UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ECOLOGIA
Regulação da estequiometria (C:N:P) da biomassa de bactérias heterotróficas em ecossistemas de água doce de baixa latitude
Maria Lenice Ventura Diniz
Orientador: Dr. André Megali Amado Co-Orientador: Dr. Ng Haig They
Natal/RN 2017
Maria Lenice Ventura Diniz
Regulação da estequiometria (C:N:P) da biomassa de bactérias heterotróficas em ecossistemas de água doce de baixa latitude
Orientador: Dr. André Megali Amado Co-Orientador: Dr. Ng Haig They
Natal Dezembro 2017
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ecologia, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito para obtenção do título de Mestre em Ecologia.
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Central Zila Mamede
Diniz, Maria Lenice Ventura.
Regulação da estequiometria (C:N:P) da biomassa de bactérias heterotróficas em ecossistemas de água doce de baixa latitude / Maria Lenice Ventura Diniz. - 2019.
37f.: il.
Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro de
Biociências, Programa de Pós-graduação em Ecologia, Natal, 2019. Orientador: Dr. André Megali Amado.
Coorientador: Dr. Ng Haig They.
1. Bactérias - Dissertação. 2. Estequiometria - Dissertação. 3. Homeostase - Dissertação. I. Amado, André Megali. II. They, Ng Haig. III. Título.
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ECOLOGIA
Regulação da estequiometria (C:N:P) da biomassa de bactérias heterotróficas em ecossistemas de água doce de baixa latitude
BANCA EXAMINADORA
__________________________________________________ Dr. André Megali Amado (Orientador - UFRN)
__________________________________________________ Dr. Ng Haig They (Coorientador - UFRN)
__________________________________________________ Dr. José Luiz de Attayde (Avaliador interno - UFRN)
__________________________________________________ Dra. Simone Jaqueline Cardoso (Avaliador externo - UFJF)
À minha família, Bento e Luciano
SUMÁRIO
1.INTRODUÇÃO...1
2.MATERIAIS E MÉTODOS...4
2.1.ÁREAS DE ESTUDO...4
2.2.PROCEDIMENTOS DE COLETA E PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS...7 2.3.QUIMIOSTATOS...8 2.4.MÉTODOS ANALÍTICOS...10 2.5.ANÁLISES ESTATÍSTICAS...11 3.RESULTADOS...12 4.DISCUSSÃO...19 5.REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...22
LISTA DE FIGURAS
Fig.1- Lagoa do Bonfim (A) e Reservatório Gargalheiras (B). Fonte: Google Earth - 2016...5 Fig.2- Esquema mostrando metodologia do fracionamento das amostras
estudadas...8
Fig.3- Desenho esquemático do sistema de quimiostato
empregado...10 Fig.4- Variáveis biológicas, limnológicas e de nutrientes ao longo do tempo para o estudo sazonal
realizado na Lagoa do Bonfim e no reservatório
Gargalheiras...14 Fig.5- Razões estequiométricas das frações bacteriana, dissolvido e seston na Lagoa do Bonfim
(oligotrófico) e no reservatório Gargalheiras (hipereutrófico) ao longo de um ano. Os quadrados representam as médias e as barras verticais e horizontais, os desvios-padrão...15 Fig.6- Variação das razões C:P bacterianas para cada razão C:P do recurso (100:1, 316:1, 1000:1,
3162:1 e 10000:1) separadas por ambientes de origem. Os grupos de ambientes estão separados pela concentração de fósforo na água...18 Fig.7- Variação das razões C:P bacterianas para cada razão C:P do recurso (100:1, 316:1, 1000:1, 3162:1 e 10000:1) separadas por intervalos de fósforo total das amostras de campo...19
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Dados de campo das amostras coletadas para a incubação nos quimiostatos. Variáveis ambientais e razões C:N:P das frações bacteriana, dissolvido e seston dos ambientes localizados no estado do Rio Grande do Norte, distribuídos desde a região costeira até a região semiárida do estado...6 Tabela 2- Teste de homogeneidade de variâncias (teste de Levene) entre Bonfim e Gargalheiras
para as razões estequiométricas (C:P, C:N e N:P) de cada fração (bacteriana, dissolvido e seston)...16 Tabela 3- Teste de homogeneidade de variâncias (teste de Levene) entre as razões estequiométricas
(C:P, C:N e N:P) das bactérias e de seus recursos (dissolvido e seston) para Bonfim e Gargalheiras...16
RESUMO
As bactérias heterotróficas são importantes mineralizadoras de nutrientes (e.g. nitrogênio [N] e fósforo [P]) para o meio aquático, subsidiando a produção primária e incorporando carbono orgânico da matéria orgânica em sua biomassa através da produção secundária. Esses processos são afetados por fatores ambientais, como temperatura e disponibilidade de nutrientes; também são determinados pela identidade das espécies e pelo seu estado fisiológico. A disponibilidade de nutrientes pode afetar a composição química das bactérias, assim como essas podem afetar a composição química dos seus predadores e assim por diante; esse desbalanço estequiométrico entre o recurso e consumidor têm influência sobre os padrões de reciclagem de nutrientes nos ecossistemas, afetando seu funcionamento e ciclos biogeoquímicos. Uma forma de lidar com a variação de nutrientes é a capacidade de regulação que os indivíduos tem, e frente a perturbações na estequiometria do seu recurso, as bactérias podem se comportar de forma homeostática ou flexível. Para as bactérias essas características parecem ser ditadas pela composição da comunidade, influenciada pelo estado trófico dos ecossistemas. Desta forma, espera-se que o comportamento homeostático seja predominante em ambientes eutróficos, enquanto o comportamento flexível seja predominante em ambientes oligotróficos. Para definir o grau de homeostase das comunidades são necessários ensaios controlados que permitam a avaliação da composição de C, N e P bacterianos frente à exposição de uma comunidade a substratos com diferentes razões C:N:P. Este tipo de experimento é realizado em quimiostatos, que representam um método de cultivo de micro-organismos em condições estacionárias de crescimento controlado em um ambiente químico estável. O objetivo desse trabalho foi testar o efeito do grau de produtividade do sistema sobre a variabilidade da estequiometria das bactérias e de seus recursos em lagos tropicais de baixa latitude. Hipóteses: (i) a variabilidade das razões estequiométricas das bactérias e dos seus recursos são menores em um reservatório hipereutrófico do que em uma lagoa oligotrófica; e (ii) o grau de homeostase das comunidades bacterianas aumenta com o grau de produtividade do sistema. Investigamos primeiramente a variabilidade das razões estequiométricas em dois lagos, um hipereutrófico (Gargalheiras) e um oligotrófico (Bonfim) sob uma abordagem ambiental, onde foram realizadas medidas mensais da composição química das bactérias e de seu recurso. Sob uma abordagem experimental, foi testado através da manipulação das razões C:P do meio de cultivo em quimiostatos, o grau de homeostase de comunidades bacterianas vindas de 11 lagos distribuídos ao longo de um gradiente de produtividade desde a costa até a região do semi-árido do Rio Grande do Norte. Os resultados mostram que Bonfim tem alta variação na estequiometria das bactérias e de seu recurso; em Gargalheiras, a razão C:N:P das bactérias varia pouco em relação a uma maior variação de seu recurso, isso mostra um indicativo de homeostase nessas comunidades. Para os quimiostatos, as comunidades se mostram homeostáticas até uma razão C:P (razão atômica) de aproximadamente 1000:1, com o aumento dessa razão, elas parecem acompanhar seu recurso, se mostrando parte homeostáticas, parte flexíveis, independente do estado trófico do ambiente de onde elas vieram.
Palavras chave: Ambientes de água doce, bactérias, estequiometria, nutrientes, homeostase, flexibilidade, estado trófico.
