MARÍLIA FREIRE ISIDRO FERRAZ
EFEITOS DO AMBIENTE ENRIQUECIDO SOBRE O
COMPORTAMENTO ALIMENTAR DE RATOS ADULTOS
SUBMETIDOS À DESNUTRIÇÃO PROTEICA PERINATAL
Marília Freire Isidro Ferraz
Efeitos do ambiente enriquecido sobre o comportamento alimentar de
ratos adultos submetidos à desnutrição proteica perinatal
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Nutrição do Centro de
Ciências da Saúde da Universidade
Federal de Pernambuco, para obtenção do
título de Mestre em Nutrição
Orientadora: Rhowena Jane Barbosa de Matos
Co-orientadora: Sandra Lopes de Souza
Recife 2014
Dedico este trabalho às minhas grandes paixões: a ciência da Nutrição, a minha família e ao meu esposo, Breno.
Agradecimentos
Meu Deus, nosso Deus, obrigada por ouvir minhas preces e me dar sempre muita força, coragem e saúde para conseguir vencer essa jornada. Obrigada Senhor por iluminar minha
mente, meu corpo e coração e me permitir sabedoria para lidar com as tristezas e com as alegrias que aparecem no nosso caminho.
Muito obrigada família querida, meus pais, João e Dulcilma, e meu irmão Mateus que me apoiaram, me compreenderam, acreditaram no meu sucesso, e acima de tudo obrigada pelo
amor que sempre me conforta e recarrega minhas energias.
Meu amor, minha vida, ao meu esposo Breno, o meu agradecimento maior! Devo cada palavra escrita, cada frase lida, cada conhecimento guardado, a todo estímulo, a tantas palavras, gestos de carinho e a tanto amor que me concebeu nestes anos que estamos juntos. Um grande companheiro que participou de cada etapa dessa vitória! Meu amor para sempre, a
quem devo toda a felicidade e a paz que agora vivem junto comigo.
Obrigada minha querida orientadora, por me fazer sentir-me capaz. Obrigada pela confiança, pelo exemplo de professora, pesquisadora e mulher. Tanto conhecimento, amor e dedicação pelo que faz, me fazem sentir muito orgulho de ter convivido e ter podido aprender um pouco
com uma pessoa que é um universo de sabedoria.
Meu grupo de pesquisa, obrigada é pouco para agradecer o que é ter tido essa turma por perto! Vou tentar resumir em poucas palavras: companheirismo, amor, amizade, ciência, verdade,
diversão, tensão, medo, nervosismo, alegria, felicidade, conhecimento, desconhecimento, aprendizado, lágrimas, sono, cansaço, sorrisos, sorrisos não, gargalhadas, coragem, força e
muito, muito orgulho... Só Deus mesmo para colocar pessoas tão talentosas e incríveis no nosso caminho. Carinho imenso e eterno: Tércya, Carol, Matheus, Waleska, Priscilla, Eloyza
e Jefferson. Muito obrigada.
Em especial, minha miuga Caroline, parceira. Obrigada por me acompanhar nessa jornada, ser minha amiga, minha conselheira e incentivadora. A sua companhia foi fundamental em todos
os momentos e é a quem tenho um carinho e amor muito especial.
Obrigada a minha co-orientadora Sandra Lopes a todo apoio dado sempre que preciso. Obrigada aos meus amigos de mestrado, com quem convivemos e torcemos pela vitória um
do outro como se fosse a nossa.
Obrigada a todos que contribuíram para a teoria, a prática, para execução e finalização desse trabalho. Obrigada a Professora Matilde, Professora Lígia, as alunas do Anexo de Anatomia, ao pessoal da Pós-Nutri, a todos os professores com quem aprendi coisas que nem imaginava
que pudessem existir.
Aos animais, por quem tenho muito amor e respeito, obrigada por ensinarem um pouco mais da vida, por serem companheiros e amigos, responsáveis pela realização de tantas pesquisas e
descobertas a favor da vida.
Obrigada ao Veterinário, Seu França, um símbolo de amor aos animais, por ter nos concedido os animais utilizados no estudo.
Obrigada à UFPE e aos órgãos de fomento: CNPq, CAPES e FACEPE, que também proporcionaram a execução deste trabalho.
“Não vivemos para comer, mas comemos para viver.”
Resumo
Alguns fatores ambientais como a desnutrição, especialmente proteica, durante o período crítico de desenvolvimento do cérebro tem sido relacionada às modificações do controle do comportamento alimentar, como a hiperfagia, e ao surgimento de doenças metabólicas na vida adulta. O ambiente enriquecido (AE) é outro fator externo que pode influenciar o organismo através do aumento da estimulação sensorial e social, e tem sido utilizado como uma alternativa de intervenção capaz de interferir na plasticidade de regiões cerebrais e, portanto, pode favorecer o comportamento alimentar de animais submetidos à desnutrição. O objetivo do trabalho foi avaliar a influência da exposição ao AE sobre o comportamento alimentar de ratos adultos submetidos à desnutrição proteica perinatal. Foram utilizados 66 ratos machos Wistar divididos em grupos de acordo com a manipulação nutricional durante a gestação e lactação: controle (proteína a 17%, n= 7) e desnutridos (proteína a 8%, n= 8). Após o desmame, aos 25 dias, os filhotes receberam dieta padrão ad libitum e foram subdivididos aleatoriamente segundo à exposição ao AE de 30 até 90 dias de vida: controle sem ambiente enriquecido (n=16); controle com ambiente enriquecido (n=18); desnutrido sem ambiente enriquecido (n=16); e desnutrido com ambiente enriquecido (n=16). O AE foi formado em uma gaiola que abrigava de 8 a 10 animais contendo: escadas, tubos e casas de plástico, suportes para escalar na posição vertical, bolas e bonecos. Acompanhou-se a evolução ponderal das proles, foram submetidas às análises de sequência comportamental de saciedade, consumo alimentar e teste de ansiedade. Os animais foram eutanasiados aos 90 dias de vida por decapitação para coleta de tecido adiposo abdominal. Os dados demonstram que a desnutrição proteica provocou nos animais uma hiperfagia associada a um retardo no aparecimento da saciedade que foi prolongada ao longo da vida, apesar do peso continuar abaixo do controle e o retardo da saciedade ter desaparecido com o tempo. O AE reduziu o peso e a ansiedade nos animais normonutridos, mas não influenciou o peso nem o comportamento dos desnutridos.Conclui-se que o AE pode ser um fator externo que promove modificações no balanço energético e no comportamento de normonutridos, porém não foi capaz de atenuar as alterações resultantes da desnutrição. Isso demonstra que a desnutrição proteica perinatal causa efeitos sobre o comportamento alimentar que podem ser permanentes, promovendo resistência no balanço energético e contribuindo assim para o surgimento da obesidade e doenças associadas.
Palavras-chave: Comportamento Alimentar. Desnutrição Proteica. Ingestão de Alimentos. Desenvolvimento Fetal. Peso Corporal.
Abstract
Some environmental factors such as malnutrition, especially protein restriction, during the critical period of brain development has been related to changes in the control of feeding behavior, such as overeating, and the emergence of metabolic diseases in adulthood. The enriched environment (EE) is another external factor that can influence the body by increasing the sensory and social stimulation, and has been used as an alternative intervention to interfere with the plasticity of brain regions and thus may favor the feeding behavior animals subjected to malnutrition. The objective of this study was to evaluate the influence of exposure to EE on the feeding behavior of adult rats subjected to perinatal protein undernutrition. Control (17% protein, n=7) and malnourished (8% protein, n=8): 66 male Wistar rats divided into groups according to the nutritional manipulation during pregnancy and lactation were used. After weaning at 25 days, the rats received a standard diet ad libitum and were randomly divided second exposure to EE 30 to 90 days of age: control without enriched environment (n=16), control-enriched environment (n= 18); malnourished without enriched environment (n=16) and starved environment enriched with (n=16). The EE was formed in a cage that housed 8-10 animals containing: stairs, pipes and plastic houses, supports for climbing vertically, balls and dolls. Was accompanied by the weight gain of the offspring were subjected to analysis of behavioral sequence of satiety and food intake test anxiety. The animals were euthanized at 90 days of age by decapitation for collection of abdominal adipose tissue. The data demonstrate that protein restriction caused in the animals a hyperphagia associated with a delay in the onset of satiety that has been extended throughout life despite the weight keep down of the control and the delay of satiety have disappeared with time. The EE reduced the weight and anxiety in normonutridos animals but did not affect the weight or the behavior of malnourished. It is concluded that the EE can be an external factor that promotes changes in energy balance and behavior of control animals, but was not able to attenuate the changes resulting from malnutrition. This demonstrates that perinatal protein undernutrition cause effects on eating behavior that may be permanent, promoting resistance to energy balance and thereby contributing to the emergence of obesity and associated diseases.
