavidade oral, como a faringe, laringe e esôfago, assim como outras áreas gastrointestinais (figura 1) (LALA et al., 2014).
Figura 1: Lesões ulcerativas com formações pseudomembranosas na mucosite oral (a) Alterações superficiais; (b) lesão celular basal apoptose e morte; (c) Ulceração; (d) cicatrização espontânea. Fonte: Adaptado de Sonis, (2009).
O câncer de cabeça e pescoço é uma neoplasia maligna que acomete os seguintes sítios: cavidade oral, faringe, laringe, cavidade nasal, seios paranasais, tireoide e glândulas salivares e representa cerca de 10% de todos os cânceres humanos. O câncer oral é um dos mais prevalentes no Brasil, atinge 40% dos pacientes com neoplasia de cabeça e pescoço, seguido pela laringe (25%), faringe (15%) (INCA 2018). A cavidade oral é compreendia por lábios, mucosa jugal (bochecha), gengiva, palato e assoalho da língua (LAMBERT et al., 2011; CHANG et al., 2015).
Esse tipo de câncer é mais comum em homens acima dos 40 anos de idade, sendo o quarto tumor mais frequente no sexo masculino na região Sudeste (INCA 2020). Estima-se para o ano de 2020 que aproximadamente 15.190 novos casos, sendo 11.180 homens e 4.000 mulheres (INCA 2020). Cerca de 650 mil pessoas são diagnosticadas com esse tipo de câncer sendo o quinto tipo de câncer mais comum no mundo, esses números demonstram as altas taxas de morbidade e mortalidade (CAMPANA E GOIATO, 2015). De acordo com o (Atlas de Mortalidade por Câncer-SIM, 2018) o número de mortos foi de 6.455 sendo 4.974 homens e 1.481 mulheres.
O tratamento pra o câncer de cabeça e pescoço consiste em procedimento cirúrgico, radioterapia, quimioterapia, hormonioterapia e terapia biológica, como consequências do tratamento há o aparecimento de efeitos colaterais irreversíveis que causam impacto significativo na qualidade de vida desses pacientes comprometendo funções vitais como a deglutição, fala, e sentidos de sabor e cheiro, acompanhados também de problemas psicossociais (NIGRO et al., 2017; SANTOS et al., 2015).
A radioterapia (RT) baseia-se na aplicação de radiações ionizantes, que causam a quebra das moléculas dos componentes citoplasmáticos assim como a quebra do material genético, com isso levando a morte da célula neoplásica (SAARILAHTI et al., 2002). O tratamento radioterápico atua sobre as células basais da mucosa oral impedindo sua capacidade de replicação, no qual, acarreta o atrofiamento do epitélio, o dano vascular associado com o infiltrado inflamatório, torna-o mais susceptível as lesões e com menor capacidade de reparo (CHIAPELLI et al., 2005). A dose total utilizada no tratamento está relacionada com o local e o tipo de tumor, no modelo tradicional é utilizado 50-70 Gy, essa dose é distribuída em frações de 1,8 a 2,0 Gy/dia cinco dias por semana durante a cinco a sete semanas (VISSINKI et al., 2003) .
O período de duração das úlceras assim como a sua gravidade, vão diferenciar de acordo com a dose e o medicamento utilizado, em determinadas situações ocorre a necessidade da diminuição da dose pelo médico ou até mesmo a interrupção do tratamento por parte do paciente, o que não é desejável por diminuir o êxito da terapia (ANTUNES et al, 2017; LEE et al., 2007). Dentre os efeitos mais comuns da radioterapia está à xerostomia, é um dos primeiros sintomas a surgir no paciente logo no início do tratamento, é caracterizada por sensação de secura na boca decorrente da diminuição da salivação. A xerostomia é provocada pela exposição das glândulas salivares a radiação, as parótidas especificamente são responsáveis por produzir cerca de 50% da quantidade total de saliva (ROLIM et al., 2011).
Logo, lesões nessas glândulas tem como consequência a produção de uma saliva mais viscosa e densa (PAIVA et al, 2010; TOLLENTINO et al., 2011). Essas alterações na composição e qualidade da saliva geram um incômodo oral noturno, como mucosa seca, halitose, sensação de ardor na língua, alterações no paladar, rachaduras e úlceras nos tecidos moles, disfagia, disfasia, aumento da susceptibilidade a infecções bacterianas, fúngicas com destaque para candidíase e cárie dentária principalmente em pacientes que não receberam tratamento odontológico antes do tratamento radioterápico (JHAM et al., 2006; FREITAS et al., 2012; BEHL et al., 2014).
A persistência e gravidade desse efeito podem estar ligadas a presença de candidíase nesses pacientes em tratamento com a radiação, possibilitando dessa maneira, a colonização e o crescimento dos fungos. Esse processo é intensificado pela acidificação do biofilme oral produzido pelos fungos e redução da capacidade residual do tampão da saliva. A prevalência de leveduras está fortemente associada à radioterapia, assim como ao desenvolvimento da mucosite oral e infecções secundárias, cerca de 20 a 70% dos pacientes irradiados apresentam Candida sp (SURYAWANSHI et al., 2012; YOGITHA et al., 2015; BAKII et al., 2014).
A magnitude da MO está relacionada com a dose e frequência da RT, volumes e os fatores anatômicos dos tecidos irradiados, as condições gerais e orais do paciente, idade, lesões dentárias tratadas e o uso associado com a quimioterapia e procedimentos cirúrgicos. Esses efeitos apresentam-se na sua forma aguda, surgindo durante o tratamento ou após semanas, ou na forma crônica, observados a meses ou até anos após o tratamento com a radiação (MINHAS et al., 2016).
Os efeitos da toxicidade aguda são aquelas manifestações que surgem durante o tratamento radioterápico, sendo autolimitadas e reversíveis, no qual cessam após semanas ou meses após o fim do tratamento. Os principais efeitos colaterais agudos são: mucosite, xerostomia, disgeusia, disfagia, odinofagia, sangramento, infecções oportunistas como
candidíase, rouquidão, alterações de pele, emagrecimento e periodontopatias (COSTA et al., 20011; VINES et al., 2017).