ABSTRACT
The heterotrophic bacteria are important nutrient mineralizers (e.g. nitrogen [N] and phosphorus [P]) to the aquatic environment, subsidizing primary production and incorporating organic carbon from the organic matter into its biomass through secondary production. These processes are affected by environmental factors such as temperature and nutrient availability; are also determined by species identity and physiological status. The availability of nutrients can affect the chemical composition of bacteria, as these can affect the chemical composition of their predators and so on; This stoichiometric imbalance between the resource and the consumer influences the patterns of nutrient recycling in ecosystems, affecting their functioning and biogeochemical cycles. One way to deal with nutrient variation is the regulating ability that individuals have, and in the face of disturbances in the stoichiometry of their resource, bacteria can behave in a homeostatic or flexible way. For bacteria these characteristics seem to be dictated by the composition of the community, influenced by the trophic state of the ecosystems. Thus, homeostatic behavior is expected to be predominant in eutrophic environments, while flexible behavior is predominant in oligotrophic environments. In order to determine the degree of community homeostasis, controlled trials are necessary to evaluate the composition of bacterial C, N and P against the exposure of a community to substrates with different C: N: P ratios. This type of experiment is performed on chemostats, which represent a method of culturing microorganisms under controlled growth stationary conditions in a stable chemical environment. The objective of this work was to test the effect of the degree of productivity of the system on the variability of the stoichiometry of bacteria and their resources in tropical lakes of low latitude. Hypotheses: (i) The variability of the stoichiometric ratios of the bacteria and their resources are smaller in a hypereutrophic reservoir than in an oligotrophic pond; and (ii) The degree of homeostasis of bacterial communities increases with the degree of productivity of the system. We first investigated the variability of stoichiometric ratios in two lakes, one hypereutrophic (Gargalheiras) and one oligotrophic (Bonfim) under an environmental approach, where monthly measurements were made of the chemical composition of the bacteria and their resource. Under an experimental approach, it was tested by manipulating the C:P ratios of the culture medium in chemostats, the degree of homeostasis of bacterial communities from 11 lakes distributed along a productivity gradient from the coast to the semi-arid region of Rio Grande do Norte. The results show that Bonfim has a high variation in the stoichiometry of the bacteria and its resource; in Gargalheiras, the C:N:P ratio of the bacteria varies little in relation to a greater variation of their resource, this shows an indicative of homeostasis in these communities. For the chemostats, the communities are homeostatic up to a C:P ratio (atomic ratio) of approximately 1000:1, with the increase of this ratio, they seem to accompany their resource, showing part homeostatic, part flexible, independent of the trophic state of the environment from where they came.
Key words: freshwater environments, bacteria, stoichiometry, nutrients, homeostasis, flexibility, trophic state.
Introdução:
Os ecossistemas aquáticos continentais são importantes componentes da biosfera, pois participam intensamente no processamento e fluxo de matéria entre ambientes terrestres, aquáticos e atmosfera (Tranvik et al. 2009). Esses ecossistemas abrangem complexas, dinâmicas e contínuas interações entre componentes bióticos (seres vivos) e componentes abióticos, contribuindo para os ciclos biogeoquímicos globais (MA 2003). Um componente importante do funcionamento dos ecossistemas aquáticos é o fluxo de nutrientes (e.g. mudanças dos estoques) e energia ao longo do tempo, cuja intensidade depende diretamente da capacidade de produção e decomposição de matéria orgânica (Dodds & Cole 2007). Portanto, devido à forte interação entre compartimento abiótico (e.g. condições ambientais, disponibilidade de nutrientes) e compartimento biológico (e.g. composição das comunidades, traços funcionais) nos ecossistemas aquáticos, um compartimento pode exercer grande influência sobre o outro e vice-versa, por exemplo um influenciando a composição química do outro (Redfield 1958).
O bacterioplâncton é o grupo de organismos mais abundantes da biosfera e é composto por organismos autotróficos e heterotróficos em sua maioria entre 0,2 e 2,0 μm de tamanho (Weisse 2004). Esses organismos são fundamentais para o funcionamento dos ecossistemas aquáticos atuando na reciclagem de matéria e fluxo de energia pelas cadeias tróficas aquáticas (Lindström 2001; Maccord et al. 2013). As bactérias heterotróficas são importantes mineralizadoras de nutrientes (e.g. nitrogênio [N] e fósforo [P]) para o meio aquático, subsidiando a produção primária ao mesmo tempo incorporando carbono orgânico da matéria orgânica (detrital) em sua biomassa através da produção secundária. Assim, o carbono orgânico dissolvido, antes inacessível aos demais organismos heterotróficos, torna-se particulado e pode ser reintroduzido às teias alimentares através da alça microbiana ("microbial loop", em inglês; Pomeroy 1974, Azam et al. 1983). Por esse mecanismo, as bactérias são utilizadas como recurso alimentar sequencialmente por ciliados e flagelados e funcionam como uma fonte alternativa de energia e matéria para o plâncton através da teia trófica microbiana (Weisse 2004).
O metabolismo bacteriano (e.g. reciclagem de nutrientes, produção de biomassa e respiração) é diretamente afetado por fatores ambientais, como temperatura, disponibilidade de nutrientes e qualidade da matéria orgânica (Hall et al. 2009, Berggren et al. 2012, Fonte et al. 2013). Por outro lado, também são determinados pela identidade das espécies e suas características, tal qual pelo seu estado fisiológico; i.e. algumas espécies apresentam maiores taxas de crescimento que outras, sob mesmas condições ambientais (Cotner & Biddanda 2002, Cotner et al. 2010,
Godwin & Cotner 2015). Organismos sob elevada taxa de crescimento devem apresentar altas demandas por N e P (fundamental para a produção das proteínas e ATP), ou seja, baixas razões C:P e N:P (enriquecimento proporcional de P); esse mecanismo foi descrito dentro da teoria da estequiometria ecológica como hipótese da taxa de crescimento (“growth rate hypothesis” – GRH) (Elser et al. 2003) e já foi corroborada para diversos organismos, inclusive para as bactérias (Makino et al. 2003). Esse enriquecimento é decorrente do aumento na alocação celular em RNA ribossomal, estrutura rica em P, como investimento para potencializar a síntese de proteínas e assim sustentar altas taxas de crescimento. Por exemplo, foi demonstrado em cultivos de Escherichia coli que sob condições de altas taxas de crescimento, mais de 70% de todo fósforo celular foi alocado no RNA ribossomal (Makino et al. 2003). Portanto, a disponibilidade de nutrientes no meio pode afetar o metabolismo e a composição química das bactérias, assim como essas podem afetar seus predadores e assim por diante.
Na natureza as condições ambientais são espacial e temporalmente muito variáveis; como, por exemplo entradas pontuais de nutrientes pelas chuvas, de forma que, frequentemente, o requerimento por nutrientes de um grupo de organismos é diferente da disponibilidade desses nutrientes pelos seus recursos. Esse desbalanço estequiométrico pode influenciar nos padrões de reciclagem de nutrientes e afetar o funcionamento e ciclos biogeoquímicos nos ecossistemas (Sterner et al. 1998). Diante do desbalanço estequiométrico entre as bactérias e seus recursos, pode-se destacar três cenários fisiológicos possíveis: (A) que os organismos pode-sejam flexíveis e possam variar sua composição química em função da composição química do seu recurso (e.g. a alteração da estequiometria do recurso resulta em alteração direta e proporcional na estequiometria do organismo); (B) que os organismos sejam homeostáticos e mantenham sua composição química constante, indiferentes às variações na composição química do seus recursos ou, (C) apresentar comportamento misto, expressando certo grau de homeostase (Sterner & Elser 2002). Recentemente foi demonstrado que as bactérias são os organismos planctônicos com maior variação na sua composição química (i.e. conteúdo de carbono [C], nitrogênio e fósforo e suas razões estequiométricas [C:N, C:P e N:P]); ainda, que diferentes espécies adotam diferentes estratégias fisiológicas, conforme descrito nos cenários A, B e C acima. Portanto, a compreensão dos fatores que determinam o comportamento estequiométrico das bactérias é fundamental para a entender o papel desses organismos para o funcionamento dos ecossistemas. Por exemplo, a homeostase e a flexibilidade estequiométrica das bactérias em relação aos seus recursos parecem estar ligadas a identidade dos organismos que compõem a comunidade, assim como ser fortemente influenciada pelo estado trófico (grau de produtividade) dos ecossistemas (Godwin & Cotner 2015b).