Keywords: Feeding Behavior. Protein Undernutrition. Eating. Fetal Development. Body Weight.
Lista de abreviaturas
AE - Ambiente Enriquecido
AgRP - Proteína Relacionada ao Agouti AMP – Adenosina Monofosfato
AMPK – Quinase ativada por adenosina 3',5'- monofosfato ARC – Núcleo Arqueado
ATP – Adenosina trifosfato
BDNF - Fator Derivado do Cérebro
CART - Transcrito Regulado pela Cocaína e Anfetamina DMH - Hipotálamo Dorsomedial
DOHaD - Origens Desenvolvimentistas da Saúde e da Doença GH - Hormônio de Crescimento
HL – Hipotálamo Lateral
HPA - Hipotálamo-pituitária-adrenal IMC – Índice de Massa Corporal NPY - Neuropeptídeo Y
POMC - Pro-opiomelanocortina PVN – Núcleo Paraventricular PYY – Peptídeo YY
SCS – Sequência Comportamental de Saciedade SN – Sistema Nervoso
SNC – Sistema Nervoso Central Trk – Receptor Tirosina Quinase VMH- Hipotálamo Ventromedial
Sumário
1 Apresentação...10
2 Revisão de Literatura...13
2.1 Desenvolvimento do sistema nervoso, a plasticidade fenotípica e obesidade...13
2.2 Comportamento alimentar e a desnutrição...16
2.3 Ambiente enriquecido e comportamento alimentar...19
2.4 Artigo de Revisão (APENDICE A)...22
3 Hipótese...23
4 Objetivos...23
5 Métodos...24
5.1 Animais e manipulação dietética ...24
5.1.1 Composição das dietas...26
5.2 Ambiente enriquecido...27
5.3 Avaliação dos indicadores somáticos...27
5.4 Avaliação do consumo alimentar diário espontâneo ...28
5.5 Teste de ansiedade...29
5.6 Sequência comportamental de saciedade (SCS)...30
5.7 Quantificação do tecido adiposo visceral e epididimal...31
5.8 Análise estatística .... ... ..31
6 Resultados - Artigo Original (APÊNDICE B)...32
7 Conclusões...33
8 Considerações finais...34
Referências...35
APÊNDICE A – Artigo de Revisão...46
APÊNDICE B – Artigo Original...67
ANEXO A- Comprovação submissão de manuscrito de revisão à revista...113
1 Apresentação
Em mamíferos, o período crítico de desenvolvimento do Sistema Nervoso (SN) ocorre durante as fases de gestação, lactação e primeira infância, e é caracterizado por crescimento rápido, maturação de órgãos e sistemas, replicação e diferenciação celular (DOBBING; SANDS, 1985), sendo esta fase de desenvolvimento a mais susceptível a insultos ambientais (ADAMS et al., 2000). Fatores ambientais como a desnutrição, especialmente proteica, durante o período crítico do SN, tem sido relacionada às alterações morfológicas, bioquímicas e fisiológicas do crescimento cerebral com impactos que podem se prolongar durante toda vida (DAUNCEY; BICKNELL, 1999; MORGANE et al., 1993).
As principais hipóteses científicas indicam que o feto adapta-se às modificações ambientais ainda na vida intrauterina ou no período pós-natal precoce (VELKOSKA; MORRIS, 2011), e que doenças na vida adulta podem surgir a partir de uma incompatibilidade entre o ambiente pós-natal real e o que é previsto pelo organismo fetal durante a fase de desenvolvimento (VICKERS et al., 2009). Este fenômeno biológico é conhecido como programação metabólica (LUCAS, 1991) e atualmente, o termo “plasticidade fenotípica” vem sendo utilizado, que corresponde à capacidade do indivíduo de modificar o fenótipo em resposta às alterações ambientais e às repercussões na vida adulta (GLUCKMAN; HANSON; PINAL, 2005).
Para explicar o processo pelo qual uma agressão ambiental, como a desnutrição, pode ter efeitos permanentes sobre a estrutura e função dos órgãos, a Origem Desenvolvimentista da Saúde e da Doença (DOHaD) é a ciência que tenta compreender essa relação entre desnutrição durante a vida fetal e infância e o surgimento de alterações orgânicas na vida adulta, como a síndrome metabólica (caracterizada por doenças coronárias, obesidade, diabetes tipo 2 e hipertensão) (GLUCKMAN; HANSON, 2004).
Um sintoma dessa síndrome é a obesidade, que atinge mais de 500 milhões de pessoas no mundo em 2013 (WHO, 2013), e em conjunto às suas patologias associadas são consideradas um grave problema de saúde pública (ARMITAGE et al., 2004; FINUCANE et al., 2011). Nas últimas quatro décadas, a prevalência da obesidade aumentou devido ao novo estilo de vida adotado pela população, caracterizado pelo sedentarismo e pelo consumo de uma dieta rica em gordura e densamente energética (REJESKI et al., 2012). A obesidade é uma doença metabólica, caracterizada por uma disfunção das vias de sinalização responsáveis pela regulação do metabolismo energético e do comportamento alimentar (TAUBE et al.,
2012; SCHWARTZ et al., 2000), estando associada a maior risco para ao surgimento de doenças crônicas (GARG et al., 2013).
A deficiência nutricional fetal e infantil tem sido estudada devido aos seus efeitos de longa duração no desenvolvimento do cérebro, incluindo as sequelas permanentes na regulação da ingestão alimentar (CHEN et al., 2009). Em ratos, o desenvolvimento dos circuitos neuronais reguladores de apetite ocorrem no final da gestação e continuam após o nascimento, sendo susceptível a mudanças ambientais, como a nutrição (VELKOSKA; MORRIS, 2011), que podem provocar modificações no comportamento alimentar e no metabolismo energético (OROZCO-SÓLIS et al., 2008).
Estudos experimentais em animais evidenciaram que a restrição nutricional durante o desenvolvimento perinatal provoca nos animais adultos hiperfagia, preferência para alimentos com alto teor de gordura (DESAI et al., 2007; LOPES DE SOUZA et al., 2008), além de retardo no aparecimento da saciedade acompanhado por um aumento no tamanho da refeição (OROZCO-SÓLIS et al., 2009). Desta forma, alterações durante o período crítico de desenvolvimento podem induzir a plasticidade fenotípica, favorecendo o quadro de obesidade e doenças associadas (OROZCO-SÓLIS et al., 2009; VELKOSKA; MORRIS, 2011).
O comportamento alimentar é regulado por um sistema complexo de sinais centrais e periféricos, que interagem modulando a resposta à ingestão de nutrientes. A regulação periférica está sob a ação de sinais de saciedade e de adiposidade (BERTHOUD et al., 2006; STANLEY et al., 2005; WREM; BLOOM, 2007), enquanto que o controle central é realizado por vários sistemas, sendo o hipotálamo um importante regulador (VALASSI et al., 2008). Os sinais periféricos agem diretamente no hipotálamo, onde seus neurônios controlam a ingestão de alimentos através da produção de neuropeptídeos envolvidos com a ativação das vias de controle orexígenas e anorexígenas de acordo com o estado nutricional do organismo (SWART et al., 2002). Os filhotes submetidos a restrição nutricional na gestação e lactação apresentam alterações nos níveis de expressão gênica dos neuropeptídeos hipotalâmicos (IKENASIO-THORPE et al., 2007; OROZCO-SÓLIS et al., 2008; PLAGEMANN et al., 2000), e essas alterações parecem ser permanentes (CHEN et al., 2009).