A mucosite oral é o efeito colateral mais presente na radioterapia, corresponde cerca de 40 a 100% dos pacientes (ANDREASSEN et al., 2018). O efeito agudo gera uma intensa dor e desconforto, que implica na aceitação e continuidade do tratamento radioterápico, a interrupção da radioterapia pode progredir para futuras complicações assim como, comprometer o estado nutricional do paciente e a aumentar o risco de infecções secundárias (VENES, 2006; WUTHRICK et al., 2015).
Os efeitos crônicos aparecem por volta dos três meses ou mais após a radioterapia, são efeitos comumente irreversíveis no qual apresentam consequências definitivas para o paciente. Essas manifestações estão ligadas aos tecidos com replicação lenta, tais como, tecido conjuntivo, vasos sanguíneos e tecido nervoso. Logo os efeitos crônicos que surgem decorrente da radioterapia são: fibrose de tecido subcutâneo, trismo, osteorradionecrose, distúrbios auditivos e oftalmológicos, fístulas, hipotireoidismos, mielite cervical e edema de face e pescoço (STROJAN et al., 2017; COSTA, 2011). As complicações sistêmicas acometem cerca de 60 a 100% dos pacientes em tratamento, como dor generalizada, anorexia, náuseas, alterações do humor, depressão e ansiedade (EPSTEIN et al., 2012).
Pacientes submetidos à quimioterapia também podem apresentar mucosite oral, cerca de 40% (FRANCO et al., 2017). Embora a radioterapia seja o tratamento padrão ouro para câncer de cabeça e pescoço, o uso associado com agentes quimioterápicos é comumente utilizado, além disso, a quimioterapia apresenta uma ação sistêmica sendo capaz de alcançar o câncer metastático (SONIS, 2015; WONG et al., 2014).
A quimioterapia causa toxicidade em células em proliferação sejam elas normais ou células neoplásicas. O metotrexato e 5-Fluorouracil (5-FU) são exemplos de quimioterápicos relacionados com a mucosite oral (VILLA et al., 2017).
2.1.1 Fisiopatologia da Mucosite Oral
A mucosa oral é constituída por um epitélio pavimentoso estratificado, pela lâmina própria formada pelo tecido conjuntivo: fibroblastos, vasos sanguíneos, macrófagos e matriz extracelular (SONIS, 2004), representado na figura 2.
Figura 2: Estrutura do epitélio normal da mucosa oral: (a) Epitélio pavimentoso estratificado, (b) Fibroblastos, (c) Macrófagos, (d) capilares,(e) Matriz extracelular
Figura 3: Estrutura do epitélio normal da mucosa oral: (a) Epitélio pavimentoso estratificado, (b) Fibroblastos, (c) Macrófagos, (d) capilares, (e) Matriz extracelular.
Fonte: Adaptado de Sonis (2004)
A fisiopatologia da mucosite oral (MO) se inicia com efeitos deletérios da radioterapia e/ou quimioterapia das células epiteliais basais. Atingem a submucosa e o epitélio da célula. Por volta de 1 a 2 semanas após o início do tratamento da radioterapia e/ou quimioterapia surgem às lesões na mucosa oral, o epitélio é submetido à injúria por meio desses agentes tóxicos, no qual acarreta dano ao DNA e apoptose da célula basal (PETERSON, 1999; SONIS, 2004).
Cerca de 1 a 2 semanas após o início do tratamento da radioterapia e/ou quimioterapia surgem às lesões na mucosa oral, o epitélio é submetido à injúria por meio desses agentes tóxicos, no qual acarreta dano ao DNA e apoptose da célula basal (PETERSON, 1999; SONIS, 2004). A MO é um evento que se divide em cinco fases: (1) iniciação ao dano celular, (2) resposta ..(3) up regulation, (4) ulceração e (5) cicatrização. Essa sequência de eventos biológicos ocorre simultaneamente e afetam as células neoplásicas assim como as células normais (SONIS, 2004; SONIS, 2007; AL- ANSARI et al., 2015).
Após a exposição das células a radioterapia e/ou quimioterapia, inicia-se a geração de espécies reativas de oxigênio, que acarreta o dano à membrana celular, tecido conjuntivo e DNA. A perturbação no estado redox celular leva a um estresse oxidativo elas representam um importante papel biológico, por ser responsável pela ativação de mecanismos de controle
a
b c d e
biológico além de causarem dano diretamente à célula (SONIS, 2007; FINKEL 2000).
A agressão direta a célula basal ocorre de forma simultânea à geração de espécies reativas de oxigênio que causam lesão direta ou não ao DNA. A lesão ao DNA resulta em quebra das fitas de DNA nas células basais, bem como nas células da submucosa causando uma pequena parcela de apoptose dessas células o estresse oxidativo é responsável por mediar a maior parte desses eventos. O aumento de espécies reativas de oxigênio (ROS) no interior da célula ativa mecanismos intrínsecos apoptóticos desencadeando a morte da célula (SONIS, 2004). O metabolismo normal intracelular é mantido por enzimas antioxidante, que são responsáveis pela regulação e bloqueio do estresse oxidativo em células endoteliais e neurais. Essas enzimas são produzidas por meio da ativação de uma via de sinalização antioxidante fator eritróide nuclear 2 relacionado ao fator 2, e funcionam inibindo o excesso de produção de espécies reativas de oxigênio e consequentemente diminui a apoptose celular (XIA et al., 2015).
A via de sinalização antioxidante Nrf2/Keap1, é de extrema importância para a indução da expressão de enzimas antioxidantes como a heme oxigenasse-1 (HMOX-1), NAD(P) H oxirredutase quinona (NQO1), glutationa (GSH). O Nrf2 está ligado a proteína Kelch-1 associado ao ECH (KEAP-1), quando esse fator é ativado por substâncias antioxidantes, como moléculas PI3K, Akt dentre outras, a proteína Kelch-1 associada ao ECH (KEAP-1) é degradada pelo proteossoma e então o Nrf2 é translocado do citoplasma para o núcleo. Após entrar no núcleo, o Nrf2 se liga ao elemento de resposta antioxidante (ARE), induzindo dessa forma o mRNA das enzimas antioxidantes, estas por sua vez vão agir combatendo o estresse oxidativo e impedindo a morte celular (JOENG,2015; XIA et al., 2015) (figura 3).