O comportamento estequiométrico de comunidades bacterianas é parcialmente explicado por mudanças na disponibilidade de recursos. Nos ambientes eutróficos, onde o aporte de nutrientes é maior e as taxas de crescimento são elevadas, os organismos investem seus nutrientes, sobretudo P, nas estruturas celulares ligadas ao crescimento (segundo a GRH). Por isso espera-se que esse meio deva selecionar organismos com essas características de alto investimento de P em ribossomos e o comportamento homeostático seja dominante nesses ambientes com alta produtividade e disponibilidade de P (Godwin & Cotner 2014), além disso, a matéria orgânica disponível nesse meio é praticamente de origem autóctone, com produção primária fitoplanctônica. Em ambientes oligotróficos, i.e. baixa disponibilidade de nutrientes e baixas taxas de crescimento, espera-se que variações ambientais na disponibilidade de nutrientes permita melhor ajuste das comunidades bacterianas à essa variação e o comportamento estequiométrico flexível seja predominante (Godwin & Cotner 2015).
Para definir o grau de homeostase das comunidades são necessários ensaios controlados que permitam condições semelhantes entre comunidades, com a manipulação exclusiva das razões estequiométricas dos recursos (e.g. C:P, C:N, ou N:P). Este tipo de experimento é realizado em sistema de cultivo de micro-organismos em condições de crescimento controlado (e.g. taxa de crescimento constante) em um ambiente químico estável, denominados de quimiostatos. Esta forma de cultivo tem sido cada vez mais usada em novas áreas de pesquisa, e sua aplicação em ecologia tem se mostrado útil no estudo da estequiometria de bactérias (Godwin & Cotner 2015; Makino et al. 2003, Makino & Cotner 2004). Sendo assim, o estudo do comportamento de comunidades bacterianas em quimiostatos é uma poderosa ferramenta para a avaliação do grau de homeostase de comunidades e isolados bacterianos frente a variações nas razões estequiométricas do substrato e das taxas de crescimento bacterianas. A estequiometria de espécies isoladas tem sido examinada para um diversificado conjunto de espécies de organismos (Sterner & Elser 2002, Elser et al. 2003, Persson et al. 2010, Godwin & Cotner 2015b), mas relativamente poucos estudos têm examinado a homesotase de comunidades (Makino & Cotner 2004, Fanin et al. 2013).
A hipótese do presente estudo é que a variabilidade das razões estequiométricas das bactérias e dos seus recursos são menores em ambientes eutróficos do que em ambientes oligotróficos.
Nesse trabalho investigamos a variabilidade das razões estequiométricas em dois lagos (um reservatório tropical eutrófico e uma lagoa costeira tropical oligotrófica) sob uma perspectiva/abordagem ambiental, onde foram realizadas medidas mensais (monitoramento) da composição química das bactérias e de seu recurso. Ainda, foram realizados experimentos de
quimiostatos, testando através da manipulação das razões C:P do meio de cultivo, o grau de homeostase de comunidades bacterianas vindas de 11 lagos distribuídos ao longo de um gradiente de produtividade desde a costa até a região do semi-árido do Rio Grande do Norte.
Objetivo Geral
Avaliar o efeito do grau de produtividade do sistema sobre a variabilidade da estequiometria das bactérias e de seus recursos e a regulação estequiométrica de comunidades bacterianas em lagos tropicais de baixa latitude
Objetivos específicos
Avaliar a variabilidade temporal das razões estequiométricas bacterianas e de seus recursos em um lago oligotrófico e outro eutrófico.
Avaliar o grau de homeostase das razões C:P em comunidades bacterianas de lagos que compõem um gradiente trófico.
Materiais e Métodos
Área de estudoEste estudo foi feito em duas abordagens, sendo a primeira uma abordagem sazonal da determinação da composição química das bactérias em 2 ambientes com estados tróficos contrastantes (monitoramento) e, a segunda abordagem submetendo as comunidades bacterianas de ecossistemas que formam um gradiente trófico, em experimentos de quimiostatos manipulando a estequiometria (i.e. razão C:P) dos seus recursos.
Abordagem sazonal:
Dois ecossistemas foram selecionados contemplando as extremidades de um gradiente trófico (oligotrófico e hipereutrófico) no Estado do Rio Grande do Norte, respectivamente, Lagoa do Bonfim e Reservatório Gargalheiras (Figura 1). A Lagoa do Bonfim é o maior reservatório da região litorânea oriental do estado do Rio Grande do Norte (Pereira 2004), cuja região apresenta clima caracterizado pela existência de condições quentes e úmidas, estação seca no verão (setembro a janeiro) e chuvas no outono-inverno (fevereiro a agosto), pluviosidade anual média de 1.270 mm (Sudene 1990). Sua hidrografia é formada por rios perenes de pequeno porte, apresenta profundidade máxima de 33 metros e temperatura média da água de 28ºC (Pereira et al. 2006).
O reservatório artificial Marechal Dutra, mais conhecido como Gargalheiras, encontra-se na bacia hidrográfica do Rio Seridó, sub-bacia do Rio Piranhas-Açu; região semiárida tropical do nordeste brasileiro com baixas taxas de precipitação anual, que variam entre 400 e 800 milímetros. A estação chuvosa ocorre normalmente entre janeiro e julho, com variação espacial e temporal de grande amplitude (Barbosa et al. 2012) e um prolongado período seco anual caracterizado pela escassez e alta variabilidade espacial e temporal das chuvas (Vieira 2002). A profundidade máxima do reservatório é de 26,5 metros (SEMARH 2014), mas durante o período amostrado a região esteve sob forte influência do El Niño, que provoca intensos períodos de seca na região nordeste (Costa 2012, They et al. 2017), e a profundidade máxima do reservatório nesse período foi de 11 metros.
Figura 1: Lagoa do Bonfim (A) e Reservatório Gargalheiras (B). Fonte: Google Earth - 2016.
Abordagem experimental:
Para a execução dos experimentos em quimiostatos, foram realizadas coletas em 11 ambientes límnicos, sendo 6 lagoas naturais e 5 reservatórios artificiais localizados no estado do Rio Grande do Norte, que vai desde a região costeira até a região semiárida do estado, contemplando um gradiente trófico. Foram selecionadas as lagoas de Bonfim, Carcará, Alcaçuz, Arituba, Extremoz, Pitangui e os reservatórios de Jambeiro, EAJ – Escola Agrícola de Jundiaí, Cruzeta, Dourado e Gargalheiras (Tabela 1).
Tabela 1: Dados de campo das amostras coletadas para a incubação nos quimiostatos. Variáveis ambientais e razões C:N:P das frações bacteriana, dissolvido e seston dos ambientes localizados no estado do Rio Grande do Norte, distribuídos desde a região costeira até a região semiárida do estado.