Um dos desafios da ciência é desvendar os mecanismos que estão implicados nesse desbalanço energético e quais são os fatores exógenos que poderiam atenuar os efeitos negativos da programação fetal hipotalâmica na vida adulta. Desta forma, alternativas ambientais que possam interferir nessa plasticidade neural têm sido estudadas, entre elas, a estimulação por ambiente enriquecido (AE). O AE é uma manipulação ambiental que aumenta a estimulação sensorial e tem-se demonstrado capaz de modular a plasticidade do
hipocampo e de outras regiões cerebrais, favorecendo a neurogênese, aumento da plasticidade e sobrevivência celular (KEMPERMANN; GAGE, 2002), aumento da gliogênese (STEINER et al., 2004) e aumento da regulação dos fatores de crescimento, como especialmente o fator derivado do cérebro (do inglês, “brain-derived neurotrophic factor”, BDNF) (GELFO et al., 2011; PIETRAPAOLO et al., 2004). Esses resultados descritos sugerem que os efeitos do AE ocorrem através das vias de sinalização do BDNF (WILLIAMSON et al., 2012).
Evidências recentes observaram uma função central do BDNF na via hipotalâmica, onde participa do controle do peso corporal e da homeostase energética (CORDEIRA; RIOS, 2011), induzindo a supressão do apetite e perda de peso (ROTHMAN et al., 2012; WANG et al., 2007b,c 2010) e aumentando a taxa metabólica de repouso (WANG et al., 2007a, 2010). Portanto, considera-se que o BDNF pode reduzir a ingestão de alimentos (CORDEIRA; RIOS, 2011), e desta forma, o ambiente enriquecido poderia influenciar na plasticidade sináptica desses núcleos e consequentemente, no controle do comportamento alimentar (WILLIAMSON et al., 2012).
O estudo de Mainardi et al (2010) demonstra que uma mudança no “estilo de vida”, provocada pela condição de enriquecimento ambiental de camundongos, pode interferir em circuitos neurais em núcleos de controle da homeostase energética. Desta forma, surge a hipótese que a exposição crônica ao ambiente enriquecido reverte ou atenua, na vida adulta, os efeitos sobre o comportamento alimentar causados pela desnutrição no início da vida.
Em termos clínicos e experimentais, é de particular interesse compreender as modificações causadas pela desnutrição na fase precoce da vida e os eventuais benefícios promovidos pelo AE na fase adulta. Portanto, o objetivo geral do trabalho foi avaliar a influência da exposição ao ambiente enriquecido sobre o comportamento alimentar de ratos adultos submetidos à desnutrição proteica perinatal. Realizou-se o acompanhamento da evolução ponderal e o comprimento naso-anal dos filhotes; verificou-se o consumo alimentar diário espontâneo, analisou-se o teste de sequência comportamental de saciedade, a sua estrutura e o consumo; observou-se se o AE promoveu ansiedade na prole, o que poderia interferir na ingestão alimentar e após o sacrifício, quantificou-se a gordura abdominal.
Ao se propor análises acerca do efeito do ambiente enriquecido sobre o comportamento alimentar de animais desnutridos no período perinatal, o presente estudo tem interesse socioeconômico e científico, buscando fornecer dados para futuras estratégias de intervenção com AE, no âmbito do estudo da programação fetal, plasticidade cerebral, comportamento alimentar e metabolismo energético, favorecendo o tratamento da obesidade e doenças associadas.
2 Revisão de literatura
Esta seção reúne informações indispensáveis para a estruturação do trabalho científico, onde o conteúdo está desenvolvido em subseções que abrangem o tema apresentando conceitos-chave da pesquisa, resultados de artigos científicos e pontos de vista diversificados de autores, a evolução da ciência sobre o tema e o seu significado atual.
2.1 Desenvolvimento do sistema nervoso, a plasticidade fenotípica e obesidade
O período crítico de desenvolvimento compreende a fase intra-uterina e a fase pós-natal de lactação, onde ocorrem os principais eventos do desenvolvimento do sistema nervoso (SN) (DOBBING; SANDS, 1985), sendo importante também para a regulação metabólica (ADAMS et al., 2000). Nessa fase podem ocorrer alterações no desenvolvimento do organismo e ocasionar, na fase adulta, alterações nas funções do SN (DAUNCEY; BICKNELL, 1999; MORGANE et al., 1993). O SN possui a habilidade de modificar a sua organização morfofuncional e de se adaptar em resposta a alterações internas ou demandas externas, caracterizando-se assim a plasticidade cerebral (MAINARD; PIZZORUSSO; MARFFEI, 2013). Esse sistema se desenvolve em um processo de síntese de componentes celulares, neurogênese e gliogênese, migração e diferenciação celular e por último, maturação morfofuncional (DOBBING; SANDS, 1985; MORGANE, MOKLER; GALLER, 2002).
A desnutrição pode ser considerada como um dos principais fatores ambientais capazes de afetar o desenvolvimento do SN, visto que o suprimento adequado de nutrientes é imprescindível para a manutenção do crescimento e desenvolvimento funcional de todos os sistemas orgânicos. (LEVITSKY; BARNES, 1972; MORGANE et al., 1993).
Estudos epidemiológicos relatam uma associação entre baixo peso ao nascer e alta susceptibilidade ao desenvolvimento de outros distúrbios como obesidade, diabetes e doenças cardiovasculares (ERIKSSON et al., 2003; GLUCKMAN; HANSON, 2004; HALES; BARKER, 1992, 2001). Durante a Fome holandesa de 1944-1945 surgiram as primeiras evidências. Um período devastador de desnutrição grave e fome como resultado das batalhas finais da II Guerra Mundial afetaram grande parte da população da Holanda. Estudos sobre as vítimas desta catástrofe revelaram que a nutrição inadequada no primeiro trimestre de gestação estava relacionada à obesidade, hipertensão e dislipidemia em jovens adultos do sexo masculino (RAVELLI et al., 1976) e em mulheres de meia-idade (RAVELLI et al., 1999; ROSEBOOM et al., 2000a, 2000b).
A obesidade e suas patologias associadas são consideradas uma ameaça à saúde neste século, representando um grave problema de saúde pública por tomar proporções de uma pandemia global (ARMITAGE et al., 2004; FINUCANE et al., 2011). Atingindo mais de 500 milhões de pessoas no mundo em 2013 (WHO, 2013), a prevalência da obesidade aumentou nas últimas quatro décadas devido ao novo estilo de vida adotado pela população, caracterizado pelo sedentarismo e pelo consumo de uma dieta rica em gordura e densamente energética (REJESKI et al., 2012).
A obesidade é uma doença metabólica, caracterizada por uma disfunção das vias de sinalização responsáveis pela regulação do metabolismo energético e do comportamento alimentar (TAUBE et al., 2012; SCHWARTZ et al., 2000), estando associada a maior risco para ao surgimento de doenças crônicas (GARG et al., 2013). Neste contexto, é de particular relevância que os estudos epidemiológicos e experimentais destaquem a relação entre o ambiente fetal e infantil no início da vida e o subseqüente desenvolvimento da obesidade (HOWIE et al., 2009), bem como busquem entender os mecanismos que intensificam o problema e as possíveis estratégias de intervenção.
Para explicar o processo pelo qual uma agressão ambiental, como a desnutrição, pode ter efeitos permanentes sobre a estrutura e função dos órgãos, a Origens Desenvolvimentista da Saúde e da Doença (DOHaD) é a ciência que busca compreender os mecanismos envolvidos entre fatores externos que incidem durante a vida fetal e primeira infância e alterações tardias, a exemplo da síndrome metabólica (caracterizada por doenças coronárias, obesidade, diabetes tipo 2 e hipertensão) (GLUCKMAN; HANSON, 2004). Sendo assim, estudos experimentais em animais têm reproduzido o modelo de privação de nutrientes, especialmente de desnutrição proteíca, durante o período crítico de desenvolvimento, e constatam que esse fator induz a alterações morfológicas, bioquímicas e fisiológicas do crescimento cerebral com impactos pontuais que podem perdurar por toda a vida (DAUNCEY; BICKNELL, 1999; MORGANE et al., 1993; PLAGEMANN et al., 2000).