Figura 4: Mecanismo antioxidante pela via de sinalização do Nrf2/KEAP1. No citoplasmao o Nrf2 se encontra ligado a duas moléculas de KEAP1, associação com o complexo Cul3-Rbx1, que sinaliza o Nrf2 para destruição pelo o proteossoma. O estresse oxidativo causa heterodimerização com uma das cisteínas no Keap1 e fosforilação do Nrf2, permitindo sua translocação para o núcleo onde se liga (homólogo do oncogene fibrosarcoma musculo aponeurótico Maf e ARE/EpRE, promovendo a transcrições dos genes das enzimas antioxidantes.
Fonte: Adaptado de Wenjun et al (2018)
O Nrf2 se localiza sob condições normais no citoplasma ligado ao complexo de proteínas Keap1-Cul3-Rbx1, na presença de estresse oxidativo o Nrf2 é liberado do Keap1 e então é direcionado para o núcleo onde se heterodimeriza com a pequena proteína Maf, ativando a expressão gênica dependente de ARE de proteínas antioxidantes e citoprotetoras (WENJUN et al., 2018).
A fase seguinte é a da resposta primária, no qual ocorre a resposta primária frente aos estímulos nocivos da quimioterapia, radioterapia e espécies reativas de oxigênio. As quebras das fitas de DNA estimulam a ativação de diversas vias de transdução, tais como a via do NF- kB e das ceramidas e esfingomielinas que desencadeiam por meios de processos biológicos a formação da lesão na mucosa oral. Essa resposta é caracterizada pelo o aumento da expressão de genes de resposta imediata e ativação de fatores de transcrição destacando-se o NF-kB (SONIS, 2007; MADDENS, et al., 2002). O NF-kB ativa a expressão de diversas citocinas pró-inflamatórias, como a interleucina 1 beta (IL-1β), fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) estes por sua vez estão diretamente ligados com a formação da lesão (SONIS, 2004; SONIS, 2000).
Fatores de transcrição são proteínas que se ligam as regiões promotoras dos genes e proporcionam o controle da iniciação da transcrição gênica. O Fator de transcrição nucelar kappa beta é um dos fatores de transcrição mais relevantes na mucosite oral, ele foi descoberto em 1986 nos Linfócitos T, por regular a transcrição da cadeia leve da k- imunoglobina. Sua importância se destaca por regular a expressão de genes envolvidos na atividade inflamatória, assim como na sobrevivência, proliferação e apoptose celular (XIAU, 2004).
A família NF-kB é formada por cinco componentes- RelA ou p65, RelB ou p68, cRel, NF-kB1 ou p 100 e NF-kB2 ou p105. São fatores que formam homo ou heterodímeros que apresentam um domínio de homologia Rel (RHD), ele é essencial para a ligação ao elemento kB no DNA. Essa via no seu estado basal é bloqueada por uma família de inibidores (IkB) de NF-kB. Diversos estímulos ativam essa via de sinalização do NF-kB, incluindo citosinas pró- inflamatórias IL-1β e TNF-α, LPS- bacterianos, cancerígenos e radiação UV. Este estímulo promove a degradação do IkB que permite a dimerização no citoplasma das proteínas NF-kB e translocação do citoplasma para o núcleo (CHEN et al., 2002; O’DEA et al., 2010).
Há duas principais vias para ativação do NF-kB, são a via canônica e a não canônica, elas apresentam mecanismos de sinalização diferentes, no entanto desempenham papéis importantes na regulação da resposta imune e inflamação (SUN, 2011). Na via canônica os dímeros de NF-kB são regulados por moléculas inibidoras da família IkB que impedem a translocação para o núcleo formando um complexo estável.
O complexo é liberado por meio da estimulação dos receptores de citosinas pró- inflamatório tais como receptor do fator de necrose tumoral (RTNF), receptor de IL-1 (RIL- 1), membros da família dos receptores tool -like (RTL) (TLR3, TLR4 E TLR7), receptores de antígenos como receptores de células B (BCR) e receptores de células de T (TCR) e fatores de crescimento como a família de receptores do fator de crescimento epidérmico (EGFR).
Todos esses receptores são capazes de ativar o complexo IkB quinase (IKK) (IKKα, IKKβ e IKKγ) essa ativação resulta na fosforilação e ubiquitinação de IkB e sua degradação pelo o proteossoma. Por fim os dímeros p65 / p50 e c-Rel / p50 são translocados para o núcleo e dessa forma ativam a expressão do gene alvo (GUPTA et al., 2010; CHEN et al., 2013).