Reservatório
TºC pH Chla (μg/L)
PT
(µg/L) Estado trófico
Bactérias (µM) Dissolvido (µM) Seston (µM)
C:P C:N N:P C:P C:N N:P C:P C:N N:P Dourado 27,9 7,4 34,99 318,67 Eutrófico 34,59 7,46 4,63 183,84 21,14 8,69 33,03 13,12 2,52 Gargalheiras 28,6 7,03 42,42 166,70 Eutrófico 52,33 5,55 9,42 1314,99 7,29 180,27 52,18 9,61 5,43 Cruzeta 31,1 8,25 32,87 289,13 Eutrófico 100,11 9,41 10,90 383,94 27,34 14,43 133,88 14,41 9,31 Jambeiro 31,9 8,26 66,44 36,10 Mesotrófico - - 25,34 4003,32 22,86 175,14 26,60 0,60 44,61 EAJ 31,1 6,63 1,13 5,79 Mesotrófico 273,03 8,36 32,66 4735,32 32,43 146,00 131,46 2,78 47,29 Pitangui 27 6,38 21,45 9,09 Mesotrófico 1243,7 9 25,30 49,16 33934,72 25,47 1332,5 174,26 5,57 31,27 Extremoz 27 7,59 2,06 0,93 Mesotrófico 326,46 11,10 29,42 - 20,17 - 396,36 10,68 37,12 Arituba 30,1 4,94 14,08 5,94 Mesotrófico 209,33 9,26 22,61 - 36,41 - 663,29 21,99 30,16 Alcaçuz 28 6,09 3,44 3,84 Oligotrófico 305,14 10,26 29,75 - 29,69 - 101,82 3,75 27,15 Carcará 34,5 5,83 4,78 1,28 Oligotrófico 237,65 5,86 40,53 - 30,50 - 201,14 9,66 20,81 Bonfim 27,3 5,59 2,30 - Oligotrófico 1502,7 9 34,49 43,57 1887,32 25,01 75,48 1412,02 15,42 91,58
Procedimentos de coleta e processamento das amostras
As coletas para o monitoramento foram realizadas mensalmente no período de outubro/2014 a outubro/2015. A amostragem de água foi realizada na superfície e no ponto central de cada lagoa/reservatório utilizando duas garrafas de polietileno com capacidade de 5L (previamente lavadas com ácido clorídrico - HCl 10% e água destilada). Em cada ambiente (Bonfim e Gargalheiras) foram analisados Clorofila, Respiração Bacteriana (RB), Produção Bacteriana (PB), Eficiência de Crescimento Bacteriano (ECB), Alcalinidade, pH, temperatura, profundidade e transparência da água.
Em campo foram medidos os parâmetros ambientais: temperatura da água (termômetro digital), profundidade no ponto de coleta (profundímetro digital ou manualmente - cabo graduado e lastro) e a transparência da água (Disco de Secchi). Para determinar alcalinidade e pH, foram coletadas amostras de água em dois frascos de polietileno de 200 ml sem atmosfera interna (head space). Todas as amostras foram acondicionadas em caixas térmicas até a chegada em laboratório (1-2 horas para as lagoas e 4-6 horas para os reservatórios do semi-árido). Todas as amostras foram processadas no mesmo dia da coleta.
Na chegada ao laboratório a alcalinidade total foi imediatamente determinada pelo método da titulação de Gran com ácido sulfúrico (0,0125 M) e calculada usando o programa ALCAGRAN (Carmouze 1995; Stumm & Morgan 1996; Weiss 1974), enquanto que o pH foi determinado potenciometricamente através de pHmetro (Hanna HI-221). As amostras de água foram filtradas sequencialmente (fracionadas) em filtros de fibra de vidro (Whatman) com porosidade de 1,6 μm (GF/A) e 0,7 μm (GF/F), respectivamente (Figura 2). O material retido no filtro de porosidade 1,6 μm foi denominado como seston; o material retido no filtro 0,7 μm (1,6 μm > bactérias > 0,7 μm) foi denominado como fração bacteriana; a soma (dos valores) do material retido no filtro 1,6 μm mais o material filtrado nesse mesmo filtro foi denominado de fração bruta; o material menor que 0,7 μm (não retido no filtro 0,7 μm) foi denominado de fração dissolvida. Todos os filtros utilizados foram previamente incinerados a 450 ºC durante 3 h para a eliminação de contaminação de matéria orgânica e nutrientes e pesados antes de sua utilização. As amostras de água filtrada foram armazenadas em congelador (-20 ºC) para análise de C, N e P total e ortofosfato (tempo médio de 5 meses). Os filtros foram armazenados em ultrafreezer a -80 ºC para posterior análise de C, N e P total (tempo médio de 5 meses).
Para análise da clorofila, um volume variável da amostra bruta foi filtrado até colmatação em filtro de fibra de vidro com retenção de 1,2 μm (Whatman GF/C) e os filtros foram armazenados
em envelopes de alumínio a -80ºC até a extração dos pigmentos. Produção e Respiração bacteriana foram determinadas a partir de amostras brutas filtradas (filtro 1,6 μm).
Figura 2: Esquema mostrando metodologia do fracionamento das amostras estudadas.
As porosidades de retenção adotadas no presente estudo foram escolhidas seguindo o critério de Cotner et al. (2010), com base na premissa de mais de 95% das bactérias não seriam retidas na porosidade de 1,6 μm, como proposto por Biddanda et al. (2001). They et al. (2017) também testou a taxa de retenção de bactérias de ambientes aquáticos no Estado do RN nos filtros 0,7 μm e 1,6 μm, nos quais encontraram alta variabilidade. Contudo, dada a necessidade de combustão dos filtros descrita acima, faz-se necessário o uso de filtros de fibra de vidro, os quais só dispõe das porosidades adotadas, como sendo as que mais se aproximam da faixa de tamanho para retenção das bactérias. Todos os filtros utilizados foram previamente muflados a 450 ºC por 3h e pesados. Após a filtração, todos os filtros foram congelados ( -80 ºC) até análise.
Quimiostatos
As coletas para os experimentos em quimiostatos foram realizadas em média a cada 20/30 dias sempre abrangendo 2 ambientes de cada vez. O quimiostato é um biorreator com volume de 100 mL onde fica a comunidade bacteriana a qual um meio de cultura líquido é continuamente
adicionado, enquanto líquido de cultura é continuamente removido para manter o volume de cultura constante. Pela mudança da taxa com a qual o meio é adicionado ao biorreator a taxa de crescimento dos microorganismos pode ser facilmente controlada. Para a preparação dos inóculos (comunidade bacteriana), as amostras foram coletadas em frascos de borosilicato de 500 ml (previamente autoclavadas a 121 ºC por 30’). Em laboratório, a água foi filtrada com filtro de retenção 1,6 μm (GF-A, Whatman) em aparato de filtração estéril, a fim de remover o seston (flagelados, ciliados, fitoplâncton e zooplâncton). O filtrado foi separado em 5 alíquotas de 50 mL (tubos tipo Falcon estéreis) e inoculadas nos quimiostatos (Figura 3) quando estes estavam preenchidos com o meio de cultura definido (Basal Microbiological Medium [BMM] White et al. 1979) em 1/3 de sua capacidade total (100 mL).