Os animais submetidos à desnutrição apresentam, na vida adulta, alterações corporais e metabólicas próprias da obesidade, como aumento do tecido adiposo (OROZCO-SÓLIS et al., 2008), distúrbios fisiológicos ligados ao metabolismo: como a síndrome de resistência à insulina (BIESWAL et al., 2006), diminuição da sensibilidade à leptina (KRECHOWEC et al., 2006; DESAI et al., 2007), esteatose hepática (ERHUMA et al., 2007), a pressão arterial elevada (MCMULLEN; LANGLEY-EVANS, 2005) e hiperlipidemia (BIESWAL et al., 2006; DESAI et al., 2007; ERHUMA et al., 2007). Esses efeitos da restrição calórica ou
protéica perinatal sobre a plasticidade cerebral podem persistir em animais adultos mesmo tendo sido recuperados da desnutrição (LAUS et al., 2011).
Em resposta a essa restrição nutricional durante o início da vida, o organismo faz adaptações metabólicas para sobreviver naquele ambiente pobre em nutrientes (GLUCKMAN; HANSON, 2004; HALES; BARKER, 2001). No entanto, essas adaptações que acontecem durante o período perinatal podem provocar um descompasso quando a realidade pós-natal é de nutrição adequada ou sobrecarga calórica, podendo gerar alterações funcionais na vida adulta (GLUCKMAN; HANSON; HAMISH, 2005; GLUCKMAN et al., 2007) e favorecer o surgimento das doenças a longo prazo (DE MOURA et al., 2007; HOWIE et al., 2009; PASSOS et al., 2002).
Uma possível explicação para a relação entre agressões sofridas nos períodos críticos e as repercussões tardias sobre os sistemas fisiológicos é proposta pela hipótese da plasticidade fenotípica, que corresponde a capacidade de o organismo modificar o fenótipo em resposta às alterações ambientais e às repercussões na vida adulta (GLUCKMAN; HANSON; PINAL, 2005). Este fenômeno biológico da plasticidade fenotípica, que engloba a “programação” metabólica, baseia-se no processo pelo qual uma agressão ambiental, como a desnutrição, pode ter efeitos a longo prazo sobre a estrutura, bioquímica e função dos órgãos (LUCAS, 1991). Observações epidemiológicas, bem como estudos clínicos em animais em todo o mundo vem embasando a hipótese de programação fetal como a origem de doenças crônicas na vida adulta (BOUANANE et al., 2009; PINHEIRO et al., 2008).
A deficiência nutricional fetal e infantil tem sido muito estudada devido aos seus efeitos de longa duração no desenvolvimento do cérebro, incluindo as alterações permanentes na regulação da ingestão alimentar (CHEN et al., 2009). A ingestão de alimentos é um dos compõe um dos elementos do balanço energético, compondo a homeostase do organismo. Alterações nos mecanismos de controle do comportamento alimentar podem ser a causa de obesidade e das suas complicações médicas associadas, incluindo, distúrbios psicológicos, metabólicos e cardiovasculares (CORDEIRA; RIOS, 2011).
Uma área encefálica nos mamíferos relacionada ao controle homeostático da ingestão alimentar e do balanço energético (PLAGEMANN et al., 2000) é o hipotálamo. Seu período crítico de diferenciação e maturação durante as três primeiras semanas de vida pós-natais (POZZO-MILLER; AOKI, 1992), portanto susceptível a mudanças ambientais, como a nutrição (VELKOSKA; MORRIS, 2011). Sendo assim, o ambiente nutricional no início da vida pode modificar a morfo-fisiologia e o metabolismo neural hipotalâmico durante o desenvolvimento e causar alterações nos mecanismos de controle do comportamento
alimentar (SPENCER, 2013). A programação de regulação do circuito hipotalâmico na homeostase energética pode ser uma via importante para entender os mecanismos que associam a obesidade e a desnutrição na vida precoce (OROZCO-SÓLIS et al., 2010).
2.2 Comportamento alimentar e a Desnutrição
O comportamento alimentar se refere à interação de diversos processos que envolvem a escolha do alimento, início e término da alimentação, a frequência, o tempo e o tamanho da refeição (MORTON et al., 2006), sendo regulado por um sistema complexo de mecanismos homeostáticos e hedônicos através da integração de sinais centrais e periféricos, que interrelacionam para modular a resposta à ingestão de nutrientes (SWART et al., 2002).
No controle central do comportamento alimentar, o hipotálamo, dentre suas inúmeras funções, desempenha um papel crucial na regulação da ingestão de alimentos e gasto de energia, monitorando, processando e gerando respostas aos sinais periféricos de nutrientes, hormonais e sinais neurais provenientes do trato gastrointestinal, dos músculos, do pâncreas, do fígado ou do tecido adiposo (DIÉGUEZ et al., 2011).
O hipotálamo, região do diencéfalo, é constituído de vários núcleos e áreas que se interligam para promover a regulação do comportamento alimentar: o núcleo paraventricular (PVN), Hipotálamo Ventromedial (VMH), Hipotálamo Dorsomedial (DMH), Hipotálamo Lateral (LH) e em particular, o Núcleo Arqueado (ARC) tem um proeminente papel na detecção de reservas de energia, e consequentemente na regulação da ingestão de alimentos, sendo um dos núcleos hipotalâmicos mais estudados (APONTE et al., 2011).
O ARC é posicionado em torno do terceiro ventrículo, onde a barreira hemato-encefálica é particularmente permeável, e isso o torna idealmente posicionado para detectar e responder a uma miríade de sinais periféricos como hormônios e nutrientes (RODRIGUEZ; BLÁZQUEZ; GUERRA, 2010). O ARC contém duas populações de neurônios importantes: as produtoras do Neuropeptídeo Y (NPY) que co-expressam a Proteína Relacionada ao Agouti (AGRP), neuropetídeos orexígenos; e as que produzem a Pro-opiomelanocortina (POMC) e o transcrito regulado por cocaína e anfetamina (CART). O POMC ainda é precursor do hormônio estimulante α–melanócito (α-MSH) que são neuropeptídios anorexígenos (DIETRICH; HORVATH, 2009; SIMPSON; MARTIN; BLOOM, 2009).
As populações neurais do ARC, que produzem NPY e POMC, recebem informações e são regulados de formas opostas por sinais de status de energia periférica. A estimulação de neurônios AGRP e NPY favorece a ingestão alimentar e reduz o gasto energético, enquanto
que a estimulação dos neurônios POMC e CART provoca efeito oposto (ZHAN et al., 2013; DIANO et al., 2011; SCHWARTZ et al., 2000). A estimulação e/ou inibição dos neuropeptídeos depende do balanço energético corporal, contribuindo assim para desencadear respostas anabólicas ou catabólicas (VALASSI et al., 2008).
No estado alimentado ou em situação de excesso de adiposidade, os nutrientes elevam os níveis plasmáticos de hormônios e sinais periféricos como a leptina liberada pelos adipócitos, o peptídeo YY (PYY) derivado do intestino e a insulina produzida pelas células β-pancreáticas, que vão agir diretamente no ARC do hipotálamo inibindo os neurônios que
expressam NPY e AGRP e, simultaneamente, estimulando os neurônios produtores de POMC/CART, reduzindo assim a ingestão alimentar favorecendo a sinalização da saciedade (SCHWARTZ et al., 2000; DHILLON et al., 2011). Em contraste, quando os níveis de energia estão baixos, como no jejum, há uma redução na concentração dos fatores de saciedade e uma maior secreção da grelina gástrica que é um fator orexígeno, facilmente transportado para o hipotálamo, onde atua ativando os neurônios NPY e AGRP, inibindo a expressão do POMC (COWLEY, 2003) e promovendo assim, a ingestão de alimentos (CORDEIRA; RIOS, 2011).