O IkB é fosforilado no resíduo de serina, por meio do meio do complexo proteína quinase IKK, esse processo de fosforilação funciona como um sinal para que a ubiquitinação ocorra e consequentemente a degradação do IkB pelo o proteossoma. Um complexo de proteínas adaptadoras e ancoradoras no citoplasma (TRAFs, MyD88 e TIRAP) e quinases (RIP, IRAK) funcionam de forma associada quando na presença de estímulo facilitando o
recrutamento da IKK. Logo após a degradação do IkB, os dímeros p50/65 são liberados para o núcleo e lá desempenham suas funções de ativação de genes específicos (KALTSCHMIDT E COL, 2005) .A via não canônica é ativa por diferentes estímulos tais como citosinas pró- inflamatórias e endotoxinas bacterianas que promove a ativação do complexo IKK. Essa ativação se dar por meio da ativação do indutor de quinase (NIK) que promove a sinalização para o homodímero IKKα fosforilar a p100 /Rel B a porção p100 é ubiquitinada e logo em seguida é degradada. A porção C terminal é degradada pelo o proteossoma, deixando a porção N-terminal para formar o peptídeo p52. Por fim o dímero p52/ RelB formado desloca- se para o núcleo ativando a expressão gênica de forma específica nos órgãos linfoides (XIAU, 2000) A via canônica do NF-kB é ativada por diversos sinais de receptores que ativam a quinase TGF-β-ativada quinase 1 (TAK1). O TAK1 ativa o complexo trimérico de IkB quinase (IKK), que é formado por subunidades catalítica e reguladora respectivamente (IKKα e IKKβ), (IKKy) via fosforilação de IKKβ. Após a estimulação, o complexo IKK, atrvés de IKKβ, na maior parte fosforila membros do inibidor da família (IkB), como o membro prototípico IkB IkBα e a molécula semelhante a IkB p105 que sequestra NF-κB membros do citoplasma. IkBα se liga a dímeros de p50 e membros o REL família (RELA ou c-REL), já os membros do p105 se associa a p50 ou REL (RELA ou c REL). Após a fosforilação por IKK, IkBα e p105 são então direcionados para ubiquitina dependente (Ub) degradação no proteossoma, causando a translocação nuclear do NF-kB canônico, os membros da família, que se ligam a elementos específicos do DNA, denominados potenciadores kB do gene alvo, no formato de diverso complexos diméricos, tais como, RELA-p50, c-REL-P50 e p50-p50. Já a sinalização não canônica do NF-κB se baseia no processamento de p100, molécula semelhante a IkB regula principalmente, não exclusivamente, RELB essa via responde a um subconjunto de membros da superfamília do receptor do fator de necrose (TNFR) que apontam a ativação da quinase indutora do NF-κB carboxi terminal (NIK). A NIK então vai fosforilar e ativar a IKKα, transforma resíduos serina do termina carboxi do p100 fosforilados, causando a degradação seletiva da estrutura do tipo C-terminal IkB de p100 ocasionando a geração de p52 e a translocação nuclear de p52 e RELB4, PRRs, receptor de reconhecimento de padrões (Figura 4).
Figura 4: Vias de sinalização canônica e não canònica do NF-kB. Fonte: adaptado de Sun, (2017).
O NF-kB é responsável também por regular a expressão de cerca de 200 genes dentre os quais estão envolvidos na patogênese da MO. Dentre esses genes podemos destacar que estão relacionados na produção de enzimas, ciclooxigenase-2 (COX-2), interleucina, fator de necrose tumoral (TNF-α) (BARNES et al., 1997).
A super expressão desses genes leva a produção de citosinas pró-inflamatórias que se destacam na MO como o TNF-α, IL-1β e IL-6 que são indispensáveis pra o desenvolvimento da lesão oral, o aumento dos níveis dessas citosinas estão diretamente relacionadas com o efeito da radioterapia e/ou quimioterapia (SONIS, 2002). Essas citocinas por sua vez
amplificam o sinal primário e ativam também o NF-kB em outras células, gerando a expressão de moléculas sinalizadoras de proteína-quinase ativada por mitógeno (MAPK), ciclooxigenase 2 (COX-2) e proteína tirosina quinase (PTK) (SONIS, 2002; SONIS, 2007).
O Fator de necrose tumoral (TNF-α) é uma citosina pleiotrópica produzido por diferentes células (astroglias, micróglias, Células de Kupffer e macrófagos alveolares) em menores quantidades, sendo produzidos principalmente por monócitos/macrófago em maior quantidade, e estes por sua vez respondem fortemente ao estímulo do TNF-α. (GRIVENNIKOV SI et al.,2005; PFEFFER K et al., 1993). Por meio de dois receptores transmembranas TNRF1 conhecido como p55ou p60 e TNRF 2 conhecido como p75 ou p80, o TNF-α faz a sinalização e a regulação de diferentes funções celulares, tais como a proliferação, sobrevivência, diferenciação e apoptose. Estudos também demonstraram que a sobrevivência em longo prazo de macrófagos depende da sinalização autócrina pelo TNFα (LOMBARDO et al., 2007).
O TNF-α por sua vez ativa a expressão do NF-kB e enzimas como esfingomielinase e ceramida sintetase, esse mecanismo de feed back é composto por uma cascata de reações que resulta no desenvolvimento das lesões ulcerativas, denominada como a amplificação de sinais, é a terceira fase do processo da lesão. As proteínas biologicamente ativas que vão se acumulando durante essa fase desempenham o papel de direcionar os processos nos tecidos do epitélio e da submucosa proporcionando aumento da lesão tecidual e estendendo o dano. (SONIS, 2004, 2007). Essas vias podem ser ativadas pela a ação direta da quimioterapia e ou radioterapia, ou de forma indireta pelas espécies reativas de oxigênio e TNF-α e consequentemente ativação do NF-kB (MADDENS, et al., 2002).
A apoptose das células da submucosa assim como as células epiteliais são induzidas pela via das ceramida sintase. Nesse processo ocorre também destruição de fibronectina que gera ativação de macrófagos, proporcionando mais lesão tecidual por intermédio da metaloproteinases, além disso, esse processo contribui para o aumento adicional de TNF-α. O TNF-α vai promover a sinalização da proteína quinase ativada por mítogenos (MAPK), que ativa a sinalização o c-JUN N-terminal quinase (JNK) que regula o fator de transcrição da AP1, que por sua vez interfere na secreção das metaloproteinases de matriz (MMPs) (VILLA; SONIS 2015, 2007).
Consequentemente essas vias de sinalização levam a ativação de metaloproteinas de matriz (MMPs) em células epiteliais e do subconjuntivo, como macrófagos, fibroblastos e células endoteliais (SONIS, 2004). As MMPs levam a destruição da matriz de colágeno subepitelial e causam o rompimento da interface do tecido epitelial com o conjuntivo
proporcionando a disseminação de outros estímulos destrutivos (SONIS, 2007; Al- DASOOQI et al., 2010).