O inóculo de cada ecossistema foi submetido a cinco razões C:P distintas que foram selecionadas para cada quimiostato: 100:1, 316:1, 1000:1, 3162:1 e 10000:1. A taxa de diluição dos quimiostatos foi ajustada para 0,3 dia-1 através de bomba peristáltica multicanal, sendo o experimento finalizado após 9 dias, ou seja, 3 renovações completas. Os quimiostatos foram mantidos aeróbicos e homogeneizados pelo suprimento contínuo de ar esterilizado por filtração (0,2 μm) por ação de um compressor de ar. Os quimiostatos, sistemas de tubos e as garrafas de borosilicato foram previamente lavados com HCl (ácido clorídrico) 10%, enxaguados com água Milli-Q e esterilizados em autoclave (121 ºC, 30’) antes da utilização. Ao final de cada experimento, as amostras de cada quimiostato foram filtradas em 3 filtros de fibra de vidro de porosidade de 0,7 μm (GF-F Whatman) previamente calcinados (450ºC, >3h) para a coleta das bactérias e posterior analise química. Os filtros foram então analisados para o conteúdo de N, P e C (particulados) e o filtrado para P total dissolvido e fosfato (métodos analíticos descritos abaixo). Durante todo o experimento foi monitorado se houve contaminação (por outras bactérias do ambiente externo) dos meios de cultura pela formação de turbidez nos meios de cultivo que alimentam os quimiostatos, sendo descartados aqueles que apresentassem turbidez aparente.
Figura 3: Desenho esquemático do sistema de quimiostato empregado.
Métodos analíticos Clorofila:
A extração dos pigmentos foi realizada em etanol 90% por menos de 24 horas a -20 ºC no escuro (Nusch & Palme 1975; Apha 1999). O líquido foi então centrifugado e lido em espectrofotômetro (Quimis 180 9001, modelo: Q798DRM) no comprimento de onda 665 nm com correção da turbidez a 750nm. Os cálculos foram feitos de acordo com Salonen & Sarvala (1995) e Schilling et al. (2006).
Respiração Bacteriana, Produção Bacteriana e Eficiência de Crescimento Bacteriano:
Para determinação da respiração bacteriana, amostras brutas foram filtradas (filtro 1,6 μm) e incubadas (com 6 réplicas) no escuro e em temperatura ambiente (25°C ±1) em frascos do tipo Exetainer® (com capacidade de 6 ml e sem atmosfera interna) por períodos que variaram entre 24 e 160 horas (até a redução de cerca de 10% da concentração inicial de oxigênio dissolvido). Para a estimativa das taxas de respiração bacteriana (RB) as concentrações de oxigênio dissolvido nos experimentos descritos anteriormente foram medidas através de microeletrodo acoplado a um picoamperímetro (Oxy Meter 1 – Unisense). As taxas de respiração foram calculadas pela diferença entre a medição inicial e final das concentrações de oxigênio e do tempo de incubação.
Para determinação da produção bacteriana foi feita incubação com 1,2 mL da amostra filtrada mais leucina marcada com trítio (3H; isótopo radioativo do hidrogênio) nas proteínas bacterianas (Smith & Azam, 1992) mantidas no escuro por 2 h 30 min (concentração final de 20
nM de leucina). Após o tempo de incubação da PB, foi adicionado 90 μL de TCA (ácido tricloroacético) 50% a fim de paralisar a reação. Para cada amostra foi feito uma réplica controle em que o TCA 50% foi adicionado ao início da incubação. A atividade radioativa foi mensurada (desintegrações por minuto; DPM) em cintilador Beckman LS- 5600. A produção bacteriana foi calculada assumindo-se um fator de diluição da leucina intracelular igual a 2, e uma razão celular carbono:proteína igual a 0.86 (Wetzel & Likens 1991). A eficiência de crescimento bacteriano (ECB) é calculada pela divisão do valor da PB pela soma dos valores de PB e RB.
Carbono, Nitrogênio e Fósforo:
A determinação das concentrações de C e N das amostras líquidas foi realizada em um aparelho analisador de carbono e nitrogênio (TOC-V CPN Shimadzu), enquanto que o P foi analisado pelo método colorimétrico após digestão com persulfato de potássio (Carmouze, 1994). O carbono foi analisado através do método de detecção por infravermelho após combustão a 680C e o nitrogênio por quimioluminescência, ambos utilizando como gás de arraste ar sintético 5.0 FID. As amostras líquidas foram mantidas refrigeradas e acidificadas com H2SO4 P.A. pH < 2.0
(≈100-500 μL) por até 2 meses antes de serem analisadas.
As concentrações de C nos filtros foram analisadas no módulo de amostras sólidas SSM-5000A do analisador de carbono utilizando oxigênio analítico 5.0 FID como gás de arraste. O N e o P dos filtros foram analisados após digestão com persulfato de potássio (Carmouze, 1994), sendo o N analisado no módulo de amostras líquidas do analisador de carbono e nitrogênio, conforme descrito acima (previamente centrifugadas por 20 minutos em centrífuga para falcon para remoção do material particulado – CELM Combate, 3500 RPM) e o P pelo método colorimétrico (Mackereth et al. 1978). A concentração de ortofosfato (PO4-3) foi medida diretamente nas frações dissolvidas,
sem digestão. As formas fosfatadas das amostras foram mensuradas por leitura em espectrofotômetro (Quimis 180 9001, modelo: Q798DRM) no comprimento de onda 885 nm, no qual a intensidade da cor azul formada pela redução do ácido molibdofosfórico, resultante da condensação ácida dos íons ortofosfatos e molibdato, é proporcional à quantidade de fosfato da amostra (Mackereth et al. 1978). As razões estequiométricas foram expressas através de razões atômicas (em µM) de C, N e P para cada fração.
Análises dos dados
Para avaliar a variação das razões de nutrientes nas bactérias (considerada a fração entre 1,6 e 0,7 µm) e recursos (seston [fração >1,6 µm] e dissolvido [fração < 0,7 µm]), das variáveis
biológicas e limnológicas ao longo do monitoramento na lagoa do Bonfim e no reservatório Gargalheiras, foram plotados os valores dessas variáveis coletadas em função do tempo durante o estudo. Para avaliar a variabilidade das razões estequiométricas das bactérias em relação a variabilidade das respectivas razões em seu recurso, como também a variação na composição química das bactérias e dos recursos entre ambientes (Bonfim e Gargalheiras), foi feito uma plotagem das médias e desvios padrão. Em seguida foi realizado um teste de homogeneidade de variâncias (teste de Levene) para comparar a variação das razões das bactérias e dos seus recursos (dissolvido e seston) entre a lagoa do Bonfim e o reservatório Gargalheiras. O mesmo teste foi feito para mostrar se a variação estequiométrica das bactérias em relação aos seus recursos foi maior no Bonfim do que no Gargalheiras.
A fim de caracterizar e classificar os ambientes amostrados para os experimentos em quimiostatos, foi feita uma tabela com os dados de clorofila, PT, NT, razões bacterianas e dos recursos em campo. A resposta das razões C:P e N:P bacteriana a variação das razões do recurso foram analisadas separando-se os ambientes por estado trófico. Para avaliar o efeito da manipulação das razões sobre a estequiometria bacteriana nos quimiostatos, foram plotados primeiramente os valores das razões C:P e N:P bacterianas de cada comunidade pelas razões C:P do recurso oferecido (razões C:P de 100:1 a 10000:1) e, plotadas as razões médias C:P e N:P e desvios separando por estado trófico. Foi realizada uma glm ANCOVA para testar o efeito das frações dos recursos sobre as razões bacterianas e se há diferença significativa entre entre estados tróficos. Como os resíduos do modelo não diferiram da normalidade, nós utilizamos a distribuição Gaussiana na GLM. Amostras que ficaram abaixo do limite de detecção foram excluídas das figuras e das análises estatísticas.
Ainda, realizamos o teste Levene para homegeneidade da variância e calculamos o coeficiente de variação (CV) para responder a hipótese de maior variabilidade estequiométrica das bactérias em lagos oligotróficos. Todas a análises foram feitas no programa R 3.1.3 ( R Core Team, 2015).