Portanto, os neurônios hipotalâmicos agem como sensores de nutrientes, respondendo às mudanças na disponibilidade de nutrientes, como a glicose e lipídeos circulantes. Em resposta a um aumento nos níveis de nutrientes, os neurônios produtores de POMC despolarizam enquanto que os neurônios NPY/AGRP hiperpolarizam, gerando, respectivamente, aumento e diminuição da liberação de seus neurotransmissores (BLOUET; JO; SCHWARTZ, 2009; JO et al., 2009). Os neurônios POMC no ARC são conhecidos por desempenhar uma função importante na detecção e integração desses fatores periféricos (WILLIAMS; ELMQUIST, 2011).
Os neuropeptídeos e o sistema hormonal hipotalâmicos do ARC são componentes fundamentais, porém outras moléculas e outras áreas hipotalâmicas atuam em conjunto para integrar e disseminar os sinais celulares envolvidos na regulação do comportamento alimentar e da homeostase energética. A ativação de neurônios POMC e AGRP/NPY, chamados de primeira ordem, ocorre de forma combinada e simultânea. A liberação de POMC atua estimulando os neurônios de segunda ordem do HL a produzirem o neuropeptídio Hormônio α-melanócito estimulante (α-MSH), que se liga ao seu receptor (MC4R) e em conjunto inibem a alimentação e promovem o gasto de energia. Concomitantemente, os neurônios hipotalâmicos AGRP/NPY liberam neuropeptídeo AGRP para inibir a liberação α-MSH. O
NPY é considerado um potente estimulador fisiológico do apetite conhecido em mamíferos (LU et al., 2013).
Outros dois neuropeptídios transcritos no HL são conhecidos por desempenhar uma ação importante na alimentação e saciedade. Os pepetídeos, orexina-A (OX-A) e orexina-B (OX-B) (também chamados de hipocretina 1 e hipocretina 2). As OX podem agir como neuropeptídeos orexígenos, influenciando os processos que envolvem o consumo do alimento (BARSON; MORGANSTERN; LEIBOWITZ, 2013).
Dados na literatura mostram que esses neuropeptídeos podem ser alterados na vida adulta após desnutrição hiproteica perinatal. Além disso a desnutrição pré-natal grave é um tipo de estresse nutricional que também pode programar mudanças no eixo hipotámo-pituitária-adrenal (HPA) e circuitos de alimentação (SPENCER, 2013). Na literatura comprovam-se os efeitos da desnutrição perinatal, induzindo a plasticidade fenotípica em várias regiões hipotalâmicas, confirmando que a plasticidade pode ocorrer no hipotálamo seja por alteração nas sinapses hipotalâmicas (PLAGEMANN et al., 2000), como também por alterações dos sensores nutricionais e assim, induzirem modificações na regulação do comportamento alimentar (FERNO, 2011).
Portanto, os sinalizadores cerebrais que ajustam as reservas energéticas em áreas de controle da ingestão alimentar, provavelmente, estão alterados pela desnutrição perinatal, já que a regulação do comportamento alimentar resulta também da ativação de neurônios hipotalâmicos que produzem os neuropeptídeos (LOPEZ et al., 2010; STARK et al., 2012).
Neste contexto, foi observado que ratos submetidos à restrição proteica durante a gestação e a lactação apresentam, depois do desmame, hiperfagia e uma preferência para alimentos com alto teor de gordura (DESAI et al., 2007; LOPES DE SOUZA et al., 2008). Em uma análise mais profunda do comportamento alimentar, verificou-se que esta hiperfagia ocorre por retardo no aparecimento da saciedade acompanhado por aumento no tamanho da refeição (OROZCO-SÓLIS et al., 2009). Somado a essas observações comportamentais, os animais desnutridos apresentam aumento do nível de expressão no hipotálamo do NPY e AGRP que são peptídeos orexígenos (IKENASIO-THORPE et al., 2007; OROZCO-SÓLIS et al., 2009), e da diminuição do nível de expressão do POMC, peptídeo anorexígeno. (OROZCO-SÓLIS et al., 2009).
Após a restrição nutricional perinatal, não só a hiperfagia é observada na vida adulta, como também, um aumento das reservas do tecido adiposo (BELLINGER; LANGLEY-EVANS, 2005; MCMILLEN; ROBINSON, 2005; MCMULLEN; LANGLEY-LANGLEY-EVANS, 2005;). Esse perfil pode ser decorrente da incompatibilidade entre os ambientes fetal e externo
durante o desenvolvimento e subsequentemente, pode conduzir a um fenômeno de recuperação de peso rápido e excessivo, chamado de "catch-up de crescimento" (GLUCKMAN; HANSON, 2004; WADHWA et al., 2009). Em relação a vida pós-natal, dados mostram que as ações anoréxicas da insulina (SARDINHA et al., 2006), a leptina e serotonina reduzem a prole de mães de ratos submetidos à restrição proteica ou calórica (DESAI et al., 2007). Tomadas em conjunto, essas observações indicam que a disfunção dos circuitos do hipotálamo que regulam a homeostase energética e a ingestão alimentar podem ser indutores no desenvolvimento de síndrome metabólica (OROZCO-SÓLIS et al., 2010; VELKOSKA; MORRIS, 2011).
Um dos desafios interessantes da ciência é o de compreender a forma como a plasticidade do hipotálamo pode ser modulada através de estímulos ambientais. Com este propósito, os modelos experimentais utilizados são: (A) o exercício físico com a execução de atividades de roda, (B) exposição à dieta rica em gordura, (C) a restrição calórica e recentemente, (D) a manipulação ambiental através do ambiente enriquecido (AE) tem sido estudado como uma estratégia de modulação da plasticidade (MAINARD; PIZZORUSSO; MARFFEI, 2013). Desta forma, o AE poderia ser um fator ambiental capaz de atenuar os efeitos a longo prazo da plasticidade fenotípica hipotalâmica induzida por desnutrição precoce sobre o comportamento alimentar, como também, pode ser uma alternativa terapêutica para tratamento da obesidade.
2.3 Ambiente Enriquecido e Comportamento Alimentar
O AE é definido como uma manipulação de habitação onde há uma combinação de arranjo de objetos no ambiente físico e condições sociais para assim, aumentar os estímulos sensoriais, físicos e sociais. Através dessa estimulação, esse modelo tem sido demonstrado capaz de estimular a plasticidade no hipocampo e em outras regiões corticais em roedores (BAAMONDE et al., 2011; DI GARBO et al., 2011).
Neste contexto, a utilização do AE tem sido uma forma de estimulação de eventos cognitivos, promovendo alterações nas funções motoras (RISEDAL et al., 2002), melhora da aprendizagem e memória (ROSSI et al., 2006; WAKABAYASHI et al., 2008), e mudanças de comportamentos em geral (KOH et al., 2007), como a redução da agressividade (ARMSTRONG; CLARK; PETERSON, 1998), redução da ansiedade, medo e excitação (HANSEN; BERTHELSEN, 2000) e diminuição do estresse (VAN LOO, CROES; BAUMANS, 2004). Estas alterações incluem a neurogênese, aumento da plasticidade e
sobrevivência celular (KEMPERMANN; GAGE, 2002), aumento da gliogênese (STEINER et al., 2004) e aumento da regulação dos fatores de crescimento, como especialmente o fator derivado do cérebro (do inglês, “brain-derived neurotrophic factor”, BDNF) (GELFO et al., 2011; PIETRAPAOLO et al., 2004).
Os resultados descritos sugerem que os efeitos do AE ocorrem através das vias de sinalização do BDNF. O BDNF pode ativar cascatas bioquímicas, favorecendo a proliferação, sobrevivência e plasticidade neuronal (MATTSON et al., 2004; SOSSIN; BARKER, 2007), induzir a neurogênese (EHNINGER; WANG; KLEMPIN, 2011). As habilidades de aprendizado e memória podem ser melhoradas em animais em condições de enriquecimento (BEAUQUIS; DE NICOLA; SARAVIA, 2010).