A apoptose das células da submucosa assim como as células epiteliais são induzidas pela via das ceramida sintase. Nesse processo ocorre também destruição de fibronectina que gera ativação de macrófagos, proporcionando mais lesão tecidual por intermédio da metaloproteinases, além disso, esse processo contribui para o aumento adicional de TNF-α. O TNF-α vai promover a sinalização da proteína quinase ativada por mítogenos (MAPK), que ativa a sinalização o c-JUN N-terminal quinase (JNK) que regula o fator de transcrição da AP1, que por sua vez interfere na secreção das metaloproteinases de matriz (MMPs) (VILLA; SONIS 2015, 2007).
A quarta fase da MO, é a ulcerativa, é a fase mais crítica do ponto de vista clínico, visto que há o surgimento das lesões orais provenientes do tratamento da quimioterapia/radioterapia, aparecimento dos sintomas e perda de função que está associada a condição. No interior da boca a úlcera penetra o epitélio até a submucosa, essas úlceras da mucosite oral são caracterizadas pela sua profundida e presença de exsudato fibrinoso, sendo mais conhecido como uma pseudomembrana que cobre constantemente a lesão (SONIS, 2004; SONIS, 2015).
As lesões nessa fase são dolorosas e estão associadas a um quadro de neutropenia do paciente que por sua vez favorece a infecções bacterianas. A entrada dos constituintes da parede celular das bactérias para a submucosa promove ativação de macrófagos, que por sua vez vão produzir e secretar citocinas pró-inflamatórias adicionais, além de promover a liberação de MMPs destrutivas adicionais. Esse processo estimula a expressão de genes apoptóticos que potencializam a lesão tecidual de genes pró-apoptóticos que potencializam a lesão tecidual formando úlceras clinicamente visíveis (AL-ANSARI et al, 2015; STRINGER & LOGAN, 2015). A baixa quantidade dos neutrófilos favorece a entrada de micro- organismos que fazem parte da microbiota oral, para dentro das lesões, promovendo bacteremia e sepse (SONIS, 2004).
A fase da cicatrização é a quinta e última fase, nesta fase há uma sinalização da matriz extracelular que estimula a migração, diferenciação e proliferação epitelial, com o objetivo de promover a reconstrução da submucosa, no entanto a estrutura da submucosa não será a mesma de antes da lesão. Os fibroblastos e endotélio vascular participam na ativação da ciclooxigenase-2 (COX-2) que promove um importante papel na reconstrução da submucosa por meio da angiogênese (EPSTEIN, 2011; SONIS, 2004).
Torna-se relevante a compreensão da fisiopatologia da MO uma vez que é fundamental visto o progresso de novas alternativas terapêuticas, uma vez que a moléculas de cada fase representam um importante alvo para interferência de seus efeitos, tais como, NF- kB, ROS e citocinas pró-inflamatórias (SONIS, 2004; CINASEURO, et al.,2017) (figura 5).
Figura 5: Progressão da fisiopatologia da mucosite oral, induzida por quimioterapia e radioterapia formada por cinco fases. Iniciação: Lesão ao DNA e formação de espécies reativas oxigênio (ROS) decorrente a exposição da radioterapia e quimioterapia. Regulação e geração de mensagem: Ativação do NF-kB que ativa a expressão de citocinas IL-1β e TNF-α, causando lesão da fibronectina e microvascular, produção de metaloproteinases (MMP) levando a apoptose celular. Amplificação: Presença de citosinas pró-inflamatórias estimula cada vez mais ativação do NF-kB aumentando as lesões teciduais. Ulceração: O produto da parede das bactérias estimula os macrófagos provocando inflamação uma pseudomembrana é formada sobre a úlcera constituída de bactéria se fungos. Cicatrização: Cicatrização espontânea da mucosa oral, proliferação, migração e diferenciação estimulada pela matriz extracelular assim como a restauração da microbiota oral.
2.1.2 5-Fluorouracil
O 5-Fluorouracil (5-FU) é um dos agentes toxicológicos mais utilizados no tratamento de diferentes tipos de câncer considerados umas das drogas que mais desencadeiam dano a célula em proliferação como as da mucosa oral. Possui baixa biodisponibilidade e seletividade para células tumorais, rápido metabolismo, meia vida curta aproximadamente de 10-20 min e por fim uma alta citotoxicidade, sendo como desvantagem a baixa seletividade pra células tumorais (THISIADIS, 2017).
O 5-FU faz parte do grupo das fluoropirimidinas, que são medicamentos antimetabolitos, responsáveis pela inibição dos processos biossintéticos ou por se incorporarem a macromoléculas como o DNA ou RNA, bloqueando dessa maneira sua função normal (BAYDAR et al., 2005; BRITO et al 2012; JOHNSTON, 2011).
Esse grupo de medicamentos foi desenvolvido na década de 1950, após estudos em hepatomas de ratos, observou-se que o uso da pirimidina uracil- uma dos quatros bases nitrogenadas encontradas somente no RNA era usada mais rapidamente do que em tecidos normais. Esse indício demonstrou que o metabolismo da uracila é potencial alvo para a quimioterapia de antimetabolitos (JOHNSTON, 2001).
Por ser um antimetabólito, possui uma estrutura bioquímica similar a um metabólito indispensável para reações normais do organismo. Sua estrutura química é análoga a da estrutura química da uracila, com um átomo de flúor na posição C-5 no lugar do átomo de hidrogênio. Ele é facilmente reconhecido pelo o organismo, no entanto não é capaz de manter as funções celulares normais, alterando dessa forma o metabolismo celular, inclusive a divisão celular (LONGLEY, 2003) (figura 6).
Fonte: Bukkitgar & Shetti, (2016) Figura 6: Estrutura Química do 5 - FU
O mecanismo citotóxico do 5-FU se dá pela incorporação do fluoronucletídeo no RNA e DNA e pela a inibição da enzima timidilato sintase (TS) e, dessa forma, interrompe a biossíntese da pirimidina (IMPACT, 1995; THISADIAS, 2017). O 5-FU apresenta-se na sua forma inativa, e para sua ativação é necessário que ocorra uma conversão enzimática gerando metabólitos ativos, permitindo dessa forma um direcionamento adequado a timidilato sintase (JORDAN, et al 1988).