Resultados
Ao longo do estudo sazonal, na Lagoa do Bonfim as razões C:N, C:P e N:P foram predominantemente mais elevadas comparadas ao Gargalheiras. Na lagoa, a razão C:P das bactérias variou entre 158,81 e 2392,69 µM (Figura 4A), a razão C:P do dissolvido variou entre 104,03 e
8555,81 µM (Figura 4D) e a razão C:P do Seston variou entre 431,74 e 3377,38 µM (Figura 4G). No Gargalheiras, essas mesmas razões variaram entre 76,38 e 211,97 µM (Figura 4A), 1456,68 e 3295,49 µM (Figura 4D) e 126,45 e 479,09 µM (Figura 4G). As razões C:N das três frações em ambos ambientes variaram numa faixa estreita de valores, sendo Gargalheiras o ambiente que teve esses valores menos variáveis. As razões N:P (bacteriana e seston), embora no Bonfim tenham variado mais em relação a Gargalheiras, esses valores são muito próximos entre os dois ambientes (Figura 4C e 4I).
As concentrações de clorofila, fósforo total (PT) e a alcalinidade na lagoa do Bonfim apresentaram baixa variação ao longo do tempo, tendo a clorofila variado de 0 a 3,25 μg L-1, o PT de 0,176 a 0,652 µM e a alcalinidade de 65,7 a 137,4 µEq/L. No Gargalheiras, a clorofila e o PT se elevaram, principalmente nos últimos meses do estudo (Junho a Outubro/2015), com a clorofila variando de 13,42 a 1066,59 μg L-1
e o PT de 4,221 a 24,956 µM; a alcalinidade aumentou constantemente no período amostrado, desde 5777,4 até 11501,1 µEq/L.
A produção (BP) e respiração bacteriana (BR) no Bonfim apresentaram valores baixos em relação ao Gargalheiras, com a BP variando de 0,015 a 0,951 µg C L-1 h-1 e a BR variando de 0,27 a 3,915 µg C L-1 h-1. Já no Gargalheiras esses valores foram mais variáveis, com a BP variando entre 12,885 e 37,324 µg C L-1 h-1 e a BR entre 2,540 e 32,944 µg C L-1 h-1. A ECB no Bonfim foi menor que no Gargalheiras até o mês de Maio, a partir daí esses valores se aproximaram e tiveram o mesmo padrão de variação. De forma geral, não houve padrão sazonal para nenhum dos ambientes.
Figura 4: Variáveis biológicas, limnológicas e de nutrientes ao longo do tempo para o estudo sazonal realizado na Lagoa do Bonfim e no reservatório Gargalheiras. BP: produção bacteriana, BR: respiração bacteriana, ECB: eficiência de crescimento bacteriano, PT: fósforo total. Pontos faltantes, com na figura D e F para o Bonfim, representam amostras que ficaram abaixo do limite de detecção e foram excluídas das figuras.
As razões C:N:P das bactérias, da fração dissolvida e do seston foram predominantemente menores no reservatório Gargalheiras em relação a lagoa do Bonfim (Figura 5). A variação da razão C:P das bactérias é bem menor que seus recursos no Gargalheiras e a variação da razão C:P das bactérias no Bonfim é tão alto quando o seu recurso (Figura 5A). A razão C:P das bactérias no Gargalheiras é bem menor que a razão C:P das bactérias no Bonfim. Porém a variação das razões
estequiométricas dos recursos foi significativamente menor no Gargalheiras para o C:P dissolvido (p=0,05), para o C:P seston (p=0,05) e para o N:P dissolvido (p<0,001). A variação nas bactérias foi significativamente menor no Gargalheiras para as razões C:P (p=0,01) e C:N (p=0,04), sendo a razão N:P parcialmente significativa (p=0,07) (Tabela 2).
No Gargalheiras, a variação da razão C:P das bactérias foi significativamente menor que a variação da razão C:P do dissolvido (p=0,01) e, menor que a variação da razão C:P no seston (p<0,001). O mesmo não foi observado para as razões C:N e N:P. No Bonfim, embora a razão C:P bacteriana tenha tido ampla variação, esta foi significativamente menor que a variação da razão C:P do dissolvido (p=0,04). As relações observadas para o N destoam um pouco do esperado, principalmente as razões N:P bacteriana x N:P dissolvido e N:P seston no Gargalheiras, onde a variação nas bactérias foram maiores que seu recurso (Tabela 3).
Figura 5: Razões estequiométricas das frações bacteriana, dissolvido e seston na Lagoa do Bonfim (oligotrófico) e no reservatório Gargalheiras (hipereutrófico) ao longo de um ano. Os quadrados representam as médias e as barras verticais e horizontais, os desvios-padrão.
Tabela 2: Teste de homogeneidade de variâncias (teste de Levene) entre Bonfim e Gargalheiras para as razões estequiométricas (C:P, C:N e N:P) de cada fração (bacteriana, dissolvido e seston).
Média (Mín-Máx) ±Desvio padrão
Homogeneidade das Variâncias
Bonfim Gargalheiras Bonfim x Gargalheiras
C:P bacteriana 981.71 (158.81-2392.6) 730.09 145.81 (76.38-211.97) 38.28 F = 7.10 / p = 0.01* C:P dissolvido 4728.58 (104,03-8555.81) 4141.31 2578.57 (1456.68-3295.49) 1298.28 F = 4.18 / p = 0.05* C:P seston 1315.00 (431.74-3377.38) 777.68 279.91 (126.45-479.09) 107.67 F = 4.14 / p = 0.05* C:N bacteriana 20.13 (4,98-67.75) 17.02 7.32 (5.70-11.53) 1.52 F = 4.37 / p = 0.04* C:N dissolvido 16.17 (7.67-29.13) 6.42 13.77 (4.21-14.96) 7.76 F = 0.32 / p = 0.81 C:N seston 13.10 (8.13-16.10) 3.19 9.14 (7.90-12.52) 1.19 F = 3.15 / p = 0.08 N:P bacteriana 427.19 (7.98-313.63) 1284.35 330.95 (12.41-30.18) 1163.24 F = 3.51 / p = 0.07 N:P dissolvido 306.81 (7.13-760.71) 320.17 196.83 (129.45-369.14) 57.96 F = 26.36 / p<0.001* N:P seston 103.82 (53.06-341.42) 74.80 31.20 (13.30-50.74) 12.42 F = 2.26 / p = 0.14
Tabela 3: Teste de homogeneidade de variâncias (teste de Levene) entre as razões estequiométricas (C:P, C:N e N:P) das bactérias e de seus recursos (dissolvido e seston) para Bonfim e Gargalheiras.