Recentemente, evidências na literatura científica indicam uma função importante do BDNF na via hipotalâmica, participando do controle do peso corporal e da homeostase da energia (CORDEIRA; RIOS, 2011). Gray et al (2006) verificaram que ratos com deficiência de BDNF são obesos. Em outros trabalhos da literatura, tem sido observado que a administração central de BDNF induz a supressão do apetite e perda de peso (ROTHMAN et al., 2012; WANG et al., 2007b,c, 2010) e aumenta a taxa metabólica de repouso (WANG et al., 2007a, 2010). Portanto, considera-se que o BDNF pode reduzir a ingestão de alimentos, seja através da alteração sináptica ou por modificação na expressão de receptores nos núcleos hipotalâmicos (CORDEIRA; RIOS, 2011) e desta forma, o ambiente enriquecido poderia influenciar na plasticidade sináptica desses núcleos e consequentemente, no controle do comportamento alimentar (WILLIAMSON et al., 2012).
A sinalização do BDNF é mediada por uma família de receptores específicos de tirosina quinase (do inglês, “tyrosine receptor kinase”, Trk) (TrkA, B e C) (PARADA et al., 1992). Korte et al (1998) observaram que o BDNF e, especificamente, o TrkB atuam na plasticidade das conexões sinápticas envolvidas na aprendizagem e memória. Sendo assim, uma redução na sinalização do TrkB poderia modificar vias responsáveis pelo controle do comportamento alimentar, reduzindo os níveis de BDNF em núcleos hipotalâmicos que causariam alterações das conexões sinápticas, levando à alteração comportamental (KERNIE et al., 2000). Em adição a essas observações, Hammond (2010) observou que uma baixa quantidade de interação social (ou seja, reduzido número de animais em uma mesma gaiola) foi demonstrado influenciar a ingestão de alimentos.
O BDNF é sintetizado em diversos núcleos hipotalâmicos como VMH , DMH , LH e PVN, mas não é produzido no ARC ( XU et al., 2003). O seu receptor , o TrkB , por sua vez, é amplamente expresso em todas as áreas do hipotálamo (YAN et al., 1997). Embora o BDNF
não seja sintetizado nos receptores do ARC, o TrkB e fibras nervosas contendo BDNF estão presentes nesta região, sugerindo o envolvimento do fator neurotrófico em processos locais de sinalização que influenciam o comportamento alimentar (YAN et al., 1997; NOBLE et al., 2011). Em estudos mais aprofundados que observaram a ação da administração central do BDNF no PVN(WANG et al., 2007a,b), bloqueando a alimentação induzida por NPY; e no VMN reduzindo a ingestão alimentar, os resultados indicam que o BDNF possui atuação em outros núcleos que não apenas o ARC (BARIOHAY et al., 2005; WANG et al., 2007c).
O BDNF é conhecido como facilitador da plasticidade sináptica estrutural do córtex cerebral, hipocampo e cerebelo (CARTER et al., 2002; MCALLISTER; KATZ; LO, 1997), sendo considerável se especular que ele também participa de remodelação sináptica no hipotálamo durante a ingestão de alimentos para promover saciedade (CORDEIRA; RIOS, 2011).
Além da função central do BDNF no controle do comportamento alimentar, a expressão hipotalâmica do BDNF também é necessária para a transdução de efeitos do AE no tecido adiposo. Cao et al (2011) observaram camundongos com um fenótipo de obesidade resistente, que o BDNF hipotalâmico agiu sinalizando vias que aumentam a atividade do sistema nervoso simpático, causando aumento do número de adipócitos marrons e aumento do gasto de energia. Além disso, a síntese endógena de BDNF no VMH desempenha um papel fundamental no equilíbrio energético e da resposta à leptina (LIAO et al., 2012). No entanto, o papel exato do BDNF na repressão da ingestão de alimentos tem ainda que ser completamente elucidado (CORDEIRA; RIOS, 2011). Estudos de Wang et al (2007b) fornecem algumas evidências, demonstrando que o BDNF pode modificar a expressão do NPY no ARC induzidas pelo jejum e, consequentemente, reduz a alimentação induzida pelo NPY. Em contrapartida, Mainard et al (2010) analisaram o comportamento alimentar de camundongos adultos expostos ao AE e apesar de terem evidenciado uma diminuição do tecido adiposo e redução da leptina plasmática, eles observaram um aumento do consumo alimentar dos animais. Subsequentemente, a maioria desses estudos, que relacionam AE e comportamento alimentar, foi realizado sem insultos ambientais iniciais (ILIN; RITCHER-LEVIN, 2009). Sendo assim, é de grande interesse científico, investigar se os efeitos do AE sobre a plasticidade hipotalâmica, também ocorrem em animais que foram submetidos a uma alteração nutricional como a desnutrição proteica perinatal, e se há reversão nas alterações encontradas no controle do comportamento alimentar.
2.4 Artigo de Revisão de Literatura
Os resultados desta etapa serão apresentados, a seguir, no trabalho de revisão intitulado: “Correlação entre o AMPK e neuropeptídeos hipotalâmicos no controle do comportamento alimentar”, que foi submetido à publicação pela Revista de Nutrição (APENDICE A e ANEXO A).
3 Hipótese
A exposição ao ambiente enriquecido reverte ou atenua, na vida adulta, os efeitos causados pela desnutrição proteica no início da vida sobre o comportamento alimentar.
4 Objetivos
Os objetivos a seguir nortearam todo o trabalho e constituem as ações gerais e detalhadas que conduziram ao tratamento e busca para a comprovação da hipótese levantada. da temática trabalhada.
4.1 Objetivo Geral
Avaliar a longo prazo a influência da exposição ao ambiente enriquecido sobre o comportamento alimentar de ratos adultos submetidos à desnutrição proteica perinatal.
4.2 Objetivos Específicos
• Avaliar o efeito a longo prazo da desnutrição perinatal sob a evolução ponderal e o comprimento naso-anal dos filhotes, após a estimulação com ambiente enriquecido; • Verificar se ocorre alguma alteração no consumo alimentar diário espontâneo após
esses fatores analisados;
• Analisar a correlação desses fatores com a sequência comportamental de saciedade; • Avaliar se há traços de ansiedade nos animais submetidos à desnutrição e/ou ambiente
enriquecido;
• Quantificar o acúmulo de gordura abdominal provocado pela desnutrição e se ocorre modificação após exposição ao ambiente enriquecido.
5 Métodos
As etapas realizadas ao longo do trabalho estão detalhadas nas seções a seguir, onde encontram-se as explicações de toda ação desenvolvida em cada método, instrumentos utilizados, tempo de pesquisa e as formas de tabulação e tratamento dos dados.
5.1 Animais e manipulação dietética
Ratos machos Wistar provenientes da colônia do Departamento de Nutrição da Universidade Federal de Pernambuco foram mantidos em biotério de experimentação no Anexo de Anatomia, com temperatura de 22°C 2, ciclo invertido escuro-claro de 12/12 horas (claro das 18:00 às 6:00h, escuro das 06:00 às 18:00h), com livre acesso à água e ração. O manejo e os cuidados estiveram de acordo com as recomendações do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA).
Para o acasalamento, após o tempo de 15 dias de habituação ao ciclo escuro/claro, ratas primíparas com peso de aproximadamente 220-250g foram alocadas em gaiolas de poliestireno juntamente com machos (300-350g) na proporção de três ratas para um macho por um período máximo de 3 dias. Para detecção de prenhez positiva, realizou-se a técnica de esfregaço vaginal para coleta de muco e ao microscópio de luz observou-se a presença de espermatozóides. Em seguida, as ratas gestantes eram transferidas para gaiolas individuais e o seu ganho de peso semanal acompanhado. As ratas foram divididas de forma aleatória em 2 grupos experimentais de acordo com a dieta fornecida durante a gestação e lactação: controle (C, dieta com proteína a 17%, n= 7) e desnutridos (D, dieta com proteína a 8%, n= 8), desde o início da gestação até o desmame dos filhotes.