O 5-FU entra na célula da mesma maneira que uracila, por meio do transporte facilitado, onde é convertido no meio intracelular em diferentes metabólitos ativos como: fluorodeoxiuridina monofosfato (FdUMP), fluorodeoxiuridina trifosfato (FdUTP) e trifosfato de fluorouridina (FUTP), esses metabólitos ativos que interrompem a sínteses de RNA e a ação de TS (WOHLLUETER et al., 1989, JOHNSTON, 2003).
O monofosfato de fluorodesoxiuridina (FdUMP) é um dos metabólitos ativos do 5-FU apresenta maior afinidade pelo o sítio de ligação de ligação da TS, do que ao substrato natural dUMP, após a ligação com a enzima tem sua atividade inibida, a síntese do dTMP é bloqueada e consequentemente a disponibilização de timidina (LONGLEY et al., 2003). A depleção de dTMP e consequentemente do trifosfato de desoxitimidina, vai estimular pertubações em outros desoxinucleotideos (dATP, dGTP e dCTP) que bloqueiam a síntese e o reparo do DNA causando danos letal (LONGLEY; HARKIN; JOHNSTON, 2003) (figura7).
Figura 7: Mecanismo de ação do 5-FUA enzima timilidato fosforilase TYMP) que faz a geração do fluorouridina (FUDR), que logo é transformada em monosfofato de fluoro-desoxiuridina (FdUMP), pela timidilato quinase (TYMK). O FdUMP bloqueia a timidilato sintase (TYMS) provocando um desequilibrio do monofosfato de desoxiuridina (dUMP) e monosfosfato de desoxitimidina (dTMP). O dTMP se incorpora ao DNA promove lesão e causa a morte celular. O 5-FU em seguida é convertido em monofosfato de fluorouridina (FUMP) por meio da uridina monofosfato sintetase (UMPS). O 5- FU é transformado em monofosfato de fluorouridina (FUMP) por meio da uridina monofosfato sintetase (UMPS) com mais fosforilação pela uridina-quinase. A adição de nucleótideos fluorados (FUTP e FdUMP) no RNA e DNA, respectivamente, causando a morte celular.
2.2 Tratamento da Mucosite Oral
O tratamento da mucosite oral (MO) consiste inicialmente em cuidados paliativos e medidas de combate a infecções. Graças ao avanço nas pesquisas sobre a fisiopatologia da MO, vem tornando-se possível a identificação de diversos alvos para o tratamento desse importante efeito adverso, que é tão frequente em pacientes submetidos ao tratamento de câncer de cabeça e pescoço (LALLA et al., 2014). O manejo adequado da mucosite oral é imprescindível para proporcionar uma melhor qualidade de vida e diminuição no tempo de hospitalização adequado, além disso, a saúde oral basal é de extrema relevância, pois está relacionada com a diminuição do risco e gravidade dessa afecção (ALTERIO et al., 2007; DJURIC et al., 2006).
Alguns fatores de risco estão diretamente ligados ao desenvolvimento da MO, tais como a falta de higiene bucal adequada, lesões periodontais, comorbidades (por exemplo diabetes e infecções), patologia oral já existente, deficiência da vitamina B12/ácido fólico, baixo índice de massa corporal, e utilização do tabaco e álcool que devem ser diminuído ou eliminado como forma de preventiva. No entanto tratamento da mucosite oral ainda é limitado e pouco eficaz o que impede o estabelecimento de um protocolo padrão de prevenção e tratamento (PETERSON et al., 2015).
Há disponíveis diretrizes que passam por atualizações conforme novos estudos são publicados, logo não são diretrizes definitivas (CINASEURO et al., 2017). O manejo da dor é o aspecto mais importante para o controle dos sintomas durante o período de tratamento destes pacientes, a sintomatologia ocasiona um grande prejuízo na qualidade de vida dos pacientes, maior parte deles requer o uso de analgésicos sistêmicos e tópicos (CAMPOS et al., 2015; ROOPASHIRI et al., 2010).
De acordo com a Associação Multinacional de Cuidados de Suporte no Câncer/ Sociedade de Oncologia Oral (MASSCC/ ISSO), conforme as diretrizes da prática clínica para mucosite oral. O uso do Palifemin/ Kepivance/KGF1 é recomendado para uso preventivo da MO, o uso do fator de crescimento de queratinócito é utilizado em pacientes que recebem a radioterapia de alta dose ou irradiação corporal total, e também seguida de radioterapia e quimioterapia para cânceres hematológicos (RICHARD et al, 2020).
Há apenas dois agentes aprovados globalmente para o tratamento da MO, o Palifermin citado anteriormente, e a Benzidamina HCL, que é uma solução com ação anti-inflamatória que demonstrou um bom efeito no controle da mucosite oral em pacientes que receberam a radiação para tratamento do câncer de cabeça e pescoço (NICOLATOU et al., 2013).
2.3. Nanopartículas Metálicas
O uso de nanopartícula metálicas ocorre há séculos. Há 2000 anos a nanopartícula de prata (AgNPs) foi utilizada na fabricação de utensílios domésticos assim como de outros materiais, tais como, espelhos e vasos (FREESTONE et al., 2007). Os primeiros relatos do uso das nanopartícula metálicas foram para a produção de efeitos coloridos a vidros e cerâmicas, um exemplo é o famoso Cálice de Licurgo (Lycurgus cup) confeccionado na Roma do século IV A.C., a cor esverdeada é visualizada por reflexão e avermelhada quando vista por transmissão de luz (FELDHEIM et al., 2002; DANIEL et al., 2005).
A taça de Lycurgos de 1.600 anos de idade demonstra o belíssimo dicroísmo vermelho-verde utilizada para fins decorativos por suas múltiplas cores. Este aspecto deve-se a presença das nanopartícula Ag-Au de 1-100 nm de tamanho e suas propriedades de espalhamento e absorção de luz (BARBEER & FREESTONE, 1995).