Média(Mín-Máx) ±Desvio padrão
Homogeneidade das Variâncias C:P bacteriana C:P dissolvido C:P bacteriana x C:P dissolvido Bonfim 934.3 (158.8-2393.0) 746.4 529.7 (104.0-8556.0) 4360.7 F = 4.62; p = 0.049* Gargalheiras 145.8 (76.3-212.0) 38.28 2579.0 (1457.0-2895.0) 1298.2 F = 7.54; p = 0.010*
C:P bacteriana C:P seston C:P bacteriana x C:P seston Bonfim 934.3 (158.8-2393.0) 746.4 1307.0 (431.7-3377.0) 811.6 F = 0.018; p = 0.89 Gargalheiras 145.8 (76.3-212.0) 38.28 279.9 (126.5-479.1) 107.6 F = 11.81; p <0.001*
C:N bacteriana C:N dissolvido C:N bacteriana x C:N dissolvido Bonfim 19.92 (4.97-67.7) 17.7 13.99 (7.67-23.2) 4.22 F = 1.77; p = 0.18 Gargalheiras 7.32 (5.69-11.53) 1.52 13.78 (4.21-39.2) 7.76 F = 1.63; p = 0.21
C:N bacteriana C:N seston C:N bacteriana x C:N seston Bonfim 19.92 (4.97-67.7) 17.7 12.99 (8.13-21.13) 3.40 F = 2.55; p = 0.12 Gargalheiras 7.32 (5.69-11.53) 9.14 (7.9-12.53) F = 0.03; p = 0.85
1.52 1.19
N:P bacteriana N:P dissolvido N:P bacteriana x N:P dissolvido Bonfim 427.2 (7.98-4694.0) 1284.3 306 (7.13-760.7) 320.1 F = 1.77; p = 0.19 Gargalheiras 331.0 (12.41-4372.0) 1163.2 180.4 (129.5-369.1) 57.9 F = 1.63; p = 0.21
N:P bacteriana N:P seston N:P bacteriana x N:P seston Bonfim 427.2 (7.98-4694.0) 1284.3 103.8 (53.06-341.4) 74.8 F = 1.03; p = 0.32 Gargalheiras 331.0 (12.41-4372.0) 1163.2 31.2 (13.30-50.74) 12.4 F = 0.95; p = 0.33 Quimiostatos
Os ambientes escolhidos para realização dos experimentos contemplam desde reservatórios ricos em clorofila e nutrientes, até lagoas com baixa concentração de clorofila e PT, com a clorofila variando de 1,13 μg/L a 66,44 μg/L e o PT variando de 0,93 μg/L a 318,67 μg/L, classificados em Oligotróficos, Mesotróficos e Eutróficos (Ver Tabela 1). De acordo com os dados iniciais, as razões C:P e N:P reduzem com o estado trófico dos reservatórios e reduzem significativamente com o aumento da concentração de fósforo (Figura 6). Entretanto, as razões C:N e N:P, há uma alta variabilidade nas respostas das razões C:N e N:P em função da concentração de nitrogênio total, não sendo afetadas pelo nitrogênio nos lagos. As menores razões C:P e N:P bacterianas foram encontradas nos reservatórios Dourado, Cruzeta e Gargalheiras – ambientes mais produtivos, eutrofizados – e as menores razões C:N, no Dourado, Gargalheiras e na Lagoa Carcará. As maiores razões C:P e N:P foram encontradas nos lagos oligotróficos e eutróficos (Tabela 1). Como apenas as razões C:P e N:P foram significativas, nós utilizamos apenas estas razões para descrever os padrões de resposta bacteriana a variação da razão C:P do recurso, no experimento de quimiostatos.
Figura 6: Razões C:P, C:N e N:P bacteriana em função das concentrações de fósforo e nitrogênio total dos 11 lagos estudados. Dados das razões iniciais para o experimento.
Os resultados do experimento de quimiostatos nos mostraram que o aumento nas razões C:P e N:P bacteriana com o aumento da razão C:P do recurso é maior em lagos oligotróficos, reduzindo em lagos mesotróficos e eutróficos (Figura 7 e 8).
Figura 7: Razões C:P e N:P bacterianas para cada razão C:P do recurso (100:1, 316:1, 1000:1, 3162:1 e 10000:1) separadas por ambientes de origem e grupo de estado trófico.
Figura 8: Variação das razões C:P e N:P bacterianas para cada razão C:P do recurso (100:1, 316:1, 1000:1, 3162:1 e 10000:1) de acordo com o estado trófico do ambiente de origem.
Os resultados da ANCOVA mostraram que a razão C:P bacteriana aumentou significativamente o aumento das razões C:P e N:P do recurso e que comunidades bacterianas vindas de reservatórios e lagos com diferentes estados tróficos responderam de forma diferente a manipulação do recurso (Tabela 4), ou seja, lagos mais produtivos responderam menos fortemente ao aumento da razão C:P (Figura 8). Todavia, nós encontramos um efeito de interação entre a variação do recurso e o estado trófico para a razão N:P bacteriana o que significa que sob baixa razão C:P do recurso, as comunidades advindas dos diferentes estados tróficos respoderam de forma similar, mas sob altas razões C:P se diferenciaram quanto a razão N:P.
Tabela 4: Resultados da Análise de Covariância para as razões C:P e N:P bacterianas, de comunidades vindas de lagos com distintos estados tróficos, em função da variação da razão C:P do recurso. Variável GL Deviance p C:P bacteriana Razão C:P recurso 1 1.31 <0.001*** Estado trófico 2 0.07 0.041*** Razão*Estado trófico 2 0.05 0.082 N:P bacteriana Razão C:P recurso 1 2.00 <0.001*** Estado trófico 2 0.04 0.263 Razão*Estado trófico 2 0.16 <0.01*** *** Efeito significante.
Além disso, comunidades bacterianas vindas de lagos mesotróficos e eutróficos apresentaram menor variabilidade (medida como o coeficiente de variação) das razões C:P e N:P em resposta ao aumento da razão C:P do recurso (Figura 8, Tabela 5). Enquanto, as comunidades bacterianas vindas de lagos oligotróficos apresentaram maior variabilidade (Figura 8, Tabelas 5). O coeficiente de variação aumentou com o aumento da fração C:P do recurso, entretanto o CV foi menor nos ambientes eutróficos. O resultado do teste de Levene mostraram que a variancia entre estados tróficos foi heterogênea sob alta razão C:P e C:N do recurso (Frações 3162 e 10000), mas não sob baixas razões (Tabela 5).
Tabela 5: Coeficiente de variação e teste de homogeneidade de variâncias (teste de Levene) das razões estequiométricas (C:P) das comunidades de bactérias vindas de diferentes estados tróficos por fração do recurso manipulada.
CV por fração CV total Teste de Levene (dentro de cada estado trófico) 100 316 1000 3162 10000 C:P Oligotrófico - 0.27 0.19 0.58 1.06 2.06 F=5.54, p=0.022*** Mesotrófico 0.57 0.31 0.35 0.18 0.80 1.36 F= 3.93, p=0.022*** Eutrófico 0.38 0.27 0.24 0.13 0.44 0.82 F=11.16, p =0.001***
Teste de Levene (entre
estados tróficos) F = 77.1, p= 0.503 F = 0.08, p= 0.923 F= 0.511, p=0.616 F=6.66, p= 0.01*** F=10.49, p= 0.004*** C:N Oligotrófico - 0.32 0.18 0.30 1.38 2.53 F = 1.90, p=0.08 Mesotrófico 0.24 0.21 0.32 0.07 0.36 1.06 F =4.25, p=0.015*** Eutrófico 0.33 0.18 0.14 0.24 0.69 0.84 F=15.00, p <0.001***
Teste de Levene (entre
estadostróficos) F = 2.66, p= 0.138 F = 0.56, p= 0.593 F=0.508, p=0.06 F=2.72, p= 0.125 F=22.49, p= 0.001***
Discussão:
Microorganismos, como as bactérias, geralmente são conhecidos pelo baixo grau de homeostase estequiométrica, já que, pequenos volumes tendem a ter uma composição química estocástica, flutuando facilmente com as condições ambientais (Kooijman, 2010, Sterner et al. 1998, Godwin & Cotner 2015b). Entretanto, vários estudos tem demonstrado que bactérias podem apresentar padrões de comportamento estequiométrico desde flexíveis até fortemente homeostáticos, sugerindo-se, todavia, que as assembléias de bactérias tendem a apresentar padrões não-homeostáticos como resposta as variações no recurso (Godwin & Cotner 2015, Scott et al. 2012, Makino & Cotner 2004, Danger et al. 2008, Fanin et al. 2013). Godwin & Cotner (2015), por outro lado, encontraram que, apesar do padrão de não-homeostase, o suprimento de baixas razões C:P podem selecionar cepas mais homeostáticas dentro das assembléias. Em nosso estudo, nós encontramos uma menor variabilidade das razões C:P e N:P em ambientes eutróficos, ou seja, ricos em nutrientes (baixa razão C:P e C:N), como é o caso do reservatório de Gargalheiras, e, maior homeostase em comunidades vindas de ambientes eutróficos e também mesotróficos, quando variamos as razões C:P do recurso. Ainda, Sob baixa razão C:P, comunidades bacterianas vindas de ambientes eutróficos e mesotróficos variaram menos o padrão de respostas que comunidades vindas de ambientes oligotróficos, no experimento de quimiostatos. Comunidades de ambientes oligotróficos, apresentaram menor grau de homeostase a variação da razão C:P do recurso.