O dia de nascimento da ninhada foi considerado o dia zero e a manipulação para redução da ninhada foi realizada no 1° dia de vida, sendo apenas os filhotes machos utilizados nesse experimento. Aos 25 dias, os filhotes foram desmamados (OST'ADALOVA; BABICKY, 2012) e passaram a receber a dieta padrão de biotério Presence® ad libitum e em seguida, foram divididos em subgrupos aleatoriamente, segundo à exposição ao ambiente enriquecido: controle sem ambiente enriquecido (CSAE, n=16); controle com ambiente enriquecido (CAE, n=18); desnutrido sem ambiente enriquecido (DSAE, n=16); desnutrido com ambiente enriquecido (DAE, n=16) (Figura 1). Os animais foram eutanasiados aos 90 dias de vida por decapitação para retirada do tecido adiposo visceral e epidimal . O desenho do estudo e os períodos de testes e sacrifício estão expressos na figura 2. Todos os
procedimentos foram avaliados e aprovados pelo comitê de ética em uso de animais da Universidade Federal de Pernambuco (protocolo 23076.018667/2012) (ANEXO B).
Figura 1: Modelo experimental representando a formação dos diferentes grupos quanto à manipulação da dieta à base de caseína (grupo controle e grupo desnutrido) e quanto à exposição ao ambiente enriquecido de ratos após serem submetidos à desnutrição proteica precoce.
Figura 2: Desenho experimental representando os diferentes grupos quanto à manipulação da dieta, os períodos de exposição ao ambiente enriquecido, as análises da sequência comportamental de saciedade (SCS), consumo alimentar e o período de sacrifício de ratos submetidos a desnutrição proteica precoce. CSAE – Controle sem ambiente enriquecido; DSAE – Desnutrido sem ambiente enriquecido; CAE – Controle ambiente enriquecido; DAE – Desnutrido ambiente enriquecido.
5.1.1 Composição das dietas
As dietas à base de caseína foram confeccionadas no Departamento de Nutrição da Universidade Federal de Pernambuco baseada na composição de dieta da AIN-93G feita por Reeves et al (1993) (Tabela 1). Tais dietas são isocalóricas com alteração apenas do conteúdo de proteínas (Tabela 2). Após o desmame os animais foram alimentados com a dieta padrão do biotério (Presence®) (Tabela 2).
Tabela 1. Composição das dietas hipoproteica e normoproteica, utilizadas no experimento durante as fases de gestação e lactação nos grupos desnutrido e controle.
Ingredientes Quantidade /kg de dieta Dieta hipoproteica (8% de caseína) Dieta normoproteica (17% de caseína) Caseína (80%) 100,0g 212,5g Mix de vitaminas* 10,0g 10,0g Mix de sais minerais† 35g 35g
Celulose 50g 50g Bitartarato de colina 2,5g 2,5g DL-metionina 3,0g 3,0g Óleo de soja 70ml 70ml Amido 629,5g 516,9g Sacarose 100g 100g BTH 0,0014g 0,0014g
∗ Mistura de vitaminas contendo (em mg.kg−1 de dieta): retinol, 12; colecalciferol, 0,125; tiamina, 40; riboflavina, 30; ácido pantotênico,140; piridoxina, 20; inositol, 300; cianocobalamina, 0,1; menadiona, 80; ácido nicotínico, 200; colina, 2720; ácido fólico, 10; ácido p-aminobenzóico, 100; e biotina, 0,6.
† Mistura mineral contendo (em mg.kg−1de dieta): CaHPO4, 17200; KCl, 4000; NaCl, 4000; MgO, 420; MgSO4, 2000; Fe2O2, 120; FeSO4.7H2O, 200; e elementos-traço, 400(MnSO4.H2O, 98; CuSO4.5H2O, 20; ZnSO4.7H2O, 80; CoSO4.7H2O, 0,16; e KI, 0,32; com amido para completar 40g [por kg de dieta].
Tabela 2. Distribuição calórica das dietas utilizadas no experimento à base de caseína (proteína a 8 e 17%) durante a gestação e lactação dos animais; e da dieta padrão de biotério Presence® consumida após o desmame.
Proteína a 8% Proteína a 17% Dieta padrão
Carboidratos (g/100g) 64,77 54,98 55,49
Lipídeos (g/100g) 6,55 6,67 2,82
Proteínas (g/100g) 8 17 23,22
VCT (kcal/100g) 350 348 340,22
5.2 Ambiente enriquecido (AE)
Os grupos CAE e DAE foram alojados em gaiolas, caracterizando-se AE, continuamente, de 30 até 90 dias de vida. Foram colocados em média 8 animais por gaiola do AE para minimizar os efeitos do estresse e aumentar a interação social. O AE consistiu de uma gaiola contendo: escadas, tubos de plástico, suportes para escalar na posição vertical, bolas, bonecos e casa de plástico (Figura 3). Foram fornecidos diferentes objetos de plástico, de diferentes formas, posicionados em diferentes alturas e alguns objetos suspensos. Os objetos foram trocados e/ou rearranjados a cada 5 dias para nova estimulação e para minimizar os efeitos da habituação. A cada troca, utilizamos brinquedos de maior complexidade e que aumentassem o nível de estimulação gradativamente de acordo com protocolo pré-estabelecido (BEAUQUIS; DE NICOLA; SARAVIA, 2010).
A) B)
Figura 3: A e B: Gaiola de ambiente enriquecido utilizada no estudo e suas dimensões 61 x 44 x 63 cm (Largura x profundidade x altura)
5.3 Avaliação dos Indicadores Somáticos de Crescimento
O peso e o comprimento foram registrados semanalmente até o desmame, e a cada dez dias a partir dos 30 dias de vida. A avaliação do peso corporal foi realizada em balança eletrônica digital (Marte, modelo S-1000, capacidade de 1kg e sensibilidade de 0,1g) e o
comprimento naso-caudal foi aferido em papel milimetrado (Figura 4). A partir dos dados de peso (g) e comprimento (cm), calculou-se o Índice de Massa Corporal (IMC). Após a idade de 60 dias, quando não há mais mudanças de comprimento considerável e onde aferição torna-se mais difícil pelo tamanho dos animais e portanto, menos fidedigna, apenas o peso corporal dos animais continuou sendo registrado semanalmente.
A) B)
Figura 4. A) Balança eletrônica digital (Marte, modelo S-1000) e B) mensuração do comprimento
naso-anal com papel milimetrado e régua.
5.4 Avaliação do consumo alimentar diário espontâneo
O consumo alimentar foi avaliado dos 26 aos 29 e dos 71 aos 74 dias de vida, antes do teste de SCS, com a finalidade de verificar a quantidade de ingestão espontânea de alimentos (diferença do peso entre a quantidade (g) de ração oferecida e rejeitada) no período de 24h com a dieta padrão do biotério (Presence®). Para essa avaliação, os animais eram colocados em gaiolas individuais e a ração padrão era fornecida no comedouro, de quantidade anteriormente mensurada. Os testes sempre eram realizados no mesmo horário, às 8h, quando a ração rejeitada era verificada e uma nova ração mensurada era fornecida. Esse procedimento foi realizado durante quatro dias consecutivos, sendo que os dois primeiros dias corresponderam aos dias de adaptação ao novo ambiente e manipulação, assim consideramos os dois últimos dias para análise de consumo. Após verificação do peso da ração, este valor foi convertido em kcal conforme tabela 2. Os resultados estão representados pela média ± DP de consumo em kcal de cada animal durante os dias de teste por 100 gramas de peso corporal (kcal/100g de peso corporal).