A palestra realizada pelo pesquisador Richard P. Feynman em 29 de dezembro de 1959 é considerada como marco inicial da criação da ideia da nanotecnologia, mesmo que este termo não tenha sido utilizado na época. O pesquisador durante seu discurso, afirmou existir um fenômeno complexo que teria infinitas aplicações. Esse fenômeno refere-se à capacidade de manipular e controlar os materiais em uma escala extremamente pequena (FEYNMAN, 1960).
Em 1974 o pesquisador japonês Nório Taniguchi utilizou o termo nanotecnologia quando descrevia um processo de semicondutores. Foi quando esse termo foi utilizado pela primeira vez (TANIGUCHI, 1974). Convergência nas descobertas científicas iniciou-se a partir da década de 80 e possibilitou um considerável avanço na nanotecnologia, dentre os quais se podem citar, o desenvolvimento do microscópio de varredura por tunelamento, em 1981, que permitiu a visualização de superfícies em nível atômico (BINNIG; ROHRER, 1987a; 1987b). Outro marco importante foi a publicação do livro Engines of creation: The coming era of nanotechnology, do pesquisador Eric Drexler, em 1986. Do ponto de vista do professor Drexler, a nanotecnologia ficou conhecida como Nanotecnologia Molecular (DREXLER, 1986).
2.4. Nanotecnologia e a Nanopartícula de Ouro
A nanociência compreende o estudo e a manipulação dos materiais em escala atômica, molecular e macromolecular, permitindo a produção de estruturas com propriedades única na escala nanométrica de até 100 nm (MOGHIMI; HUNTER; MURRAY, 2005). A nanotecnologia é definida como o conhecimento, controle da matéria e processos em escala nanométrica, apresentando dimensões de 1-100 nm (FDA, 2012). O nanômetro corresponde a bilionésima parte do metro ou milionésima parte do milímetro (1x10-9) (MARTINELLO, AZZEVEDO, 2009).
A nanotecnologia vem expandindo em diversos setores, tais como, automotiva, têxtil, materiais esportivos, telecomunicações, alimentos, dispositivos médicos, eletrônicos, testes de diagnóstico, farmacêutica dentre outras (HODGE, 2006 ABDI, 2010). È importante ressaltar que dentre as áreas que mais se destaca no uso da nanotecnologia é a área da saúde, que se refere a terapêutica e diagnóstico (MURDAY et al., 2009), visto a extrema necessidade de esquemas terapêuticos e diagnósticos eficientes melhorando assim o risco/benefício do paciente (SHI, 2011).
Há uma grande preocupação no que se refere a possibilidade de danos biológicos. Não há estudos toxicológicos suficientes para criação de uma regulamentação segura e eficaz, que podem gerar impactos ambientais significativos, no entanto pesquisas já apresentam resultados da toxicidade desses novos produtos (SANTOS, 2008).
A síntese e estabilização de materiais na escala nanométrica marcam a abertura de uma nova área na pesquisa, com ação biológica diversificada e com novas propriedades físico-químicas é a inserção da tecnologia avançada em diferentes áreas de conhecimento.
(DURAN, 2006). As nanopartícula podem facilmente se agregar e aumentar seu crescimento, pois são termodinamicamente instáveis, ao ultrapassar o tamanho de 100 nm deixam de ser nanopartícula e são consideradas nanomateriais (ZARBIN, 2007).
Essas nanopartícula favorece o controle sobre sua morfologia, e as modificações no seu tamanho e forma podem proporcionar efeitos impressionantes nas propriedades físicas e reatividade de um determinado composto e por essa razão as propriedades óticas exibidas por essas partículas são de grande interesse (DANIEL et al., 2004). Uma importante característica está diretamente relacionada ao seu tamanho reduzido, esse fato faz com que as nanopartícula tenham um aumento na sua área superficial, aumentando dessa forma sua eficiência, por exemplo, na entrega de drogas (MOGHIMI; HUNTER; MURRAY, 2005).
As nanopartícula inorgânicas vêm despertando bastante interesse nas diferentes áreas de pesquisas nas últimas décadas devido ao seu tamanho e as propriedades biológicas (BHATTACHARYA; MUKHERJEE, 2008). A nanopartícula de ouro está entre as que mais se destacam, e há uma maior atenção devido às propriedades ópticas, eletrônicas, redox e catalítica (DANIEL; ASTRUC, 2004).
As nanopartícula de ouro são excelentes para as pesquisas na área da saúde por serem biocompatíveis, de fácil preparação e por possuírem uma maior tendência a formar fortes ligações com grupamentos tióis (HAINFELD et al, 2006; MUKHERJEE et al, 2005). Possuem a capacidade de alterar o estado redox da célula alterando suas funções normais assim como alterando vias de sinalização apoptóticas conforme o tamanho da nanopartícula a ser testada. Além disso, tem atraído bastante atenção por causa das suas propriedades dependentes de tamanho, suas dimensões finas e por apresentarem baixa toxicidade (GAO, 2011).
A forma geométrica da nanopartícula também é de extrema importância na determinação de suas propriedades assim como suas aplicações (BAR-ILAN et al.,2009). Podem ser sintetizadas em diferentes tamanhos e formatos, tais como nanoesferas, nonobastões, nanogaiolas, nanoestrelas e nanoconchas. Sua síntese geralmente é econômica, mesmo que os reagentes sejam custosos, são utilizadas concentrações muito baixas (DANIEL et al., 2004; WILSON, 2008). Essas propriedades exclusivas das nanopartícula levaram a uma grande diversidade de aplicações da AuNp em liberação controlada de fármaco, terapia fototérmica (OLIVER & GEBER, 2008; XU et al., 2014), bioimagem (RINCON, 2012) e detecção (QUADROS et al., 2015). Atualmente há uma diversidade de aplicações das nanopartícula metálicas, tais como, na liberação controlada de fármacos, detecção de imagem. Estudos demonstraram que as nanopartícula podem ser usadas como carreadores de
anti-inflamatório (CARVALHO et al., 2018). Assim como o imunossupressor conjugado com heparina revelou propriedades anti-inflamatórias sem exibir nenhum efeito sobre a hemostasia sistêmica (PEDERSEN et al., 2009).