Apesar de ecossistemas aquáticos (in situ) apresentarem alta complexidade de interações entre componentes bióticos e abióticos, sendo inviável seu controle, podemos aqui inferir uma tendência de regulação estequiométrica das comunidades bacterianas de ambientes eutróficos, como o reservatório Gargalheiras. As relações que envolvem nitrogênio porém não seguem o esperado, já
que esse nutriente é muito dinâmico e pode ser fixado a partir da atmosfera quando na ocorrência de cianobactérias fixadoras de N, disponibilizando esse nutriente no meio, comum em condições de eutrofização (Sterner & Elser 2002).
Como encontrado aqui, corroborando Godwin & Cotner (2015b), o comportamento homeostático e flexível parece ser influenciado/selecionado pelo estado trófico dos ecossistemas. Em ambientes onde a concentração de nutrientes é baixa e experimenta alta variação no recurso, as comunidades bacterianas com baixa capacidade de regulação homeostática tendem a dominar, e a eficiência na assimilação de nutrientes tende a ser maior (Sterner & Elser 2002; Hessen et al. 2013). De acordo com Funk & Vitousek (2007) e González et al. (2010) em ambientes ricos em nutrientes (e.g. ambientes eutrofizados) as espécies que obtêm maior sucesso na colonização são aquelas que possuem rápido crescimento e baixas razões C:P e N:P. Em nosso experimento, bactérias vindas de ambientes com maior e com menor concentração de fósforo mantiveram suas razões baixas sob as menores razões do recurso (100:1, 316:1 e 1000:1), porém com o aumento da razão do recurso, as razões bacterianas aumentaram em diferentes proporções: bactérias vindas de ambientes com maior grau de produtividade apresentaram forte homeostase mesmo com a ampla variação da razão C:P do recurso ( até 10000:1). Em contrapartida, as bactérias vindas de ambientes com menor grau de produtividade apresentaram maior variação no grau de homeostase (desde forte homeostase até ampla flexibilidade) frente ao aumento da razão C:P do recurso. Sendo assim, em nosso estudo podemos afirmar que ambientes produtivos selecionaram bactérias mais homeostáticas e ambientes mais oligotróficos selecionaram bactérias com ampla variabilidade em sua regulação estequiométrica, desde homeostáticas até muito flexíveis. Fatores como a composição da comunidade e suas diferentes taxas de crescimento e diferentes estratégias metabólicas, tais como aumento na afinidade por P ribossomal ou alterações no metabolismo de carbono (Godwin & Cotner 2014) poderiam explicar essas diferentes regulações como forma de manter seus requerimentos ideais por nutrientes, visto que podem ser flexíveis até atingirem requerimentos mínimos necessários a sua manutenção (Godwin & Cotner 2015a).
Nós também encontramos uma menor variabilidade da razão C:P bacteriana em relação ao recurso no ambiente eutrófico (reservatório Gargalheiras). A alta luminosidade pode induzir uma grande produção primária afetando as razões C:nutrientes na biomassa bacteriana, pois com o aumento das taxas fotossintéticas mais nutrientes disponíveis na água e, de acordo com as demandas bacterianas, maior retenção desses nutrientes (metabolismo mais intenso). As altas taxas metabólicas observadas no Gargalheiras (BP, BR e ECB) podem indicar também maiores taxas de crescimento, que segundo a GHR favorecem o acúmulo de P intracelular, reduzindo as razões C:P
bacterianas (Hessen et al. 2013). A variação na composição química do substrato e o alto enriquecimento nesse ambiente favorece/facilita o ajuste das comunidades bacterianas que conseguem manter suas razões pouco variáveis frente a constante disponibilidade de nutrientes, uma vez que sua variação química não depende apenas da disponibilidade de nutrientes, mas também da composição taxonômica da comunidade (Martiny et al. 2013). Em ambientes oligotróficos, por outro lado, as razões de seus recursos são maiores e a qualidade nutricional é baixa; espera-se portanto, que variações ambientais na disponibilidade de nutrientes para mais ou para menos, facilite o ajuste das bactérias à essa variação, fazendo com que estas apresentem maior variação na sua biomassa. De fato, sob menores níveis de clorofila há maior variabilidade no conteúdo de C:P e N:P microbiano (Cotner et al. 2010).
A força na homeostase de nutrientes difere entre os principais grupos filogenéticos (Persson et al. 2010), mas dentro de cada grupo existem variações tanto da força da regulação estequiométrica quanto da composição química da biomassa, isso determina como bactérias respondem a disponibilidade de nutrientes, assimilando ou restaurando esses elementos (Hall et al. 2011). Um experimento com Escherichia coli, por exemplo, mostrou que essa bactéria exibe forte homeostase e altas taxas de crescimento sob diferentes disponibilidades de P (Makino et al. 2003). Em seguida foi visto que bactérias vindas de lagos temperados foram mais flexíveis em resposta a disponibilidade de nutrientes (Makino & Cotner 2004). Esses comportamentos estão relacionados às diferentes estratégias de regulação estequiométrica que esses organismos exibem.
Como bactérias possuem um importante papel na cliclagem de nutrientes, subsidiando a produção primária e sendo fonte de alimento (enriquecido ou pobre) para outros organismos, o grau de homoestase nas comunidades bacterianas pode afetar a mineralização e cliclagem de nutrientes no ambiente (Cotner & Biddanda 2002). Organismos que apresentam afinidade por P e são homeostáticos nessa relação, alocam esse P na biomassa, proporcionando um recurso rico para os níveis tróficos superiores, mas reduzem os estoques de P no meio. Entretanto, comunidades flexíveis, podem tanto reduzir os estoques de fósforo, quanto aumentá-los, quando não forem eficientes na sua alocação, e amortecer os efeitos do imbalanço de C:P no meio, esperando-se também remineralizar o excesso de carbono (Godwin & Cotner 2015b). Deste modo, bactérias homeostáticas poderiam aumentar a eficiência de transferência de nutrientes na cadeia alimentar, enquanto não-homeostáticas aumentariam a eficiência de transferência de carbono (Mitra et al. 2014).
Neste trabalho nós encontramos um padrão observado em cepas e comunidades bacterianas de ambientes temperados (Godwin & Cotner 2015b), mas que não havia evidencias para ambientes
tropicais, ou seja, a seleção para espécies ou grupos de espécies que são mais homeostáticos estequiometricamente sob condições de enriquecimento por nutrientes no ambiente. Encontramos que comunidades vindas de lagos e reservatórios eutróficos e mesotróficos variam menos em composição estequiométrica quando se varia a composição do recurso, que cepas vindas de ambientes oligotróficos, o que foi encontrado tanto no trabalho de monitoramento do reservatório de Gargalheiras e Lagoa do Bonfim, como no experimento de quimiostatos. Tanto a variabilidade no meio aquático natural quanto os diferentes comportamentos homeostáticos observados em quimiostatos, tem influência sobre os padrões de reciclagem de nutrientes, no funcionamento dos ciclos biogeoquímicos e no fluxo de energia dos ecossistemas aquáticos, pois bactérias mais ricas em nutrientes tendem a atuar como reservatórios enquanto que bactérias mais pobres atuam mais como mineralizadoras (Makino et al. 2003, Godwin & Cotner 2015a).
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