5.5 Teste de ansiedade
Aos 60 dias de vida, o teste para avaliação da ansiedade foi realizado nos animais sempre no mesmo horário das 12 horas, utilizado o modelo do labirinto em cruz elevado baseado em PELLOW et al (1985), o qual é constituído por dois braços abertos (50 x 10 cm) e dois braços fechados (50 x10x 40 cm), estendendo-se a partir de uma plataforma central comum (10x10cm) com piso e paredes escuros, elevado a uma altura de 50 cm a partir do nível do piso e iluminado sob uma luz vermelha de baixa voltagem (15 w) acima da área central (Figura 5). Este modelo experimental é baseado nos procedimentos realizados por Montgomery (1955), que considera o medo inato que os roedores têm pelo espaço aberto e elevado, preferindo ficar nos braços fechados, onde o maior tempo de permanência nos braços abertos em relação ao tempo nos braços fechados representa um comportamento menos ansioso. O maior tempo no centro e a menor frequência de entrada no braço aberto não representam explicitamente comportamento ansioso, mas sugerem traços de ansiedade.
No teste, os animais foram colocados individualmente no espaço central do aparelho com a cabeça voltada para o braço fechado e seus comportamentos foram filmados por um período de 5 minutos. Os registros foram realizados através de imagens por câmera com sistema infravermelho e armazenados em computador. Três observadores cegos e devidamente treinados, visualizaram os filmes e registraram em protocolo o tempo de permanência nos braços abertos e fechados, no centro e a frequência de entrada no braço aberto. O registro de cada entrada teve validade a partir do momento em que o animal encontrou-se com as 4 patas em um dos braços do labirinto. O tempo de cada animal foi marcado através de um cronômetro digital.
5.6 Sequência comportamental de saciedade (SCS)
Nos dias 30 e 75 pós-natal, a SCS foi realizada e avaliada de acordo com Halford, Wanninayake e Blundell (1998), que preconizavam verificar a frequência e a duração de uma sequência de comportamentos progressivos em relação ao tempo, permitindo a identificação do processo de saciação (término da refeição) e o desenvolvimento da saciedade (inibição pós-ingestiva da alimentação). Para esta análise os animais foram transferidos para gaiolas individuais com dimensões adequadas para a análise da SCS. Os animais foram mantidos em privação alimentar prévia de 4 horas antes da oferta do alimento de peso conhecido. O peso dos animais também foi aferido antes do jejum, depois do jejum e ao final do teste. A ração utilizada no teste foi a padrão de biotério, consumida pelos animais desde o desmame. Os testes eram realizado sempre às 12:00 horas. Com auxilio de luz vermelha de baixa intensidade, a SCS foi registrada por sistema de filmagem acoplado a computador em sala próxima ao biotério por um período de uma hora. Ao finalizar esse período de teste o consumo alimentar era verificado, mensurando-se a ração rejeitada. Os filmes foram analisados por três observadores cegos devidamente treinados, onde registraram a frequência e duração (em segundos) dos comportamentos classificados como: a) Alimentação: o rato apresentava-se ingerindo alimento, roendo, mastigando e segurando a ração com as patas; b) Ingestão de água: quando o animal ingeria água direto do bebedouro; c) Exploração: realização de movimentos ao redor da gaiola ou cheirando o ambiente; d) Limpeza: apresentação de cuidados com o corpo, lambendo as patas anteriores e as movimentando sobre a cabeça, continuando com o lamber da região ventral, do dorso e das patas posteriores; e) Repouso: o rato apresentava-se em posição de descanso, apresentando o corpo repousado sobre o assoalho da gaiola ou dormindo.
A partir da observação comportamental da alimentação, outras medidas também foram registradas: a frequência da alimentação (quantas vezes o animal procura o comedouro para alimentar-se), duração da refeição (monitoramento do tempo em que o animal está comendo ao longo do período do teste) e a velocidade da alimentação (quantidade de ração consumida/duração da refeição). Os resultados de comportamentos estão representados em média em minutos (min), ou percentual (%), a ingestão alimentar em kcal/100g ou kcal/Kg de peso corporal do animal e a velocidade da alimentação em kcal/min ± DP.
5.7 Quantificação do tecido adiposo
Após a decapitação do animal, foi realizada uma incisão na região mediana do abdômen para retirada do tecido adiposo das regiões mesentérica, visceral e epididimal com auxílio de pinças e tesouras. Posteriormente, o peso do tecido adiposo foi mensurado em balança eletrônica (Marte, modelo S-1000, capacidade de 1kg e sensibilidade de 0,1g), de acordo com a metodologia explicada por Cinti e colaboradores. (2005). Os dados foram expressos em grama por 100g do peso corporal do rato (g/100g peso).
5.8 Análise estatística
Inicialmente, foi aplicado o teste de normalidade (Kolmogorov-Smirnov). Quando os dados revelaram normalidade e homogeneidade de variâncias, para comparação de dois grupos foi utilizado o teste t de Student para avaliar as diferenças entre as médias do peso e IMC ao nascimento e para verificar a evolução ponderal foi utilizado o teste two-way ANOVA. Após a exposição ao ambiente enriquecido, para comparações múltiplas dos parâmetros comportamentais utilizou-se o teste three-way ANOVA seguido do teste post-hoc de Tukey. Os valores estão expressos em média ± desvio padrão para cada grupo. O nível de significância foi mantido em 5% (p<0,05) em todos os casos. As análises dos dados foram realizadas através do programa estatístico STATISTICA 7.0 (CA, USA).
6 Resultados
Os resultados desta etapa experimental estão apresentados a seguir, na forma de manuscrito de artigo original intitulado: O ambiente enriquecido pode interferir no padrão de comportamento alimentar de ratos adultos submetidos à desnutrição proteica perinatal? que será submetido à publicação na revista Journal of DOHaD (APÊNCICE B).
7 Conclusões
Em animais normonutridos o AE interferiu no balanço energético, promovendo uma perda de peso, apesar do seu consumo alimentar estar aumentado. Além disso promoveu redução da ansiedade desses animais controle.
Os animais desnutridos mantiveram o seu peso reduzido, e apresentaram um comportamento mais ansioso, mesmo após a exposição ao AE, e desenvolveram um comportamento hiperfágico que se prolongou ao longo da vida, onde o AE não foi capaz de influenciar no consumo alimentar desse grupo, o que nos sugere a existência de uma resistência dos mecanismos de controle da ingestão alimentar alterados pela plasticidade hipotalâmica programada durante o período de insulto nutricional. Esses resultados evidenciam que esses animais desencadeiam uma desensibilização às influências ambientais tardias, após de uma desnutrição proteica perinatal. Entretanto, quando o organismo não tem o estresse nutricional no período de desenvolvimento as suas mudanças são mais sensíveis às mudanças ambientais tardiamente, hipótese que foi observada nas respostas do grupo controle aos estímulos do AE.
8 Considerações Finais
Sendo assim, o ambiente de vida precoce tem um papel crítico na programação do comportamento alimentar na vida adulta, resultando em influências específicas sobre o desenvolvimento do cérebro, provocando alterações no padrão de alimentação a longo prazo que parecem ser irreversíveis, e assim, favorecer o surgimento de doenças metabólicas, como a obesidade. É necessário encontrar ferramentas que possam servir como as alternativas terapêuticas para a prevenção e tratamento dessas desordens.
Apesar do tema de suma importância e interesse para a saúde, até então, não existiam trabalhos que abordassem o AE como estratégia de intervenção para reverter ou atenuar os efeitos provocados pela desnutrição sobre o comportamento alimentar.
Os resultados desse trabalho norteiam alguns aspectos sobre este tema, sugerindo que o AE pode ser um fator externo que promove modificações no balanço energético em normonutridos, porém não foi capaz de atenuar as alterações do comportamento alimentar resultantes da desnutrição. Porém, análises complementares são necessárias que abordem os mecanismos celulares e moleculares de áreas envolvidas no controle do comportamento alimentar, como o hipotálamo, no intuito de elucidar como o insulto nutricional modifica o padrão alimentar de uma forma a ser tão resistente e persistente. Além disso, quais os possíveis mecanismos moleculares que explicam a plasticidade induzida pelo AE nas áreas de controle homeostático do comportamento alimentar.
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