De acordo com Chen et al.. 2010, foi relatado uma redução nos níveis de mRNA de TNF-α e IL-6 quando nanopartícula de ouro de 21 nm foram injetadas em camundongos, o resultado demonstrou perda de gordura e inibição de efeitos inflamatórios. Mais um estudo demonstrou que a administração da nanopartícula de dióxido de magnésio (MnO₂), causou acúmulo Mn no cérebro, medula espinhal e tecidos musculares de rato no qual levou a uma diminuição na sensação da dor e por fim as nanopartícula possuem atividades antitumorais, o que se torna bastante viável para formulações de novos medicamentos contra o (KALITA et al., 2015).
Outras aplicações conjugação de anticorpos (LOO et al., 2004), entrega de drogas (MOGHIMI; HUNTER; MURRAY, 2005), proteção contra raios UV (GANESAN; PRABU, 2015), purificação de água (BINDHU; UMADEVI, 2014), para fins de diagnóstico, como agente antimicrobiano (GANESAN; PRABU, 2015), dentre outros como mostrado na figura 9.
Figura 8: Aplicações da Nanopartícula de Ouro Fonte: Adapatado de Salman, 2018.
3. JUSTIFICATIVA
As úlceras orais são dolorosas, e comprometem o tratamento antitumoral estendendo o período de tempo nas internações hospitalares e consequentemente causa prejuízo comprometendo o bem-estar destes pacientes (SILVERMAN, 2007). A interrupção do bem estar destes pacientes é decorrente da dor debilitante, sangramento, disfagia, infecções, comprometimento a ingestão alimentar, alta taxa de hospitalização e consequentemente limitação no tratamento antitumoral (SANCTIS et., al 2016).
Poucos protocolos demonstram ser eficazes na prevenção da (MO), maior parte dos procedimentos usados para tratar a mucosite oral são apenas paliativos (RODRIGUEZ et al., 2012). Protocolos preventivos incluem dieta adequada, uso de analgésico para controlar as dores, medidas de prevenção assim como tratamento de infecções secundárias, no entanto um tratamento eficaz para estes pacientes acometidos da mucosite oral, decorrente do tratamento quimioterápico/radioterápico do câncer é limitado por não se conhecer na sua totalidade os mecanismos de sinalização ligados ao desenvolvimento da mucosite oral (MARIA et al., 2017).
As pesquisas experimentais sobre a fisiopatologia da mucosite oral vêm crescendo, o conhecimento sobre vias moleculares tem sido crucial na possibilidade de desenvolver novas estratégias de prevenção e tratamento. Atualmente há disponíveis diversas medidas de prevenção e fármacos já utilizados, porém ainda não há um protocolo estabelecido que fosse eficaz e seguro (PETERSON et al., 2015; CINAUSERO et al., 2017).
Diversos trabalhos na literatura demonstram que a nanopartícula de ouro possui atividade anti-inflamatória por diminuir importantes marcadores inflamatórios, tais como, a IL-1β, IL-10 e TNF-α (VICTOR et al, 2012); (SWAN, 1999; DANIEL; ASTRUC, 2004); (DOHNERT et al, 2012); kB (PEREIRA et al, 2012); (TSAI et al, 2007); (SWAN, 1999;) (DANIEL; ASTRUC, 2004). AHN, 2016 relatou que a NpAu era capaz de inibir a ativação do NFkB em macrófagos e consequentemente reduzindo a atividade anti-inflamatória.
Considerando-se as manifestações clinicas relatada por pacientes acometidos da mucosite oral versus os protocolos pouco eficazes e associado à falta de um estudo que esclareça seu efeito nessa patologia, a presente pesquisa tem como objetivo esclarecer os efeitos protetivos assim como, avaliar a via de sinalização antioxidante e o efeito anti- inflamatório da NpAu no modelo experimental da mucosite oral em hamsters.
4. OBJETIVOS
4.1 Objetivo Geral
Avaliar o efeito anti-inflamatório e antioxidante da nanopartícula de ouro na mucosite oral experimental em hamsters induzido por 5- flouorouracil.
4.2 Objetivos Específicos:
Avaliar o efeito da nanopartícula de ouro na mucosite oral, pela quantificação dos níveis das citocinas IL-1β e TNF-α e GSH.
Avaliar o efeito da nanopartícula de ouro na mucosite oral, através da análise da imunomarcação do NF-kB e COX-2.
Avaliar o efeito da nanopartícula de ouro na mucosite oral, pela análise da expressão gênica das enzimas antioxidantes NQO1, HMOX1 e KEAP 1.
5. MATERIAIS E MÉTODOS
5.1 Considerações Éticas
Os protocolos experimentais desenvolvidos nessa pesquisa foram aprovados pelo Comitê de Ética no uso de animais (CEUA) da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN) sob o número de protocolo 071/2014 (Anexo).
5.2 Síntese da Nanopartícula de Ouro (NpAu)
A produção da nanopartícula de ouro foi obtida por meio da parceria com o Departamento de Química da Universidade Federal do Rio Grande do Norte UFRN, Brasil. As nanopartícula foram produzidas conforme descrito por Gasparotto et al., 2012.
A obtenção das nanopartícula metálicas foi realizada pelo método químico. Inicialmente a solução de glicerol/ NaOH (Sigma-Aldrich) foi adicionada à solução AuCl3 / PVP (Sigma-Aldrich, 99%; Sigma-Aldrich, 10.000) com agitação magnética, para produzir as seguintes concentrações finais: 1,0 mmol / l de Au3+, 0,10 mol / l de NaOH, 0,10 mol / l de glicerol e 10g/l de PVP. O Au3+ foi reduzido pelo glicerol em meio alcalino e a polivinilpirrolidona foi usada para estabilizar a nanopartícula de ouro. O HCl foi adicionado para aumentar o ph da solução e assim gerar uma nanopartícula neutra (CARVALHO et al., 2018) representado na figura 10.
Figura 9: Síntese da nanopartícula de ouro Fonte: autoria própria.
